CN114437938B - 一株高产耐高温酸性β-甘露聚糖酶的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株高产耐高温酸性β‑甘露聚糖酶的黑曲霉菌株及其应用。所述菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)HNG26‑22，保藏编号为CGMCC NO.23221。利用该菌株进行工业化发酵生产的发酵酶活水平可达到12000‑13000U/mL以上，大大降低了生产成本，有利于β‑甘露聚糖酶的大规模应用，节能减排。所产β‑甘露聚糖酶具有耐高温、良好的pH稳定性和蛋白酶抗性等特点。更易在动物、家禽的胃和肠道中发挥作用，同时也在饲料应用中显示出其巨大的潜力。

Description

一株高产耐高温酸性β-甘露聚糖酶的菌株及其应用

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株高产耐高温酸性β-甘露聚糖酶的黑曲霉菌株及生产方法。

背景技术：

β-甘露聚糖酶(endo-1,4-β-D–mannanmanno hydroase EC 3.2.1.78)是一类能水解含β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露聚糖的半纤维素酶，广泛存在于动植物和微生物中。其作用底物非常广泛，包括甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖。β-甘露聚糖酶是一种新型的酶制剂，它除具有一般非淀粉多糖酶类的作用——降解非淀粉多糖，降低肠道粘度，促进营养物质的消化吸收外，还是一种多功能的促进剂，可以促进胰岛素生长因子的分泌，促进蛋白质的合成，促进生长。同时还可以促进动物肠胃中有益菌的生长而抑制有害菌的繁殖，提高动物免疫力及成活率。近年来β-甘露聚糖酶的研究日益受到重视，已在饲料、食品、石油开采等领域得到了广泛的应用。

已报道的产β-甘露聚糖酶的微生物包括：细菌中的芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌；真菌中的曲霉、木霉、青霉；酵母菌和放线菌中的链霉菌等。微生物是β-甘露聚糖酶的主要来源，各种微生物产生甘露聚糖酶的条件和所产酶活性的高低、酶的性质等均有所不同。目前，国内外对来源不同菌种的β-甘露聚糖酶的研究、生产和应用多集中在碱性和中性酶方面，而在饲料中应用的甘露聚糖酶，需要在酸性条件下具有较高活性，因此，酸性β-甘露聚糖酶的研究与开发在饲料工业应用中有重要意义。

β-甘露聚糖酶在工业化应用时，经常会涉及到高温处理过程，而导致酶失活。因此，为满足各种工业应用要求，提高β-甘露聚糖酶的耐高温性能一直是急需解决的问题。而在饲料中应用的甘露聚糖酶，需要在酸性条件下具有较高活性，因此耐高温酸性β-甘露聚糖酶的研究与开发在饲料工业应用中具有重要意义。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将提供一株高产耐高温酸性β-甘露聚糖酶的菌株，该菌株是由实验室保存的黑曲霉菌株HQM-2经NTG诱变后获得的，具体为黑曲霉(Aspergillus niger)HNG26-22，该菌株已于2021年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO.23221。

本发明还提供黑曲霉(Aspergillus niger)HNG26-22在生产β-甘露聚糖酶中的应用，特别是提供一种发酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的β-甘露聚糖酶的液态微生物发酵生产方法。本发明的目的可以通过以下措施来实现：

(1)液态发酵生产β-甘露聚糖酶

发酵罐发酵工艺条件：接种量1.5-2.5％，罐压0.05-0.08MPa，培养温度32-34℃，转速200-800r/min，当溶氧降至最低再升至30-35％时开始补料，控制溶氧20-30％(初始补料量为300g/h，当溶氧低于20％时减少补料量，当溶氧高于30％时增加补料量，根据溶氧情况适当调整补料量)，培养至110-130h左右，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶时放罐；

