CN101481674A - 一种饲用β-甘露聚糖酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种饲用β－甘露聚糖酶及其制备方法，属于微生物发酵和酶工程技术领域。本发明经诱变、筛选获得了一种能以丰富、廉价农副产品为发酵原料，所产酸性β－甘露聚糖酶对热和pH稳定性较强的黑曲霉新菌株(Aspergillus niger)MA－56 CGMCC No.2722；并提出了以该菌株为生产菌种，接种于由麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份60～90∶10～40∶1～6比例配制而成的固体培养基中，经发酵、培养、烘干、检测制备成饲用β－甘露聚糖酶的生产方法。该酶在70℃保温1h，仍能保持85％左右的酶活，在pH 3.0～9.0环境下2h，仍保持酶活90％以上，较适宜作为饲料添加剂。可在饲料生产领域中推广应用。

Description

一种饲用β-甘露聚糖酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵和酶工程技术领域，尤其涉及一种由黑曲霉(Aspergillus niger)新菌株发酵生产的饲用β-甘露聚糖酶及其制备方法。

背景技术

我国猪、鸡的主要日粮是玉米/豆粕型日粮，尽管单胃动物对玉米的消化率较高，但对豆粕的能量利用率仅为50％～60％，主要原因是豆粕中含有1.3％的β-甘露聚糖，它对动物，包括对人有强大的抗营养作用，影响能量代谢与蛋白质合成。β-甘露聚糖酶能将广泛存在于豆类籽实中的甘露聚糖等多糖降解为甘露寡糖等低聚糖，不仅消除了甘露聚糖对单胃动物各种营养素的抗营养作用，同时生成的甘露低聚糖在动物肠道中起着重要的调节作用。大量研究表明，甘露寡糖可通过减少动物肠道病原菌，调节免疫反应，提高肠粘膜的完整性而最终提高动物的生产性能，由此已被认为是最有希望的抗生素替代品之一。β-甘露聚糖酶不仅具有一般非淀粉多糖(NSP)酶类的作用，还是一种多功能促生长剂，可促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率。因此可以认为，β-甘露聚糖酶是一种超脱了传统酶制剂的作用，具有提高能量、促进动物生长的新型饲用酶制剂，已引起越来越广泛的关注。

对β-甘露聚糖酶的研究最初是集中在以地衣芽孢、枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌等菌株产生的中性或碱性β-甘露聚糖酶上，并主要应用在食品、医药、造纸、采油等领域内，后才逐步有了关于将β-甘露聚糖酶应用于饲料业的报道。国内虽对酸性β-甘露聚糖酶的营养功能及在动物饲料中应用效果研究的报道较多，而对有关酸性β-甘露聚糖酶生产的报道则较少。其中，在有关应用不同菌株所产酸性β-甘露聚糖酶的性质方面也有较大差别：例如，朱劼等分离的黑曲霉WM20-11所产的酸性β-甘露聚糖酶其最适pH为3.5，37℃保温2h在pH2.5～6.0范围内剩余酶活力均在80％以上，其最适作用温度为70℃，且酶在50℃、60℃保温30min时，仍能保持90％左右的活力；皮雄娥等分离的黑曲霉AS6034所产的酸性β-甘露聚糖酶在pH3.2左右时酶活力达到最大，该酶液在pH3.8左右较为稳定，保温2h后残留酶活力超过80％，但pH4.0～5.0时酶活力迅速下降，尤其是pH为8.0时酶活力仅为10％左右；李剑芳等分离的黑曲霉LW-1最适pH和最适反应温度分别为3.5和70℃，在pH5.0～8.0时酶活稳定，残余酶活在85％以上，在温度低于60℃时酶活较稳定；张辉分离的青霉QM-1所产的β-甘露聚糖酶最适反应pH为5.8，但pH稳定性和热稳定性未知；韦跃华等将从里氏木霉基因组中获得的内切-甘露聚糖酶全长基因去除内含子后，插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中，获得重组质粒pM242；电击法转化毕赤酵母菌株GS115，获得的重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃，在pH5.0～6.0时酶活稳定，在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50％以上。

