KR20190018724A - 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법 - Google Patents
피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법을 제공한다. 상기 발효 공법은 파스퇴르 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 균종으로 사용하여, 먼저 1차 종자 배양을 진행하고, 균농도가 20 ± 2 g/L 일 때, 2차 종자 배양으로 전환하고, 균농도가 120 ± 10 g/L일 때, 2차 종자 배양을 글리세린 배양 단계로 전환하며, 글리세린 배양 단계에서 글리세린의 첨가량은 60 내지 70 g/L이고, 용존 산소가 급격히 상승하여 상대적으로 안정적인 상태에 도달할 때, 메탄올 유도 단계에 진입하고, 120 ± 8 h 동안 유도한 후 발효를 종료한다.
Description
본 발명은 발효 공법 기술 분야에 관한 것으로, 구체적으로 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 재조합 단백질의 발효 공법에 관한 것이다.
파스퇴르 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 시스템은 1980 년대 초에 개발된 신형의 이종단백질 발현 시스템으로서, 원핵 발현 시스템의 조작하기 쉬우며, 배양하기 쉽고, 성장 속도가 빠르며, 발현량이 높고, 원가가 낮은 등 이점을 갖고 있을 뿐만 아니라, 원핵 생물 발현 시스템이 구비하지 않는 이종단백질에 대한 글리코실화, 단백질 인산화 등과 같은 변형 특징도 갖고 있다. 파스퇴르 피치아 파스토리스 발현 시스템은 하기와 같은 이점을 갖고 있다. (1) 알코올 산화 효소(aox1) 유전자 프로모터는 현재 가장 강하고 조절 메커니즘이 가장 엄격한 프로모터 중 하나이다. (2) 발현 효율이 높고, 이에 의해 발현된 이종단백질은 전체 발현 단백질의 90 % 이상을 차지할 수 있어 타겟 단백질의 분리 정제에 유리하다. (3) 간단한 합성 배지에서 고밀도 배양을 실현할 수 있다. (4) 발현 플라스미드는 게놈의 특정 사이트에서 단일 카피 또는 다중 카피 형태로 안정하게 정합(整合)될 수 있다. (5) 해당 효모는 메탄올을 유일한 탄소원으로 할 수 있으며, 배지 성분은 기타 유기 물질을 첨가할 필요가 없어 오염을 감소시킨다.
현재, 흔히 사용되는 발현 벡터와 발효 공법은 대부분 미국 인비트로젠(Invitrogen) 회사에서 구축하여 개발된 것으로서, 상기 시스템은 이미 수백 종의 이종단백질을 성공적으로 발현시켰다. 인비트로젠 회사에서 개발된 파스퇴르 피치아 파스토리스 발효 공법은 그 산업화에 의해 1차 및 2차 종자 배양, 글리세린(Glycerin) 배양 단계, 글리세린 유가(fed-batch) 단계 및 메탄올 유도 단계로 나뉠 수 있다. 상기 공법은 현재 파스퇴르 피치아 파스토리스 발현에 의한 이종단백질 생산에서 보편적으로 사용되는 발효 공법(중국 특허 201010602114.5, 201110327865.5)이다. 글리세린 배양 및 글리세린 유가 단계는 균체가 신속하게 성장하고 증식하여 고밀도 발효의 최적 균체 농도 범위에 도달하도록 하는 것을 목적으로 하며, 상기 단계는 산업화 생산에서 매우 중요한 것으로, 실시간 모니터링이 필요하며, 조작이 복잡하고 통제하기 어려우며, 상기 범위보다 높거나 낮으면 원가를 증가시키고 단백질 생산량을 감소시키는 좋지 않은 결과를 초래한다.
실제 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 산업화 생산에서, 주요 작업자는 일반 노동자를 위주로 하는데, 너무 복잡한 조작은 비교적 높은 오류율을 초래하기 쉬움으로써, 기술적 실수가 발생하게 되어 발효 공법의 최종 실패를 초래한다. 따라서, 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법을 간소화하는 것, 특히 기존의 발효 공법 중 복잡한 글리세린 배양 및 글리세린 유가 단계의 공법을 간소화하는 것은, 생산 원가를 감소시킬 뿐만 아니라, 오류 발생 확률도 감소시키고, 기술적 실수로 인한 발효 실패를 감소시킬 수 있어, 재조합 단백질의 산업화 생산에 편의 및 매우 큰 경제적 가치를 가져다 줄 수 있다.
