CN102586210B

CN102586210B - 一种固体耐高温酸性甘露聚糖酶的制作方法

Info

Publication number: CN102586210B
Application number: CN 201210068282
Authority: CN
Inventors: 郭芳坤
Original assignee: BIOFNORNOON
Current assignee: Ji'nan Sijie Biological Engineering Co. Ltd.
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2012-03-15
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2032-03-15
Also published as: CN102586210A

Abstract

本发明属于酶制剂领域，具体涉及一种固体耐高温酸性甘露聚糖酶的制作方法。该方法包括下述的步骤：浸泡根霉固体发酵曲料，再将混合液离心去渣后过滤，再将滤液超滤浓缩，得浓缩液，再将浓缩液喷雾干燥，制得固体甘露聚糖酶。本发明的有益效果在于，和普通的由毕赤酵母流加甲醇液体发酵生产甘露聚糖酶等方法相比，无论是从耐酸性还是从耐热性方面来看，本发明的方法生产的甘露聚糖酶其耐酸性强，耐热性高。

Description

一种固体耐高温酸性甘露聚糖酶的制作方法

技术领域

本发明属于酶制剂领域，具体涉及一种固体耐高温酸性甘露聚糖酶的制作方法。

背景技术

甘露聚糖酶（endo-1,4-β-mannanase）是一种新型的酶制剂，属于一种半纤维素酶类，它除具有一般非淀粉多糖（NSP）酶类的作用——降解NSP，降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收外；近来很多研究表明，甘露聚糖酶还是一种多功能的促生长剂，它可促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；同时，它还可消除豆类中富含的β-甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼粕尤其是豆粕的能量消化率。实际使用中还可看出，添加了甘露聚糖酶后动物的抵抗力及整齐度都有提高。实践证明，甘露聚糖酶已超脱了传统酶制剂的作用，成为一种新型的促生长饲料添加剂。

甘露聚糖酶可以分解玉米-豆粕型饲粮中的甘露聚糖为甘露寡糖。甘露寡糖作为一种生物化学益生素，可以改善肠道微生物组成，形成以双歧杆菌和乳酸菌为优势的肠道菌群。据报道，甘露寡糖可作为营养物质被双歧杆菌和乳酸杆菌选择性发酵利用，并促进其生长繁殖。但大肠杆菌、沙门氏菌等致病性菌却因无法利用而导致饥饿死亡。除此之外，甘露寡糖可与病原菌细胞壁上的受体结合，从而阻止细菌与动物肠黏膜上的糖基结合，保护肠黏膜结构和功能的完整，又由于甘露寡糖为非消化性物质，这种复合物就顺利通过胃肠道被排出体外，因而起到吸附肠道病原菌，对动物具有保健的作用。甘露寡糖不仅能连接到细菌上，而且能连接在毒素、病毒、真核生物上，结合后甘露寡糖可作为这些外源性抗原的助剂，缓解抗原的吸收，增强机体的细胞免疫和体液免疫。甘露寡糖不仅直接参与免疫调节而部分替代抗生素，在其与抗生素共用中，还能起到降低机体组织抗生素残留的作用。

在饲料加工过程和动物采食后，酶制剂一般要经受高温高湿制粒的破坏，胃酸和胃蛋白酶的损害，能够到达动物体内作用位点依然存留活性的那部分酶活称为有效酶活。这要求相应酶种具有良好耐热耐酸性能、抗胃蛋白酶、胰蛋白酶特性等等。良好的饲料酶有较宽的温度作用范围，保证既能在动物体温的温度下表现有较高的酶活，又能对饲料高温高湿制粒过程中表现出较好的耐受性；既能耐受胃酸的损害，在胃的酸性环境及小肠的中性环境下也能具有较高的酶活表现。

近年来，甘露聚糖酶一般由毕赤酵母流加甲醇液体发酵后，板框过滤或碟片离心生产出一些较低品质的甘露聚糖酶。虽然也有报道甘露聚糖酶由黑曲霉固体发酵的研究，但也未见其实际发酵生产及提取制造。本发明是由根霉固体发酵后，选用适合粗料分离的三足式离心机分离，生产出耐酸性耐高温的甘露聚糖酶。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种固体耐高温酸性甘露聚糖酶及其制作方法。

本发明固体耐高温酸性甘露聚糖酶的制作方法，其步骤包括：

浸泡：按根霉固体发酵曲料：水＝1：8-16的重量比例投料，将曲料投入水中浸泡，浸泡用水pH调至4.5，搅拌2-3小时，得混合液；

离心：将混合液置于离心机中在转速800-1200rpm的条件下离心10-15min；

过滤：取离心后的上清液置于过滤机中，加入占上清液重量7-10%的硅藻土，过滤获得滤清液；

超滤浓缩：膜分子量10000，浓缩至滤清液体积的1/8-1/12；

喷雾干燥：按浓缩液：玉米淀粉：羧甲基纤维素钠=1：0.2：0.03的比例加入,搅拌均匀，喷雾干燥的进风温度：160-180℃，出风温度：70-80℃，物料终水分：<8%。