综上所述，从利用不同菌株进行发酵生产酸性β-甘露聚糖酶的已有研究报导来看，以黑曲霉为菌种所生产的酸性β-甘露聚糖酶其最适pH为3.5左右，这与动物的胃液酸度相仿是较适宜作为饲料添加剂的；但是饲料在其制备的过程中一般都要经过高温的造粒过程；同时，在动物体内从肠到胃其pH值的变化是较大的，因而对作为饲料添加剂的酶来讲，对其耐热的稳定性与对pH的稳定性均有较高的要求；然而已报道的黑曲霉菌株所产酸性β-甘露聚糖酶对热与pH的稳定性是不高的。

发明内容

本发明目的是，针对上述现有黑曲霉菌株所产β-甘露聚糖酶，所存在对热稳定性和pH稳定性不高的缺陷，筛选一种能以丰富、廉价农副产品为发酵原料，所产β-甘露聚糖酶对热和pH稳定性较强的黑曲霉新菌株；本发明的另一目的是提出利用该新菌株发酵生产β-甘露聚糖酶的方法。

本发明目的通过以下技术方案得以实现。

一种高产酸性β-甘露聚糖酶的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株MA-56的诱变、选育、鉴定及其特性：

(1)出发菌株MA的选育：

发明人从浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所实验室保藏的曲霉菌种中，在选择性培养基上经初筛、复筛，获得一株产酸性β-甘露聚糖酶活性最高的菌株MA，并以该菌株作为进一步诱变选育的出发菌株；

(2)诱变菌株MA-56的选育：

将在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面上生长成熟的出发菌株MA的新鲜孢子，用无菌水洗下，制成孢子浓度为1×10⁷～10⁸个/ml的孢子悬浮液；分别取2ml孢子悬浮液于试管内，置钴源室按0(对照)、0.5、1.0、1.5kGy的处理剂量，每处理重复10次，经Co⁶⁰辐照处理后，吸取各处理的悬浮液，梯度稀释，涂布于初筛培养基上，每个稀释度3个平板，28—30℃下培养48—72h后，挑取不同形态的单菌落进行固体发酵的初筛、复筛及菌株间的多重比较，最终获得一株产β-甘露聚糖酶活力高的菌株MA-56；

诱变菌株筛选方法具体如下：

初筛：将诱变后挑取的菌株斜面分别用30ml无菌水冲洗制成孢子悬浮液，吸取2ml接入筛选培养基，每支菌种做一个重复，28℃恒温培养48h，进行初筛；以未经Co⁶⁰处理的出发菌株MA作为对照，计算各诱变菌株产β-甘露聚糖酶活比对照提高的百分数，从中选出酶活性显著高于对照的菌作为进一步进行复筛的菌株；

复筛：将初筛得到的菌株，按照完全随机试验设计，每株菌三重复，再次接入筛选培养基进行复筛；同样，将未经Co⁶⁰处理的出发菌株MA作为对照，将其中发酵酶活极显著提高的菌株MA-56进行保藏；

初筛、复筛的培养基为：在300ml锥形瓶中，装入麸皮8g、豆粕2g、魔芋粉0.4g、玉米浆粉0.2g、(NH₄)₂SO₄ 0.2g、H₂O 10ml，pH自然，0.1MPa灭菌30min。

(3)黑曲霉(Aspergillus niger)MA-56的生物学特性：

所得β-甘露聚糖酶高产菌株MA-56，经浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所酶工程研究室鉴定为一株黑曲霉菌种Aspergillus niger。

①形态学特征：所得酶菌种的孢子为褐黑色，分生孢子头球形至辐射形，直径150-450μm；分生孢子梗生于基质，孢梗茎1000-3000×12-20μm，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40—70μm，全部表面可育；产孢结构双层，梗基10-20×4.5-7.0μm，瓶梗6-10×2.5-3.5μm；分生孢子球形或近球形，直径3-4.5(-5)μm，褐色，壁粗糙；

②培养学特性：菌落在查氏琼脂培养基上生长迅速，25℃7天直径40-50mm，质地丝绒状或稍带絮状，分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液，菌落反面略带黄色。

黑曲霉(Aspergillus niger)菌株MA-56，于2008年10月24日保藏于北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2722。

一种饲用β-甘露聚糖酶，该饲用β-甘露聚糖酶可以黑曲霉(Aspergillusniger)菌株MA-56CGMCC No.2722为生产菌种，接种于由麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份60～90：10～40：1～6比例配制成的固体培养基中，经发酵、培养、烘干、检测后获得。

