CN111117986A - 一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因、制备技术和应用 - Google Patents

一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因、制备技术和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111117986A
CN111117986A CN202010047484.0A CN202010047484A CN111117986A CN 111117986 A CN111117986 A CN 111117986A CN 202010047484 A CN202010047484 A CN 202010047484A CN 111117986 A CN111117986 A CN 111117986A
Authority
CN
China
Prior art keywords
arabinofuranosidase
epabf62c
calcium
dependent
resistant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010047484.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111117986B (zh
Inventor
龙良鲲
林群英
孙璐
丁少军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Huahui Tiancheng Biopharmaceutical Co.,Ltd.
Original Assignee
NANJING INSTITUTE FOR COMPREHENSIVE UTILIZATION OF WILD PLANTS CHINA COOP
Nanjing Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NANJING INSTITUTE FOR COMPREHENSIVE UTILIZATION OF WILD PLANTS CHINA COOP, Nanjing Forestry University filed Critical NANJING INSTITUTE FOR COMPREHENSIVE UTILIZATION OF WILD PLANTS CHINA COOP
Priority to CN202010047484.0A priority Critical patent/CN111117986B/zh
Publication of CN111117986A publication Critical patent/CN111117986A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111117986B publication Critical patent/CN111117986B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01055—Alpha-N-arabinofuranosidase (3.2.1.55)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种来源于微细正青霉的钙依赖型耐热α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶，其氨基酸序列和核酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该阿拉伯呋喃糖苷酶基因在瑞氏木霉中重组表达，获得的纯酶(EpABF62C)分子量为33 kDa。EpABF62C具广泛的催化活性，最适温度为65℃、最适pH为4.5，其热稳定性依赖于Ca2+，在55℃下稳定5天，在pH2.0‑11.0下稳定，比酶活达205.24U/mg。阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C能协同木聚糖酶高效降解小麦阿拉伯木聚糖，制备低聚糖和单糖。该发明在功能食品、医药保健和生物能源等领域具有广泛的应用前景。

Description

一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因、制备 技术和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C及其编码基因，制备技术和应用。
背景技术
植物半纤维素是地球上储量仅次于纤维素的生物质资源。木聚糖是半纤维素的重要成分，常见于阔叶木及禾本科植物的细胞壁，是一种复杂的多聚五碳糖。木聚糖的木糖基主链上通常含有阿拉伯糖侧链分支，尤其是谷物麸皮来源的木聚糖的阿拉伯糖侧链含量高达38-45%。木聚糖主链的降解主要由糖苷水解酶（GH）家族10和11中内切型木聚糖酶完成。研究数据显示，木糖残基上的阿拉伯糖取代基对木聚糖主链的降解形成阻碍作用，去除阿拉伯糖侧链基团是高效降解木聚糖的前提。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(alpha-L-arabinofuranosidase, EC 3.2.1.55)是能够催化水解阿拉伯木聚糖或阿拉伯聚糖等高分子上的阿拉伯糖残基非还原端，释放出阿拉伯糖分子的一类酶的总称。在碳水化合物活性酶数据库（http://www.cazy.org/）中，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶分布于糖苷水解酶（GH）家族GH2、3、43、51、54和62家族，不同家族的酶具有差别性的作用特点。例如，GH62家族α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶具有更高的底物专一性，仅表现出对天然阿拉伯木聚糖的高催化活性。
工业上，以α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶去除木聚糖的阿拉伯糖取代基，进而木聚糖酶作用于木糖残基间的连接键，能够获得木二糖、木三糖等低聚木糖和木糖分子。阿拉伯糖、木糖和低聚木糖具有多种生物活性和功能，已广泛用于医药保健、食品、饲料和生物炼制等领域。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶成为具有重要利用价值的工业用酶资源。耐热酶常具有高的最适催化温度、高的比活性和高的热稳定性，容易实现高效催化和循环利用的目的，在工业应用中备受青睐。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的耐热性已成为评价其应用价值的重要指标之一。
当前，不同来源和类型的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶已有研究报道，但同时具有催化效率高、生产成本低和循环使用等特性，符合市场需求的产品仍然不足。因此，挖掘新颖的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因，实现高效率及低成本的制备工艺，明确其酶学特性及工业应用条件，是α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶资源产业化利用的有效手段。
发明内容
