CN103509730A - 一种类芽孢杆菌、选育方法及其生产β-葡聚糖酶及方法 - Google Patents

一种类芽孢杆菌、选育方法及其生产β-葡聚糖酶及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能有效降解索拉胶的高产β-葡聚糖酶菌株,分类命名为类芽孢杆菌S09(Paenibacillussp.S09),保藏登记号为CCTCC M2012196,保藏日期为2012年5月30日,保藏单位:中国典型微生物保藏中心(CCTCC),地址为:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心,其16SrRNA基因序列在Genbank上的登录号为JQ945736。本发明还公开了一种利用类芽孢杆菌S09生产β-葡聚糖酶的方法及按照该方法得到的粗酶制剂。该酶制剂具有较高的昆布多糖酶和地衣多糖酶酶活,在饲养业、酿酒工业及生物防治等领域具有广泛的应用前景。

Description

一种类芽孢杆菌、选育方法及其生产β-葡聚糖酶及方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域,更具体涉及一株β-葡聚糖酶高产菌株,其菌体发酵培养的粗酶及其制备方法。 
背景技术
β-葡聚糖是自然合成的非淀粉多糖,作为细胞壁的重要组成成分广泛存在与高等植物和真菌中,也可由细菌分泌到胞外,成为胞外多糖。不同来源的β-葡聚糖其糖苷键结合方式和比例不同,主链主要由b-1,3糖苷键连接,通常还含有不同比例和大小的b-1,2、 b-1,4、 b-1,6糖苷键连接的支链。从褐藻和酵母中提取的β-葡聚糖主要是带β-1,6-分枝的β-1,3-葡聚糖,禾谷类作物中的β-葡聚糖主要是β-1,3-1,4-葡聚糖。存在与麦类作物中的β-葡聚糖因其吸水性和黏性,成为了动物饲料中的主要抗营养因子,并给啤酒酿造中的麦汁过滤造成困难。 
β-葡聚糖酶主要来源于微生物,属GH16家族的水解酶类。按水解底物糖苷键的不同,可分为β-1,3-1,4-葡聚糖酶,β-1,3-葡聚糖酶,β-1,4-葡聚糖酶,β-1,3/4-葡聚糖酶;按作用方式的不同,可分为内切和外切两类。β-葡聚糖酶将长片段的β-葡聚糖降解成为低分子量片段,使其失去黏性和亲水性,对动物饲料工业和酿造业有极大的应用价值。在动物饲料中添加β-葡聚糖酶可改变单胃动物肠道内容物特性,消除抗营养作用,促进养分的消化和吸收;在啤酒糖化过程中添加β-葡聚糖酶可降低麦汁粘度,减少啤酒中的凝胶状沉淀物,提高麦汁过滤速度和得率,从而提高啤酒质量。另外,β-葡聚糖酶可用于改善葡聚糖的水溶性和制备低分子量β-葡聚糖,研究其生物学活性和制备免疫性多糖。 
目前已经筛选出的细菌来源的β-葡聚糖酶主要由芽孢杆菌产生,其他来源较少。真菌性β-葡聚糖酶的热稳定性一般低于芽孢杆菌的β-葡聚糖酶。我国的β-葡聚糖酶的研究起步较国外晚约二十年,生产的β-葡聚糖仍存在生产水平偏低,耐热性差,菌株来源不足等缺点。通常,β-葡聚糖酶产生菌是由地衣多糖、茯苓多糖或酵母和霉菌细胞壁等传统底物筛选而来,这在一定程度上限制了新型β-葡聚糖酶及其产生菌的筛选。索拉胶(Salecan)是一种由土壤杆菌Agrobacteriumsp.ZX09产生的一种胞外多糖,其结构如下所示:→{3)-beta-D-Glup-(1→3)-[beta-D-Glup-(1→3)-beta-D-Glup-]3-alpha-D-Glup-(1→3)-alpha-D-Glup-(1}n→,n为100~200.(授权公告号CN 101935623 B)(Xiu A, Kong Y, Zhou M, Zhu B, Wang S, Zhang J. October 15 2010. The chemical and digestive properties of a soluble glucan from Agrobacterium sp. ZX09. Carbohydrate Polymers, Vol. 82, No. 3, 623-628)。索拉胶是可溶于水且粘度较高的一种新型的线性β-葡聚糖。由于其结构的新颖性与特殊性,可用于筛选新的β-葡聚糖酶及其产生菌。 
