CN103695448A - 一种透明质酸酶编码基因及其发酵生产和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了透明质酸酶基因，其核苷酸序列如（a）或（b）或（c）所示：（a）核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；（b）在（a）中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个核苷酸或几个核苷酸且具有透明质酸酶活性的基因；（c）与（a）中氨基酸序列整体相似度在85%以上，具有透明质酸酶活性的基因。本发明通过采用毕赤酵母表达系统，成功实现了对所获得的水蛭透明质酸酶的高效异源表达及其纯化。本发明重组制备的水蛭透明质酸酶产物属于药理活性化合物，可以用于治疗脑、心血管疾病、眼科疾病、抗肿瘤和药物扩散剂等医疗领域。本发明为实现水蛭来源的透明质酸酶的工业化制备生产奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种透明质酸酶基因及其发酵生产和纯化方法，特别是一种来源于水蛭的透明质酸酶基因，属于生物工程技术领域。
背景技术
透明质酸酶于1928年被Duran Reynals发现并称为扩散因子，1940年被Chain和Duthie正式命名为透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)。透明质酸酶广泛存在于真核生物和原核生物中，主要水解透明质酸，是一种重要的生理活性物质。根据透明质酸酶作用的底物特异性和催化机制，将其分为三类。第一类是来源于哺乳动物的透明质酸4-糖基水解酶家族，这类透明质酸酶(EC3.2.1.35)是具有水解和转糖苷活性的糖苷酶，通过水解透明质酸（HA）的β-1、4-糖苷键，产物以四糖透明质酸分子为主。也可作用于硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素产生硫酸皮肤素产物。第一类中比较常见的有来自于哺乳动物的睾丸、蛇毒、蜂毒以及溶菌体的透明质酸酶。第二类为微生物透明质酸酶，这类透明质酸酶(EC4.2.2.1)通过β-消除反应裂解HA的β-糖苷键，产生以不饱和的双糖分子2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enepyranosyluronic acid)-D-glucose为主要产物。这类透明质酸裂解酶来源于包括Clostridium,Micrococcus,Streptococcus,andStreptomyces等菌株，并且它们的底物特异性也不同。第三类代表性的透明质酸酶主要来源于水蛭，这类水蛭来源的透明质酸酶(EC3.2.1.36)属于透明质酸3-糖基水解酶家族，通过水解HA的β-1、3-糖苷键，生产以四糖分子HA且还原端带有葡萄糖醛酸为主的产物。水蛭来源的透明质酸酶对底物的专一性强，对硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素不具有活性，并且不具有转糖苷活性。
透明质酸酶主要水解透明质酸，在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复，以及正常细胞和肿瘤细胞增生。许多病理变化过程往往伴随着透明质酸酶和透明质酸的变化，暗示它们可能起着重要的作用。同时透明质酸酶也可以改变机体内一些药物和生理活性物质的分布状况。
透明质酸水解酶作为一种药理活性物质在临床上具有比较广泛的用途。透明质酸酶能够降解心肌透明质酸，显著减少间隙体积，阻止由缺血引起的动脉阻力增大，增加血流量。
A等人对大鼠实验性心肌梗塞研究发现，心肌梗塞区的含水量显著增高与HA的积累强烈相关。相关研究实验也证实透明质酸酶对治疗心肌梗塞效果显著。另外，透明质酸酶在抗肿瘤方面也具有重要的作用，恶性组织经透明质酸酶处理后粘多糖含量增加，有利于肿瘤细胞结合更多的抗癌药物。如它可以加强阿霉素对乳腺癌的抗癌能力，降低膀胱癌的复发率等。此外，透明质酸酶在临床上也作为药物扩散助剂，眼科手术后用于降低眼内压，与麻醉剂利多卡因盐酸盐配合使用，可加快进入麻醉状态和延长麻醉时间。
水蛭来源的透明质酸酶由于其底物专一性强，与其它来源的透明质酸酶相比，它不能降解软骨素或硫酸软骨素，活性不受肝素影响。因此，理论上来讲，水蛭透明质酸酶用于临床药用更具医疗价值意义。1941年Hirst首次证实水蛭透明质酸酶强有力的抗菌性。水蛭透明质酸酶能溶解体内和体外细菌被膜并形成抗体，从而使宿主获得很好的药物治疗效果。虽然哺乳动物透明质酸酶作为“扩散因子”被广泛应用于药物扩散助剂，然而这类透明质酸酶活性易受肝素抑制。相比水蛭透明质酸酶活性不受肝素影响，在临床上作为“药物扩散因子”、治疗血栓、青光眼和其它药用方面具有更大的应用价值。
