CN104988077A - 一种产高温纤维素酶及木聚糖酶的微细正青霉及应用 - Google Patents

一种产高温纤维素酶及木聚糖酶的微细正青霉及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种土壤真菌微细正青霉，其分类命名为微细正青霉4-14（Eupenicillium parvum 4-14），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年6月25日，保藏号为CCTCC No: M2015404。本发明公开土壤真菌微细正青霉在生产高温纤维素酶和木聚糖酶方面的应用。本发明公开一种发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法。本发明菌株能以小麦杆和小麦麸皮为主要原料，发酵合成高活性的纤维素酶和木聚糖酶。同时，发酵产纤维素酶和木聚糖酶具有高温（70-75℃）和低pH（4.5-5）的催化特性，具有优良的温度和pH稳定性。本发明对耐高温纤维素酶和木聚糖酶资源的工业利用具有重要价值。

Description

一种产高温纤维素酶及木聚糖酶的微细正青霉及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种产高温纤维素酶及木聚糖酶的微细正青霉及应用。
背景技术
纤维素酶是能将纤维素降解为葡萄糖单体的一组酶的总称，通常包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。木聚糖酶则是一类能降解木聚糖类半纤维素为寡糖或低聚糖的酶系总称。纤维素酶和木聚糖酶是可持续利用生物质资源的重要工具，其在生物能源,饲料、洗涤、造纸及植物源活性物质制备等领域具有重要应用价值。当前,已报道的纤维素酶及木聚糖酶资源仍然存在活性低、作用温度或pH范围窄及生产成本高等问题，难以全面达到工业化应用的要求。
丝状真菌是重要的纤维素酶及木聚糖酶产生菌，涉及到的类群主要为木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)及枝顶孢霉属(Acremonium)菌株。这些种类的菌株所产纤维素酶或木聚糖酶具有较好的活性，但耐高温性能通常不好。耐高温酶具有使用成本低、易于保存和运输等优势，利于工业应用，因此开发耐高温纤维素酶和木聚糖酶具有重要价值。
发明内容
发明目的：本发明的第一个目的是提供一种土壤真菌微细正青霉。
本发明的第二个目的是提供上述的土壤真菌微细正青霉在生产高温纤维素酶和木聚糖酶方面的应用。
本发明的第三个目的是提供一种发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种土壤真菌微细正青霉，其分类命名为微细正青霉4-14(Eupenicillium parvum 4-14)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年6月25日，保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，保藏号为CCTCC No：M2015404。
其中，上述土壤真菌微细正青霉菌株的生长温度为28℃～45℃。
其中，上述土壤真菌微细正青霉菌株的最适生长温度为37℃。
上述的土壤真菌微细正青霉在生产高温纤维素酶和木聚糖酶方面的应用。
其中，上述土壤真菌微细正青霉菌株能够以小麦杆和麸皮为基料发酵产生高温纤维素酶和木聚糖酶。
一种发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法，包括以下步骤：
1)取少量微细正青霉4-14真菌菌块接种于50mL PDA培养液，37℃、200rpm下振荡培养7d得到菌悬液；
2)取1mL菌悬液接入固态发酵培养基中，并于37℃、70％湿度条件下黑暗发酵培养9d；
3)发酵结束后，按每发酵瓶加入30mL无菌水，搅拌均匀，并于28℃、120rpm振荡浸提2h，继续以7000rpm离心20min得到粗酶液，将粗酶液转入新的离心管中，加入终浓度0.1％叠氮钠，于4℃冰箱保存。
其中，上述固态发酵培养基包括脱木素后的麦杆1.5g，麸皮1.5g，不含羧甲基纤维素钠的10×Mandels培养基5mL。
其中，上述麦杆的脱木素方法：按每10g麦杆加入20mL 4％NaOH溶液，混匀后，121℃、20min处理，并以流水去除褐色物质，处理后的麦杆晾干即可。
其中，上述发酵粗酶液的SDS-PAGE分析图谱中，主要胞外蛋白分布于35-130kDa分子量范围，其中，羧甲基纤维素钠的降解酶(CMC酶)条带处于50-55kDa之间，而木聚糖酶条带处于60-70kDa之间。
其中，上述CMC酶最适反应温度为70℃，80℃仍有70％以上的活性；β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为70℃，75℃活性仍达95％；木聚糖酶的最适反应温度为75℃，在85℃时仍然有70％的活性，温度稳定性为：CMC酶在50℃和60℃下分别处理4h残余酶活达85％和80％；木聚糖酶60℃处理4h，残余酶活接近70％；β-葡萄糖苷酶在40℃时热稳定性好，处理4h，残余酶活高于80％
