CN105602859B - 小孢根霉c97102734及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及小孢根霉(Rhizopus microsporus)C97102734，其保藏编号为CCTCC NO.M2015706，本发明还涉及利用所述小孢根霉C97102734对石斛进行液化制备石斛液化液的方法，所述制备方法为：取石斛茎或花切碎，加入水打汁，石斛汁液经灭菌后，先接入益生中性β‑甘露聚糖酶初步酶解后接入小孢根霉C97102734发酵，过滤液化后汁液，取滤液即得，所得滤液可用于酒的勾兑。本发明采用酶解或发酵或二者结合的方式，将不溶于酒的石斛多糖转化成为溶于酒的石斛低聚糖，解决了石斛多糖不溶于酒，不能用石斛生产合格酒的技术难题，用石斛低聚糖对酒进行勾兑，得到的石斛酒具有良好的保健功能，实现了石斛深加工，大幅度提高了其附加值。

Description

小孢根霉C97102734及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及小孢根霉C97102734及应用，此外还涉及利用小孢根霉C97102734制备石斛液化液的方法。

背景技术

脾胃虚弱主要表现为四肢乏力、全身软瘫无力、反复腹泻、食欲不振、消古不化、面色萎黄等症状，肠胃不好影响全身机能，也会影响心情，影响精力现代人工作节奏加快，交通工具的普及，精神压力大、经常吃垃圾食品饮料，尤其学生和上班族脾胃虚弱者甚多，平常需要有防治脾胃虚弱的饮料食品进行食疗。

铁皮石斛、紫皮石斛、鼓槌石斛为名贵的药食两用中药，其性平，味甘、无毒、稍有清香气，富含粘液质、多糖、生物碱，石斛酚、石斛胺，总氨基酸，还有特殊的菲类、联苄类抗癌成分，石斛主要的成分为石斛多糖、石斛碱。其中石斛多糖含量高达22％～60％，石斛多糖属于活性多糖的一种，具有抗炎、抗病毒、修复自身提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化的功效，具有“延年益寿、健脾开胃、增强体质、清热解毒、滋养阴精、润养肌肤、调节血糖、抗癌”等功效。

石斛多糖是石斛的主要有效成份，目前为止，用石斛生产的保健酒分为浸泡酒和蒸馏酒，如发明专利CN101451098A、CN104352050A、CN104127700A、CN103666959A、CN103849542A为浸泡酒代表，黏糊状的石斛多糖不可能被酒浸泡并完全溶于酒中，即使是采用水浸泡石斛多糖也只能将石斛中含量极少的生物碱和色素溶于酒中，难以将石斛防病养生的功效发挥出来；如发明专利CN103666960A为蒸馏酒代表，将石斛加入米饭中发酵蒸酒，但是石斛多糖等有效成分也并不能完全溶于酒中。

科学界研究发现硒具有预防癌症作用，是人体微量元素的“防癌之王”，补硒可使肝癌发病率下降35％，使有肝癌家史者发病率下降50％。体内硒和维生素E协同，能够保护细胞膜，防止不饱和脂肪酸的氧化。微量硒具有防癌作用及保护肝脏的作用。有机硒能清除体内自由基，排除体内毒素、抗氧化、能有效的抑制过氧化脂质的产生，防止血凝块，清除胆固醇，增强人体免疫功能。硒是构成谷胱甘肽过氧化物酶的活性成分，它能防止胰岛β细胞氧化破坏，使其功能正常，促进糖份代谢、降低血糖和尿糖，改善糖尿病患者的症状。视网膜由于接触计算机辐射等较多，易受损伤，硒可保护视网膜，增强玻璃体的光洁度，提高视力，有防止白内障的作用。硒是维持心脏正常功能的重要元素，对心脏肌体有保护和修复的作用。人体血硒水平的降低，会导致体内清除自由基的功能减退，造成有害物质沉积增多，血压升高、血管壁变厚、血管弹性降低、血流速度变慢，送氧功能下降，从而诱发心脑血管疾病的发病率升高，然而科学补硒对预防心脑血管疾病、高血压、动脉硬化等都有较好的作用缺硒是克山病、大骨节病、两种地方性疾病的主要病因，补硒能防止骨髓端病变，促进修复，而在蛋白质合成中促进二硫键对抗金属元素解毒。对这两种地方性疾病和关节炎患者都有很好的预防和治疗作用硒与金属的结合力很强，能抵抗镉对肾、生殖腺和中枢神经的毒害。硒与体内的汞、铅、锡、铊等重金属结合，形成金属硒蛋白复合而解毒、排毒。