본 발명은 기존의 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법을 간소화하는 것을 목적으로 하며, 공법이 간단하고, 조작이 편의하며, 재조합 단백질의 수율 및 순도가 높고, 산업화 대규모 생산에 적합한 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법을 제공한다.
본 발명의 기술적 해결 수단은 하기와 같다.
피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법은 파스퇴르 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 균종으로 사용하여, 먼저 1차 종자 배양을 진행하고, 균농도가 20 ± 2 g/L 일 때, 2차 종자 배양으로 전환하고, 균농도가 120 ± 10 g/L일 때, 2차 종자 배양을 글리세린 배양 단계로 전환하며, 글리세린 배양 단계에서 글리세린의 첨가량은 60 ~ 70 g/L이고, 용존 산소가 급격히 상승하여 상대적으로 안정적인 상태에 도달할 때, 메탄올 유도 단계에 진입하고, 120 ± 8 h 동안 유도한 후 발효를 종료하는 것이다.
본 발명에 따른 파스퇴르 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 2011년 6월 29일에 중국 미생물 균종 기탁 관리위원회 일반 미생물 센터에 기탁되었으며, 기탁 번호는 CGMCC 제5021호이고, 중국 특허 201110327865.5에서 충분하게 공개되었다.
본 발명에 따른 1차 종자 배양은 기존의 일반 방법을 사용하였으며, 구체적으로, 균종 파스퇴르 피치아 파스토리스를 종자 배지에 접종하여, 30 ℃에서 균체 습중량이 20 ± 2 g/L에 도달할 때까지 24 h ~ 36 h 동안 진탕 배양(shaked culture)하는 것이다.
본 발명에 따른 2차 종자 배양은 기존의 일반 방법을 사용하였으며, 구체적으로, 1차 종자액을 모두 발효 배지에 옮긴 후, 30 ℃에서 배양하며, 암모니아수로 pH 값을 5.0으로 조절 및 제어하고, 용존 산소는 20％ ~ 30％로 제어하며, 균체 습중량이 120 ± 10 g/L에 도달할 때까지 배양하는 것이다.
본 발명에 따른 글리세린 배양 단계의 구체적인 단계는, 2차 종자액을 발효 배지에 옮긴 후, 60 ~ 70 g/L의 글리세린을 첨가하여, 30 ℃에서 배양하며, 암모니아수로 pH값을 5.0으로 조절 및 제어하고, 통기량은 30 m3/h이며, 교반 속도는 300 ~ 500 rpm이고, 용존 산소가 급격이 상승할 때, 1 h 동안 기아 상태로 하여 글리세린을 소진시키는 것이다.
본 발명에 따른 메탄올 유도 단계는 기존의 일반 방법을 사용하였으며, 구체적으로, 유도 단계 온도를 30 ℃, pH 값을 5.0으로 제어하고, 메탄올 보충재료와 용존 산소의 연동을 설정하며, 용존 산소가 20 %보다 높을 때, 메탄올 유가를 시작하고, 용존 산소가 20 %보다 낮을 때, 메탄올 유가를 정지시키며, 120 ± 8 h 동안 유도 후, 발효를 종료하여, 발효액을 원심 분리하고, 원심 분리 후의 상청액을 수집하여 농축, 한외 여과 및 나노 여과 탈색 탈염을 차례로 진행함으로써 재조합 인간 콜라겐을 얻는 것이다.
선행기술에 비해, 본 발명은 하기와 같은 이점을 구비한다.
(1) 본 발명의 피치아 파스토리스 발효 공법은 유가용 무균 글리세린을 준비할 필요가 없으며, 글리세린 멸균 탱크를 간소화하여 에너지, 자원 소모 및 글리세린 낭비를 감소시킨다.
(2) 본 발명에서 글리세린이 소모된 후 바로 다음 공법 과정에 진입하여, 피치아 파스토리스 발효 공법이 복잡하고 단백질 생산량이 불안정한 문제를 효과적으로 해결하는 동시에 글리세린 배양 단계 시간을 단축시킨다.
(3) 본 발명의 피치아 파스토리스 발효 공법은 실행하기 쉽고 편리하고, 균체 농도를 모니터링할 필요가 없으며, 오류 발생 확률을 감소시킴으로써, 생산 인원이 쉽게 실시할 수 있어 대규모 산업화 생산에 더 적합하다.
기존의 공법에 비해, 본 발명의 공법은 간단하고, 타겟 단백질의 수율이 상당하며, 회수율은 약 70 %까지 향상하고, 순도는 95 % 이상에 도달함으로써, 재조합 인간 콜라겐의 산업화 대규모 생산에 더 적합하다.