目前，尚无水蛭来源的透明质酸酶基因的相关报道。水蛭来源的透明质酸酶是以活体水蛭组织进行提取为主获得，且每个水蛭提取所获得透明质酸酶仅约为230U。水蛭原料的来源和提取分离步骤的繁琐等因素都极大的限制了水蛭透明质酸酶在医疗和科研上的广泛应用。本发明提供的重组微生物工程菌株高效生产制备纯化水蛭透明质酸酶的方法，打破了水蛭透明质酸酶的活体水蛭提取纯化的瓶颈。对实现工业化生产和医疗科研应用水蛭透明质酸酶奠定了坚实的基础。
发明内容
本发明提供了一种透明质酸酶基因，核苷酸序列如如（a）或（b）或（c）所示：
（a）核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（b）在（a）中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个核苷酸或几个核苷酸且具有透明质酸酶活性的基因；
（c）与（a）中氨基酸序列整体相似度在85%以上，具有透明质酸酶活性的基因。
所述透明质酸酶基因编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或其保守性变异多肽。
含有权利要求1所述透明质酸酶基因的转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。
本发明要还提供了一种表达上述透明质酸酶基因的方法，具体步骤如下：以含有透明质酸酶基因的重组毕赤酵母为生产菌株，使用BMGY培养基，甲醇诱导发酵生产透明质酸酶。
所述毕赤酵母为GS115，具体为以含有透明质酸酶基因的重组毕赤酵母P.pastorisGS115/pPIC9K-HaseA3887为生产菌株，发酵条件为：将种子培养液按10%的接种量接种到25ml（摇瓶容量250ml）BMGY培养基中，温度为30℃、pH为6.0培养至OD600为4，更换诱导表达培养基，添加1%的甲醇进行诱导，每隔24h补加一次甲醇，诱导表达96h。7、权利要求4所述的方法，其特征在于所示透明质酸酶的纯化条件为：采用二乙氨乙基纤维素柱（DEAE-ellulose）进行离子交换，分别用pH6.5、6.0的双甘氨肽缓冲液洗脱杂质，再以pH5.6、50mM的乙酸盐缓冲液特异性洗脱目标蛋白。
透明质酸酶活性分别采用平板检测法和CTAB浊度检测法进行鉴定，发酵液比活采用DNS还原糖测定法。
本发明成功从野生水蛭中克隆获得透明质酸酶全长基因，并实现利用重组毕赤酵母，异源高效表达透明质酸酶及其纯化制备的方法。本发明为实现水蛭来源的透明质酸酶的工业化制备生产奠定了基础。
附图说明：
图1为重组透明质酸酶的蛋白纯化SDS-PAGE电泳结果（M，蛋白marker；1，pPIC9k-GS115对照发酵液上清；2，重组HaseA3887-pPIC9K发酵液上清；3，纯化的重组透明质酸酶蛋白）。
图2为平板法鉴定发酵液产透明质酸酶的活性（A3887-1和A3887-2为两个重组透明质酸酶发酵液，pPIC9k-GS115为不含重组基因的空白对照发酵液）。
图3为浊度法快速简便的鉴定透明质酸酶的活性。（A3887-1和A3887-2为两个重组透明质酸酶发酵液，pPIC9k-GS115为不含重组基因的空白对照发酵液）
图4为两个重组HaseA3887-pPIC9K-GS115克隆摇瓶发酵产透明质酸酶的粗酶液比活。
具体实施方式
材料与方法
透明质酸酶活力单位定义：在pH5.5和38℃下，每小时从透明质酸中释放1ug葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
平板透明圈法和CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)浊度法检测透明质酸酶活性：透明质酸为大分子聚多糖，在一定浓度的表面活性剂水溶液中沉淀析出，被水解的小分子量低聚HA不会被沉淀析出。利用这一原理可以快速简便的鉴定透明质酸酶活性。
DNS还原糖测定方法：水蛭透明质酸酶水解HA，通过降解β-1、3-糖苷键，产生带有还原端羟基的还原糖产物。通过DNS还原糖法测定水解HA产生的相对于葡萄糖还原当量的还原糖产物的产生量，来计算酶比活力。
实施例1：野生水蛭RNA提取
取活体水蛭一条，剪取头部组织约100mg，迅速液氮冷冻。用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用组织/细胞总RNA提取试剂盒（杭州宝赛生物科技有限公司）进行提取。加入1ml的裂解液，迅速涡旋混匀使细胞裂解充分及RNA酶灭活，室温孵育放置2min。加入0.2ml氯仿，剧烈震荡混匀使样品变为乳白色，放置2-3min。以12000rpm在4℃离心10min，样品分三层，将上层含RNA的水相转移置一新管中。加入1/2体积的无水乙醇，颠倒混匀后全部转入吸附柱，以12000rpm在4℃离心1min。弃掉滤液，再加入500μl去蛋白液，以12000rpm在4℃离心1min，弃掉滤液。加入600μl的漂洗液，以12000rpm在4℃离心1min，弃掉滤液，该步骤重复一次。弃掉滤液后，再以12000rpm在4℃离心2min，室温静置几分钟以去除干净乙醇，将吸附管套至一新管，加入50μl预热的RNA-Free的ddH2O，室温静置2min，以12000rpm在4℃离心1min，收集RNA，-80℃保存备用。