因此，如何将不易溶于酒的石斛多糖转化成易溶于酒的石斛低聚糖，将其用于制酒工业中，并在酒中引入有机硒，生产出同时具有石斛和硒双重保健功能的酒具有很大的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术存在的缺陷，提供一种小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)C97102734，采用此种菌株对石斛进行发酵，能够顺利地将石斛多糖转化成为石斛低聚糖。该菌株于2015年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072)，保藏编号CCTCC NO.M2015706。

该菌株是从成都水井坊分离得到的，其分离方法为：孢子繁殖法。

所述菌株的形态特征为：菌落长满培养皿，深灰褐色，薄棉絮状匍匐菌丝及假根褐色；rRNA基因ITS1-5.8ITS2区序列测定结果详见序列表，菌株在电镜下的照片详见图2，图3。

本发明的第二个目的是提供所述小孢根霉C97102734在石斛发酵中的应用，该菌株能够将石斛多糖转化成为石斛低聚糖。

本发明的第三个目的是提供一种石斛液化液的制备方法，所述制备方法为：将石斛茎或花切碎，加入水打汁，石斛汁液经灭菌后，采用如下①-③方式中的任意一种对石斛汁液进行液化：

①单独接入小孢根霉C97102734发酵；

②单独接入益生菌酶酶解；

③先接入益生菌酶酶解，后接入小孢根霉C97102734发酵；

过滤液化后汁液，取滤液即得。

为了方便后续的发酵和酶解，本发明优选在制备石斛汁液时，水的加入量为石斛重量的5～8倍。

此外，打汁后，汁液不经过滤处理，直接进行灭菌，所述灭菌可采用本领域常规的技术手段，本发明优选采用伽马射线辐照灭菌、低温等离子体(NTP)杀菌中的一种，此种灭菌手段不仅大幅度缩短了灭菌时间，同时大幅度减少了能源消耗，显著降低了企业成本，而且克服了常规灭菌技术存在的灭菌时间长，活性成分被破坏变性变形，产品色香味形不理想等缺陷，保证了活性成分不被破坏不变性不变形。

采用小孢根霉C97102734对汁液进行发酵，能够将石斛中难溶于酒精的石斛多糖液化成能够溶于酒精的石斛低聚糖，且得到的液化液气味清香，品质佳。

采用方式①对汁液进行发酵时，益生菌的接种量优选为40亿～80亿个/kg石斛。为了得到品质最佳的发酵液，本发明优选发酵在25～30℃，90～100％溶氧，搅拌速度120～180转/min条件下进行；进一步优选在27℃，100％溶氧，搅拌速度150转/min条件下进行。

接入的益生菌酶可采用本领域常用的酶，本发明优选为益生中性β-甘露聚糖酶，采用益生菌酶对汁液进行酶解，同样能够将石斛中难溶于酒精的石斛多糖液化成能够溶于酒精的石斛低聚糖。

采用方式②对汁液进行酶解时，益生中性β-甘露聚糖酶的用量为200000U～600000U/kg石斛，为了得到品质最佳的酶解液，优选所述酶解在50℃～60℃，pH6～7.5条件下进行；进一步优选在53℃，pH6.8条件下进行。

单独采用益生菌进行发酵，得到的发酵液品质优异，但其生产成本较高；单独采用益生菌酶进行酶解，得到的发酵液气味较差，不利于后期对酒进行勾兑。为了节约成本，且生产出品质优异的液化液，本发明优选采用先酶解后发酵的方式制备液化液，其具体操作为：按照1kg石斛加入100000U～300000U益生菌酶的比例，向灭菌处理后的汁液中加入益生中性β-甘露聚糖酶，于50℃～60℃，pH6～7.5条件下酶解3h～5h；然后将酶解液降温至室温，按照1kg石斛接种10亿～30亿个小孢根霉C97102734的比例，向其内接种小孢根霉C97102734，并在25～30℃，90～100％溶氧，搅拌速度120～180转/min条件下发酵培养直至发酵完全。采用此种方式进行生产，不仅节约了企业成本，有利于工业化生产，且最终得到的产品气味清香。

