CN1490335A - 用酵母表达sTNFR免疫粘附素融合蛋白和多肽的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组人肿瘤坏死因子可溶性受体和/或多肽免疫粘附素及用巴斯德毕赤酵母表达系统表达生产的方法，本发明还包括利用本发明所生产的融合蛋白或其组合物用于治疗需要中和TNF－α的有害作用的疾病即“TNF介导的疾病”方面的应用。

Description

用酵母表达sTNFR免疫粘附素融合蛋白和多肽的方法及其应用

技术领域：

本发明涉及采用基因工程方法构建可溶性受体免疫黏附素蛋白及其聚合物，和用巴斯德毕赤酵母表达系统表达生产该蛋白的方法，以及在治疗TNF介导的疾病方面的应用。

技术背景：

炎症是机体对诸如机械损伤、感染或抗原刺激引起的伤害而产生的一种防御反应。当炎症由不适当的刺激如自身抗原引起时，炎症反应可病理性地表达，当有害物去除后，炎症反应仍可以过度地或持久地病理性地表达。人们对炎症的病因学认识较少，但随着现代生物技术的发展，近年来已经获得了关于炎症分子方面的相当多的信息，由此鉴定出据信在炎症调节中作用显著的某些细胞因子。细胞因子是调节细胞、特别是在细胞因子合成和释放速发区域中的细胞行为的胞外蛋白。许多细胞因子与机体的炎症反应有关，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-1、-2、-6(IL-1、IL-2、IL-6)，转移生长因子-β(TGF-β)和巨噬细胞粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)等，其中肿瘤坏死因子-α(TumorNecrosis Factor alpha，TNF-a)和白细胞介素-1(Interleukin-1，IL-7)是目前已经发现的两种最有效的炎性细胞因子，分别被认为是被称为  “TNF-α介导的疾病”和“IL-1介导的疾病”的许多疾病和紊乱中的关键介质的细胞因子。

肿瘤坏死因子(TNFs)是一族由数目众多的细胞类型，包括单核细胞和巨噬细胞产生的细胞因子。如果自发性或实验性疾病或紊乱与体液或组织中较高水平的TNF相关，或从所述机体中取出的细胞或组织在培养中产生较高水平的TNF，那么所述疾病或紊乱被认为是“TNF介导的疾病”。在许多情况下，由以下另外两种状况也可识别这类TNF介导的疾病：(1)可以通过给与TNF在动物中试验性地模拟与所述疾病或紊乱有关的病理学发现；以及(2)可以通过用抑制TNF作用的药物，抑制或消除所述疾病或紊乱的实验行动物模型中诱导的病理。在大多数TNF介导的疾病中，遇到至少三种状况中的两个，在许多“TNF介导的疾病”的疾病中，遇到所有三种状况。非全部的急性和慢性TNF介导的炎症疾病的一览表包括(但不限于)以下：

炎症性肠炎(inflammatory bowel disease，IBD)包括溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)和克隆氏病(Crohn′s disease，CD)；关节的炎症性疾病，包括骨关节炎、牛皮癣性关节炎和类风湿性关节炎；分泌性中耳炎；急性胰腺炎；病毒性心肌炎；牛皮癣；脓毒症和脓毒性休克；肝硬化；子宫内膜异位；多发性硬化；肌病(例如肌蛋白代谢，尤其是脓毒症中)；急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；全身炎症反应综合征(SIRS)；缺血性损伤，包括小脑缺血(例如由创伤引起的脑损伤、癫痫、出血或中风，每种都可能导致神经变性)；充血性心力衰竭；再灌注损伤；移植排斥反应；或由劳累、扭伤、软骨损伤、创伤、整形外科、感染或其他疾病产生的炎症反应。

目前研究报道的肿瘤坏死因子有TNF-α和TNF-β(或淋巴细胞毒素)，每一种作为三聚体分子是有活性的，被认为通过交联受体而启动细胞信号。一系列证据表明TNF-α和TNF-β是主要的炎症性细胞因子，在机体的许多炎症反应疾病如类风湿性关节炎、红斑狼疮、硬皮病、脓血症的发生和发展中起重要作用。这些已知的TNFs对许多不同的靶细胞具有重要的生理作用，这些靶细胞包含在多种刺激如感染或损伤而引起的炎症反应中。

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、反复发作性、非特异性和多发性关节炎，它是全身结缔组织和胶原纤维组织病变的局部表现，特别以手中指、趾等小关节最易受累。RA患者早期或急性期发病，关节红、肿、热、痛和运动障碍，晚期则关节强直或畸形，并有骨和骨骼肌萎缩，在整个病程中，可有发热、无力、贫血、多发病。本病的病因尚不明确，一般认为其发病与自身免疫、遗传、感染、病毒、内分泌改变等有关，是一种自身免疫性疾病，在局部免疫系统活动性极度活跃时关节衬开始出现发炎症状。类风湿性关节炎常常造成关节的破坏、疼痛和损害变形，进而限制了患部关节的正常活动范围。本病虽一般不致影响患者生命，但致残率高，可造成严重残废使病人完全丧失劳动能力，如病变严重破坏颈椎或累及重要脏器也威胁患者生命。未经治疗的患者，两年致残率为50％，三年致残率为70％，与正常人相比，类风湿性关节炎患者的平均寿命缩短10-15年，且严重影响生活质量，因此该病要早诊断早治疗，以延缓致残，降低致残率。在我国该病的发病率约为0.3％～0.5％，平均约0.35％，女性与男性的发病人数之比约为3∶1或女性更多一些，患病人数约达450万人。

