CN103255118A - 一种β-甘露聚糖酶、编码基因及其生产菌和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β-甘露聚糖酶、编码基因及其生产菌和应用，该高温β-甘露聚糖酶的真菌Aspergillus sp.T16，保藏号为CCTCC NO:M2013122，从该菌克隆获得的新型高温甘露聚糖酶基因manT16，其具有如SEQ ID NO.2或3所示的核苷酸序列，编码获得的β-甘露聚糖酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，及包含编码该甘露聚糖酶基因的重组载体和酵母基因工程菌。本发明的甘露聚糖酶最适温度为75℃，最适pH为3.5-5.0，可耐受75℃高温，在pH2.2-8.0下稳定，作为新型高温酶，具有极大的生产应用价值，在饲料、食品、医药、酿酒、能源等行业中应用前景广阔。

Description

一种β-甘露聚糖酶、编码基因及其生产菌和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，本发明涉及一株产高温β-甘露聚糖酶的曲霉属真菌Aspergillussp.T16，及从该菌中获得的高温β-甘露聚糖酶及编码基因，和包含编码该高温酶基因的重组载体和酵母基因工程菌，以及它们的应用。

技术背景

β-甘露聚糖酶（endo-1,4-β-D-mannanmanno hydroase EC3.2.1.78）是一类水解β-1,4-D-甘露聚糖糖苷键的内切水解酶，属于半纤维素酶类。其可水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖。甘露聚糖在自然界中含量丰富，广泛存在于植物细胞中，如魔芋精粉、田青胶、角豆胶、澳大利亚蒲葵等（Dhawan S.&Kaur J.,Critical reviewsin biotechnology,27(4):197-216）。甘露聚糖酶水解甘露聚糖为低聚糖，低聚糖由二至十个单糖通过糖苷键连接起来，具有低热、稳定、安全无毒等良好生理特性，可降低人体胆固醇水平，增加肠道双歧杆菌，降低人体血糖，抑制有害菌的生长。β-甘露聚糖酶可广泛应用于造纸、食品、纺织、饲料和石油开采等领域，成为近年来研究的热点(van Zyl W,et al.,ProcessBiochemistry,45(8):1203-1213;Shallom D.&Shoham Y.,Current opinion in microbiology,6(3):219-228)。

β-甘露聚糖酶广泛存在于植物、低等动物和微生物中（Chauhan PS,et al.,Appliedmicrobiology and biotechnology,93:1817-1830）。微生物来源的β-甘露聚糖酶广泛分布于细菌、放线菌和真菌中，其具有宽泛的温度和pH作用范围，催化活力高，活力稳定而成为工业用酶的主要来源（Duffaud,et al.,Appl Environ Microbiol,63(1):169-177;Akino,et al.,Appl.Microbial Biotech,26:323-327）。

目前，国内外的研究和开发的β-甘露聚糖酶主要为中温酶，其耐热性较差，不能满足工业应用中一些高温工艺的要求。而近几年国内开发的酸性β-甘露聚糖酶，虽具有较高的最适温度，但仍不能满足一些高温工艺要求。如中国发明专利201110086452.2公开了由一种来源于硫色曲霉的新型酸性甘露聚糖酶及其突变体，其最适温度为65℃，在70℃有较好的稳定性；中国发明专利201110410537.1公开了由一种来源于黑曲霉LW-1的新型酸性甘露聚糖酶，其最适温度为70℃，在60℃以下稳定；中国发明专利200810113343.3公开了由一种来源于Bispora sp.MEY-1的新型酸性甘露聚糖酶，其最适温度为65℃，在60℃以下稳定。国内尚未有75℃及以上稳定的耐热β-甘露聚糖酶的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种产高温β-甘露聚糖酶的菌株Aspergillus sp.T16。

本发明的目的是提供一种来源于上述菌株的高温β-甘露聚糖酶。

本发明的目的是提供上述高温β-甘露聚糖酶的全基因。

本发明再一目的是提供包含上述高温β-甘露聚糖酶基因的重组载体。

本发明再一目的是提供包含上述高温β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。

本发明再一目的是提供上述高温β-甘露聚糖酶的表达方法。

本发明再一目的是提供上述高温β-甘露聚糖酶的应用。

一种高温β-甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种高温β-甘露聚糖酶基因manT16，是满足下列要求的核苷酸序列之一：