发酵结束时，发酵液酶活力为12000-13000U/mL；

(2)β-甘露聚糖酶的提取与精制

发酵结束后，按发酵液体积加入40-45％的水和0.25-0.35％氯化钙，加入2.5-3.5％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；用孔径为20KDa的超滤膜对澄清压滤酶液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂(7-9％葡萄糖、8-10％氯化钠)，防腐剂(0.15-0.2％山梨酸钾)，然后用硅藻土进行过滤除菌，即得到β-甘露聚糖酶成品酶制剂(“％”表示质量体积比)。

进一步地，发酵罐培养基组成如下：魔芋粉1.5-2％，玉米浆1.6-2％，磷酸氢二钾2-2.5％，硫酸镁0.2-0.3％，硫酸铵1.5-2.0％，硝酸钠0.25-0.3％，其余为水，pH6.0-6.2(“％”表示质量体积百分比)；

进一步地，发酵罐灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌30min。

进一步地，补料培养基组成如下：魔芋粉10-12％，玉米浆3-3.5％，硫酸铵1.5-2.0％，磷酸二氢钾1-2.5％，其余为水，pH6.0-6.2(“％”表示质量体积百分比)。

本发明制备的β-甘露聚糖酶，酶学特性如下：

(1)最适反应温度为40℃，在90℃条件下保温2h，仍能保持85％以上的酶活，热稳定性较好；

(2)最适反应pH为3.0，在pH2.0-7.0的条件下处理2h，相对酶活力仍然保持在80％以上。

有益效果：

本发明提供的黑曲霉及生产方法，相比现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，并能产生如下积极效果：

1.发明首先提供了一株高产β-甘露聚糖酶的黑曲霉突变菌株，利用该菌株进行工业化发酵生产的发酵酶活水平可达到12000-13000U/mL以上，大大降低了生产成本，有利于β-甘露聚糖酶的大规模应用，节能减排。

2.该β-甘露聚糖酶同时具有耐高温、良好的pH稳定性和蛋白酶抗性等特点，最适反应温度为40℃，在90℃条件下保温2h，仍能保持85％以上的酶活，热稳定性较好；最适反应pH为3.0，在pH2.0-7.0范围内处理2h，该酶能够维持其80％以上活力；具有极好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶处理能力，其中经胃蛋白酶处理2h后，相对酶活仍保持95％以上，经胰蛋白酶处理2h后，相对酶活仍保持在90％以上。本发明中的β-甘露聚糖酶更易在动物、家禽的胃和肠道中发挥作用。

另外，由于该β-甘露聚糖酶具有较好的耐热性，适宜于饲料添加剂制备过程中的热处理。因此，本发明中的耐高温酸性β-甘露聚糖酶将在饲料应用中显示出其巨大的潜力。

3.本发明提供了一种发酵活力更高、提取收率更高、制造成本更低的β-甘露聚糖酶液态生物发酵的生产方法和生产菌株。

附图说明：

图1最适反应温度曲线图；

图2热稳定性曲线图；

图3最适反应pH曲线图；

图4pH稳定性曲线图；

图5对胃蛋白酶、胰蛋白酶消化耐受性曲线图。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

实施例1菌株的诱变选育

取一株出发菌株黑曲霉HQM-2的新鲜培养斜面，用无菌生理盐水洗脱菌体，转移至装有玻璃珠的三角瓶中，置于摇床振荡30min使菌体分散，用无菌脱脂棉过滤，收集单孢子，用生理盐水调整单孢子浓度为10⁶个/mL左右，并加入NTG母液，使得最终浓度为0.2g/L。然后于34℃反应30min，经适当稀释之后，取100μL涂布于筛选平板上，34℃培养4天左右，挑取筛选平板上透明圈较大的单菌落接入种瓶中培养，待种子长好后接入发酵摇瓶。最终筛选到一株β-甘露聚糖酶酶活提高4.6倍的高产菌株HNG26-22，通过酶学特性研究，该突变菌株产生的β-甘露聚糖酶具有良好的耐热性和pH稳定性。