在美国，近4,000万关节炎患者采用目前有效的NSAIDs，使用这些药物有可能会导致胃溃疡和其它严重的并发症(如胃肠道出血或穿孔)。事实上，近期的一项研究评估指出，这些并发症每年可造成107,000名美国人住院接受治疗和16,500名美国人死亡。

据世界卫生组织WHO报告提供的数字，约有1％的人在其一生中会患有类风湿性关节炎病，这样仅中国患者就将达1000多万人，但目前的治疗非常有限的，因而这类药物将具有广阔的市场前景。

据估计，在医疗保健和劳资损失方面，美国关节炎患者每年要耗费650亿美元，用于因严重NSAIDs副作用面临住院治疗的年耗资超出的10亿美元。类风湿性关节炎的医疗费用支出年增长率为7％。预计类风湿性炎治疗剂的销售额将从1997年的约15亿美元上升到2009年的66亿美元。主要是由于新的生物制剂和新的细胞分裂素调节剂的近几年将陆续上市，预计到2009年仅治疗RA的生物药品部分价值就达45亿美元。

我国人口众多，RA患者众多，特别在高寒、高湿地区尤为突出，目前尚缺乏特别有效的治疗药物，现有药物或疗效差、或毒副作用大，对新型针对性强、有效率高、副作用小的免疫耐受型药物有着迫切的要求。

关节组织中的TNFs主要由滑膜细胞的软骨细胞产生。类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)患者的血清及关节液中检测出高水平TNFs已得到公认，提示TNFs与RA的发生和发展关系密切。研究表明TNFs是关节软骨破坏的最重要的一种细胞因子。它能促进滑膜组织的滑膜细胞和淋巴细胞的增殖和分化；能促进滑膜细胞和软骨细胞合成并释放前列腺素E2和胶原酶。PGE2和胶原酶引发滑膜炎症反应、软骨基质的崩解，而局部免疫复合物、游离的胶原等分解产物刺激TNFs的合成，这样形成一个恶性循环。另外TNFs能刺激滑膜细胞和软骨细胞合成过量的金属蛋白酶包括胶原酶和基质溶素，后者(又称蛋白多糖酶)能溶解破坏软骨基质。TNFs还能作用滑膜细胞释放纤维蛋白酶原激活剂，诱导滑膜细胞和软骨细胞释放磷脂酶A2，而磷脂酶A2能抑制蛋白多糖前体物质氨基多糖的合成，抑制软骨细胞对多种生长因子促有丝分裂作用。此外TNFs还具有诱导IL-2和IL-6产生的诈用，在某些病理状况下，TNF可与IL-2或IL-1发生协同性生物学效应。

肿瘤坏死因子(TNFs)是炎症和免疫反应的主要介质，对其活性的调节是调节和控制这些反应的主要手段。由两种截然不同的白细胞介素-1编码基因IL-1α和IL-1β，分别编码IL-1α蛋白和IL-1β蛋白。IL-1α和IL-1β两种蛋白分子均具有约17.5Kda的分子量，并均曾以具有分子量约为31Kda的较大的前体分子在以前合成过，但他们在序列上显示很少的相似性。两种蛋白均为多效性的细胞因子，对不同的组织和对人类的许多病理，特别是在组织的免疫应答和炎症的过程中产生种种相似的效用。

TNF产生的生物活性是通过与特异性质膜受体结合而介导的。TNF有两个受体，分别称为I型和II型TNF受体(TNF-RL和TNF-RII)，以单分子可溶形式天然存在。肿瘤坏死因子受体I，又称为TNFR55、P55、P60、TNF-RI，CD编号为CD120a，是55-60kDI型跨膜糖蛋白，前体长455氨基酸残基，切除29氨基酸的信号肽后，成熟膜蛋白长426氨基酸残基。胞膜外区(182氨基酸)有4个CRD，其中有3个N-糖基化位点。跨膜区有21氨基酸，胞浆区较长，有223氨基酸，有3个蛋白激酶C(PKC)作用位点，1个蛋白酪氨酸激酶(PTK)的作用位点。肿瘤坏死因子受体II又称为TNFR75、P75、P80、TNF-RII，CD编号为CD120b，为75-80kD的I型跨膜糖蛋白，前体长461氨基酸残基，N端为22氨基酸的信号肽，成熟蛋白长439氨基酸残基，胞膜外区为235氨基酸，也有4个CRD，有2个N-糖基化位点。在靠近跨膜区的连接区还有一个富含丝/苏/脯氨酸的STP区，是潜在的O-糖基化位点。跨膜区有30氨基酸，胞浆区长174氨基酸，有1个PKC作用位点。TNFRI与TNFRII在胞膜外区有28％的同源性，在胞浆区没有同源性。TNFRI在胞浆区有一个约80氨基酸的死亡结构域，TNFRII没有同样的结构域，但其羧基端的78个氨基酸残基可以结合TRAF2等胞浆信号蛋白，在信号转导中发挥重要作用。TNFRI和TNFRII分布十分广泛，几乎存在于所有有核细胞表面。通过每个分子的细胞外配体结合(ligand-binding)部分的蛋白酶剪切，它们都可以从细胞表面脱落而被转化为相应的可溶性TNF受体(sTNFR)，即sTNFRI与sTNFRII。TNF的生物活性依赖于其与细胞表面的TNFR的结合。由于这些可溶性的TNFR可与TNF结合，所以又被称为TNF结合蛋白(TNF-BPI和TNF-BPII)。一般认为，可溶性TNFR可以结合TNF，从而局限或抵销TNF活性，因而也可以作为TNF的拮抗剂。金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶都可能参与了可溶性受体的产生。