도 1은 비교예 1(a) 및 실시예 2(b)에서 얻은 발효액이 분리 정제를 거친 후의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 검출도이다.
본 발명의 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법은 1차 종자 배양, 2차 종자 배양, 글리세린 배양 단계, 및 메탄올 유가 단계인 4개의 단계를 포함한다.
기존의 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법은 1차 종자 배양, 2차 종자 배양, 글리세린 배양 단계, 글리세린 유가 단계, 및 메탄올 유가 단계인 5개의 단계를 포함한다.
특별히 설명되지 않은 한, 본 발명의 실시예와 비교예에서 사용된 균종 및 각 배지는 기본적으로 하기와 같다.
1. 균종: 파스퇴르 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 기탁 번호: CGMCC 제5021호, 2011년 6월 29일에 중국 미생물 균종 기탁 관리위원회 일반 미생물 센터에 기탁되었으며, 중국 특허 201110327865.5에서 충분하게 공개되었다.
2. 배지:
(1) 1차 종자 배지는 BMGY 배지이며, 아래와 같이 구성된다.
효모 침출 분말: 10 g/L
트립톤(tryptone): 20 g/L
pH 6.0 인산칼륨 완충용액: 100 mmol/L
효모 기초 질소원: 13.4 g/L
바이오틴(biotin): 0.2 mg/L
글리세린: 10 g/L
(2) 2차 종자 배지는 아래와 같이 구성된다.
글리세린: 40 g/L
K2SO4
: 18.2 g/L
H3PO4
: 26.7 mL/L
CaSO4ㆍ2H2O: 0.93 g/L
MgSO4: 14.9 g/L
KOH: 4.13 g/L
PTM1: 4.35 mL/L
(3) 발효 배지는 아래와 같은 성분을 포함한다.
K2SO4
: 18.2 g/L
H3PO4
: 26.7 mL/L
CaSO4ㆍ2H2O: 0.93 g/L
MgSO4: 14.9 g/L
KOH: 4.13 g/L
PTM1: 4.35 mL/L
비교예에서 글리세린 농도는 40 g/L이며, 질량 농도가 50 %인 글리세린 수용액을 유가한다. 실시예에서 글리세린 농도는 55 ~ 75 g/L이며, 글리세린 단계가 종료된 후 메탄올 유가 단계로 진입하면 배지를 더 이상 교체하지 않는다.
여기서 PTM1은 아래와 같이 구성된다.
CuSO4ㆍ5H2O: 6.0 g/L
NaI: 0.08 g/L
MnSO4ㆍH2O: 3.0 g/L
Na2MoO4ㆍ2H2O: 0.2 g/L
H3BO3
: 0.02 g/L
CoCl2ㆍ6H2O: 0.5 g/L
ZnCl2
: 20.0 g/L
FeSO4ㆍ7H2O: 65.0 g/L
바이오틴: 0.2 g/L
농황산(H2SO4): 5.0 mL/L
실시예 1
피치아 파스토리스 발현 단백질의 발효 공법 단계는 아래와 같다.
(1) 1차 종자 배양
글리세린이 보존한 균종을 200 mL의 종자 배지를 함유한 진탕 플라스크에 접종하여, 30 ℃, 250 rpm의 조건에서 균체 습중량이 20 ± 2 g/L에 도달할 때까지 24 h ~ 36 h 동안 배양한다.
(2) 2차 종자 배양
1차 종자액을 60 L의 발효 배지를 함유한 100 L의 발효 탱크에 모두 옮긴 후, 30 ℃에서 배양하며, 암모니아수로 pH 값을 5.0으로 조절 및 제어하고, 용존 산소는 20 ％~ 30 ％로 제어하며, 균체 습중량이 120 ± 10 g/L에 도달할 때까지 배양한다.
(3) 발효 탱크 배양 및 유도 발현
2차 종자액을 60 L의 발효 배지를 함유한 1,000 L의 발효 탱크에 모두 옮긴 후, 60 g/L의 글리세린을 첨가하여, 30 ℃에서 배양하며, 암모니아수로 pH값을 5.0으로 조절 및 제어하고, 통기량은 30 m3/h이며, 교반 속도는 300 ~ 500 rpm이고, 용존 산소가 급격이 상승할 때, 1 h 동안 기아 상태로 하여 글리세린을 소진시킨다.