十六烷基三甲基溴化铵是一种阳离子型的表面活性剂,能与富含阴离子的高分子多糖结合形成不溶于水的多糖-CTAB复合物,从而常用于多糖的分离纯化及杂质多糖的去除等方面。 
类芽孢杆菌是不同于芽孢杆菌的新的种属,于1993年由Ash等将11个种从芽孢杆菌中分出(Ash C, Priest FG, Collins MD. 1993. Molecular identification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Farrow, Wallbanks and Collins) using a PCR probe test. Proposal for the creation of a new genus Paenibacillus. Antonie Van Leeuwenhoek, Vol.64, No.3-4,253-260),其模式种为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。类芽孢杆菌属的菌株具有显著的生防潜力,且生长快,营养简单,性能稳定,是具有较强应用潜力的菌种之一。目前对类芽孢的应用研究报道呈快速上升趋势。 
发明内容
本发明的目的是提供一种利用新型β-葡聚糖索拉胶作为筛选底物,利用十六烷基三甲基溴化铵-索拉胶(CTAB-salecan)透明圈法筛选葡聚糖酶产生菌的方法。 
本发明的另一目的是提供一种基于索拉胶作为筛选底物筛选出的高产β-葡聚糖酶菌株(Paenibacillus sp. S09)。 
本发明的目的还在于提供一种用索拉胶和类芽孢杆菌S09发酵生产的β-葡聚糖酶及其方法。该菌株产生的β-葡聚糖酶具有复杂的包含昆布多糖酶和地衣多糖酶等葡聚糖酶的混合水解酶系,该混合酶系具有较高的最适反应温度、热稳定性和pH稳定性好等特点,具有广泛的工业应用价值。 
本发明的目的通过下述技术方案实现: 
一种用索拉胶作为筛选底物筛选β-葡聚糖酶产生菌的选育方法,步骤如下:
(1)配制筛选培养基:将质量浓度为KH2PO4 0.5-1‰,NaNO2-3‰,CaCl2 0.07-0.15‰,MgSO4 0.1-0.3‰,FeSO4·7H2O 0.007-0.015‰,索拉胶3-8‰溶于H2O中,pH为6-7.5,固体培养基添加0.9-1.5%的琼脂;
(2)将培养基于115°C~121°C灭菌15-30分钟,然后冷却;
(3)将采集的用于筛选的土样或水样加入液体培养基中,于28-37°C摇床中振荡培养2-4天用于富集索拉胶降解菌,培养基中索拉胶粘度降低的菌液用于后续筛选;
(4)将富集培养的菌液做十倍梯度稀释,涂布到固体筛选培养基上,于28°C ~37°C培养箱中培养2-4天;
(5)将平板上的单菌落做好标记,影印至新的固体培养基上,将原平板上的菌落刮下,用质量浓度为1-3% CTAB溶液覆盖平板15-30min后观察;
(6)将形成透明圈的菌落挑出,重新接种到液体筛选培养基中,于28-37°C摇床中振荡培养2-4天,将使培养基中索拉胶粘度下降的菌筛出并保存。