存在于受累关节滑液中的可溶性TNF受体(sTNFR)是TNF的一种重要的内平衡天然调节剂和天然抑制物，但其量非常低。事实上，TNF-α介导的炎症反应在相当程度上取决于TNF-α和sTNF-R之间是否平衡。健康人血循环中的sTNFR水平为1～2ng/ml，而RA患者滑膜液内的sTNFR可能要比之高4～5倍，可中和过量的TNF。TNF-α与其同源分子TNF-β相等地与TNF细胞表面受体结合而介导它们的生理和病理作用。通过加入sTNFR可竞争性地结合TNF而使TNF不能与细胞表面的TNFR相互结合，从而抑制或减少引起的生物反应。但sTNFR的半衰期特别短，通常为了延长其在体内的稳定时间而将其与免疫球蛋白IgG形成融合蛋白。

临床上，针对细胞因子受体的治疗策略已经得到了广泛的应用，包括利用单克隆抗体、基因工程抗体或利用重组可溶性受体封闭其配体的作用。与抗体技术相比，重组可溶性受体的主要优点是其属于人体自身成分，在治疗中不易引起免疫应答的发生，因而安全性较好。但由于产生封闭效应所需的重组可溶性受体往往剂量很大，因而规模化生产较为困难，生产成本亦较高。此外，多数情况下，重组可溶性受体在体内的半衰期很短，需要多次给药，因此目前进入临床的重组可溶性受体多采用免疫粘附素(immunoadhesin)的策略，即在其C端通过基因融合技术加入免疫球蛋白的Fc段，使其成为融合蛋白，利用免疫球蛋白稳定性好的特点，使其体内半衰期延长。同时，由于免疫球蛋白Fc段可通过链间二硫键形成双聚体，因而免疫粘附素融合蛋白亦形成双聚体，能够提高与其配体的亲和力，更好地发挥疗效。

免疫粘附素是指在基因水平将目的蛋白基因同免疫球蛋白的Fc片段基因相连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上述两部分结构域的重组蛋白。由于目的蛋白同免疫球蛋白部分结构域融合，使重组蛋白获得了多种新的特性：

(1)引入的重链稳定区CH结构域使重组蛋白具有更长的半衰期，更适合于体内的应用。

(2)通过抗Fc段亲和层析、葡萄球菌A(G)蛋白可以方便地进行纯化及免疫共沉淀实验。

(3)由于存在大量商品化的与Fc段配套的产品，使融合蛋白的检测更加方便、特异、敏感。

(4)Fc段具有穿过胎盘、结合补体并介导补体依赖的细胞毒作用，介导ADCC效应等，这一特性被应用于某些疾病的靶向性治疗。

(5)不同免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)Fc结构域可以形成多聚体分子，提高重组蛋白结合抗原或配体的能力。

Ashkenazi等构建了TNFR和IgG的融合蛋白，其二聚体分子与TNF的亲和力较天然TNFR高6～8倍。体外实验中，融合蛋白阻断TNF裂解细胞的能力较可溶性TNFR高24倍，较中和性TNFmAb高4倍。在小鼠接受内毒素半小时前给予融合蛋白能完全预防内毒素诱导的死亡，在接受内毒素后1h给予融合蛋白仍有明显的保护作用。

TNFR-IgG含有TNFR的全部胞外部分，可与细胞表面的TNFR或可溶性TNF形成复合物。人TNFR-IgG1免疫粘附素可大大增强TNFR的免疫粘附作用，其抑制TNF细胞毒效应为可溶性TNF受体的24倍，为TNF-αMcAb的4倍，对TNF的攻击具有明显的保护作用，TNFR-IgG1剂量是TNFMcAb的1/10时，其效应仍高于后者，抗外源性TNF的细胞毒作用比后者强～50倍，比TNFR强100～500倍。(Jin H et al.Protection against rat endotoxic shock by p55 TNFRimmunoadhesin：coparision with anti-TNF McAb.J.Infect.Dis.1994，170(5)：1323-1326)

晶体结构表明，TNF与TNFRI作用的残基数较多，而抗体与抗原的CDR则较少。因此，TNFR-IgGFc与TNF的结合可能比TNFMcAb与TNF结合更稳定，其中尤以TNFRI-IgGFc-TNF复合物更为明显，TNFRI-IgGFc中和TNF的能力要比TNFRII-IgGFc更强。TNGR-IgGFc对人体的免疫原性很弱，没有明显的毒副作用，在使用上安全可靠，特别适用于治疗类风湿性关节炎、败血症的疾病。