有益效果：本发明具有以下优点：本发明从土壤中分离获得了一株微细正青霉(Eupenicillium parvum)，该菌株可以利用天然基质发酵获得高活性、低成本、耐高温的纤维素酶和木聚糖酶。本发明对获取新的纤维素和木聚糖酶资源，促进生物炼制产业的发展具有重要价值。
附图说明
图1微细正青霉4-14的培养特征；A在不同温度下的菌落生长的比较；B在PDA、MEA、YPD和CYA平板上37℃培养6d的菌落特征；
图2邻位法构建菌株微细正青霉4-14及相关菌株ITS(A)和β-Tubulin(B)序列系统进化树；
图3微细正青霉4-14固态发酵阶段产滤纸酶、CMC酶、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶的情况；
图4温度对微细正青霉4-14发酵液CMC酶、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶的影响，A、最适反应温度的测定；B、CMC酶的温度稳定性；C、β-葡萄糖苷酶的温度稳定性；D、木聚糖酶的温度稳定性；
图5微细正青霉4-14发酵液CMC酶、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶的最适pH(A)及pH稳定性(B)测定；
图6微细正青霉4-14发酵液SDS-PAGE图谱分析；A、1和2为胞外蛋白图谱；B、1为CMC酶图谱，2为木聚糖酶图谱；M蛋白分子量。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案，以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1微细正青霉的培养和生长特点
菌株以稀释涂布法从土壤中分离获得，分离培养基为Mandels培养基(KH2PO42g，(NH4)SO41.4g，Urea 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，微量元素浓缩液1mL，10g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和0.3g Yeast Extract，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1000mL。微量元素浓缩液每升含：CoCl2·6H2O 3.7g,ZnSO4·7H2O1.4g,MnSO4H2O 1.6g，FeSO4·7H2O 5.0g。分离步骤：称取1g采集于南京市紫金山的土壤样品，悬浮于20mL无菌蒸馏水中，120rpm、28℃振荡30min，静置30min。吸取上清液1mL，以无菌蒸馏水稀释10倍，取0.1mL涂布Mandels分离平板，并置于28℃暗培养5d。挑取长出的真菌菌落，转接于同样的Mandels平板，28℃暗培养5d，以0.1％的刚果红溶液染色平板，并用1MNaCl脱色。从中获得透明圈较大的菌株，编号为4-14。取该菌株接种于PDA斜面培养，定期转管并于4℃保存。
为确定菌株的最佳生长温度，将预先于PDA平板上培养的菌株4-14打孔(直径0.8cm)，取菌饼接种于PDA平板(直径6cm)中央，并于28℃、32℃、37℃、42℃和45℃恒温条件下培养，并每天测量菌落直径。结果：菌株在37℃下生长最快(图1-A)。
将菌株分别接种于PDA、MEA、YPD和CYA(查氏)平板，37℃暗培养6-7d，观察菌丝及产孢等情况。在PDA平板，菌落由外至内的菌丝颜色为白、黄和粉红色，产生大量椭圆或不规则形的子囊果和球状子囊孢子，菌落中央产生褐色色素；在MEA平板上为外周白色中央黄褐色的菌落，形成大量的子囊果和子囊孢子；在YPD板上则呈现白色菌落，只见菌丝而未见孢子产生；在CYA板上培养，形成主要为白色略带黄褐色的菌落，能形成少量褐色分泌物，并形成子囊果和子囊孢子。该菌株的ITS及β-tubulin序列与NCBI基因数据中的Eupenicillium parvum存在99％的序列一致性，系统进化分析证明其属于微细正青霉Eupenicillium parvum。所述培养特征见图1-B。
以PDA培养获得微细正青霉4-14菌体，以植物基因组提取试剂盒(TransGen,北京)提取获得总DNA。通过常规PCR，分别以引物对ITS1/ITS4和Bt2a/Bt2b扩增获得ITS和β-tubulin序列。
ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′
ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′
Bt2a：5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′
Bt2b：5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′