筛选平板培养基：胰蛋白胨1％；酵母粉0.5％，氯化钠0.5％，槐豆胶0.5％，刚果红0.3％，琼脂2％，其余为水，pH6.0；

发酵摇瓶培养基：魔芋精粉2％；酵母粉2％，玉米浆1.6％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.3％，硫酸铵0.5％，硝酸钠0.8％，碳酸钠0.3％，其余为水，pH6.0。

(1)β-甘露聚糖酶高产菌株HNG26-22的稳定性传代实验

将β-甘露聚糖酶高产菌株黑曲霉HNG26-22培养好的新鲜斜面，用无菌铁铲取一接种环菌苔接种到发酵摇瓶中，34℃，200r/min培养4d，测定β-甘露聚糖酶酶活。将该菌株连续传代10次的摇瓶结果如表1所示：

表1.菌株HNG26-22稳定性检测结果

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菌株HNG26-22生长速度较快，产孢子量少，在液体摇瓶中培养时菌丝球较少。将该突变菌株传代培养10代，实验结果由表1可以看出，该突变菌株的遗传稳定性好。

实施例2β-甘露聚糖酶酶活测定方法

(1)本发明β-甘露聚糖酶酶活单位的定义

在一定条件下(如未特别说明，则条件为：40℃，pH5.0)，每分钟分解槐豆胶中的β-甘露聚糖生成1μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活单位。

(2)酶活测定方法

采用DNS法对本发明的β-甘露聚糖酶进行活性检测，利用3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成正比例关系，因此可用于比色法测定。

具体方法如下：取900μL pH5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制的0.5％槐豆胶溶液，加入100μL用pH5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液适当稀释的酶液，于40℃条件下准确反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水浴5min，冷却后540nm测OD值。

实施例3菌株液体发酵生产β-葡聚糖酶及其提取

1、种子培养

培养基质量体积百分比组成如下：

(1)平板分离培养基

胰蛋白胨1％；酵母粉0.5％，氯化钠0.5％，槐豆胶0.5％，刚果红0.3％，琼脂2％，其余为水，pH6.0。

(2)种子培养基

胰蛋白胨2％，牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，硫酸铵0.3％，其余为水，pH6.0。

(3)发酵摇瓶酵培养基

魔芋精粉2％；酵母粉2％，玉米浆1.6％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.3％，硫酸铵0.5％，硝酸钠0.8％，碳酸钠0.3％，其余为水，pH6.0。

(4)培养条件

分离平板：34℃培养4天；

液体种子：从平板上取一环菌种，接种至种子培养基，34℃培养48h，摇床转速200r/min；

发酵摇瓶：取种子液按接种量2％接种至发酵摇瓶培养基中，34℃培养120h，摇床转速200r/min。

2、种子罐扩大培养

培养基质量体积百分比组成如下：

(1)种子罐培养基

玉米淀粉3％，蛋白胨1.5％，豆饼粉2％，氯化钠1％，氯化钙0.5％，硫酸铵3％，硫酸镁1％，其余为水，pH 6.0；

(2)种子罐灭菌工艺条件：121℃，0.12MPa条件下，灭菌30min；

(3)种子罐培养工艺条件

接种量2％，罐压0.05MPa，培养温度34℃，搅拌转速200r/min，pH控制6.0；

(4)种子罐移种条件：菌体染色深、粗壮，无杂菌。

3、液态发酵生产β-甘露聚糖酶

培养基质量体积百分比组成如下：

(1)发酵罐培养基：魔芋粉2％，玉米浆1.8％，磷酸氢二钾2.2％，硫酸镁0.25％，硫酸铵1.8％，硝酸钠0.3％，其余为水，pH6.0；

(2)发酵罐灭菌工艺条件：121℃，0.12MPa条件下，灭菌30min。

(3)发酵罐发酵工艺条件：罐压0.05MPa，培养温度34℃，转速400r/min，接种量2％，当溶氧降至最低再升至30％时开始补料，控制溶氧在20-30％(初始补料量为300g/h，当溶氧低于20％时减少补料量，当溶氧高于30％时增加补料量，根据溶氧情况适当调整补料量)，发酵至菌体自溶严重，酶活无明显提高时放罐。