我国在重组可溶性受体的研究与开发方面尚处于落后状态，虽然有一些相关实验室的报道，但均未达到进入开发的阶段，其主要原因是此类药物的临床用量较大，并且多数需要用CHO真核表达系统来表达生产，因而对开发生产的技术和设备条件要求高，生产成本高，投资强度高，我国目前的生物技术产业的培养表达技术水平不能满足这些条件。随着我国生物技术总体水平的提高，应该重视重组可溶性受体药物的开发研究问题，使我国在这一领域有所突破。

体外表达重组蛋白质的方式有许多种，包括于大肠杆菌，杆状病毒，酵母，哺乳动物细胞或其他表达系统。本发明采用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统来表达生产所设计的肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素嵌合蛋白。这类蛋白和多肽以前一直用CHO系统来表达，近年来也有用大肠杆菌表达系统表达的研究。然而，原核大肠杆菌表达系统虽然表达量较高，但溶胞产物中纯化重组蛋白质十分困难，由大肠杆菌表达的外来蛋白质常会聚集且形成不溶的包涵体，因此常需要包涵体的溶解作用及接下来的再折叠(Schein，C.H.andNoteborn，H.M.，Biotechnology，6：291-294，1988；Wilkinson，D.L.and Hamson，R.G.，Biotechnology，9：443-448，1991)，且大肠杆菌无法进行转译后修饰作用，如糖基化作用。而CHO表达系统除由于前述原因外，其表达量太低、不能满足临床需要也严重制约了其应用。

酵母是一类种类繁多的生物资源，已知有80个属约600多种，数千个分离株，具备安全无毒，不致病；遗传背景较为清楚，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入；培养条件简单，容易进行高密度发酵；良好的蛋白分泌能力；类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能等作为基因表达系统宿主条件。酵母表达系统通常可克服利用细菌系统时所遇到的某些问题，表大量较高，且有能力进行各种转译后处理修饰作用。所表达的外来蛋白质可分泌至培养物上清液中，其中并无其他许多蛋白质存留，而使得蛋白质的纯化作用及过程的扩大更为容易。甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三种，其中Pichia Pastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛(李黄金等.《生物工程学报》，1998，14(4)：337)。自从1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为宿主表达外源蛋白以来，作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越引起人们的重视，到1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与以往的基因表达系统相比，它具有无可匹敌的高表达特性，已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。这是由于与其它表达系统相比，巴斯德毕赤酵母表达系统具有以下特点和优势：

1)含有特有的强有力的AOX(醇氧化酶基因)启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；

2)表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化；

3)发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升；

4)培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；

5)外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；

6)作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

蛋白质的糖基化链参与细胞识别、激素受体结合、蛋白质定位及宿主-微生物间相互作用，糖基化具组织和细胞特异性。蛋白糖链的剪切在高尔基体中进行。酿酒酵母缺乏甘露糖酶，对表达的外源蛋白不进行剪切，相反还会加上高达75个之多的甘露糖残基，并含有许多侧链，这就产生了过糖基化作用。过分糖基化作用阻遏蛋白与抗体的反应活性，而且，出现在外链的大量α-1，3-甘露糖使蛋白呈免疫原性，因而该表达糖蛋白不能用于治疗。巴斯德毕赤酵母中修饰糖链的平均长度为8-14个甘露糖，而酿酒酵母多达50-150个甘露糖，使得它表达的外源蛋白分子量大，且变异范围广。而巴斯德毕赤酵母的外链不含α-1，3-甘露糖，避免了免疫原性的问题。

巴斯德毕赤酵母属于甲醇营养型酵母，其重要特征是能利用甲醇作为唯一的碳源和能源来源，甲醇可诱导其表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶(AlcoholOxidase AOX)、二羟丙酮合成酶(Dihydroxy-acetone synthase DHAS)和过氧化氢酶(catalase)，表达的AOX可达细胞蛋白的30％，而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源时，AOX几乎不表达，进一步研究表达，AOX的表达是在转录水平调控的，其基因启动子具有明显的调控功能，可用于外源基因的表达。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。

已经在毕赤酵母染色体鉴定了二个AOX基因(AOX1和AOX2)，两者编码的蛋白有97％的同源性和几乎相同的特异催化活性，但AOX1基因启动子受甲醇强烈诱导，而AOX2启动子则很弱，使得AOX1比AOX2表达量高得多。

巴斯德毕赤酵母演常见的表达载体有pPIC3、pPIC9、pPSC3k、pHIL-D1、pAO815等，表达载体结构一般为：AOX1基因的5`AOX1启动子、3`AOX1终止序列，3`AOX1序列，多克隆位点、组氨酸脱氢酶筛选标志基因(His4)，大肠杆菌pBR322质粒片断，外源目的基因一般插入5`AOX启动子和转录终止信号之间的单克隆位点。

表达载体一般有两种方式整合到毕赤酵母染色体上，一种是在His4或5`AOX1启动子DNA片段的单酶切位点将质粒载体切成线性，通过单交换整合到染色体上，这样整合的菌株表型为Mut+，毕赤酵母染色体上AOX1基因保持完整；另一种是双位点互换，含5`AOX1启动子、外源基因和转录终止区的表达单元置换染色体上的有完整功能的AOX1基因，产生的菌株表型为Mut-，由于AOX1基因被置换，只能靠弱转录的AOX2基因，因此该菌利用甲醇速度慢，但这两个表达菌的表达水平均较高。