以上所说的离心机采用三足式离心机；过滤机为板框过滤机；喷雾干燥为离心式喷雾干燥塔。

由上述方法制作固体耐高温酸性甘露聚糖酶也在本发明的保护范围之内。

上述固体耐高温酸性甘露聚糖酶，其含甘露聚糖酶50000U／g。

本发明的有益效果在于，和普通的由毕赤酵母流加甲醇液体发酵生产甘露聚糖酶等方法相比，无论是从耐酸性还是从耐热性方面来看，都明显的具有优势：

从耐酸性上看，本发明的甘露聚糖酶比AB MP1000耐酸性pH1.0，比和美酵素耐酸性pH3.5，比01毕赤酵母耐酸性pH2.5，比BSA细菌耐酸性pH1.5，比BSA米曲霉耐酸性pH1.0，比K毕赤酵母耐酸性pH2.5；

从耐热性上看，本甘露聚糖酶比AB MP1000耐高温3-5℃，比和美酵素耐高温约13℃，比01毕赤酵母耐高温约12℃，比BSA细菌耐高温30℃，比BSA米曲霉耐高温2℃，比K毕赤酵母耐高温约13℃。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。

实施例1

浸泡：按根霉固体发酵曲料与水按1：10的比例混合，浸泡水用乙酸调pH4.5，搅拌2.6小时；

离心：在转速800rpm的条件下在三足式离心机中离心15min，离心后取上清液；

板框过滤：加入10%硅藻土，用板框过滤机过滤获得滤清液；

超滤浓缩：膜分子量10000，浓缩至滤清液体积的1/10；

喷雾干燥：按浓缩液：玉米淀粉：羧甲基纤维素钠=1：0.2：0.03的比例加入,搅拌均匀，喷雾干燥的进风温度：180℃，出风温度：80℃，物料终水分：5.9%。

材料的来源

曲料：由根霉固体发酵而成

本发明所用检测方法——酶活性检测方法：具体检测方法如下：

分光光度法甘露聚糖酶活力测定

A.1 甘露聚糖酶活力测定

A.1.1 定义：在pH为5.5，温度为37℃条件下，每分钟从浓度为3 mg/ml的甘露聚糖（Sigma G0753）溶液中降解释放1 μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。

A.1.2 试剂和溶液

A.1.2.1 氢氧化钠溶液，浓度C（NaOH）为200 g/L：

称取氢氧化钠20.0 g，加水溶解，定容至100 ml。

A.1.2.2 乙酸溶液，浓度c（CH₃COOH）为0.1 mol/L：

吸取冰乙酸0.60 ml，加水溶解，定容至100 ml。

A.1.2.3 乙酸钠溶液，浓度c（CH₃COONa）为0.1 mol/L：

称取三水乙酸钠1.36 g，加水溶解，定容至100 ml。

A.1.2.4 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c（CH₃COOH—CH₃COONa）为0.1 mol/L，pH值为5.5：

称取三水乙酸钠23.14 g，加入冰乙酸1.70 ml。再加水溶解，定容至2000 ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（A.1.2.2）或乙酸钠溶液（A.1.2.3）调节至5.5。

A.1.2.5甘露糖溶液，C（C₆H₁₂O₆）为10.0mg/ml：

称取无水D-甘露糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。

A.1.2.6 0.6％（w/v）的甘露聚糖溶液：

称取甘露聚糖（Sigma G0753）0.60g，加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至甘露聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液定容至100ml。甘露聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为3天。

A.1.2.7DNS试剂

称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500 ml，搅拌5 s，水浴至45℃。然后逐步加入100 ml氢氧化钠溶液（A.1.2.1），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g。继续45℃水浴加热，同时补加水300 ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。

A.1.3仪器、设备

A.1.3.1实验室用样品粉碎机或碾钵。

A.1.3.2分样筛：孔径为0.25 mm（60目）。

A.1.3.3分析天平：感量0.001 g。

A.1.3.4 pH计：精确至0.01。

A.1.3.5磁力搅拌器：附加热功能。

A.1.3.6电磁振荡器。

A.1.3.7烧结玻璃过滤器：孔径为0.45 μm。

A.1.3.8离心机：4000 r/min。

A.1.3.9恒温水浴锅：温度控制范围在30—60℃之间，精度为0.1℃。

A.1.3.10秒表：每小时误差不超过5s。

A.1.3.11分光光度计：能检测350—800nm的吸光度范围。

A.1.4分析步骤

A.1.4.1标准曲线的制作

吸取缓冲液（A.1.2.4）4.0ml，加入DNS试剂5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。

