CN103436508A - 一种高效重组表达透明质酸酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效重组表达透明质酸酶的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过在重组透明质酸酶基因N端添加一段编码组氨酸的核苷酸序列，不仅简化了透明质酸酶的纯化步骤，同时实现了重组透明质酸酶的高活性分泌表达，活性达到了21333.33U/mL。本发明所构建的重组毕赤酵母工程菌株，具有非常大的应用前景。本发明所提出的提高透明质酸酶高效表达制备的方法，进一步降低了透明质酸酶的生产成本，为工业化生产奠定了基础。

Description

一种高效重组表达透明质酸酶的方法
技术领域
本发明涉及一种高效重组表达透明质酸酶的方法，具体地是在透明质酸酶基因N端添加一段寡聚核苷酸序列以显著提高透明质酸酶表达产量，属于基因工程技术领域。
背景技术
透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)主要专一性水解透明质酸，广泛存在于真核和原核生物中，在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复，以及正常细胞和肿瘤细胞增生，是一种重要的生理活性物质。且于1928年被Duran Reynals首次发现并称为“扩散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名为透明质酸酶。根据透明质酸酶作用的底物特异性和催化机制，水蛭透明质酸酶属于透明质酸3-糖基水解酶家族(EC3.2.1.36)，通过水解HA的β-1、3-糖苷键，生产以四糖分子HA且还原端带有葡萄糖醛酸为主的产物。水蛭来源的透明质酸酶对底物的专一性强，与其它来源的透明质酸酶相比，它对硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素不具有活性，并且不具有转糖苷活性，活性不受肝素影响。因此，水蛭透明质酸酶用于临床药用更具医疗价值意义。1941年Hirst首次证实水蛭透明质酸酶强有力的抗菌性。相关研究实验已经证实透明质酸酶对治疗心肌梗塞效果显著。透明质酸酶在抗肿瘤方面也具有重要的作用，恶性组织经透明质酸酶处理后粘多糖含量增加，有利于肿瘤细胞结合更多的抗癌药物。此外，透明质酸酶在临床上作为“药物扩散因子”、治疗血栓、青光眼和其它药用方面具有更大的应用价值。
目前，水蛭来源的透明质酸酶基因尚未有相关报道。当前水蛭来源的透明质酸酶是以活体水蛭组织提取为主获得，且每个水蛭提取所获得透明质酸酶仅约为230U。本发明采用毕赤酵母重组生产透明质酸酶具有无法比拟的优势，突破了水蛭原料来源的限制和提取分离步骤的繁琐等因素的限制，能够推动透明质酸酶在医疗和科研上的广泛应用。
外源蛋白在宿主中的活性表达与产量是构建工程菌最重要的两个指标，本发明在已获得水蛭透明质酸酶在毕赤酵母中活性分泌表达的基础上，通过人为在N端添加一段寡聚核苷酸序列，显著提高了透明质酸酶的表达产量。在N端添加的一段序列，对于mRNA的转录、稳定性和后翻译修饰，以及信号肽的后加工成熟分泌都有重要影响。而这些因素也显著影响着外源蛋白在宿主菌中的正确折叠、后加工修饰和顺利分泌。
鉴于此，本发明中构建的新型重组工程菌显著提高了重组透明质酸酶的产量，该方法将有利于进一步降低工业化生产水蛭透明质酸酶的成本，更有利于水蛭透明质酸酶的医疗药用和科研范围的扩大。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种高效重组表达透明质酸酶的方法，是在透明质酸酶基因N端添加一段寡聚核苷酸序列，构建透明质酸酶产量显著提高的基因工程菌。
所述在透明质酸酶基因N端添加的一段寡聚核苷酸序列，其核苷酸序列如(a)或(b)所示：
（a）如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
（b）与（a）中的序列具有类似功能，添加至透明质酸酶基因N端不引起翻译移码，能活性表达透明质酸酶并提高重组透明质酸酶表达量和/或酶活。
所述透明质酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；在其N端添加SEQ ID NO.1所述序列后所得重组透明质酸酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
具体地，是在透明质酸酶基因HaseA3887（SEQ ID NO.2）的N端添加一段核苷酸，构建重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887，转化毕赤酵母P.pastoris GS115进行表达。包括以下步骤：基于透明质酸酶基因HaseA3887，合成引物时，在上游引物BYA3887HF引入限制性酶切位点EcoRI和18个核苷酸（6×his-tag序列），下游引物BYA3887R引入NotI酶切位点；构建的重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887经SalI线性化后电转入P.pastoris GS115中并确认HaseA3887基因重组P.pastoris GS115成功。
所述上游引物BYA3887HF:5’-CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGAC-3’；下游引物BYA3887R:5’-TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC-3’。