一种饲用β-甘露聚糖酶的制备方法，该方法按以下步骤进行：

(1)黑曲霉(Aspergillus niger)菌株MA-56各级培养基的配制：包括，

①斜面种子培养基：去皮马铃薯200g/l，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，自然pH，经0.1Mpa灭菌20min；

②固体种子培养基：300ml三角瓶中装入由麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份80：19：1比例配制而成的培养基10g，按与固形物重量1：1比例加入自来水，搅拌均匀，经0.1Mpa灭菌30min；

③固体生产培养基：先将麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份60～90：10～40：1～6比例配制成固体培养基；再将该固体培养基与水按重量1：0.9～1.3的比例加水并搅拌均匀，装入布袋中，经0.1Mpa灭菌30min，冷却后均匀置于曲盘中，发酵物料厚度为2～3cm；

(2)斜面种子制备：将黑曲霉菌株MA-56划线接种在步骤(1)①斜面种子培养基上，于28℃下恒温培养5d后，放置4℃冰箱内保存，备用；

(3)固体种子制备：将步骤(2)斜面种子用无菌蒸馏水制备成浓度为1×10⁷～10⁸个/ml的孢子悬浮液后，吸取2ml接入步骤(1)②固体种子培养基中，于28℃下恒温培养3d，再与无菌蒸馏水按重量1：100比例搅拌混合后，用双层纱布在无菌条件下过滤，得到浓度为1×10⁷～10⁸个/ml固体种子孢子悬浮液，备用；

(4)发酵生产：将步骤(3)固体种子孢子悬浮液与步骤(1)③固体生产培养基按重量份15～30∶100比例混合均匀后，置28℃曲房中发酵培养56h得饲用β-甘露聚糖酶酶曲；

(5)酶曲的后处理、质量检测及包装：将步骤(4)酶曲置40℃鼓风条件下烘干10h、粉碎、过80目筛，得酶干曲；将经饲用β-甘露聚糖酶活力检测达到1×10⁵～1.3×10⁵U/g的酶干曲包装、封口即成产品。

本发明的有益效果是：

(1)利用廉价的麸皮、豆粕等农副产品为主原料，配制成由麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份60～90：10～40：1～6比例制成的高效发酵培养基，且整个生产过程中无需添加其它价格昂贵的试剂，使生产成本较低；同时，固体发酵生产出来的酶干曲制剂可作为饲料添加剂直接添加使用，更进一步降低了生产成本。

(2)黑曲霉MA-56所生产的β-甘露聚糖酶具有很好的热稳定性和pH稳定性，在70℃时保温1h，仍能保持85％左右的酶活，在pH 3.0～9.0的环境下保持2h，其酶活仍能保持90％以上，是所报道的酸性β-甘露聚糖酶中热稳定性和pH稳定性最好的(见实施例5)。

附图说明

图1黑曲霉MA-56β-甘露聚糖酶的最适反应温度

图2黑曲霉MA-56β-甘露聚糖酶的热稳定性

图3pH对酶活力及稳定性的影响

具体实施方式

通过以下具体实施例，对本发明作进一步的具体说明，但应该理解本发明并不受这些内容所限止。

实施例1：(β-甘露聚糖酶生产制备1)

本例β-甘露聚糖酶按以下步骤制备：

(1)黑曲霉菌株MA-56各级培养基的配制：包括，

①斜面种子培养基：去皮马铃薯200g/l，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，自然pH，经0.1Mpa灭菌20min；

②固体种子培养基：300ml三角瓶中装入由麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份80：19：1比例配制而成的培养基10g，按与固形物重量1：1比例加入自来水，搅拌均匀，经0.1Mpa灭菌30min；

③固体生产培养基：先将麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份75：23：3比例配制成固体培养基；再将该固体培养基与水按重量1：1.3比例加水并搅拌均匀装入布袋中，经0.1Mpa灭菌30min，冷却后均匀置于曲盘中，发酵物料厚度为2～3cm；