分别吸取甘露糖溶液（A.1.2.5）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml，分别用缓冲液（A.1.2.4）定容至100ml，配制成浓度为0.10—0.70mg/ml D-甘露糖标准溶液。

分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00ml（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试剂。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。

以甘露糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。

A.1.4.2试样溶液的处理

固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25 mm），按照附录B中建议的称样量称取试样两份，精确至0.001 g。加入50 ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液（A.1.2.4）。磁力搅拌30 min，再用缓冲溶液（A.1.2.4）定容至100 ml，在4℃条件下避光保存24h。上离心机离心3 min。取0.5ml上清液，再用缓冲溶液（A.1.2.4）做适当稀释。（稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间）。

液体样品可以直接用缓冲溶液（A.1.2.4）进行稀释、定容。稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间）。

A.1.4.3测定步骤

吸取10.0ml甘露聚糖溶液（A.1.2.6），37℃平衡10min。

吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。

吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试剂，电磁振荡3s。然后加入2.0ml甘露聚糖溶液（A.1.2.6），37℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。

吸取2.0ml经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml甘露聚糖溶液（A.1.2.6）（已经过37℃平衡），电磁振荡3s，37℃精确保温30min。加入5.0mlDNS试剂，电磁振荡3s，酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。

A.1.5计算

XD = [（AE - AB）×K + CO] × 1000 /M/t------------------------（1）

X = XD·Df -------------------------（2）

式中：

XD — 试样稀释液的甘露聚糖酶活力，U/ml；

AE — 酶反应液的吸光度；

AB — 酶空白样的吸光度；

K — 标准曲线的斜率；

CO — 标准曲线的截距；

M —甘露糖的分子量（180.2）；；

t — 酶解反应时间，min；

1000 — 转化因子，1mmol = 1000μmol。

XD值应在0.04—0.08 U/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。

X — 试样中甘露聚糖酶的活力，U/g或U/ml；

Df — 试样的总稀释倍数。

A.1.6 结果允许偏差

同一试样两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。

本发明所使用的设备均为本行业常用设备，包括浸泡罐、三足式离心机、混液罐、板框、清液罐和喷雾干燥塔。

pH性质

配制A溶液:0.05mol/l的柠檬酸溶液，B溶液:0.1mol/l的磷酸氢二钠溶液，将A.B两种溶液按一定比例混合，并以A或B调整pH至2.5、3.0、3.5、4.0……8.5的缓冲液。

用蒸馏水配制底物溶液。

准确称取酶样品1.0g于50ml容量瓶中，加入40ml蒸馏水，磁力搅拌30min，静置一段时间，用蒸馏水定容。再以不同pH的缓冲液作适当稀释，按照测定方法进行测定酶活。

pH	AB MP1000	和美酵素	01毕赤酵母	本甘露聚糖酶	BSA细菌	BSA米曲霉	K毕赤酵母
								2.5	29556	0	0	2449	0	9774	0
3.0	37072	0	0	2733	0	12344	0
								3.5	44634	3.5	785	2810	0	14328	0
4.0	50413	16	5084	2855	289	15369	29
								4.5	57693	30	10805	2953	1545	16372	1633
5.0	57784	43	23068	2778	2611	16497	4604
								5.5	59422	72	27116	2578	3235	18347	9083
6.0	58876	134	28301	2366	3278	18064	9649
								6.5	50695	269	36842	1889	3157	15188	14014
7.0	32378	591	37821	1541	2583	10609	15452
								7.5	20128	978	23634	1298	1437	6009	13661
8.0	19609	1066	19685	747	732	3842	10090
								8.5	10137	926	12643	476	393	2795	6060

以最高点为100%折算成百分比：

pH	AB MP1000	和美酵素	01毕赤酵母	本甘露聚糖酶	BSA细菌	BSA米曲霉	K毕赤酵母
								2.5	50	0	0	83	0	53	0
3.0	62	0	0	93	0	67	0
								3.5	75	0.3	2	95	0	78	0
4.0	85	1.5	13	97	9	84	0.2
								4.5	97	2.8	29	100	47	89	11
5.0	97	4	61	94	80	90	30
								5.5	100	6.7	72	87	99	100	59
6.0	99	13	75	80	100	98	62
								6.5	85	25	97	64	96	83	91
7.0	54	55	100	52	79	58	100
								7.5	34	92	62	44	44	33	88
8.0	33	100	52	25	22	21	65
								8.5	17	87	33	16	12	15	39