扩增获得目标DNA送上海英骏生物技术公司测序，并对获得序列进行NCBI在线BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)比对分析。同时，以clustalx1.83对相关序列进行列队后以MGA6.0软件构建序列进化树，确定目标菌株的分类地位。
获得的微细正青霉4-14ITS序列(参见序列表SEQ ID NO.5)和β-tubulin序列(参见序列表SEQ ID NO.6)，两序列与NCBI基因数据库中的Eupenicilliumparvum存在99％的序列一致性，系统进化分析证明其与微细正青霉Eupenicilliumparvum处于同一进化分支(图2)。进而确定菌株4-14分类地位为微细正青霉Eupenicillium parvum。
实施例2微细正青霉固态发酵产酶及酶量测定
取少量微细正青霉4-14菌块接种于50mL PDA培养液(250-mL三角瓶)，37℃、200rpm下振荡培养7d。取1mL菌悬液接入固态发酵培养基中，并于37℃、70％湿度条件下黑暗发酵培养10d。
固态发酵培养基配方：麦杆(粉碎至1-3mm，且脱木素)1.5g，麸皮1.5g，10×Mandels培养基(同上述，不含羧甲基纤维素钠)5mL，以上组分装入250-mL三角瓶中，充分混匀，高压灭菌。麦杆的脱木素方法：按每10g麦杆加入20mL 4％NaOH溶液，混匀后，121℃20min处理，并以流水去除褐色物质，处理后的麦杆晾干。
发酵结束后，按每三角瓶加入30mL无菌水(含0.1％Tween-80)，搅拌均匀，并于28℃、120rpm振荡浸提2h。继续以7000rpm离心20min，将粗酶液转入新的离心管中，于4℃冰箱保存。
滤纸酶活的测定，以Whatman NO.1滤纸(3cm×0.5cm)作为底物，70℃反应60min；CMC酶(内切型纤维素酶EG)酶活的测定以1％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为底物，70℃反应30min；最后均以DNS的方法测定还原糖的生成量，通过标准葡萄糖曲线，换算获得酶活(IU/g基质干重)。木聚糖酶活性以0.1％榉木木聚糖(Beechwood，sigma)作为底物，70℃反应10min，以3,5-二硝基水杨酸法(DNS)的方法测定还原糖的生成量，通过标准木糖曲线，换算获得酶活(IU/g基质干重)。β-葡萄糖苷酶的活性测定，以5mM的4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)作为底物，70℃反应30min，并根据标准曲线，计算酶活性(IU/g基质干重)。以上酶活测定均在pH4.8的50mM的柠檬酸缓冲液中进行，每处理3-4次重复。
滤纸酶、CMC(EG)酶或木聚糖酶单位酶活定义为：该实验条件下，每分钟催化相应底物生成1μmol葡萄糖(滤纸酶和CMC)或木糖(木聚糖酶)的酶量。β-葡萄糖苷酶单位酶活定义为：该实验条件下，每分钟催化pNPG生成1μmol4-硝基苯酚的酶量。
发酵结果见图3，在最佳发酵条件下，CMC酶活最高可达554IU/g，木聚糖酶活为385IU/g，β-葡萄糖苷酶活为218IU/g，而滤纸酶活为2.62IU/g。
实施例3微细正青霉所产纤维素酶和木聚糖酶的温度适应性
最适反应温度的测定，以pH4.8的50mM的柠檬钠作为缓冲液，分别测定30-95℃(间隔5℃)下的粗酶的CMC酶(EG)、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性(方法同上述)。
为评价各酶组分的温度稳定性，取原酶液100μl于不同温度(40-60℃或50-70℃)下分别保温1-4h。处理结束后，分别测定各种酶活性，并以未处理组(4℃存放)的酶活作为100％，比较处理后的残余酶活性。
如图4-A所示，微细正青霉4-14所产CMC酶的最适反应温度为70℃，80℃仍有70％以上的活性；β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为70℃，75℃活性仍达95％；木聚糖酶的最适反应温度为75℃，在85℃时仍然有70％的活性。温度稳定性为：CMC酶在50℃和60℃下分别处理4h残余酶活达85％和80％；木聚糖酶60℃处理4h，残余酶活接近70％；β-葡萄糖苷酶在40℃时热稳定性较好，处理4h，残余酶活高于80％(图4-B-D)。
实施例4、微细正青霉所产纤维素酶和木聚糖酶的pH适应性
最适反应pH的测定，依据文献配置广泛缓冲液(Turner B.L.,Variation in pHoptima of hydrolytic enzyme activities in tropical rain forest soils.Applied andEnvironmental Microbiology,2010,76(19),6485-6493)，比较测定pH 2-10(间隔0.5)的粗酶CMC酶(EG)、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性。
为评价各酶组分的pH稳定性，取原酶液100μl于pH 2-10(间隔1)下于4℃放置16h。处理结束后，以pH4.8的50mM的柠檬钠作为缓冲液，70℃下测定各种酶活性，并以未处理组的酶活作为100％，比较处理后的残余酶活性。