1）编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的高温β-甘露聚糖酶的核苷酸序列；

2）序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

3）序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

包含所述高温β-甘露聚糖酶基因manT16的重组载体为pGAPZα-manT16和pPICZα-manT16。

包含所述高温β-甘露聚糖酶基因manT16重组载体的高温β-甘露聚糖酶酵母基因工程菌。

构建所述高温β-甘露聚糖酶工程菌的方法，是将所述的重组载体pGAPZα-manT16和pPICZα-manT16导入毕赤酵母中获得；所述高温β-甘露聚糖酶基因manT16在重组载体pGAPZα-manT16和pPICZα-manT16中位于α分泌引导肽基因序列下游。

用于构建表达所述高温β-甘露聚糖酶工程菌的出发菌株为毕赤酵母X-33或GS115。

一种表达高温β-甘露聚糖酶的方法，培养所述的高温β-甘露聚糖酶工程菌，组成型或诱导型表达该β-甘露聚糖酶，提取纯化后，得到高温β-甘露聚糖酶。

所述的高温β-甘露聚糖酶能在食品、纺织、洗涤、医药、石油开采或动物饲料添加剂中应用。

一种曲霉属真菌Aspergillus sp.T16，其保藏号为：CCTCC NO:M2013122。

本发明筛选获得能够用于食品、医药、洗涤、纺织、饲料和石油开采领域的高温β-甘露聚糖酶。本发明人通过平板水解圈法初筛和微板培养法复筛，获得一株产高温β-甘露聚糖酶的曲霉属真菌Aspergillus sp.T16，本菌株已保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为：CCTCC NO:M2013122。

从上述菌株获得一种新型高温β-甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。该甘露聚糖酶最适温度为75℃，最适pH为3.5-5.0，可耐受75℃高温，在pH2.2-8.0下稳定。

本发明提供了编码该高温β-甘露聚糖酶的基因manT16，该酶的全基因序列如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；编码该高温β-甘露聚糖酶成熟肽的cDNA序列如SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供了包含上述高温β-甘露聚糖酶基因的重组载体pGAPZα-manT16和pPICZα-manT16。高温β-甘露聚糖酶基因在上述重组载体中位于α分泌引导肽基因序列下游。本发明的最优方案是将高温β-甘露聚糖酶基因插入到质粒pGAPZαA中的XhoⅠ和XbaⅠ限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于GAP启动子下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pGAPZα-manT16。

本发明提供了包含上述高温β-甘露聚糖酶基因的重组菌，是将上述重组载体导入毕赤酵母X-33或GS115中获得。

本发明提供了表达高温β-甘露聚糖酶的方法：培养上述的高温β-甘露聚糖酶工程菌，组成型或诱导型表达，过滤除菌后，得到高温β-甘露聚糖酶。

本发明提供了高温β-甘露聚糖酶的应用，在食品、纺织、洗涤、医药、石油开采或动物饲料添加剂领域中得到广泛应用。

用基因工程手段产业化生产如此耐热的高温β-甘露聚糖酶目前尚未见报道。本发明提供的高温β-甘露聚糖酶作用pH范围广，具有极好的耐热性，可作为应用于饲料、食品、医药等工业的有效酶制剂，根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产高温β-甘露聚糖酶。

本发明得到的一株产高温β-甘露聚糖酶的曲霉属真菌Aspergillus sp.T16已于2013年4月3号保存于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为：CCTCCNO:M2013122。

附图说明

图1为本发明重组菌株X-33/pGAPZα-manT16表达产物的SDS-PAGE检测结果。1泳道为重组菌株X-33/pGAPZα-manT16发酵液中蛋白；2泳道为重组菌株X-33/pGAPZα-manT16发酵液经Sephadex^TM G-75凝胶纯化所得蛋白；