发明目的：针对现有市场耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶制剂产品的不足，本发明的目的是提供一种来源于微细正青霉4-14中的钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C，使其具有高效的催化能力、良好的热稳定性和pH稳定性。本发明的另一目的是提供上述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的制备技术和应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
经蛋白同源性比对发现α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C属于糖苷水解酶家族62成员。其最适pH为4.5，最适温度为65℃，pH稳定性好；钙离子对于该酶的热稳定性具有关键作用，在存在钙的情况下，其在55 ℃下能稳定5天，50℃下能稳定至少7天；该酶对阿拉伯木聚糖的比活性高，对黑麦阿拉伯木聚糖的比活性高达205.24 U/mg。
所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的编码基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
含有所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C编码基因的表达载体M13-EpABF62C。
一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的制备技术。以原生质体法将重组载体M13-EpABF62C导入瑞氏木霉，获得重组菌株；用含1%乳糖作碳源的Mandels培养基对重组菌株进行发酵，诱导目标酶表达；用镍柱系统纯化所表达的目标酶。该制备技术具有简单、高效和低成本的特点。
所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C在酶解小麦阿拉伯木聚糖制备单糖和低聚糖中的应用。
制备的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C经过CaCl2溶液饱和处理。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C与内切型木聚糖酶EpXYN1协同作用酶解小麦阿拉伯木聚糖，制备阿拉伯糖、木糖和低聚糖；α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C与内切型木聚糖酶EpXYN1协同作用降解去淀粉小麦麸皮制备还原糖。
用于扩增所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C基因的特异性引物，包括以下两条序列：
上游引物：5′-ttggccacagctcgtgctcagtcggactgcgcacttccgtcga-3′；
下游引物：
5′-ctttcgcacggagctctcgagtcagtgatggtgatggtgatgattcttcagggtaagca-3′。
有益效果：与现有技术相比，本发明从微细正青霉4-14中克隆得到钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的编码基因，并通过瑞氏木霉对其重组载体进行表达，获得纯酶。通过试验证实，本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C具有生产成本低、高比活性、高热稳定性、高pH稳定性等优势，该酶与内切型木聚糖协同作用下，能够显著提高小麦阿拉伯木聚糖和小麦麸皮的酶解效果，在医药保健、食品、饲料以及生物能源等领域具有重要应用前景。
附图说明
图1是重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的SDS-PAGE电泳图；图中，M：蛋白分子量；1，瑞氏木霉转化子a表达获得的目标α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶纯酶；2，瑞氏木霉转化子b表达获得的目标α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶纯酶；
图2是重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的最适pH结果图；A，以小麦阿拉伯木聚糖为底物进行测定；B，以黑麦阿拉伯木聚糖为底物进行测定。
图3是重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的最适温度结果图；
图4是金属离子对α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C活性影响的结果图；
图5 是重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的pH稳定性结果图；
图6是钙离子对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C热稳定性影响的测定结果图；
图7是重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的温度稳定性结果图；
图8是重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C与内切型木聚糖酶EpXYN1协同降解小麦阿拉伯木聚糖的产物HPLC分析图谱；A，阿拉伯糖；X1，木糖；X2，木二糖；X3，木三塘；U，未鉴定的低聚糖；
图9 重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C协同木聚糖酶降解小麦麸皮的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例所使用的材料和试剂如下：
菌株及载体：微细正青霉4-14（Eupenicilliumparvum 4-14），于2015年6月25日由中国典型培养物保藏中心保藏(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号为CCTCC No: M2015404。
瑞氏木霉（Trichoderma reesei）D-86271（=Rut-C30)购于芬兰 VTT 培养物保藏中心，大肠杆菌Top10及基因操作质粒pEASY-Blunt购自北京全式金生物技术有限公司（TransGen Biotech）。
酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA 聚合酶、连接酶和dNTP 购自北京全式金生物技术有限公司（TransGen Biotech）；小麦阿拉伯木聚糖和黑麦阿拉伯木聚糖购至爱尔兰Megazyme公司；木糖、阿拉伯糖和低聚木糖的标准品为美国Sigma公司产品；其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
LB 培养基：蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，加蒸馏水至1000 mL，pH自然（约为6.5-7.0）。固体培养基在此基础上加1.5%（w/v）琼脂粉。
PDA培养基：土豆200 g, 葡萄糖 20 g，琼脂粉 15 g，加蒸馏水至1000 mL。
再生培养基：蔗糖 15.06 g，酵母膏 0.3 g，蛋白胨 0.6 g，加蒸馏水至100 mL。
Mandels 培养基：KH2PO4 2 g，(NH4)2SO4 1.4 g，尿素0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，葡萄糖10 g，微量元素浓缩液 1 mL，加蒸馏水至1000 mL。其中微浓配方：CoCl2·6H2O 3.7 g，ZnSO4·7H2O 1.4 g，MnSO4·H2O 1.6 g，FeSO4·7H2O 5.0 g，加蒸馏水定容至1000 mL。