目前已有多种蛋白质的基因在该表达系统中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等。尽管各种外源蛋白质产生的水平不一，但各种蛋白质在甲醇酵母中的产生水平均为在细菌、昆虫或哺乳动物等表达系统中产量的10～100倍(戴秀玉.《微生物学报》，1997，37(6)：483--485)。如表皮生长因子(EGF)在酿酒酵母中的产量为7.4mg/L，而在甲醇酵母中为450mg/L，提高了60倍(彭毅等.《生物技术通报》，2000，(1)：38)。椐报道，外源蛋白质在甲醇酵母中的产量最高可达12g/L(Clare JJ et al.Bio/Technology，1991，9：455--460)。

表达载体  首先，甲醇酵母中没有稳定的质粒，所以其表达载体采用整合型质粒。利用醇氧化酶(甲醇代谢的关键酶)基因-1(AOX1)的启动子(P_AOX1)和转录终止子(3`AOX1)构建成整合型表达载体。P_AOX1是一个极强的启动子，醇氧化酶的产量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30％，所以能使外源蛋白质在它的控制下高效产生。其次，在载体中加入酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列(α因子)构建分泌型载体，一方面可以减轻宿主细胞的代谢负荷，另一方面可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均为此类载体。此外，使多拷贝目的基因整合入甲醇酵母染色体，形成多个表达单元，产生高产的菌株，此类载体有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。

受体菌  在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，诱导基因表达，使外源蛋白质的产量更高。甲醇酵母适合高密度连续培养的条件，细胞干重达100g/L以上，蛋白质产量极高(柴清等.《(生命的化学》，1997，17(4)：36)。受体菌采用蛋白水解酶缺陷型，从而大大降低产物的降解。常用的甲醇酵母受体菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。

经过近几年的发展完善，甲醇酵母表达系统已日趋成熟，应用也日趋广泛。国内已有多篇在甲醇酵母中生产外源蛋白质成功的报道。美国Invitrogen公司也已开发出多种新型的甲醇酵母表达系统试剂盒，如Multi-copy PichiaExpression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia ExpressionSystem等，利用甲醇酵母表达系统克隆一个外源基因已十分方便。相信随着对甲醇酵母研究的进一步深入，它在生产外源蛋白质方面将日益展示出诱人的前景。

发明详述：

本发明的目的在于提供一个高级的酵母表达系统以生产具有生物活性的新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素，该产品可作为一种生物制品药物应用于人类“TNF介导的疾病”的治疗。

IgG类免疫球蛋白当用于形成重组免疫粘附素嵌合体时，发现IgG可增加许多配体结合蛋白质(受体)的半衰期。然而，此种嵌合体有一个问题，即在活性部份肽与Fc部分肽融合处会生成新的肽序列，其对于人体是一种新抗原，具免疫原性。

本发明采用T细胞免疫学上惰性的连接肽来连接活性肽与Fc，如图4所示的连接序列Sequence No.：4-12，如GlyGlySerGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。这些连接肽本身是免疫学上无活性的，在融合点处将这些连接肽插入，可将由于二个肽部分连接所产生的新抗原性消除。连接肽也可增加这些部分的挠性，且可保留生物活性。相对较长的连接肽有助于克服由嵌合体Fc部分带来的可能的立体位阻，后者可干扰嵌合体的活性。

嵌合体有较天然sTNFR长得多的半衰期。由于接头，也可设计以将产生新的免疫原性表位(新抗原)的可能性减低，此点是sTNFR及免疫球蛋白Fc片段的融合点。细胞因子通常是有相当短半衰期的小蛋白质，其可在各种组织中，包括不希望位置，快速消失。本发明所述的特异嵌合体也可充作设计及构建其他细胞因子一Fc嵌合体的模型。可使用相同或类似的接头以减少产生新的免疫原性表位的可能性，同时保留生物活性。

本发明的特征在于在TNF可溶性受体与免疫球蛋白Fc之间引入了独特的连接肽。经特殊设计的连接肽可增加二部分的挠性，且因此维持其生物活性。虽然TNF可溶性受体及免疫球蛋白均源自人体，但在二分子融合点处始终有产生新的免疫原性表位的可能性。因此，本发明连接肽(其主要由T细胞惰性序列所组成)的其他优点在于可在融合点减低免疫原性。若没有连接肽存在，则TNF可溶性受体与免疫球蛋白Fc连接后所组成的新序列对人体而言将是一个新抗原。

本发明的特征还在于使用巴斯德毕赤酵母表达系统表达生产，既可克服大肠杆菌表达系统和CHO表达系统的一些缺陷，又可综合这两个表达系统的一些优势。

具体地说，本发明的新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素融合蛋白及其多聚体为下式所代表的物质：

                     (Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n

其中：

Xa和Xb可以相同也可以不同；

m和n分别独立地为0或1，至少有一个为1.