本发明所述的石斛可采用本领域常用的各种石斛，本发明优选采用紫皮石斛、铁皮石斛或鼓槌石斛中的一种或多种。

为了获得具有更好保健功能的石斛液化液，本发明优选采用富有机硒成分的石斛，进一步优选硒含量3mg/kg～40mg/kg的紫皮石斛、铁皮石斛、鼓槌石斛中的一种或多种。以富有机硒成分的石斛为原料制备得到的石斛液化液中同样含有有机硒成分。其中，所述的有机硒成分包括硒氨基酸、硒多糖、硒蛋白中的一种或多种。

本发明所述富有机硒成分的石斛是通过向处于生长期的石斛叶面喷施富硒菌剂得到的，所述富硒菌剂是通过微生物对含有硒源的培养液发酵得到的，所述富硒菌剂可采用普通市售产品或采用本领域常用的技术手段制备得到，如可以采用专利CN201210388963.4中的富硒菌剂。

本发明同时提供了一种具体的富有机硒成分的石斛的种植方法：向处于生长盛期的石斛叶面喷施上述富硒菌剂，每隔5～7天时间喷施一次，整个生长期喷施2～4次即得。

为了方便储存，可采用本领域常用的冷冻干燥手段将所述石斛液化液冷冻干燥，制得石斛低聚糖冷冻干燥粉。本发明优选冷冻干燥的条件为：温度-50℃～-60℃，真空度1Pa～10Pa。

本发明的第四个目的是提供采用上述任意一种方法制备得到的石斛液化液或石斛低聚糖冷冻干燥粉，所述石斛液化液或石斛低聚糖冷冻干燥粉中含有石斛低聚糖、毛兰素和鼓槌菲；或含有石斛低聚糖、硒、毛兰素和鼓槌菲。

本发明的第五个目的是提供上述任意一种石斛液化液或石斛低聚糖冷冻干燥粉在制酒中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种石斛酒的制备方法，具体为使用上述任意一种石斛液化液/石斛低聚糖冻干粉对酒基进行勾兑。

优选地，所述石斛酒中石斛低聚糖含量为0.1％～2.5％，毛兰素含量为1～1000mg/L，鼓槌菲含量为1～500mg/L，有机硒含量为0～0.05mg/L。

在勾兑过程中，采用SA-系列原子荧光形态分析仪测定酒中的有机硒含量，如果硒含量不达标，则通过添加含有硒元素的石斛液化液或硒代半胱氨酸使硒达标；如果硒超标，则加入酒基稀释到达标。

本发明对勾兑的酒基没有特殊限制，可采用各种商品类型的中国白酒、葡萄酒、黄酒、米酒、干红酒、白兰地酒、威士忌酒、俄得克酒、金酒、朗姆酒、伏特加酒、啤酒、果露酒、利口酒、味美酒、水果酒中的一种。酒基香型可以为酱香型、浓香型、兼香型、特香型、米酒香、清香型、凤香型、药香型、豉香型、老白干香型、馥郁香型、酒芝麻香型中的任意一种。

本发明采用特定的菌种将不溶于酒的石斛多糖转化成为溶于酒的石斛低聚糖，解决了石斛多糖不溶于酒，不能用石斛生产合格酒的技术难题。用含石斛低聚糖的石斛液化液对酒进行勾兑，得到的石斛酒具有良好的保健功能，此外，采用富硒石斛作为原料制备石斛液化液，用其勾兑的石斛酒含有有机硒，更加提高了石斛酒的保健功能。本发明所述的方法实现了对石斛的深加工，大幅度提高了石斛的附加值，降低了酒燥性和酒毒性，赋予酒以健脾胃的功能，提高了人们的生活品质。

附图说明

图1为小孢根霉C97102734的菌落图。

图2为小孢根霉C97102734的电镜照片。

图3为小孢根霉C97102734的电镜照片。

图4为小孢根霉C97102734的rRNA基因ITS1-5.8ITS2区的序列。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中涉及到的小孢根霉C97102734种子液、富有机硒成分的石斛采用如下方法制备得到，益生中性β-甘露聚糖酶为普通市售产品，规格为50000U/g。如无特殊说明，实施例中涉及到的物质均可市购获得或通过本领域常规手段制备得到，涉及到的操作均为本领域常规操作。

小孢根霉C97102734试管种菌活化培养：

取400g马铃薯切成小块置2L烧杯中，加水0.6L煮沸20～30分钟煮烂，用八层纱布过滤，加热，再加40g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入40g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至2L，分装试管加塞、包扎，置伽马辐照机2500千拉德辐照灭菌后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后置超净工作台接种小孢根霉C97102734，接种完毕后，置恒温培养箱27℃培养4天。