以上培养基经121℃、20 min高压蒸汽灭菌后使用。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J. 萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C编码基因的克隆
真菌培养与总RNA提取：取约10 mg微细正青霉4-14菌株的菌丝孢子混合物接入50 mLPDA液体培养基中，37 ℃、180 rpm培养4 天。取1mL培养物接入一瓶固态发酵培养基（L.Long, D. Ding, Z. Han, H. Zhao, Q. Lin, S. Ding, Thermotoleranthemicellulolytic and cellulolytic enzymes from Eupenicillium parvum 4-14display high efficiency upon release of ferulic acid from wheat bran, Journal of Applied Microbiology, 2016, 121: 422-434）中，摇匀后置于37 ℃、70% 湿度条件下静置培养3 天。取白色菌丝体以无菌水漂洗干净后，滤纸吸干水分，液氮速冻后置于-70 ℃保存。以TransZolTM Plant试剂盒（TransGen，北京）提取菌体总RNA。
基因克隆：取适量总RNA 以EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix 试剂盒 (TransGen，北京) 和oligo (dT) 为引物进行反转录反应获得cDNA。以获得 cDNA为模板，以引物Abf62_f1（5′- attcaaaccatcgcttgaccaa-3′）和Abf62_r1（5′-catctaccgccgcacatct-3′）进行常规PCR反应，获得目标基因片段。进一步，将目标基因片段克隆到载体pEASY-Blunt (TransGen Biotech，北京)，并由苏州金唯智生物技术有限公司完成序列分析。
得到含有α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的基因全长的片段。测序结果显示，该α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C基因全长984 bp，DNA序列见SEQ ID NO.2，表达的蛋白（α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C）序列见SEQ ID NO.1，其阅读框包含 328个氨基酸，其中前26个氨基酸为信号肽。经蛋白同源性比对发现其属于碳水化合物水解酶家族62成员，成熟蛋白的理论分子量为32.82 kDa，理论等电点（pI）为5.89。
实施例2 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的瑞氏木霉表达及纯化
1)真菌表达质粒的构建
分别设计合成表达α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的特异性引物Abf62_f2和Abf62_r2，如下：
Abf62_f2：5′-ttggccacagctcgtgctcagtcggactgcgcacttccgtcga-3′；
Abf62_r2：
5′-ctttcgcacggagctctcgagtcagtgatggtgatggtgatgattcttcagggtaagca-3′。
利用以上引物以含有α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C基因的质粒为模板扩增获得其不含信号肽的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C基因片段，并进行切胶纯化。重组质粒M13-Pcbh1s/Tcbh1经限制性内切酶XhoI线性化，并进行切胶纯化。以限制性内切酶KpnI和XbaI酶切质粒pAg-PTcbh1（L. Long, H. Zhao, D. Ding, M. Xu, S. Ding,Heterologous expression of two Aspergillus niger feruloyl esterases in Trichderma reesei for the production of ferulic acid from wheat bran,Bioprocess and Biosystems Engineering. 2018，41：593-601）切下5.1 kb 长度的片段Pcbh1s-TcbhI-hph，并将该片段与经同样酶切的质粒pBluescript I KS(+)（Stratagene，美国）连接，获得质粒M13-PTcbh1。质粒M13-PTcbh1经限制性内切酶XhoI线性化处理后，切胶纯化，并与扩增和纯化的EpABF62C基因片段进行同源重组，获得表达质粒M13-EpABF62C。
2)瑞氏木霉重组菌株的构建
以瑞氏木霉（T. reesei） D-86271 (=Rut-C30)（保存于 VTT Culture Center, 芬兰）作为表达宿主。将瑞氏木霉D-86271接种到PDA平板，于28 ℃下培养6天，以棉芯过滤法收集真菌孢子。将真菌孢子配置成浓度为107个/mL悬液，分别取200 μL孢子悬液，均匀涂布于5个铺有玻璃纸的PDA平板上，28 ℃培养20小时。取20 mL Solution A (0.1 M KH2PO4, 1.2M Sorbitol)，加入终浓度5 mg/mL 的Lysing enzymes（Sigma L1412, 美国）和10 mg/mL的Zymolyase® (Nacalai Tasque, Kyoto, 日本) 配制成裂解酶溶液。将带有已萌发木霉菌丝的玻璃纸从PDA平板上揭下，并将菌丝转移至含有裂解酶溶液的平皿中，30℃、80 rpm温浴2小时，直至产生大量的原生质体。以4层擦镜纸过滤酶解液，收集原生质体悬液，室温下3,000 rpm离心4 min，收集原生质体到2-mL 离心管中。将原生质体用2 mL的Solution B(50 mM CaCl2, 1 M Sorbitol, 10 mM Tris·HCl, pH 7.5)重悬，室温下3,000 rpm离心4min，弃上清；重复该步骤2次。以适量Solution B重悬，将原生质体悬浮至浓度为1×108个/ml左右，放置冰上待用。
取200 μL 制备好的原生质体中加入10-20 μg (10-20 μL) 质粒M13-EpABF62C，冰浴20 min。加1-2 mL PEG-CaCl2转化液，轻轻混匀，室温静置20 min。加1-2 mL再生培养基（液体，含0.44 M蔗糖），轻轻混匀，室温静置2 min （可在10-mL或50-mL离心管中进行）。加4-8 mL再生培养基，28℃静止培养20 h （可加入200 µg/mL的Cefotaxime Sodium以防止污染）。3000 rpm离心5 min，弃上清（如已长成菌丝，可用滤纸过滤收集）。取200 µL 悬液涂布含50 µg/mL 潮霉素B的PDA筛选板，共涂布3个平板。28 ℃培养3-5天，直至转化子长出，并在同样抗性的PDA板上继代2次，以获得稳定的转化子。获得的真菌转化子经PCR扩增鉴定(目的基因特异性引物)，即得到瑞氏木霉工程菌株。
3)瑞氏木霉工程菌株的发酵及酶的纯化