其中Xa和Xb为肿瘤坏死因子可溶性受体sTNFRI(图1，Sequence No.1)、肿瘤坏死因子结合蛋白TNF-BPI或其多肽，和/或sTNFR II(图2，Sequence No.2)、肿瘤坏死因子结合蛋白TNF-BPII或其多肽；其中Fc为免疫球蛋白IgG的Fc区，优选为免疫球蛋白IgG1的Fc区(图3，Sequence No.3)；其中L为零或免疫学上无活性的接头肽，选自图4所示的序列(Sequence No.4-12)，优选为序列11(SequenceNo.11)。

本发明提供了一种用酵母表达系统生产具有生物活性的新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素融合蛋白及其多聚体的方法，所述方法包括：

(a)在酵母表达载体中插入含有免疫学上无活性的接头肽序列的编码新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素融合蛋白或多肽的聚核苷酸序列，其中载体含有多个克隆位点；

和

(b)利用步骤(a)的载体转化适当的酵母菌株，并且在适当的条件下培养酵母菌株生成新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素融合蛋白或多肽。

及

(c)用适当的纯化方法处理步骤(b)的上清，提纯新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素蛋白。优选用PBS平衡的蛋白质A琼脂糖柱纯化，结合于蛋白质A琼脂糖柱上的重组人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素蛋白质以柠檬酸盐溶液洗脱。

上述的方法中表达载体包括整合型质粒pPIC9K、pPIC3.5、pPIC9、pPICZαA、pMETαA、B、C等载体，优选为pPICZαA。其中酵母菌株是巴斯德毕赤氏(Pichiapastoris)酵母，包括GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等，优选为GS115。

应用本发明的新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素融合蛋白及其多聚体或其组合，采用医药上可接受的载体，用于治疗“TNF介导的疾病”，这类炎症性疾病包括但不限于：炎症性肠炎(inflammatory bowel disease，IBD)包溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克隆氏病(Crohn′s disease，CD)；关节的炎症性疾病，包括骨关节炎、牛皮癣性关节炎和类风湿性关节炎；分泌性中耳炎；急性胰腺炎；病毒性心肌炎；牛皮癣；脓毒症和脓毒性休克；肝硬化；子宫内膜异位；多发性硬化；肌病(例如肌蛋白代谢，尤其是脓毒症中)；急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；全身炎症反应综合征(SIRS)；缺血性损伤，包括小脑缺血(例如由创伤引起的脑损伤、癫痫、出血或中风，每种都可能导致神经变性)；充血性心力衰竭；再灌注损伤；移植排斥反应；或由劳累、扭伤、软骨损伤、创伤、整形外科、感染或其他疾病产生的炎症反应。尤其适合治疗“TNF介导的疾病”中的自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、多发性硬化、牛皮癣、移植排斥反应、全身炎症反应综合征等炎症性疾病。

本发明的目的是通过以下措施来达到的：

1、克隆编码人肿瘤坏死因子可溶性受体I和II(sTNF RI和sTNF RII)的基因

本发明的人肿瘤坏死因子可溶性受体I和II(sTNFRI和sTNFRII)的编码序列是用PCR法从人心肌细胞cDNA文库中克隆得到的。人肿瘤坏死因子受体I基因全长4016碱基对；蛋白编码序列为第316至3451核苷酸片断，全长3136碱基对；可溶性受体sTNFRI的序列为第524至2063核苷酸片断(Genomics 1992，13(1)，219-224)，全长1540碱基对，其DNA序列及其编码的氨基酸序列见序列1(SequenceNo.1)。人肿瘤坏死因子受体II基因全长4323碱基对；蛋白编码序列为90至2115核苷酸片断，全长2026碱基对；可溶性受体sTNF RII的序列为第156至1178核苷酸片断(Genomics 1996，35(1)，94-100)，全长1023碱基对，其DNA序列及其编码的氨基酸序列见序列2(Sequence No.2)。

2、克隆编码人免疫球蛋白IgG1Fc的基因

本发明的人免疫球蛋白IgG1Fc基因的编码序列是用PCR法从人心肌细胞cDNA文库中克隆得到的。得到的全长696碱基对的基因片断包括了全部IgG1Fc区(第28至696核苷酸片断)和部分铰链区(第1至27核苷酸片断)的编码序列(Sequence No.3A)。中国人的IgG1Fc基因是将上述克隆到的IgG1Fc的基因的535位碱基T点突变为C，这样由密码子TCC编码的丝氨酸(Ser)就突变为密码子CCC编码的脯氨酸(Pro)(Sequence No.3B)(王海涛：国家八六三计划项目验收自评估报告《人源抗-HBs全基因克隆及其表达研究》http：//www.886688.com/863jt.htm)。

3、构建含有人肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素基因的酵母表达质粒。

按常规分子克隆方法，将PCR扩增的人肿瘤坏死因子可溶性受体编码基因片断和人免疫球蛋白IgG1Fc基因片断用连接酶按设计要求经连接肽基因连接。再经一定的酶切之后，插入酵母表达载体pPICZαA(购自INVITROGEN)，使其与α-因子信号短肽表达成融合蛋白，所得表达质粒称为pPICZαA/(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n，其构建过程见图5。

4、用pPICZαA/(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n表达质粒转化毕赤酵母GS115并筛选高效表达株CS115/pPICZαA/(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n。

5、高效表达株CS115/pPICZαA/(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n的培养与甲醇诱导表达。