实施例2：反转录制备cDNA
反转录cDNA制备采用的是M-MLV First Strand RT kit（杭州宝赛生物科技有限公司）。以提取的水蛭RNA为模板，按下述(20μl)体系配置反应混合物：5×First-Strand buffer，4μl；Oligo(dT)18Primer(50μM)，1μl;10mM dNTP,1μl;RNase Inhibitor(40U/μl),1μl;M-MLV(200U/μl)，1μl;RNA,12μl。将该反应体系置于PCR仪50℃反应1h。再70℃加热10min终止反应。置于冰上进行后续实验或-80℃保存。
实施例3：水蛭透明质酶基因的获取
通过对NCBI数据库的Expressed sequence tags(EST)中的水蛭EST搜索分析，发现两个不完整的mRNA基因(GenBank:JZ186329.1和GenBank:FP652258.1)类似肝素酶基因（同源性低于40%），通过进一步与其他透明质酸酶进行比较，初步确认这两条不完整的mRNA序列为水蛭透明质酸酶序列。根据这两条序列在靠近5端设计两条简并引物(EST1：CTGGTGMYCACRTAACYGCTTTTAC；EST2：TCAACATACCTTGAYGCYWCWTA)。简并引物分别作为上游引物，下游引物为Oligo(dT)18，以实施例2中制备的cDNA作为模板，PCR扩增目标片段。经PCR扩增，获得以引物EST1和Oligo(dT)18扩增的约900bp的目标片段。回收目标片段，连接PMD19克隆载体并测序，经比对与EST库中的两条序列同源性达到80%以上。再根据测序获得的序列，从5端设计合成一条反向引物，采用SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒，按操作说明扩增该片段的上游未知序列。扩增获得的片段进行测序比对，与之前的下游片段进行拼接，分析比对找到一个1470bp的ORF，根据这个ORF序列，设计上下游引物，以cDNA为模板，进行目标序列全长基因的扩增。将PCR扩增获得目标片段大小的序列进行测序，比对正确，获取的透明质酸酶基因命名为HaseA3887。
实施例4：含透明质酸酶基因（HaseA3887）表达系统的构建
根据实施例3中获取的本发明透明质酸酶HaseA3887全长基因序列设计表达引物，(A3887BYF:CCGGAATTCATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTGAC；A3887BYR:TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC)。在上下游引物上分别引入限制性内切酶位点（本发明中所述表达载体为pPIC9K，根据此载体选取上游酶切位点为EcoR I，下游为Not I）。使用含本发明中所述的透明质酸酶A3887基因序列的质粒，经PCR扩增后，对扩增获得的透明质酸酶核苷酸片段进行双酶切，连接至具有相对应切口的表达载体上（载体pPIC9K经EcoRI、Not I双酶切），转化至E.coil DH5α中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒HaseA3887-pPIC9K，经DNA测序比对，重组序列正确。HaseA3887-pPIC9K重组质粒经Sal I线性化后电转入表达宿主P.pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证正确。
实施例5：重组毕赤酵母异源表达透明质酸酶
验证正确的重组A3887克隆子进行发酵培养表达。单克隆接种于5ml的YPD培养基（酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L），30℃、200rpm培养16h。按10%的接种量转接于100ml的诱导表达培养基BMGY（配1L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB100mL(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL），30℃200rpm培养至OD600值为2-5之间，离心收集菌体，更换至100ml诱导表达培养基BMMY（酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至895mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃以后在超净台上加入100×YNB100mL(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL）。30℃200rpm培养，每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%进行诱导表达，诱导表达96h。重组透明质酸酶发酵液与对照菌发酵液进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图1所示，泳道1为对照发酵液，泳道2为重组酶发酵液，经比较分析，确定在箭头标示的位置为重组酶的表达蛋白。