取瑞氏木霉工程菌株接种于PDA平板培养，28 ℃培养，直至产生大量墨绿色孢子。取1×108个孢子接入50 mL Mandels 培养基，并于28℃和180 rpm条件下培养2 d，制备成种子液。取10 mL种子液接入200 mL Mandels 培养基（以1%乳糖替代葡萄糖作为碳源），于28℃和160 rpm条件下诱导培养6 d。从第3 d开始以1 M的NaOH溶液调节发酵液pH至4.5-5.0。发酵结束后，以100 目筛网过滤发酵物，获得发酵上清液。离心法超滤（滤膜截留分子量为3000）对发酵液液进行超滤浓缩至20 mL，并参照Ni-NTA Agarose（Qiagen，德国）的方法对目标酶进行分离纯化，纯酶保存于储存缓冲液（25 mM Tris·HCl, 150 mM NaCl）中。蛋白定量分析采用BCA检测试剂盒（Thermo Tech, 美国）完成。将纯化得到的蛋白利用SDS-PAGE进行检测。结果如图1所示，可见重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C在瑞氏木霉菌株中成功表达，经纯化后为单一条带，分子量接近33 kDa。实际分子量大小与理论分子量（33.86kDa，包括组氨酸标签）接近。计算得出，每毫升发酵液中能够获得33.6 μg纯酶。
实施例3α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的酶学特性
3.1 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的活性测定方法
以天然阿拉伯木聚糖（小麦阿拉伯木聚糖或黑麦阿拉伯木聚糖）为底物，在pH 4.5的醋酸钠缓冲液中测定α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的活性。取40 μL醋酸钠（0.1 M，pH4.5）缓冲液，加入50 μL浓度为10 mg/mL的阿拉伯木聚糖，置于65℃预热5 min，加入10 μL浓度为25 ng/μL的酶液。将混合物于65℃下反应20 min，并在99 ℃下处理10 min 终止反应。反应混合物于冰上冷却，并以灭活酶液作对照。
采用Somogyi-Nelson法（N. Nelson, A photometric adaptation of theSomogyi method for the determination of glucose. Journal of Biological Chemistry. 1944,153(2): 375-379）对酶促反应释放的还原糖（阿拉伯糖）进行定量分析并计算酶活性。将100 μL反应物与100 μL蒸馏水混合后，加入200 μL Somogyi Reagent溶液，放入99℃水浴锅中热处理20 min；冷却置室温，加入200 μL Nelson Reagent，充分混匀，5 min反应后，加入2 mL蒸馏水稀释，静置10 min；吸取1 mL样品置于分光光度计，读取波长540 nm下样品的吸光度（OD值）。同时，分别配制浓度为50、100、150、200和250 μg/mL的标准阿拉伯糖溶液，以上述方法（Somogyi-Nelson法）测定各阿拉伯糖溶液的OD 540读数。以阿拉伯糖溶液浓度为横坐标和OD 540读数为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线为：y=0.0037x-0.0352; 其中，y为OD 540读数，x为阿拉伯糖浓度（µg/mL）。根据标准曲线计算样品中阿拉伯呋喃糖苷酶活性。一个α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活单位(U)指每分钟产生1 μmol 阿拉伯糖所需的酶量。阿拉伯呋喃糖苷酶活性计算公式如下：
酶活性（U/mL）=
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，X为根据阿拉伯糖标准曲线算出的阿拉伯糖含量(μg)；M为阿拉伯糖的摩尔质量(150.13 g/mol)；C为酶液体积(mL)；T为酶解作用时间(min)；n=酶液的稀释倍数。
3.2 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C酶学特性的测定
1）α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的最适催化pH和温度
最适催化pH：配制浓度为0.1 M具有不同pH值的缓冲液，分别为：甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.5-3.5), 乙酸钠缓冲液 (pH 3.5-6.0), 磷酸钠缓冲液(pH 6.0-8.0) 和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 (pH 8.0-10.0)。分别以小麦阿拉伯木聚糖或燕麦阿拉伯木聚糖为底物，按照实施例3.1中的方法，分别测定α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C在不同pH下的活性。设置灭活的酶作为对照。以测定的最高活性为100%，计算不同pH下的相对酶活。结果如图2所示，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpAbf62C在酸性条件下具有高的活性，最适pH为4.5。
最适催化温度：分别以小麦阿拉伯木聚糖或黑麦阿拉伯木聚糖为底物，按照实施例3.1中的方法，分别测定α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C在不同温度下（30-90℃，间隔5℃）的活性。以测定的最高活性为100%，计算不同温度下的相对酶活。结果如图3所示，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的最适反应温度为65℃。
2）金属离子对α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C活性的影响
在50 mM醋酸钠缓冲液（pH4.5）中，分别添加终浓度为1 mM的MgCl2 (Mg2+), CaCl2(Ca2+), CoCl2 (Co2+), NiSO4 (Ni2+), FeSO4 (Fe2+), MnSO4 (Mn2+), ZnSO4 (Zn2+) 或CuSO4 (Cu2+)，或者添加终浓度为1 或5 mM的EDTA (钠盐)，按照实施例3.1中的方法，分别测定α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的酶活。以未处理组作为对照，计算各处理的相对酶活。结果如图4所示，Mg2+、Ca2+、Ni2+或Co2+对酶活性没有影响。Fe3+、Zn2+、Mn2+和Cu2+对该酶的活性具有明显的抑制作用，残余的酶活为44.90%-64.70%。低浓度(1 mM)EDTA的添加对酶活性无明显影响，高浓度（5 mM）EDTA添加使得酶活性降低15%。
3）α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的pH稳定性
将纯化的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C与上述不同pH的缓冲液混合，使得缓冲液的盐浓度为50 mM，酶浓度为0.1 μg/μl，于4 ℃下放置24 h后，按照实施例3.1中的方法检测残余酶活。以未经处理的酶活为100%，计算相对酶活。结果如图5所示，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C具有高的pH稳定性，经pH2.0-11.0处理后，剩余活性均达到90%以上。
4）α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C钙依赖的热稳定性