将单菌落接种于BMGH培养液，加℃振摇培养过夜。次日转接种于较大体积的同种培养液，30℃继续培养至O.D600＝16-20。离心收集细胞，将细胞悬浮于BMMH诱导培养液，30℃，振荡培养，每小时加入甲醇，使其最终浓度为1％。4天后离心收集上清。

6、人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素的纯化

上述收集的上清经超滤浓缩至一定体积后，使其通过用PBS平衡的蛋白质A琼脂糖柱，结合于蛋白质A琼脂糖柱上的重组人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素蛋白质以柠檬酸盐溶液洗脱。用SDS-PAGE检测其分子量大小及相对纯度，冻干，-70℃保存。

7、用鼠L929细胞检测本发明所生产的重组人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素对hTNF的中和活性作用，测活方法按徐春晓等的文献(中华微生物学和免疫学杂志，2000，20(3)：132)方法进行，MMT显色，测量A570。

附图简述：

图1是编码人TNFRI的DNA序列及氨基酸序列

图2是编码人TNFRII的DNA序列及氨基酸序列

图3A是人FcDNA序列及氨基酸序列

图3B是中国人FcDNA序列及氨基酸序列

图4是连接肽序列。

图5是巴斯德毕赤氏酵母表达载体的图解说明。

图6是利用本发明的巴斯德毕赤氏酵母表达载体系统克隆人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素方案的图解说明。

图7是本发明的巴斯德毕赤氏酵母表达载体pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc的图解说明。

图8是本发明表达纯化的人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素的聚丙烯酰胺电泳图。

图9是本发明生产的重组人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素对人肿瘤坏死因子的抑制作用。

以下通过实施例对本发明作进一步说明：

实施例一编码人肿瘤坏死因子可溶性受体sTNF RII基因的克隆

根据已知的人肿瘤坏死因子可溶性受体sTNFRII的cDNA序列，设计并合成下列上下游引物，其序列如下：

N1：5'-GAA TTC CAT ATG CTG CCG GCG CAG GTG GCA TTT AC-3’

C1：5’-AC GGA TCC ACC GCC ACC GGG TAA GTG TAC TG-3，

上游引物N1中引入EcoR 1酶切位点，下游引物C1中分别引入BamHI酶切位点和氨基酸序列GlyGlyGlyGlySer的接头。PCR扩增出sTNFRII，同时去掉信号肽，并在其羧基端引入短肽。PCR扩增反应体系为：1μl人心肌细胞cDNA文库，10×PCR缓冲液5μl，10mmol/LdNTP1μl，50μmol/L上、下游引物各1μl，加水至50μl。经95℃预变性5min后，加入pfuDNA聚合酶2U。PCR循环为：94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 60s，共30个循环，最后72℃延伸10min。按标准操作程序纯化PCR产物。所得纯化PCR产物用EcoR1和BamHI双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳纯化后得到的基因1038bp基因片段。

实施例二  编码人免疫球蛋白IgG1Fc基因的克隆

根据已知的人免疫球蛋白IgG1Fc的cDNA序列，设计并合成下列上下游引物，其序列如下：

N2：5’-TA GGA TCC GGA GGT GGA GGT AGC GTT GAG CCC AAA TCT-3’

C2：5’-AT CTC GAG TTA CTA CTG CGT GTA GTG GTTG-3’

上游引物N2中分别引入BamHI酶切位点和氨基酸序列GlySerGlyGlyGlyGlySer的接头，下游引物C2中引入XholI酶切位点。PCR扩增出IgG1Fc，并在其氨基端引入短肽GlySerGlyGlyGly GlySer，羧基端引入翻译中止信号TAGTAA。PCR扩增反应体系为：1μl人心肌细胞cDNA文库，10×PCR缓冲液5μl，10mmol/LdNTP1μl，50μmol/L上、下游引物各1μl，加水至50μl。经95℃预变性5min后，加入pfuDNA聚合酶2U。PCR循环为：94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 90s，共30个循环，最后72℃延伸10min。按标准操作程序纯化PCR产物。所得纯化PCR产物用BamHI和XholI双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳纯化后得到的基因711bp基因片段。

实施例三人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素酵母表达载体的构建

将克隆得到的两个基因片段用T4连接酶连接后得到人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素基因sTNFRII-IgG1Fc。用EcoR1和Not1双酶切酵母表达载体pPICZαA质粒，将sTNFRII-IgG1Fc基因克隆入这两种内切酶位点中，转化大肠杆菌DH5α，筛选具有Zeocin耐药性的转化株，从这些耐药株中提取质粒，用酶切和测序分析筛选得到含有人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素基因正确序列并与α-因子在同一阅读框内的质粒pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc。

实施例四高效表达人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素的巴斯德毕赤酵母表达菌株的构建与筛选

用限制性核酸内切酶SaC1切开环形表达质粒pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc使之线型化。将线型化了的pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc表达质粒转化毕赤酵母株GS115，经同源重组得到表达人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素的巴斯德毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc。筛选具有Zeoein耐药性的转化体。将所有的耐Zeoein转化体分别接种于少量培养液并用甲醇诱导表达(具体方法详见实施例五)。离心收集上清，用SDS-PAGE电泳检测上清中所表达的人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素的量，从中筛选高表达株。