图2为本发明表达的高温β-甘露聚糖酶的最适pH检测结果；

图3为本发明表达的高温β-甘露聚糖酶的pH稳定性检测结果；

图4为本发明表达的高温β-甘露聚糖酶的最适温度检测结果；

图5为本发明表达的高温β-甘露聚糖酶的温度稳定性检测结果；

孵育温度为75℃；

图6为本发明表达的高温β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖（刺槐豆胶）质谱检测结果；

A为酶解2h检测结果，B为酶解64h检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，不会对本发明形成限制。

实验材料和试剂

1、菌株及载体：Aspergillus sp.T16由本发明人分离获得，表达载体pGAPZαA和pPICZαA，毕赤酵母菌株X-33和GS115购自于Invitrogen公司。

2、试剂：限制性内切酶、连接酶、Pfu DNA Polymerase、反转录试剂盒购自于Fermentas公司，RNA提取试剂盒购自于Promega公司，刺槐豆角购自于Sigma公司，其它试剂均为国产试剂，可从一般的生化试剂公司购买。

3、培养基：

（1）野生菌株的筛选培养基为：0.5%魔芋粉溶于基础盐培养基（NaNO₃，0.2%；K₂HPO₄，0.1%；KCl，0.05%；MgSO₄·7H₂O，0.05%；FeSO₄·7H₂O，0.001%；pH4.5）。Aspergillus sp.T16培养基为：魔芋粉，0.5%；蛋白胨，1%；NaNO₃，0.2%；K₂HPO_4，0.1%；KCl，0.05%；MgSO₄·7H₂O，0.05%；FeSO₄·7H₂O，0.001%（pH4.5）。

（2）大肠杆菌培养基LB（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl，pH7.0）和LLB培养基（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%NaCl，pH7.4）；在LB或LLB液体培养基中加入1.5%琼脂粉得到相应的固体培养基。

（3）酵母菌培养基YPD（2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖）和YPDS（2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖，1M山梨醇）；在YPD或YPDS液体培养基中加入1.5%琼脂粉得到相应的固体培养基。

下述实施例中所采用方法如无特殊说明均为常规的方法；所述引物，序列测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

实施例1、产高温β-甘露聚糖酶的Aspergillus sp.T16筛选

将采自于湖南省长沙市岳麓山桔园的土样经富集培养（富集培养基：0.5%的魔芋粉溶于基础盐培养基，调pH至5.0，30℃，200rpm）48h。富集培养液稀释10⁴-10⁶倍后各0.2mL涂初筛平板（富集培养基中加入1.5%琼脂粉和0.2%刚果红），30℃恒温培养2-3天。初筛平板长出后，待菌落周围有透明的水解圈出现，挑取接种于含有富集培养基的24孔细胞培养板中，30℃，200rpm培养48h。取培养液上清稀释合适的倍数，以0.5%的刺槐豆胶做底物，在pH5.0和80℃，采用DNS法测量培养液中酶活，选取具有较高酶活的菌株。通过此方法筛选到产高温β-甘露聚糖酶的Aspergillus sp.T16。

该菌株在平板分离培养基上30℃培养2天，菌落直径在4cm～5cm，质地疏松，丝绒状。菌落颜色初为白色，3天后变为淡黄色，产生孢子之后变为黑色。菌落中央菌丝生长形成突起边缘不整齐，菌落背面呈淡黄色；孢子头呈球形至放射状，直径约为200～400μm；孢子梗长1～3mm，直径20～25μm，壁光滑，无横隔，无色；分生孢子呈球形，黑色，直径5.0～6.0μm，壁粗糙，有刺状突起；菌丝透明无色，有横隔，一部分伸入培养基内，一部分形成气生菌丝，菌丝顶端膨大形成分生孢子梗。

根据以上形态学和培养特征，初步判定该真菌为曲霉属真菌。该产高温β-甘露聚糖酶的真菌Aspergillus sp.T16已于已保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为：CCTCCNO:M2013122。