取300 μL α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的纯蛋白（2 μg/μL）装入 Slide-A-LyzerTM G2 透析盒(Thermo scientific, USA), 置于100 mL含有50 mM EDTA的储存缓冲液（25 mM Tris·HCl, 150 mM NaCl）中透析处理20小时（4 ℃下进行），继续置于100 mL不含EDTA的储存缓冲液中透析处理8小时，共进行3次。最终，获得去除二价金属离子和EDTA的纯酶。将获得的纯酶稀释至0.1 μg/μL，取50 μL分别与 CaCl2 (Ca2+), CoCl2 (Co2+),NiSO4 (Ni2+)或MgCl2 (Mg2+)混合，至金属离子的终浓度为5 mM，冰上静置1 h。同时，设置不添加金属离子的对照。将经过不同处理的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C（0.1μg/μL）置于60 ℃下处理0.5、4和24 h后，按照实施例3.1中的方法测定剩余的酶活性。以各处理的初始酶活性为100%计算相对酶活。结果如图6所示，经Ca2+处理后的酶在热处理24 h后仍能保存81.29%的残余酶活；经其金属离子处理的酶的残余酶活较对照组有一定的提高，但仍呈快速下降的趋势。由此可见，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的热稳定性依赖于钙的存在。
取α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C以50 mM的醋酸钠（pH 5.0）稀释至 0.1 μg/μL，并加入终浓度5 mM CaCl2冰上处理1 h后，分别置于50 ℃、55 ℃和60 ℃中分别孵育4-168 h，并按照实施例3.1中的方法检测残余酶活，以各处理的初始酶活性为100%计算相对酶活。结果如图7所示，EpABF62C在50 ℃中放置168 h仍能保持90 %的活性，在55 ℃下能稳定120 h（80%以上活性)，在60 ℃放置4 h后会快速失去活性。
5）α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的比活力及动力学常数测定
按照实施例3.1中的方法，分别测定α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C对小麦阿拉伯木聚糖或黑麦阿拉伯木聚糖的酶活性，并计算比活力。同时，分别在50 mM的醋酸钠缓冲液（pH4.5）中加入0.5-10 mg/mL（梯度浓度）的小麦阿拉伯木聚糖或黑麦阿拉伯木聚糖作为底物，并加入250 ng（对小麦阿拉伯木聚糖）或125 ng（对黑麦阿拉伯木聚糖）的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C，并按照实施例3.1中方法分别测定酶活性。酶动力学常数的数据利用Graphpad Prism 7.04软件进行非线性回归分析计算该酶的动力学常数。实验结果如表1所示：EpABF62C对黑麦阿拉伯木聚糖具有最高的催化活性，针对该底物的比活力为205.24 U/mg，V max为321.80 U/mg；K m为4.27 mg/mL；K cat为181.59 s-1。
表 1 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的比活力和动力学参数
底 物 比活力(U/mg) <i>K</i><sub>m</sub>(mg/mL) <i>V</i><sub>max</sub>(µmol/mg) <i>K</i><sub>cat</sub>(s<sup>-1</sup>)
小麦阿拉伯木聚糖 44.86±3.24 6.22±0.79 75.13±4.07 42.40±2.30
黑麦阿拉伯木聚糖 205.24±5.51 4.27±0.48 321.80±16.63 181.59±9.38
注: 以上数据在pH4.5的醋酸钠缓冲液（50 mM）和65℃下测定。
实施例4 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C在协同降解小麦阿拉伯木聚糖和小麦麸皮中的应用
按实施例2中的方法制备α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C，并以终浓度5 mM CaCl2对酶进行饱和处理。按文献方法制备木聚糖酶EpXYN1（L. Long, M. Xu, Y. Shi, Q. Lin,J. Wang, S. Ding, Characterization of two new endo-β-1,4-xylanases fromEupenicillium parvum 4-14 and their applications for production of feruloyloligosaccharides. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2018,186: 816-833）。取50 μL小麦阿拉伯木聚糖（10 mg/mL）与100 μL醋酸钠缓冲液（0.1 M，pH 4.5）混合，分别加入木聚糖酶EpXYN1或α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C，或同时加入两种酶（酶的添加量为0.5 μg/酶），以无菌水不足体积至200 μL，混匀后置于55 ℃反应24 h，并99 ℃灭活10min终止反应。取100 μL反应液与400 μL乙醇（99%纯度）混匀，冰上沉淀1小时，9,000 g×离心10分钟后，吸取375 μL上清进行真空干燥，最终以75 μL超纯水重溶。以高效液相色谱（HPLC）进行产物分析。检测条件：Shodex糖类分析柱（SH 1821），流动相为0.01 N硫酸，流速为0.8 mL/min，柱温60℃，进样量5 μL，以示差折射检测器进行检测。结果如图8及表2所示，可知：α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C单独水解的产物仅为阿拉伯糖；木聚糖酶EpXYN1单独作用的产物包括木糖、木二糖、木三糖和未鉴定的寡糖U；两种酶共同作用下，木糖的释放量提高了238%，木二糖的释放量提高了65%，未鉴定的低聚糖U释放量也显著提高（峰面积提高了150%）。可知，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpAbf62C能够协同木聚糖酶将小麦阿拉伯木聚糖转化为单糖和寡糖。
表2 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C与木聚糖酶EpXYN1降解小麦阿拉伯木聚糖产物分析
Figure DEST_PATH_IMAGE002
注：“ND”表示没有检测到。
同时，将市场购买的小麦麸皮按照文献方法（L. Long, D. Ding, Z. Han, H.Zhao, Q. Lin, S. Ding, Thermotolerant hemicellulolytic and cellulolyticenzymes from Eupenicillium parvum 4-14 display high efficiency upon releaseof ferulic acid from wheat bran. Journal of Applied Microbiology, 2016, 121:422-434）进行去淀粉处理，获得去淀粉小麦麸皮并进行80目筛网过筛，60 ℃下烘至恒重，密闭备用。在1 mL的反应体系中，分别加入：500 μL的醋酸钠缓冲液（0.1 M，pH 4.5）、30 mg的去淀粉小麦麸皮、10 μg的木聚糖酶EpXYN1或10 μg的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C，或同时加入两种酶（10 μg /酶），混匀后置于50 ℃、200 rpm下反应72 h，并99 ℃灭活10min终止反应。每隔24 h取20 μL样品稀释10-20倍，以Somogyi-Nelson法测定总还原糖的释放量。结果如图9所示：相比于两种酶单独作用，EpABF62C与木聚糖酶EpXYN1协同作用下释放的还原糖总量提高了37%。