本发明还提供了一种利用上述方法构建得到的重组毕赤酵母发酵生产透明质酸酶的方法，具体步骤如下：以含有重组透明质酸酶基因的重组毕赤酵母P.pastorisGS115/pPIC9K-His-HaseA3887为生产菌株，将种子培养液按10%的接种量接种到25mL（摇瓶容量250mL）BMGY培养基中，温度为30℃、pH为6.0培养至OD600为4，离心菌体接种到诱导表达培养基BMMY，每隔24h补加1%（v/v）甲醇，诱导表达96h。
本发明方案中还包括一种特异性纯化重组表达的透明质酸酶的方法，重组透明质酸酶基因（SEQ ID NO.3）所编码的重组蛋白在N端形成6个连续的组氨酸标签，能与葡聚糖镍特异性结合。采用葡聚糖镍与发酵液混合孵育后，分别用0、10、20、30、40、50mM的咪唑洗脱杂质，再以500mM的咪唑缓冲液特异性洗脱目标蛋白，再进行梯度透析获得纯透明质酸酶蛋白。
本发明方案在透明质酸基因上游添加一段核苷酸序列、构建了高效表达重组透明质酸基因的毕赤酵母菌，同时解决了透明质酸酶基因高效表达及透明质酸酶亲和纯化的问题。所得重组毕赤酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887发酵上清酶活是对照重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-HaseA3887发酵上清酶活的5倍以上；所得酶通过特异性亲和纯化即可得到。本发明通过在透明质酸基因上游添加一段核苷酸序列。本发明将有利于进一步降低工业化生产水蛭透明质酸酶的成本，更有利于水蛭透明质酸酶的医疗药用和科研范围的扩大，在工业上具有巨大的应用价值。
附图说明
图1所示为平板法检测发酵上清液透明质酸酶的活性（1，A3887HF重组透明质酸酶发酵上清液水解HA反应产生透明圈；2，pPIC9k-GS115对照发酵上清液作对照）。
图2所示为摇瓶发酵产透明质酸酶的粗酶液酶活力；1，对照重组菌株GS115/pPIC9K-HaseA3887；2，本发明重组菌株GS115/pPIC9K-His-HaseA3887。
图3所示为重组透明质酸酶的蛋白SDS-PAGE电泳结果（M，蛋白marker；1，GS115/pPIC9k菌株发酵液上清；2，对照重组菌株GS115/pPIC9K-HaseA388发酵液上清；3，重组GS115/pPIC9K-His-HaseA3887发酵液上清；4，NTA-Ni纯化的重组透明质酸酶蛋白）。
具体实施方式
材料与方法：
透明质酸酶活力单位定义：在pH5.5和38℃下，每小时从透明质酸中释放1μg葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
平板透明圈法检测透明质酸酶活性：透明质酸为大分子聚多糖，在一定浓度的表面活性剂水溶液中沉淀析出，被水解的小分子量低聚HA不会被沉淀析出。利用这一原理可以快速简便的鉴定透明质酸酶活性。
DNS还原糖测定方法：水蛭透明质酸酶水解HA，通过降解β-1、3-糖苷键，产生带有还原端羟基的还原糖产物。通过DNS还原糖法测定水解HA产生的相对于葡萄糖还原当量的还原糖产物的产生量，来计算酶比活力。
实施例1：含透明质酸酶基因（HaseA3887）表达载体的构建
全化学合成透明质酸酶HaseA3887全长基因序列（SEQ ID NO.2），以此为模版，设计表达引物，上游引物BYA3887HF:CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGAC;下游引物BYA3887R:TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC，在上下游引物分别引入限制性内切酶位点（本发明中所述表达载体为pPIC9K，根据此载体选取上游酶切位点为EcoRI，下游为NotI）。使用该对引物扩增HaseA3887基因，对扩增获得的透明质酸酶片段进行EcoRI和NotI双酶切，连接至具有相对应切口的表达载体上（载体pPIC9K经EcoRI、NotI双酶切），转化至E.coil DH5α中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒pPIC9K-His-HaseA3887，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒经SalI线性化后电转入表达宿主P.pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证正确。
实施例2：重组毕赤酵母异源表达透明质酸酶
重组P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887克隆子进行发酵培养表达。单克隆接种于5ml的YPD培养基（酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L），30℃、200rpm培养16h。按10%的接种量转接于100ml的诱导表达培养基BMGY（酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，10×YNB100ml/L(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL），30℃200rpm培养至OD600值为4之间。离心收集菌体，更换至100mL诱导表达培养基BMMY（酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，100×YNB100mL/L(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL），30℃200rpm培养，每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0%（v/v）进行诱导表达，诱导表达96h。发酵上清液经SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果见附图3中泳道3所示，与对照重组菌株（透明质酸酶基因N端未添加SEQ ID NO.1所示序列，其余相同）表达量（泳道2）相比，具有一条比较明显的目标条带。