广泛pH缓冲液配方：6.3g硼酸，14.0g柠檬酸，11.6g顺丁烯二酸，12.1g Trisbase，19.5g NaOH溶解于适量蒸馏水并定容至500mL。取上述溶液50mL，以1MHCl或1M NaOH调节至相应pH，并以蒸馏水定容至100mL。
结果：微细正青霉4-14所产CMC酶和β-葡萄糖苷酶的最适pH为4.5，木聚糖酶的最适pH为5.0(图5-A)。在pH3-10的缓冲液中4℃处理16h，CMC酶和木聚糖酶能保持80-100％的活性；β-葡萄糖苷酶在pH 3-8时活性不降低(图5-B)。
实施例5、微细正青霉发酵胞外蛋白图谱及酶解图谱
取微细正青霉4-14粗酶液30μl，以10％聚丙稀酰胺进行常规SDS-PAGE分析。为分析粗酶液SDS-PAGE中CMC酶和木聚糖酶条带位置，进行了SDS-PAGE酶活性染色实验操作如下：样品加入上样缓冲液后，95℃失活10min，以含有0.1％CMC-Na或0.1％Beechwood木聚糖的聚丙稀酰胺凝胶进行电泳。电泳结束后，凝胶以含20％(v/v)异丙醇的PBS缓冲液(pH5.8)漂洗20min，继续以PBS缓冲液(pH5.8)20min×3次。将凝胶置于PBS缓冲液(pH5.8)中50℃保温1h(对CMC-Na)和5min(对木聚糖)。将处理好凝胶置于0.1％的刚果红溶液中染色30min，最后以1M NaCl脱色，并观察脱色条带的位置，拍照比较。结果：微细正青霉4-14的发酵粗酶液SDS-PAGE分析，其主要胞外蛋白分布于35-130kDa分子量范围(图6-A)。其中，CMC酶的条带处于50-55kDa之间，而木聚糖酶的条带处于60-70kDa之间(图6-A)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种土壤真菌微细正青霉，其特征在于，其分类命名为微细正青霉4-14（Eupenicillium parvum 4-14），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年6月25日，保藏号为CCTCC No: M2015404。
2.根据权利要求1所述的土壤真菌微细正青霉，其特征在于，所述土壤真菌微细正青霉菌株的生长温度为28℃~45℃。
3.根据权利要求2所述的土壤真菌微细正青霉，其特征在于，所述土壤真菌微细正青霉菌株的最适生长温度为37℃。
4.权利要求1所述的土壤真菌微细正青霉在生产高温纤维素酶和木聚糖酶方面的应用。
5.权利要求4所述应用，其特征在于，所述土壤真菌微细正青霉菌株能够以小麦杆和麸皮为基料发酵产生高温纤维素酶和木聚糖酶。
6.一种发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）取少量微细正青霉4-14真菌菌块接种于50 mL PDA培养液，37 ℃、200 rpm下振荡培养7 d得到菌悬液；
2）取1 mL菌悬液接入固态发酵培养基中，并于37 ℃、70%湿度条件下黑暗发酵培养9 d；
3）发酵结束后，按每发酵瓶加入30 mL无菌水，搅拌均匀，并于28 ℃、120 rpm振荡浸提2 h，继续以7000 rpm 离心20 min得到粗酶液，将粗酶液转入新的离心管中，加入终浓度0.1%叠氮钠，于4 ℃冰箱保存。
7.根据权利要求6所述的发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法，其特征在于，所述固态发酵培养基包括脱木素后的麦杆1.5 g，麸皮 1.5 g，不含羧甲基纤维素钠的10 ×Mandels 培养基5 mL。
8.根据权利要求7所述的发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法，其特征在于，所述麦杆的脱木素方法：按每10 g麦杆加入20 mL 4% NaOH溶液，混匀后，121 ℃ 20 min 处理，并以流水去除褐色物质，处理后的麦杆晾干即可。
9.根据权利要求6所述的发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法，其特征在于，所述发酵得到的粗酶液的SDS-PAGE分析图谱中，主要胞外蛋白分布于35-130 kDa分子量范围，其中，CMC酶的条带处于50-55 kDa之间，而木聚糖酶条带处于60-70 kDa之间。
10.根据权利要求6所述的发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法，其特征在于，所述CMC酶最适反应温度为70℃，80℃仍有70%以上的活性；β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为70℃，75℃活性仍达95%；木聚糖酶的最适反应温度为75℃，在85℃时仍然有70%的活性，温度稳定性为：CMC酶在50℃和60℃下分别处理4 h残余酶活达85%和80%；木聚糖酶60℃处理4 h，残余酶活接近70%；β-葡萄糖苷酶在40 ℃时热稳定性好，处理4 h，残余酶活高于80%。
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