序列表
<110> 南京林业大学
中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所
<120> 一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因、制备技术和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 328
<212> PRT
<213> 微细正青霉(Eupenicillium parvum)
<400> 1
Met Ala Pro Leu Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Ala Ser Gly Ala Pro
1 5 10 15
Leu Leu Ala Ser Val Pro Val Val Ala Ala Ala Cys Ala Leu Pro Ser
20 25 30
Thr Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Leu Ala Ala Pro Leu Ser Gly
35 40 45
Thr Thr Ala Ile Leu Ala Pro Ser Ala Val Val Pro Ala Ala Ala His
50 55 60
Ile Val Thr Ala Ser Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ser Met
65 70 75 80
Ala Pro Gly Thr Pro Ser Ala Thr Ser Gly Met Ala Ser Ala Ser Gly
85 90 95
Ala Leu Met Ser Pro Ser Ala Val Ala Pro Thr Leu Pro Thr Pro Gly
100 105 110
Pro Leu Ala Ile Thr Val Leu Ala Thr Gly Thr Gly Ser Ser Thr Pro
115 120 125
Thr Thr Ala Thr Ser Ala Ala Pro Thr Ala Ala Ala Gly Thr Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Ala Leu Pro Ser Gly Gly Ile Thr Gly Ser Ser Thr Gly Ala
145 150 155 160
Ile Ala Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Thr His Met Thr Leu Pro Pro
165 170 175
Ala Gly Ala Ala Gly Leu Ile Thr Ala Ser Ser Met Pro Ile Ala Ala
180 185 190
Pro Pro Gly Ala Pro Gly Thr Ser Ser Gly Val Val Leu Ser Ala Ser
195 200 205
Gly Ala Ala Leu Pro Gly Ala Val Gly Val Thr Thr Val Leu Gly Gly
210 215 220
Ala Leu Thr Leu Met Ile Val Gly Ala Ile Gly Ser Gly Gly Ala Thr
225 230 235 240
Pro Ala Ser Pro Thr Ala Thr Ser Leu Gly Gly Ser Thr Thr Pro Gly
245 250 255
Ala Thr Ser Gly Ser Gly Pro Pro Ala Gly Leu Ala Ala Ser Gly Ala
260 265 270
Thr Thr Thr Ala Ala Ile Ser His Gly Ala Leu Val Ala Thr Ala Pro
275 280 285
Ala Gly Thr Met Thr Ile Ala Pro Cys Ala Leu Gly Pro Leu Thr Gly
290 295 300
Gly Leu Ala Pro Ser Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Leu Pro Thr Ala
305 310 315 320
Pro Gly Val Leu Thr Leu Leu Ala
325
<210> 2
<211> 984
<212> DNA
<213> 微细正青霉(Eupenicillium parvum)
<400> 2
atgagattcc tcaaggcaaa agctggccta gtggcatctg gcgcatttct tctcgcgtca 60
gtgccagttg ttgccgccga ctgcgcactt ccgtcgactt atagttggac atcaactggc 120
cctctggcga atcccaagtc cggatggacg gcaatcaagg acttcagcaa tgtggtcttc 180
aacaacaatc atattgtgta cgcatcaacg accgacgcaa atgggaacta cggctcgatg 240
aacttcggca ccttttcgga ttggtctggt atggcatccg cgagtcaaaa caaaatgagc 300
ttttcagcgg ttgcgcccac attgttctac ttccagccga agaacatttg ggtcctggcc 360
tatcaatggg gctcgagcac gtttacctac cgaacatcga atgaccctac caatgccaat 420
ggatggtcat cggagcaagc cctcttttct ggacaaatca caggctcgag tactggtgct 480
attgaccaga ctcttatcgg tgactctacg catatgtacc ttttctttgc gggagacaat 540
ggcaagatct atcgctccag catgcctatc aacaatttcc ctggaaactt cggaacaagt 600
tcagaggtgg tgctgagtga cagtcagaac aacctgttcg aggcagttca ggtctacact 660
gtcaaaggcc aaaacaagta cttgatgatc gtcgaggcaa ttggctcgca agggcggtat 720
ttccgttcat tcactgccac cagtctcggc ggttcgtgga caccacaggc aacaagcgag 780
agccagcctt tcgctggaaa ggccaacagc ggcgcaacat ggaccaacga catcagtcac 840
ggcgatttgg ttcgcaccaa ccctgaccag accatgacca tcgatccttg caacctgcaa 900
ttcctctacc agggaaaaaa cccaagcgcc ggtggcaact ataatactct gccgtggagg 960
ccgggtgtgc ttaccctgaa gaat 984
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Abf62_f1序列(Artificial)
<400> 3
attcaaacca tcgcttgacc aa 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Abf62_r1序列(Artificial)
<400> 4