다음, 메탄올 유도를 시작하며, 유도 단계 온도를 30 ℃, pH 값을 5.0으로 제어하고, 메탄올 보충재료와 용존 산소의 연동을 설정하며, 용존 산소가 20 %보다 높을 때 메탄올 유가를 시작하고, 용존 산소가 20 %보다 낮을 때 메탄올 유가를 정지시키며, 112 h 동안 유도한 후 편평기(plateau phase)에 도달하고, 120 h 동안 유도한 후 탱크에서 추출되며, 유도 발현 후의 발효액을 원심 분리하고, 원심 분리 후의 상청액을 수집하여 농축, 한외 여과 및 나노 여과 탈색 탈염을 차례로 진행함으로써 재조합 인간 콜라겐을 얻는다.
실시예 2
본 실시예가 실시예 1과 상이한 점은 글리세린 첨가량이 65 g/L인 것이고, 다른 단계는 실시예 1과 동일하다.
실시예 3
본 실시예가 실시예 1과 상이한 점은 글리세린 첨가량이 70 g/L인 것이고, 다른 단계는 실시예 1과 동일하다.
비교예 1
본 비교예가 실시예 1과 상이한 점은 글리세린 첨가량이 55 g/L인 것이고, 다른 단계는 실시예 1과 동일하다.
비교예 2
본 비교예가 실시예 1과 상이한 점은 글리세린 첨가량이 75 g/L인 것이고, 다른 단계는 실시예 1과 동일하다.
비교예 3
(1) 1차 종자 배양
글리세린이 보존한 균종을 200 mL의 종자 배지를 함유한 진탕 플라스크에 접종하여, 30 ℃, 250 rpm의 조건에서 균체 습중량이 20 ± 2 g/L에 도달할 때까지 24 h ~ 36 h 동안 배양한다.
(2) 2차 종자 배양
1차 종자액을 60 L의 발효 배지를 함유한 100 L의 발효 탱크에 모두 옮긴 후, 30 ℃에서 배양하며, 암모니아수로 pH 값을 5.0으로 조절 및 제어하고, 용존 산소는 20 ％~ 30 ％로 제어하며, 균체 습중량이 120 ± 10 g/L에 도달할 때까지 배양한다.
(3) 발효 탱크 배양 및 유도 발현
2차 종자액을 60 L의 발효 배지를 함유한 1,000 L의 발효 탱크에 모두 옮긴 후, 40 g/L의 글리세린을 첨가하여, 30 ℃에서 배양하며, 암모니아수로 pH값을 5.0으로 조절 및 제어하고, 통기량은 30 m3/h이며, 교반 속도는 300 ~ 500 rpm이고, 용존 산소가 급격이 상승할 때, 글리세린을 보충 유가하기 시작하여, pH값을 5.0, 용존 산소를 20 % 이상으로 제어하고, 균체 농도가 160 ± 10 g/L에 도달할 때, 글리세린 유가를 정지시켜 1 h 동안 기아 상태로 하여 글리세린을 소진시킨다.
다음, 메탄올 유도를 시작하며, 유도 단계 온도를 30 ℃, pH 값을 5.0으로 제어하고, 메탄올 보충재료와 용존 산소의 연동을 설정하며, 용존 산소가 20 %보다 높을 때 메탄올 유가를 시작하고, 용존 산소가 20 %보다 낮을 때 메탄올 유가를 정지시키며, 112 h 동안 유도한 후 편평기에 도달하고, 120 h 동안 유도한 후 탱크에서 추출된다. 유도 발현 후의 발효액을 원심 분리하고, 원심 분리 후의 상청액을 수집하여 농축, 한외 여과 및 나노 여과 탈색 탈염을 차례로 진행함으로써 재조합 인간 콜라겐을 얻는다.
도 1은 비교예 1 및 실시예 2에서 얻은 발효액이 분리 정제를 거친 후의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 검출도이며, 도면에서 피크는 재조합 인간 콜라겐이고, 여기서 a는 비교예 1이고 b는 실시예 2이다. 도면으로부터 알 수 있듯이, 비교예 1의 발효액은 분리 정제를 거친 후, 단백질 순도가 91.7 %이고, 실시예 2의 발효액은 분리 정제를 거친 후, 단백질 순도가 96.4 %이므로, 본 발명의 발효 공법으로부터 얻은 재조합 인간 콜라겐의 순도는 비교예에 비해 우수하다.