(2)斜面种子制备：将黑曲霉菌株MA-56划线接种在步骤(1)①斜面种子培养基上，于28℃下恒温培养5d后，放置4℃冰箱内保存，备用；

(3)固体种子制备：将步骤(2)斜面种子用无菌蒸馏水制备成浓度为1×10⁷～10⁸个/ml的孢子悬浮液后，吸取2ml接入步骤(1)②固体种子培养基中，于28℃下恒温培养3d，再与无菌蒸馏水按重量1∶100比例搅拌混合后，用双层纱布在无菌条件下过滤，得到浓度为1×10⁷～10⁸个/ml固体种子孢子悬浮液，备用；

(4)发酵生产：将步骤(3)固体种子孢子悬浮液与步骤(1)③固体生产培养基按重量份20∶100比例混合均匀后，置28℃曲房中发酵培养56h得饲用β-甘露聚糖酶酶曲；

(5)酶曲的后处理与质量检测：将步骤(4)酶曲置40℃鼓风条件下烘干10h、粉碎、过80目筛，得酶干曲；将经饲用β-甘露聚糖酶活力检测达到1×10⁵～1.3×10⁵U/g的酶干曲包装、封口即成产品。

实施例2：(β-甘露聚糖酶生产制备2)

本例中：步骤(1)黑曲霉菌株MA-56各级培养基的配制：③固体生产培养基：先将麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份88：13∶1比例配制成固体培养基；再将该固体培养基与水按重量1：1.1比例加水并搅拌均匀装入布袋中，经0.1Mpa灭菌30min，冷却后均匀置于曲盘中，发酵物料厚度为2～3cm；

步骤(4)木聚糖酶发酵生产：将步骤(3)固体种子孢子悬浮液与步骤(1)③固体生产培养基按重量份15∶100比例混合均匀后，置28℃曲房中发酵培养56h得饲用β-甘露聚糖酶酶曲；

步骤(5)：经饲用β-甘露聚糖酶活力检测达到1×10⁵～1.3×10⁵U/g；

其余工艺步骤均同于实施例1。

实施例3：(β-甘露聚糖酶生产制备3)

本例中：步骤(1)黑曲霉菌株MA-56各级培养基的配制：③固体生产培养基：先将麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份62：37：6比例配制成固体培养基；再将该固体培养基与水按重量1：0.9比例加水并搅拌均匀装入布袋中，经0.1Mpa灭菌30min，冷却后均匀置于曲盘中，发酵物料厚度为2～3cm；

步骤(4)木聚糖酶发酵生产：将步骤(3)固体种子孢子悬浮液与步骤(1)③固体生产培养基按重量份30∶100比例混合均匀后，置28℃曲房中发酵培养56h得饲用β-甘露聚糖酶酶曲；

步骤(5)：经饲用β-甘露聚糖酶活力检测达到1×10⁵～1.3×10⁵U/g；

其余工艺步骤均同于实施例1。

实施例4：(β-甘露聚糖酶活力检测)

β-甘露聚糖酶活力测定：取3支试管各加入0.5ml适当稀释的待测酶液，与用pH5.0的0.1mol/l乙酸-乙酸钠缓冲液配制的0.5％角豆胶底物一起40℃水浴预热5min；在第1、2试管中各加入0.5ml角豆胶底物，40℃精确反应10min，反应完后在3支试管中各加入1.5ml的DNS试剂，并在第3支试管中补加0.5ml角豆胶底物；取出并摇匀3支试管后在沸水浴中反应5min，迅速冷却至室温，用水定容至5.0ml，以第3支试管试液为对照在540nm波长下测定第1、2支试管试液的吸光度，吸光度在0.2～0.4之间为宜。酶活性定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μg还原糖的酶量定义为一个活力单位(U)。

实施例5：(对β-甘露聚糖酶粗酶热稳定性和pH稳定性的检测)

①温度对黑曲霉MA-56β-甘露聚糖酶活力及稳定性的影响

将实施例1、2、或3制备的β-甘露聚糖酶粗酶，经30倍蒸馏水在40℃水浴浸提30min后过滤，得到的滤液再次用蒸馏水进行100倍稀释，与pH为5.0的0.1mol/l乙酸-乙酸钠缓冲液配制的0.5％角豆胶底物一起，在30℃～80℃的不同温度下，分别测定酶的活力，结果显示该酶反应随着温度升高而活力增加，至70℃时达到最高峰，但超过70℃后则活力急剧下降，表明β-甘露聚糖酶的最适反应温度为70℃(见图1)，这与报道的大多数β-甘露聚糖酶的最适反应温度接近；研究酶的热稳定性时则将稀释好的酶液分装在不同的试管中，在65℃～80℃温度的水浴中保温不同时间，取出，立即冰水浴冷却，然后与pH为5.0的0.1mol/l乙酸-乙酸钠缓冲液配制的0.5％角豆胶底物一起，40℃精确反应10min，测定残余酶活(图2)。结果表明，该酶在70℃时保温1h，仍能保持85％左右的酶活，是所报道的酸性β-甘露聚糖酶中热稳定性最好的。