实施例2、来自于真菌Aspergillus sp.T16的高温β-甘露聚糖酶全基因的获得

1、高温β-甘露聚糖酶N端和C端氨基酸序列测序

Aspergillus sp.T16在诱导培养基（0.5%魔芋粉和1.0%蛋白胨溶于基础盐培养基，pH5.0，35℃，200rpm）培养48小时，纱布过滤除去菌丝体，培养液上清经透析袋浓缩、透析和SephadexTM G-75凝胶纯化后进行N和C端氨基酸测序，其N端序列为SFASTSGLQF，其C端测序结果为TDHVAAIGSA，两者与来源于Aspergillus usamii（ADZ99027.1）、Aspergilluskawachii（GAA89125.1）、Aspergillus niger（ACJ06979.1，ADK88903.1，AEY76082.1）和Aspergillus sulphureus（ABC59553.1）具有很高的同源性；根据编码上述蛋白相应N端和C端氨基酸的基因序列比对，设计上游简并引物ManTF-5TCCTTCGCCAGCACCTCSGG3和下游简并引物ManTR-5CATGTKGCTGCTATTGGTAGYGCT3。

2、编码高温β-甘露聚糖酶基因的克隆

Aspergillus sp.T16在诱导培养基（0.5%魔芋粉和1.0%蛋白胨溶于查氏基础盐培养基，pH5.0，35℃，200rpm）培养48小时，纱布过滤获得菌丝体0.1g，置于液氮研钵中充分研磨，之后按照Promega公司产的酵母基因组提取试剂盒和RNA提取试剂盒提取Aspergillus sp.T16的全基因组和总RNA。

以设计合成的ManTF和ManTR为引物，提取的Aspergillus sp.T16全基因组为模板进行PCR扩增，PCR扩增参数为：95℃变性5min；94℃变性1min，52℃退化1min，72℃延伸2min30S，30个循环；72℃充分延伸15min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，纯化产物测序结果如SEQ ID No.2，其包含两段内含子，其中+611-673bp和+804-865为其内含子序列。

以提取的Aspergillus sp.T16总RNA为模板，利用Promega的反转录试剂盒得到编码高温β-甘露聚糖酶的cDNA第一链；以第一链cDNA为模板，以设计合成的ManTF和ManTR为引物，进行PCR扩增，PCR扩增参数为：95℃变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃充分延伸15min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，纯化产物测序结果如SEQ ID No.3所示。

实施例3、重组高温β-甘露聚糖酶的制备

根据编码成熟高温β-甘露聚糖酶的cDNA序列合成引物ManPF-5CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCCTTCGCCAGCACCTCCGG3（C^TCGAG为Xho I酶切位点）和ManPR-5GCTCTAGATCAAGCACTACCAATAGCAGCAACATG3（T^CTAGA为Xba I酶切位点），以实施例2中获得的编码成熟高温β-甘露聚糖酶的cDNA序列为模板进行PCR扩增，PCR扩增参数为：95℃变性5min；94℃变性1min，52℃退活1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃充分延伸15min。

用Xho I和Xba I双酶切pGAPZαA和pPICZαA质粒，同时双酶切上述PCR产物，用T4连接酶将双酶切PCR产物与双酶切pGAPZαA和pPICZαA质粒进行连接。将连接产物化转法转入E.coli DH5α，挑取阳性克隆子菌落PCR鉴定后测序。提取测序正确的重组质粒pGAPZα-manT16和pPICZα-manT16，电击转化毕赤酵母X33和GS115，涂布于含100μg/mL的YPDS平板，30℃培养2-3天，长出的重组子即为产高温β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌。

挑取上述高温β-甘露聚糖酶重组菌株接种于5mL YPD培养基中，28℃，250rpm培养24小时，取1mL接种于100mL YPD培养基中，28℃，250rpm培养36小时，取上清5000g离心5min，测定上清中甘露聚糖酶酶活并进行SDS-PAGE。发酵液中酶活为210U/mL，SDS-PAGE表明发酵液主要为高温甘露聚糖酶（图1）。