实施例6：重组生产透明质酸酶的活性检测摇瓶发酵液酶活测定
根据平板透明圈法检测透明质酸酶活性。配置缓冲液（50mM的柠檬酸/柠檬酸钠pH5.3，150mM的NaCl，0.02%Na3N），量取50ml缓冲液，加入1.5%的琼脂糖和1mg/ml的HA，融化后配置平板。将发酵液滴入孔径内部，平板置于37℃培养10h，在平板上覆盖适量的10%（w/v）的氯化十六烷吡啶（cetylpyridinium chloride）水溶液，约10-20min后出现透明圈，如本发明专利附图2所示。CTAB浊度法检测透明质酸酶活性。在1ml反应体系中，含HA（2mg/ml）100μl，加入发酵液上清或者酶液适量，pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液补足至1ml。混匀后置于38℃水浴反应30min，立即加入2ml的CTAB（2.5g/L）,室温反应5min，在400nm下进行浊度对比测定。浊度比色结果如附图3所示，具有透明质酸酶活性的A3887-1和-2发酵液作用透明质酸后，反应体系呈澄清状，而对照呈浑浊状。
透明质酸酶专一作用于透明质酸内的葡萄糖苷酸键，产生具有还原端为葡萄糖醛酸小分子多糖。采用3，5—二硝基水杨酸比色法测量水解透明质酸产生的还原糖当量，用分析纯葡萄糖作标准曲线，用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，求出酶的比活力。反应体系为1ml，用pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置2mg/ml的HA，反应体系加入400μl的HA溶液、100μl的发酵上清液酶液，缓冲液补足至1ml；对照组采用pPIC9K-GS115发酵上清液。在38℃反应20min，立即沸水终止反应，采用DNS法测定产生的还原糖当量（相当于等量葡萄糖的还原力），计算发酵液产生的酶活单位数。两个平行发酵组采用此方法测定的发酵液酶比活如图4所示，分别为3963.22U/ml和4043.67U/ml。
实施例7：重组透明质酸酶的纯化制备
根据透明质酸的结构特性，属于高聚阴离子型糖胺聚糖，可采用二乙氨乙基纤维素柱（DEAE-ellulose）进行离子交换纯化。发酵液上清用磷酸盐缓冲液调pH值至7.0，DEAE纤维素柱采用相同pH值的缓冲液平衡30min，将发酵液上清注入DEAE纤维素柱，混匀静置1h，每15min搅匀一次。随后分别用pH6.5、6.0的双甘氨肽缓冲液洗脱杂质，再采用pH5.6的乙酸盐缓冲液特异性洗脱目标蛋白。洗脱的目标蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，如附图1中泳道3所示，采用此步骤纯化方法获得了单一条带的透明质酸酶蛋白。
Claims (7)
1.一种透明质酸酶基因，其特征在于核苷酸序列如（a）或（b）或（c）所示：
（a）核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（b）在（a）中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个核苷酸或几个核苷酸且具有透明质酸酶活性的基因；
（c）与（a）中氨基酸序列整体相似度在85%以上，具有透明质酸酶活性的基因。
2.根据权利要求1所述透明质酸酶基因编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或其保守性变异多肽。
3.含有权利要求1所述透明质酸酶基因的转基因细胞系。
4.一种表达权利要求1所述透明质酸酶基因的方法，其特征在于包括如下步骤：以含有透明质酸酶基因的重组毕赤酵母为生产菌株，使用BMGY培养基，甲醇诱导发酵生产透明质酸酶。
5.权利要求4所述的方法，其特征在于所述毕赤酵母为GS115。
6.权利要求4所述的方法，其特征在于具体步骤如下：以含有透明质酸酶基因的重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-HaseA3887为生产菌株，发酵条件为：将种子培养液按10%的接种量接种到25ml（摇瓶容量250ml）BMGY培养基中，温度为30℃、pH为6.0培养至OD600为4，更换诱导表达培养基，添加1%的甲醇进行诱导，每隔24h补加一次甲醇，诱导表达96h。
7.权利要求4所述的方法，其特征在于所示透明质酸酶的纯化条件为：采用二乙氨乙基纤维素柱（DEAE-ellulose）进行离子交换，分别用pH6.5、6.0的双甘氨肽缓冲液洗脱杂质，再以pH5.6、50mM的乙酸盐缓冲液特异性洗脱目标蛋白。
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