②pH对黑曲霉MA-56β-甘露聚糖酶的活力及稳定性影响

将实施例1、2、或3制备的β-甘露聚糖酶粗酶用30倍蒸馏水在40℃水浴浸提30min，过滤，将滤液分别用不同pH的缓冲液进行100倍稀释，然后与用相应pH缓冲液配制的0.5％角豆胶底物在40℃下反应10min，测定酶活，研究β-甘露聚糖酶的最适反应pH。所用缓冲液为pH 3.0～6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH 6.5～8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH 9.0～10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

将浸提得到的滤液用上述不同pH的缓冲液进行10倍稀释，置于40℃水浴环境中2h后，用pH 5.0的0.1mol/l乙酸-乙酸钠缓冲液进行再次10倍稀释，使其最终pH均为5.0，40℃下测定残余酶活，以研究酶的pH稳定性。

最适pH和pH稳定性结果见图3。结果表明，黑曲霉MA-56β-甘露聚糖酶的最适pH为pH2.5～pH3.5，pH大于5.0酶活急骤下降。但该酶的pH稳定范围较广，在pH 3.0～9.0的环境下保持2h，其酶活仍能保持90％以上。

Claims (3)

1、一种高产β-甘露聚糖酶的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株MA-56，其菌种保藏号为CGMCC No.2722。

2、一种饲用β-甘露聚糖酶，其特征在于：该饲用β-甘露聚糖酶可以黑曲霉(Aspergillus niger)菌株MA-56CGMCC No.2722为生产菌种，接种于由麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份60～90：10～40：1～6比例配制成的固体培养基中，经发酵、培养、烘干、检测后获得。

3、一种制备权利要求2所述饲用β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于按以下步骤进行：

(1)黑曲霉(Aspergillus niger)菌株MA-56各级培养基的配制：包括，

①斜面种子培养基：去皮马铃薯200g/l，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，自然pH，经0.1Mpa灭菌20min；

②固体种子培养基：300ml三角瓶中装入由麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份80：19：1比例配制而成的培养基10g，按与固形物重量1：1比例加入自来水，搅拌均匀，经0.1Mpa灭菌30min；

③固体生产培养基：先将麸皮、豆粕和魔芋粉按重量份60～90：10～40：1～6比例配制成固体培养基；再将该固体培养基与水按重量1：0.9～1.3的比例加水并搅拌均匀，装入布袋中，经0.1Mpa灭菌30min，冷却后均匀置于曲盘中，发酵物料厚度为2～3cm；

(2)斜面种子制备：将黑曲霉菌株MA-56划线接种在步骤(1)①斜面种子培养基上，于28℃下恒温培养5d后，放置4℃冰箱内保存，备用；

(3)固体种子制备：将步骤(2)斜面种子用无菌蒸馏水制备成浓度为1×10⁷～10⁸个/ml的孢子悬浮液后，吸取2ml接入步骤(1)②固体种子培养基中，于28℃下恒温培养3d，再与无菌蒸馏水按重量1：100比例搅拌混合后，用双层纱布在无菌条件下过滤，得到浓度为1×10⁷～10⁸个/ml固体种子孢子悬浮液，备用；

(4)发酵生产：将步骤(3)固体种子孢子悬浮液与步骤(1)③固体生产培养基按重量份15～30∶100比例混合均匀后，置28℃曲房中发酵培养56h得饲用β-甘露聚糖酶酶曲；

(5)酶曲的后处理、质量检测及包装：将步骤(4)酶曲置40℃鼓风条件下烘干10h、粉碎、过80目筛，得酶干曲；将经饲用β-甘露聚糖酶活力检测达到1×10⁵～1.3×10⁵U/g的酶干曲包装、封口即成产品。

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