从上表中能看出本甘露聚糖酶比AB MP1000耐酸性pH1.0，比和美酵素耐酸性pH3.5，比01毕赤酵母耐酸性pH2.5，比BSA细菌耐酸性pH1.5，比BSA米曲霉耐酸性pH1.0，比K毕赤酵母耐酸性pH2.5。

耐热性

1g（ml）酶/100ml pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌30分钟，取上清液待用。

将盛有9ml缓冲液的试管分别置35、45、55、65、75、80℃的水浴锅中预热10min, 分别加入1.00ml酶上清液迅速摇匀并准确计时10分钟, 迅速取出于冰水浴中冷却。冷却后进一步稀释测酶活。

温度	AB MP1000	和美酵素	01毕赤酵母	本甘露聚糖酶	BSA细菌	BSA米曲霉	K毕赤酵母
								35℃	58678	76	33940	3036	4396	18889	12463
45℃	66643	94	37302	3122	3878	20412	12958
								55℃	63594	81	36938	3042	2295	20593	13018
65℃	63485	0	4116	3040	222	19481	115
								75℃	25254	0	404	1886	0	7845	73
80℃	1064	0	516	613	0	430	0

以最高点为100%折算成百分比：

温度	AB MP1000	和美酵素	01毕赤酵母	本甘露聚糖酶	BSA细菌	BSA米曲霉	K毕赤酵母
								35℃	100	100	100	100	100	100	100
45℃	100	100	100	100	88	100	100
								55℃	100	100	100	100	52	100	100
65℃	100	0	11	100	5	100	0.9
								75℃	40	0	1	62	0	40	0.6
80℃	1.7	0	1	20	0	2.2	0

从上表中能看出本甘露聚糖酶比AB MP1000耐高温3-5℃，比和美酵素耐高温约13℃，比01毕赤酵母耐高温约12℃，比BSA细菌耐高温30℃，比BSA米曲霉耐高温2℃，比K毕赤酵母耐高温约13℃。

实施例2

浸泡：按根霉固体发酵曲料与水按1：16的比例混合，浸泡水用乙酸调pH4.5，搅拌2小时；

离心：在转速1000rpm的条件下在三足式离心机中离心12min，离心后取上清液；

板框过滤：加入8%硅藻土，用板框过滤机过滤获得滤清液；

超滤浓缩：膜分子量10000，浓缩至滤清液体积的1/12；

喷雾干燥：按浓缩液：玉米淀粉：羧甲基纤维素钠=1：0.2：0.03的比例加入,搅拌均匀，喷雾干燥的进风温度：170℃，出风温度：76℃，物料终水分：6.2%。

实施例3

浸泡：按根霉固体发酵曲料与水按1：8的比例混合，浸泡水用乙酸调pH4.5，搅拌3小时；

离心：在转速1200rpm的条件下在三足式离心机中离心12min，离心后取上清液；

板框过滤：加入7%硅藻土，用板框过滤机过滤获得滤清液；

超滤浓缩：膜分子量10000，浓缩至滤清液体积的1/8；

喷雾干燥：按浓缩液：玉米淀粉：羧甲基纤维素钠=1：0.2：0.03的比例加入,搅拌均匀，喷雾干燥的进风温度：160℃，出风温度：70℃，物料终水分：7.0%。

为考察酶制剂对饲料高温高湿制粒过程中表现的耐受性，将本批甘露聚糖酶饲料厂制粒实验

一、甘露聚糖酶造粒实验条件

温度：80℃左右时间：15s左右

投料量：500kg饲料/罐

取样：造粒前——每罐原料投料混合后分别取样5袋，200g/袋。造粒后——每罐造粒冷却后分别取样5袋，200g/袋。

检测：将每袋样品用粉碎机粉碎至40目后进行酶活检测，每个样品称取10g，用缓冲溶液溶解搅拌30min后，定容至100mL，离心取上清，将上清用0.45μm的微孔滤膜过滤后，按照规定的方法进行酶活检测。

二、实验结果

Figure 201210068282X100002DEST_PATH_IMAGE001

从上表可以看出本甘露聚糖酶比其它几个甘露聚糖酶明显能耐受高温。

Claims

1.固体耐高温酸性甘露聚糖酶的制作方法，包括根霉固体发酵曲料浸泡、离心、过滤、超滤、喷雾干燥，各步骤的具体条件如下：

超滤浓缩：膜分子量10000，浓缩至滤清液体积的1/12-1/8；

2.根据权利要求1所述固体耐高温酸性甘露聚糖酶的制作方法，其中所述的离心机为三足式离心机。

3.根据权利要求1所述固体耐高温酸性甘露聚糖酶的制作方法，其中所述的过滤机为板框过滤机。

4.根据权利要求1所述固体耐高温酸性甘露聚糖酶的制作方法，其中所述的喷雾干燥为离心式喷雾干燥塔。