catctaccgc cgcacatct 19
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> Abf62_f2序列(Artificial)
<400> 5
ttggccacag ctcgtgctca gtcggactgc gcacttccgt cga 43
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> Abf62_r2序列(Artificial)
<400> 6
ctttcgcacg gagctctcga gtcagtgatg gtgatggtga tgattcttca gggtaagca 59

Claims (7)

1.一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的编码基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求2所述的钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的编码基因的表达载体M13-EpABF62C。
4.一种钙依赖型耐热阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的制备技术，其特征在于，包括以下步骤：
1）以权利要求3的重组载体以原生质体法转化瑞氏木霉，获得重组菌株；
2）用含1%乳糖作碳源的Mandels培养基对重组菌株进行诱导培养；
3）用镍柱系统纯化所表达的钙依赖型耐热阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C。
5.权利要求1所述的耐热阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C在制备单糖和低聚糖中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，
1）以权利要求4制备的钙依赖型耐热阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C经过CaCl2溶液饱和处理；
2）钙依赖型耐热阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C与内切型木聚糖酶协同作用酶解小麦阿拉伯木聚糖，制备阿拉伯糖、木糖和低聚糖；
3）钙依赖型耐热阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C与内切型木聚糖酶协同作用降解去淀粉小麦麸皮制备还原糖。
7.用于扩增权利要求4所述的耐热阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C基因的特异性引物，其特征在于，包括以下两条序列：
上游引物：5′-ttggccacagctcgtgctcagtcggactgcgcacttccgtcga-3′；
下游引物：5′-ctttcgcacggagctctcgagtcagtgatggtgatggtgatgattcttcagggtaagca-3′。
CN202010047484.0A 2020-01-16 2020-01-16 一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因、制备技术和应用 Active CN111117986B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010047484.0A CN111117986B (zh) 2020-01-16 2020-01-16 一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因、制备技术和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010047484.0A CN111117986B (zh) 2020-01-16 2020-01-16 一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因、制备技术和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111117986A true CN111117986A (zh) 2020-05-08
CN111117986B CN111117986B (zh) 2022-04-22

Family

ID=70489519

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010047484.0A Active CN111117986B (zh) 2020-01-16 2020-01-16 一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因、制备技术和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111117986B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115109735A (zh) * 2021-03-22 2022-09-27 山东大学 一株高产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用
CN116179516A (zh) * 2022-12-29 2023-05-30 云南师范大学 一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006125438A1 (en) * 2005-05-24 2006-11-30 Novozymes A/S Penicillium capsulatum arabinofuranosidase
CN101128580A (zh) * 2004-12-22 2008-02-20 诺维信公司 用于淀粉加工的酶
CN104988077A (zh) * 2015-07-29 2015-10-21 南京林业大学 一种产高温纤维素酶及木聚糖酶的微细正青霉及应用
CN107208080A (zh) * 2014-12-19 2017-09-26 诺维信公司 包括具有木聚糖酶活性的多肽和具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽的组合物
CN110621781A (zh) * 2017-05-30 2019-12-27 诺维信公司 淀粉提取方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101128580A (zh) * 2004-12-22 2008-02-20 诺维信公司 用于淀粉加工的酶
WO2006125438A1 (en) * 2005-05-24 2006-11-30 Novozymes A/S Penicillium capsulatum arabinofuranosidase
CN107208080A (zh) * 2014-12-19 2017-09-26 诺维信公司 包括具有木聚糖酶活性的多肽和具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽的组合物
CN104988077A (zh) * 2015-07-29 2015-10-21 南京林业大学 一种产高温纤维素酶及木聚糖酶的微细正青霉及应用