小孢根霉C97102734种子液培养：

取40kg马铃薯切成小块，置200L化糖锅中，加水60L煮沸20～30分钟煮烂，用八层纱布过滤，继续加热搅拌混匀，加入4kg葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至200L，置伽马辐照机2500千拉德辐照灭菌后，用无菌泵和无菌管道输入200L发酵罐中，在无菌条件下从发酵罐接菌口将100支小孢根霉C97102734活化试管种接入发酵罐，接种完毕后，在无菌条件下密封接种口，在27℃，100％溶氧、搅拌速度150转/min，培养8h，即得。

富有机硒成分的石斛的培养：

向处于生长盛期的石斛叶面喷施富硒菌剂，每隔七天时间喷施一次，整个生长期喷施3次，即得含有硒元素的石斛。

实施例1 单独发酵法制备石斛液化液

将新鲜的180kg富有机硒成分的石斛枝条洗净，用变频变速高效切碎机将石斛鲜条、鲜花切成3mm薄片后送入变频变速打汁机中，向打汁机中加入1260kg水，打汁机开机后其速度由慢变快打汁，转速控制在10～1000转/min范围，待全部打出汁后，用泵和管道将石斛汁输送到灭菌室，用伽马辐照机2500千拉德辐照灭菌，将灭菌后的石斛汁用无菌泵和无菌管道输送到2吨的无菌发酵罐中，并按照9份石斛汁加1份小孢根霉C97102734种子液的比例，向无菌发酵罐中加入种子液，在27℃，100％溶氧、搅拌速度150转/min条件下培养6h，然后用无菌泵和无菌管道将石斛液化的低聚糖输送到无菌固液离心机上离心，用无菌泵和无菌管道将无菌的水状透明的石斛液化液输送到无菌储藏罐内密封保存。

经检测，石斛液化液中石斛低聚糖的含量为2.1％，毛兰素含量为180mg/L，鼓槌菲含量为30mg/L。

实施例2 单独酶解法制备石斛液化液

将新鲜的180kg富有机硒成分的石斛枝条洗净，用变频变速高效切碎机将石斛鲜条、鲜花切成3mm薄片后送入变频变速打汁机中，向打汁机中加入1260kg水，打汁机开机后其速度由慢变快打汁，转速控制在10～1000转/min范围，待全部打出汁后，用泵和管道将石斛汁输送到灭菌室，用伽马辐照机2500千拉德辐照灭菌，将灭菌后的石斛汁用无菌泵和无菌管道输送到2吨的无菌发酵罐中，并向其中加入0.12kg益生中性β-甘露聚糖酶，在50℃～55℃，pH6～6.5条件下酶解4h，然后用无菌泵和无菌管道将石斛液化的低聚糖输送到无菌固液离心机上离心，用无菌泵和无菌管道将无菌的水状透明的石斛液化液输送到无菌储藏罐内密封保存。

经检测，石斛液化液中石斛低聚糖的含量为1.8％，毛兰素含量为170mg/L，鼓槌菲含量为27mg/L。

实施例3 先酶解后发酵法制备石斛液化液

将新鲜的180kg富有机硒成分的石斛枝条洗净，用变频变速高效切碎机将石斛鲜条、鲜花切成3mm薄片后送入变频变速打汁机中，向打汁机中加入1260kg水，打汁机开机后其速度由慢变快打汁，转速控制在10～1000转/min范围，待全部打出汁后，用泵和管道将石斛汁输送到灭菌室，用伽马辐照机2500千拉德辐照灭菌，将灭菌后的石斛汁用无菌泵和无菌管道输送到2吨的无菌发酵罐中，并向其中加入0.08kg益生中性β-甘露聚糖酶，于50℃，pH条件下酶解3.5h；然后向酶解液中加入36kg小孢根霉C97102734种子液，在27℃，100％溶氧、搅拌速度150转/min条件下培养6h，然后用无菌泵和无菌管道将石斛液化的低聚糖输送到无菌固液离心机上离心，用无菌泵和无菌管道将无菌的水状透明的石斛汁液化的低聚糖输送到无菌储藏罐内密封保存。