实施例3：重组生产透明质酸酶的活性检测及摇瓶发酵上清液酶活测定
根据平板透明圈法检测透明质酸酶活性。配置缓冲液（50mM的柠檬酸/柠檬酸钠pH5.3，150mM的NaCl，0.02%Na3N），量取50ml缓冲液，加入1.5%的琼脂糖和1mg/ml的HA，加热融化后配置平板。将发酵上清液滴入孔径内部，平板置于37℃培养10h，在平板上覆盖适量的10%（w/v）的氯化十六烷吡啶（cetylpyridinium chloride）水溶液，约10min出现透明圈，结果如图1所示，重组P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887发酵上清液（图例1）形成直径约2cm的透明圈，而对照（图例2）未出现透明圈，说明该重组酶实现了活性表达。
采用3，5—二硝基水杨酸比色法测量水解透明质酸产生的还原糖当量。反应体系为1mL，用pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置2mg/mL的HA，反应体系加入400μL的HA溶液、100μL的发酵上清液酶液，缓冲液补足至1mL；对照组采用pPIC9K-GS115发酵上清液。在38℃反应20min，立即沸水终止反应，采用DNS法测定产生的还原糖当量（相当于等量葡萄糖的还原力），计算发酵液产生的酶活单位数。结果如附图2所示，本发明中的重组菌株（P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887）的发酵上清液酶活高达201333.33U/mL，是透明质酸酶基因未经修饰的对照重组菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-HaseA3887发酵上清液透明质酸酶活的5倍多。
实施例4：重组透明质酸酶的纯化制备
在HaseA3887基因前端添加的一段寡聚核苷酸序列，能显著提高透明质酸酶的表达量，同时，经转录翻译后在透明质酸酶N端融合了6个连续组氨酸标签，根据亲和层析原理，该标签能特异性与葡聚糖镍结合。葡聚糖镍先用pH6.0、50mM的磷酸盐缓冲液平衡30min，再加入经过0.45μm过滤的发酵液，在4℃孵育2h，依次用相同缓冲液配置的0、10、20、30、40、50mM的咪唑缓冲液进行洗脱杂质。最后用500mM的咪唑缓冲液洗脱目标蛋白。高浓度咪唑洗脱的目标蛋白进行过夜透析。获得单一条带的透明质酸酶纯蛋白，SDS-PAGE电泳结果如附图3中泳道4所示。所得透明质酸酶纯蛋白，经测定，具有透明质酸酶活力。

Claims (8)

1.一种高效重组表达透明质酸酶的方法，是在透明质酸酶基因N端添加一段核苷酸，构建基因工程菌进行表达；所述添加的核苷酸序列为如下（a）或（b）所示的序列：
（a）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，
（b）与（a）中的序列具有类似功能，添加至透明质酸酶基因N端不引起翻译移码，能活性表达透明质酸酶并提高重组透明质酸酶表达量和/或酶活。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，是在SEQ ID NO.2所示的透明质酸酶基因的N端添加一段SEQ ID NO.1所示的核苷酸，构建重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887，转化毕赤酵母P.pastoris GS115进行表达。
3.根据权利要求1所述方法获得的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，优选含有重组透明质酸酶基因的pPIC9K。
5.根据权利要求1所述方法获得的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，优选含有重组透明质酸酶基因的毕赤酵母P.pastoris GS115。
7.应用权利要求6所述基因工程菌高效表达透明质酸酶的方法，其特征在于将种子培养液按10%的接种量接种到含25mL BMGY培养基的容量为250mL的摇瓶中，温度为30℃、pH为6.0培养至OD600为4，离心收集菌体接种至诱导表达培养基BMMY，每隔24h补加1%甲醇，诱导表达96h；将发酵液经亲和层析纯化得到透明质酸酶蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，透明质酸酶的纯化条件为：采用葡聚糖镍进行亲和层析纯化透明质酸酶蛋白，分别用0、10、20、30、40、50mM的咪唑洗脱杂质，再以500mM的咪唑缓冲液特异性洗脱目标蛋白，再进行梯度透析获得纯透明质酸酶蛋白。
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