实施例4、高温β-甘露聚糖酶的活性分析

采用DNS法对本发明制备的各β-甘露聚糖酶进行活性分析。具体测量方法如下，取500μL稀释合适倍数的β-甘露聚糖酶溶液加入到500μL溶于0.1M磷酸盐缓冲液的1.0%的刺槐豆角（pH5.0）中，于75℃反应10min后，加入1000μL DNS溶液，沸水煮5min后用冷水冷却，于540nm测量吸光度。

酶活定义：在pH5.0、75℃、1min催化终浓度为0.5%的刺槐豆角（Sigma G0753）产生1μmol甘露糖所需要的酶量为一个酶活单位。

实施例5、高温β-甘露聚糖酶酶学性质分析

1、最适pH与pH稳定性分析

最适pH值的确定：采用pH2.2-8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释酶液和配制底物，分别于不同pH下按实施例4测定β-甘露聚糖酶的活力。

pH值稳定性的确定：纯酶样品置于不同pH值的磷酸氢二钠-柠檬酸(2.2-8.0)缓冲液中于室温放置24h后，按实施例4测定残留的酶活力。

结果如图2和3，该酶在pH3.5-5.0具有最高相对酶活，在pH3.0仍具有60%的相对活性；在pH2.2-8.0条件下室温放置24h仍能残留75%以上的相对酶活，具有极好的耐酸性，适宜于用于饲料、食品、医药、纺织、造纸和石油开采行业。

2、最适温度与温度稳定性分析

最适温度的确定：纯酶样品经适当稀释后，分别在40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃和90℃按照实施例4测定β-甘露聚糖酶的活力。

温度稳定性的确定：纯酶样品置于75℃下保温不同时间，按实施例4测定残留的酶活力。

结果如图4和5，该酶的最适作用温度为75℃，在75℃下保温5min残留酶活在80%以上，具有较好的热稳定性，可满足饲料等行业的高温工艺要求。

实施例6、高温β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖特性分析

取10U的高温β-甘露聚糖酶加入甘露聚糖底物溶液中（1%的刺槐豆胶溶于蒸馏水中），于60℃孵育2h和60h以使底物充分水解。14000g离心10min，经超滤除去残留蛋白。酶解产物NH⁴⁺离子化、钠离子化和钾离子化后进行质谱MS分析。

结果如图6，质谱分析结果表明，高温β-甘露聚糖酶水解刺槐豆胶主要产物为甘露二糖，及相对少量的甘露糖、甘露三糖和甘露四糖，表明该高温β-甘露聚糖酶可降解甘露聚糖产生低聚合度的甘露寡糖，可广泛应用于食品、医药、饲料、纺织、造纸和石油开采以降解甘露聚糖。

Claims (9)

1.一种高温β-甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种高温β-甘露聚糖酶基因manT16，其特征在于，是满足下列要求的核苷酸序列之一：

1）编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的高温β-甘露聚糖酶的核苷酸序列；

2）序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

3）序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

3.包含权利要求2所述高温β-甘露聚糖酶基因manT16的重组载体pGAPZα-manT16和pPICZα-manT16。

4.包含权利要求3所述高温β-甘露聚糖酶基因manT16重组载体的高温β-甘露聚糖酶酵母基因工程菌。

5.构建权利要求4所述高温β-甘露聚糖酶工程菌的方法，是将权利要求3所述的重组载体pGAPZα-manT16和pPICZα-manT16导入毕赤酵母中获得；所述高温β-甘露聚糖酶基因manT16在重组载体pGAPZα-manT16和pPICZα-manT16中位于α分泌引导肽基因序列下游。

6.根据权利要求5所述构建工程菌的方法，其特征在于，用于构建表达所述高温β-甘露聚糖酶工程菌的出发菌株为毕赤酵母X-33或GS115。

7.一种表达高温β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于，培养权利要求4所述的高温β-甘露聚糖酶工程菌，组成型或诱导型高温β-甘露聚糖酶工程菌表达，提取纯化后，得到高温β-甘露聚糖酶。

8.权利要求1所述的高温β-甘露聚糖酶在食品、纺织、洗涤、医药、石油开采或动物饲料添加剂中的应用。

9.一种曲霉属真菌Aspergillus sp.T16，其保藏号为：CCTCC NO:M2013122。

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