经检测，石斛液化液中石斛低聚糖的含量为2.6％，毛兰素含量为110mg/L，鼓槌菲含量为33mg/L。

实施例4 石斛低聚糖冷冻干燥粉的制备

将实施例3制备得到的石斛液化液在-55℃，真空度7Pa条件下进行冷冻干燥即得。

实施例5 30度富硒健脾胃石斛功能酱香酒原浆勾兑方法

取1吨53度茅台酒置于无菌搅拌罐中，加入实施例3制备得到的石斛液化液0.767吨，60转/min搅拌均匀后，灌装入100kg装酒专用陶瓷缸中密封，得富硒健脾胃石斛功能酱香商品酒，送藏酒窖储藏1月以上开封，装瓶，贴牌，入库批发，销售。入库前将整箱富硒健脾胃石斛功能酱香酒送入灭菌室用伽马辐照机2500千拉德辐照灭菌。

经检测，该酒中硒含量为0.04mg/L，石斛低聚糖含量为0.11％，毛兰素含量为100mg/L，鼓槌菲含量为30mg/L。

实施例6 53度富有机硒健脾胃石斛功能酱香酒勾兑方法

该实施例的勾兑方法同实施例4，其区别仅在于本实施例加入20kg实施例4所述的石斛低聚糖冷冻干燥粉，得有机硒健脾胃石斛功能酱香商品酒。

经检测，该酒中硒含量为0.05mg/L，石斛低聚糖含量为2％，毛兰素含量为120mg/L，鼓槌菲含量为40mg/L。

实施例7 43度富有机硒健脾胃石斛功能酱香酒勾兑方法

该实施例的勾兑方法同实施例4，其区别仅在于本实施例采用实施例1的石斛液化液0.233吨，得富有机硒健脾胃石斛功能酱香商品酒。

经检测，该酒中硒含量为0.03mg/L，石斛低聚糖含量为0.4％，毛兰素含量为32mg/L，鼓槌菲含量为10mg/L。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.小孢根霉（Rhizopus microsporus）C97102734：其保藏编号为CCTCC NO：M2015706。

2.权利要求1所述的小孢根霉C97102734在石斛发酵中的应用。

3.一种石斛液化液的制备方法，其特征在于：将石斛茎或花切碎，加入水打汁，石斛汁液经灭菌后，采用如下①或②方式对石斛汁液进行液化：

①单独接入权利要求1所述的小孢根霉C97102734发酵；

②先接入益生菌酶初步酶解，后接入权利要求1所述的小孢根霉C97102734发酵，所述益生菌酶为益生中性β-甘露聚糖酶；

过滤液化后汁液，取滤液即得。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：将石斛茎或花切碎，加入石斛茎或花重量5-8倍的水打汁，石斛汁液经伽马射线辐照灭菌或低温等离子体灭菌后，进行液化。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：方式①的操作为：按照小孢根霉C97102734的接种量40亿~80亿个/kg石斛，向石斛汁液中接入小孢根霉C97102734，进行发酵；

或，方式②的操作为：按照益生中性β-甘露聚糖酶用量100000U~300000U/kg石斛，小孢根霉C97102734接种量10亿~30亿个/kg石斛，先向灭菌后的石斛汁液中接入石斛益生中性β-甘露聚糖酶，于50℃~60℃，pH6~7.5条件下对石斛多糖初步酶解3~5h；然后向酶解液中接入小孢根霉C97102734，于25~30℃，90~100%溶氧，搅拌速度120~180转/min条件下发酵。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：方式①中，所述发酵在25~30℃，90~100%溶氧，搅拌速度120~180转/min条件下进行。

7.根据权利要求3~6任一所述的制备方法，其特征在于：所述石斛为富有机硒成分的紫皮石斛、铁皮石斛、鼓槌石斛中的一种或多种，所述富有机硒成分的石斛是通过向处于生长期的石斛叶面喷施富硒菌剂得到的。

8.根据权利要求3~6任一所述的制备方法，其特征在于：还包括将制备得到的液化液进行冷冻干燥制取石斛低聚糖冻干粉的步骤，所述冷冻干燥的条件为：温度-50℃~-60℃，真空度1Pa~10Pa。

9.权利要求3~6任一所述的制备方法在制酒中的应用。

10.一种石斛酒的制备方法，其特征在于：使用权利要求3~6任一所述的制备方法制备得到含石斛低聚糖的石斛液化液或使用权利要求8所述的制备方法制备得到石斛低聚糖冻干粉，用所述石斛液化液或石斛低聚糖冻干粉对酒基进行勾兑，即得。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述石斛酒中石斛低聚糖含量为0.1%~2.5%，毛兰素含量为1~500mg/L，鼓槌菲含量为1~500mg/L，有机硒含量为0~0.05mg/L。