CN110621781A (zh) * 2017-05-30 2019-12-27 诺维信公司 淀粉提取方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AYAKA SHINOZAKI等: "Identification and characterization of three Penicillium chrysogenum α-l-arabinofuranosidases (PcABF43B, PcABF51C, and AFQ1) with different specificities toward arabino-oligosaccharides", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY.》 *
KJAERBOLLING,I.等: "arabinoxylan arabinofuranohydrolase [Aspergillus avenaceus]", 《GENBANK DATABASE》 *
LONG,L.DENG: "Penicillium parvum strain 4-14 alpha-L-arabinofuranosidase (ABF62C) mRNA, complete cds", 《GENBANK DATABASE》 *
SAKAMOTO,T.等: "Penicillium chrysogenum axs5 gene for alfa-L-arabinofuranosidase, complete cds", 《GENBANK DATABASE》 *
VAN DEN BERG M.A.: "Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 complete genome, contig Pc00c20", 《ENA》 *
丁少军: "利用真菌纤维素结合域（CBD）保守性序列进行草菇木聚糖酶cDNA的克隆", 《中国生物化学与分子生物学报》 *
陈小燕: "双功能木聚糖酶XynBE18分子催化机理的初步研究及其与阿拉伯呋喃糖苷酶的协同作用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115109735A (zh) * 2021-03-22 2022-09-27 山东大学 一株高产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用
CN115109735B (zh) * 2021-03-22 2024-04-30 山东大学 一株产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用
CN116179516A (zh) * 2022-12-29 2023-05-30 云南师范大学 一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用
CN116179516B (zh) * 2022-12-29 2024-01-26 云南师范大学 一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111117986B (zh) 2022-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xu et al. Strain improvement for enhanced production of cellulase in Trichoderma viride
CN112481240B (zh) 一种gh16家族耐热葡聚糖酶突变体及其构建方法与应用
CN109385413B (zh) 葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用
CN105018448B (zh) 一种真菌来源的耐热酸性纤维素酶及其基因和应用
CN111117986B (zh) 一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因、制备技术和应用
CN107142253A (zh) 一种高催化效率且耐高温木聚糖酶突变体及其制备方法和应用
CN107586767B (zh) 一种耐热内切型木聚糖酶EpXYN1及其编码基因和应用
Chimtong et al. Isolation and characterization of endocellulase-free multienzyme complex from newly isolated Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum strain NOI-1
CN106916752B (zh) 制备纤维素酶和/或木聚糖酶的方法及其专用菌株
Chi et al. A novel alkaliphilic xylanase from the newly isolated mesophilic Bacillus sp. MX47: production, purification, and characterization
CN109371004B (zh) 热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体K203E及其基因和应用
CN102363774B (zh) 一种具有宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A及其基因和应用
CN1952115A (zh) 一种低温淀粉酶菌株、低温淀粉酶及其生产方法
CN111575261B (zh) 一种耐热耐酸木葡聚糖酶基因及其表达蛋白与应用
CN105154417B (zh) 一种真菌来源的酸性纤维素酶及其基因和应用
CN116144571B (zh) 一种不依赖于抗生素并稳定高产α-淀粉酶的短小芽孢杆菌及其构建方法和应用
CN110093326B (zh) 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用
CN105219664B (zh) 一种重组基因工程菌构建及高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的制备与应用
CN115029335B (zh) 一种耐高温木聚糖酶突变体及其应用
Driss et al. Purification and properties of a thermostable xylanase GH 11 from Penicillium occitanis Pol6
CN104130989B (zh) 中温酸性淀粉酶Amya及其基因和应用
CN116179517A (zh) 一种葡聚糖酶突变体及其应用
CN114381448A (zh) 一种葡聚糖酶突变体及其应用
CN111100853B (zh) 木聚糖酶xyn11A及其编码基因与应用
CN108277176B (zh) 一种嗜碱链霉菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20231018

Address after: 210000 No.4 jiangwangmiao, Xuanwu District, Nanjing, Jiangsu Province

Patentee after: Nanjing Huahui Tiancheng Biopharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: Longpan road Xuanwu District of Nanjing city of Jiangsu Province, No. 159 210037

Patentee before: NANJING FORESTRY University

Patentee before: NANJING INSTITUTE FOR THE COMPREHENSIVE UTILIZATION OF WILD PLANTS, CHINA COOP