각 실시예와 비교예에서의 발효 결과를 검출하고 메탄올 유가 전 균체 습중량, 콜라겐 생산량, 단백질 회수율과 단백질 순도를 각각 측정하였으며, 구체적인 검출 결과는 표 1과 같다.
| 메탄올 유가 전 균체 습중량 | 콜라겐 생산량 | 단백질 회수율 | 단백질 순도 | |
| 비교예 1 | 147.8 g/L | 14.51 g/L | 67.2 % | 91.7 % |
| 비교예 2 | 186.2 g/L | 15.43 g/L | 67.9 % | 93.4 % |
| 비교예 3 | 166.7 g/L | 16.82 g/L | 62.8 % | 92.1 % |
| 실시예 1 | 163.3 g/L | 16.93 g/L | 70.7 % | 95.3 % |
| 실시예 2 | 169.4 g/L | 17.02 g/L | 73.3 % | 96.4 % |
| 실시예 3 | 177.8 g/L | 16.87 g/L | 72.8 % | 95.9 % |
상기 표로부터 볼 수 있듯이, 본 발명의 발효 공법을 사용할 경우, 재조합 인간 콜라겐의 회수율은 70 % 이상에 도달하고 순도는 95 % 이상에 도달하여, 비교예에 비해 우수하다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 정제한 후의 콜라겐 농도와 순도를 측정하였는데, 단백질 발현량은 비교예와 비슷하고, 단백질 수율과 순도는 모두 비교예에 비해 높다. 종합해보면, 본 발명의 공법은 간단하고, 재조합 인간 콜라겐의 산업화 대규모 생산에 더 적합하다.
Claims (6)
- 파스퇴르 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 균종으로 사용하여, 먼저 1차 종자 배양을 진행하고, 균농도가 20 ± 2 g/L 일 때 2차 종자 배양으로 전환하고, 균농도가 120 ± 10 g/L일 때 2차 종자 배양을 글리세린 배양 단계로 전환하며, 글리세린 배양 단계에서 글리세린의 첨가량은 60 내지 70 g/L이고, 용존 산소가 급격히 상승하여 상대적으로 안정적인 상태에 도달할 때, 메탄올 유도 단계에 진입하고, 120 ± 8 h 동안 유도한 후 발효를 종료하는 것을 특징으로 하는, 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법.
- 제1항에 있어서,
상기 파스퇴르 피치아 파스토리스의 기탁 번호가 CGMCC 제5021호인 것을 특징으로 하는, 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법. - 제1 항에 있어서,
상기 1차 종자 배양은, 균종 파스퇴르 피치아 파스토리스를 종자 배지에 접종하여, 30 ℃에서 균체 습중량이 20 ± 2 g/L에 도달할 때까지 24 내지 36 h 동안 진탕 배양하는 것을 특징으로 하는 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법. - 제1 항에 있어서,
상기 2차 종자 배양은, 1차 종자액을 모두 발효 배지에 옮긴 후, 30 ℃에서 배양하며, 암모니아수로 pH 값을 5.0으로 조절 및 제어하고, 용존 산소는 20 내지 30 ％로 제어하며, 균체 습중량이 120 ± 10 g/L에 도달할 때까지 배양하는 것을 특징으로 하는, 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법. - 제1 항에 있어서,
상기 글리세린 배양 단계는, 2차 종자액을 발효 배지에 옮긴 후, 60 내지 70 g/L의 글리세린을 첨가하여, 30 ℃에서 배양하며, 암모니아수로 pH값을 5.0으로 조절 및 제어하고, 통기량은 30 m3/h이며, 교반 속도는 300 내지 500 rpm이고, 용존 산소가 급격이 상승할 때, 1 h 동안 기아 상태로 하여 글리세린을 소진시키는 것을 특징으로 하는, 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법. - 제1 항에 있어서,
상기 메탄올 유도 단계는, 유도 단계 온도를 30 ℃, pH 값을 5.0으로 제어하고, 메탄올 보충재료와 용존 산소의 연동을 설정하며, 용존 산소가 20 %보다 높을 때 메탄올 유가(fed-batch)를 시작하고, 용존 산소가 20 %보다 낮을 때 메탄올 유가를 정지시키며, 120 ± 8 h 동안 유도한 후, 발효를 종료하고, 발효액을 원심 분리하며, 원심 분리 후의 상청액을 수집하여 농축, 한외 여과 및 나노 여과 탈색 탈염을 차례로 진행함으로써 재조합 인간 콜라겐을 얻는 것을 특징으로 하는, 피치아 파스토리스 발현 재조합 단백질의 발효 공법.
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