实施例五高效表达人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素的巴斯德毕赤酵母表达菌株的培养与甲醇诱导

将单个新鲜的毕赤酵母工程菌GS115/pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc接种于BMMH培养液，36℃，继续培养至O.D.₆₀₀ 16-20。离心收集细胞，将细胞悬浮于1/5原体体积的BMMH诱导液中，30～C，振荡培养，每24小时加入甲醇使甲醇最终浓度为1％，四天后离心收集上清。取少量上清用15％SDS-PAGE电泳分析。如图8中的“粗品”即未经纯化的上清中有明显的分子量为60KDa左右的蛋白带，此为酵母表达后分泌至上清中的人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素。

实施例六  重组人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素的纯化

将离心收集的上清经centracon plus 80(Millpore)超滤浓缩至一定体积后，使其通过用PBS平衡的蛋白质A琼脂糖柱，结合于蛋白质A琼脂糖柱上的重组人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素蛋白质以柠檬酸盐溶液洗脱。先后用含10mM、20mM和50mM的柠檬酸盐溶液(pH3.0)洗脱，分别收集洗脱样品，从各收集管中取出少许样品进行电泳分析，结果见图7。绝大部分重组人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素可被50mM的柠檬酸盐溶液(pH3.0)洗脱。由此法所得到的重组人血管内皮细胞抑制素在SDS-PAGE上呈单一的分子量为60kd的蛋白带(图8)。将从蛋白质A琼脂糖柱上所收集的含人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素的蛋白溶液经PBS透析脱盐后，冻干，干燥，-70℃保存，此为纯化的重组人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素。

实施例七  重组人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素活性检测

重组人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素的活性表现为对TNF-α生物学活性的中和活性，TNF-α的活性测定采用最常应用的结晶紫染色法(FlickDA，Gifford GE.Comparison ofin vitro cell cytotoxic assay for tumor necrosisfactor.J Immunol Methods，1984，68：167-175)，以鼠L929细胞株为测定细胞。常规制备96孔L929细胞单层，37℃5％二氧化碳培养8小时。纯化后的重组人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素用PBS稀释，与0.2ng的人TNF-α37℃保温2小时，用含放线菌素D的1640培养基二倍序列稀释，每孔0.1ml，继续培养20小时，MTT法测定每孔的光吸收值，计数得到的一组杀伤率与对应的稀释倍数的对数值作图，得出残存TNF的活性，从而反映出本发明产品的生物活性(图9)。从图9所示结果可以看出，大肠杆菌表达的肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素的活性较单纯的可溶性受体高约一个数量级，本发明巴斯德毕赤酵母表达的肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素的活性较大肠杆菌表达的高约一个数量级，CHO系统表达的肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素的活性较本发明巴斯德毕赤酵母表达的高约2～3倍。

Claims (11)

1.下式物质所代表的新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素融合蛋白及其多聚体：

                    (Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n

其中m和n分别独立地为0或1，至少有一个为1；

其中Xa和Xb可以相同也可以不同，Xa和Xb为肿瘤坏死因子可溶性受体sTNFRI、肿瘤坏死因子结合蛋白TNF-BPI或其多肽，和/或sTNFRII、肿瘤坏死因子结合蛋白TNF-BPII或其多肽；

其中Fc为免疫球蛋白IgG的Fc区；

其中L为免疫学上无活性的接头肽，选自的序列4-12(Sequence No.4-12)。

2.编码权利要求1中任一物质的核酸序列。

3.编码权利要求1中任一物质的氨基酸序列

4.一种生产具有生物活性的权利要求1中的新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素融合蛋白及其多聚体的方法，其特征在于采用酵母表达系统，所述方法包括以下步骤：

(a)在酵母表达载体中插入含有免疫学上无活性的接头肽序列的编码新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素融合蛋白或多肽的核苷酸序列，其中载体含有多个克隆位点；

和

(b)利用步骤(a)的载体转化适当的酵母菌株，并且在适当的条件下培养酵母菌株生成新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素融合蛋白或多肽。

及

(c)用适当的纯化方法处理步骤(b)的上清，提纯新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素蛋白。

5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(c)纯化方法为用PBS平衡的蛋白质A琼脂糖柱纯化，结合于蛋白质A琼脂糖柱上的重组人新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素蛋白质以柠檬酸盐溶液洗脱。

6.根据权利要求4所述的方法，其中表达载体包括质粒pPIC9K，pPIC3.5，pPIC9，pPICZαA，pMETαA、B、C等。

7.权利要求6所述表达载体为pPICZαA。

8.根据权利要求4所述的方法，其中酵母菌株是巴斯德毕赤氏(Pichiapastoris)酵母，包括GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。

9.权利要求8所述的巴斯德毕赤氏(Pichia pastoris)酵母为GS115。

10.根据权利要求1或权利要求4--9中所述的方法生产的新型肿瘤坏死因子可溶性受体免疫粘附素融合蛋白及其多聚体与药学上可接受的载体构成的组合物，用于制备治疗TNF介导的疾病的药物。

11.根据权利要求10中所述的组合物，用于制备治疗“TNF介导的疾病”中的自身免疫性疾病的药物，包括类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、多发性硬化、牛皮癣、移植排斥反应、全身炎症反应综合征等炎症性疾病。

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