4、补料

(1)补料培养基：魔芋粉10％，玉米浆3.5％，硫酸铵1.8％，磷酸二氢钾1.5％，其余为水，pH 6.0。

(2)补料方法：当溶氧降至最低再升至30％时开始补料，补料控制溶氧在20-30％。

5、放罐

培养至110-120h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐。

6、β-甘露聚糖酶的提取与精制

发酵结束后，按发酵液体积加入40％的水和0.3％氯化钙，加入3％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；用20KDa超滤膜对澄清压滤酶液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂：8％葡萄糖、10％氯化钠，防腐剂：0.15％山梨酸钾，然后用硅藻土进行过滤除菌，即得到β-甘露聚糖酶成品酶制剂。

应用上述黑曲霉诱变菌株CGMCC NO.23221及培养方法进行发酵，表2是进行6批发酵的发酵周期和发酵液酶活力，发酵液酶活力在12000-13000U/mL。

表2. 50L小罐发酵实验结果

由表2可以看出，诱变菌株HNG26-22发酵水平较稳定，发酵酶活均达到了12000U/mL以上。

实施例4最适反应温度

取实施例3批次1制备的β-甘露聚糖酶成品，采用实施例2所述的方法，以正常条件pH5.0，分别在30、35、40、45、50、55、60℃条件下测定β-甘露聚糖酶活力，以40℃时的酶活为100％计算相对酶活。结果如图1所示，最适反应温度为40℃。

实施例5热稳定性

取实施例3批次1制备的β-甘露聚糖酶成品，将酶液分别置于60、65、70、75、80、85、90、95、100℃条件下保温处理2h，保温结束后采用实施例2所述的方法测定酶活，以未处理的原始酶活力为100％计算相对酶活。其实验结果如图2所示。在90℃条件下保温2h，仍能保持85％以上酶活，热稳定性较好，可以达到饲料及其它工业用酶的要求。

实施例6最适反应pH

取实施例3批次1制备的β-甘露聚糖酶成品，根据实施例2所述的酶活测定方法，在温度为40℃条件下，分别测定在pH值在2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0条件下β-甘露聚糖酶活力，以pH3.0时的酶活力为100％计算相对酶活。测定结果如图3所示，β-甘露聚糖酶的酶活在pH为3.0附近时酶活最高。

实施例7耐酸碱性

取实施例3批次1制备的β-甘露聚糖酶成品分别置于pH为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，于室温条件下静置2h后，采用实施例2所述的方法测定酶活力，以未处理的原始酶活力为100％计算相对酶活。测定结果如图4所示，在pH2.0-7.0的条件下处理2h后，相对酶活力仍然保持在80％以上。

实施例8β-甘露聚糖酶对胰蛋白酶和胃蛋白酶水解耐受性测定

取0.1mL实施例3批次1制备的β-甘露聚糖酶成品酶液，分别加入0.5mL胃蛋白酶(pH2.0浓度100U/mL)和0.5mL胰蛋白酶(pH7.0浓度150U/mL)，于37℃条件下处理不同时间后测定酶活，以未处理的原始酶活力为100％计算相对酶活。结果如图5所示，其中经胃蛋白酶处理2h后，相对酶活仍保持95％以上，经胰蛋白酶处理2h后，相对酶活仍保持在90％以上，说明本发明的β-甘露聚糖酶具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (2)

1.一株生产耐高温酸性β-甘露聚糖酶的菌株，其特征在于，所述菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)HNG26-22，保藏编号为CGMCC NO.23221。

2.权利要求1所述黑曲霉(Aspergillus niger)HNG26-22在生产β-甘露聚糖酶中的应用。

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