一种通过上述方法分离出的能有效降解索拉胶的高产β-葡聚糖酶菌株,分类命名为类芽孢杆菌S09(Paenibacillussp. S09),保藏登记号为CCTCC NO:M2012196,保藏日期为2012年5月30日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址为:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心,其16SrRNA基因序列在Genbank上的登录号为JQ945736。 
一种利用类芽孢杆菌S09菌体发酵培养粗酶液的制备方法,包括如下步骤: 
(1)种子培养基为:0.3-0.5%(w/v)索拉胶,pH6-7,110-121°C高压灭菌15-30min,接种固体培养基上的S09单菌落,28-37°C振荡培养2-3天;
(2)发酵培养基为:0.5-1%(w/v)索拉胶, pH6-7,110-121°C高压灭菌15-30min;按2-4%接种量接种种子液,28-37°C,200-225rpm,振荡培养24-36h,7000rpm,10-20min离心去除菌体,收集上清液,得葡聚糖酶的粗酶液。
本发明的有益效果是:(1)上述利用索拉胶为底物筛选葡聚糖酶产生菌的筛选方法,快速简便,易于操作,且容易观察和判别;(2)筛选出的类芽孢杆菌S09是类芽孢杆菌属的一个新种,在添加索拉胶的培养基中生长迅速,能快速降解索拉胶并分泌胞外葡聚糖酶;(3)该菌株产酶量高,且酶活性质稳定,具有较高的酶反应温度和耐温性,以及广泛的酸碱稳定性,适合工业化生产并应用于酿酒、饲料、生物防治等领域。 
下面结合附图对本发明作进一步的详细描述。 
附图说明
图1a是本发明一种类芽孢杆菌S09在含索拉胶的固体平板上形成的透明水解圈;图1b是本发明一种类芽孢杆菌S09的扫描电镜镜检图。 
图2是本发明一种类芽孢杆菌S09的16SrRNA进化树分析图。 
图3是本发明一种类芽孢杆菌S09的菌体生长与产酶量的关系曲线。 
图4是本发明一种类芽孢杆菌S09生产的β-葡聚糖酶最适反应温度测定曲线。 
图5是本发明一种类芽孢杆菌S09生产的β-葡聚糖酶最适反应pH测定曲线。 
图6是本发明一种类芽孢杆菌S09生产的β-葡聚糖酶热稳定性测定曲线。 
图7是本发明一种类芽孢杆菌S09生产的β-葡聚糖酶酸碱稳定性测定曲线。 
图8是本发明一种类芽孢杆菌S09的16SrDNA序列表。 
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面理解本发明,但不以任何方式限制本发明。 
实施例1:本发明的β-葡聚糖酶产生菌S09的分离筛选 
取南京郊区燕麦地燕麦根围土样,加入液体筛选培养基富集培养3天后,选取降粘程度较高的菌液稀释,涂布到以索拉胶为唯一碳源的固体培养基上,在28°C恒温培养箱中培养。3天后,观察菌落生长情况,将2%的CTAB溶液覆盖于培养基上,20min后观察索拉胶水解圈的形成情况。分泌β-葡聚糖酶的菌落周围的索拉胶被降解,无法与CTAB结合而呈透明色,未被水解的索拉胶与CTAB结合形成白色不溶物沉淀。将形成水解圈的菌落复接回液体培养基中,于28°C,220rpm振荡培养3天,确认该菌的索拉胶水解能力。经反复筛选试验和平板划线分离,得到一株高产β-葡聚糖酶菌株,将其命名为S09。图1 a为S09在索拉胶固体平板上形成的水解圈。16SrRNA基因序列鉴定其为类芽孢杆菌属,其16SrDNA序列见图8。
所用的筛选培养基为NaH2PO4 1‰,NaNO2.5‰,CaCl2 0.1‰,MgSO4 0.15‰, FeSO4·7H2O 0.01‰,索拉胶5‰,pH6.5,固体培养基中添加1%的琼脂。 
实施例2:本发明的类芽孢杆菌S09(Paenibacillus sp.S09)的鉴定 
a. 形态特征:在无机盐索拉胶固体培养基上于28°C培养2-4天后观察,菌落呈淡黄色,圆形,表明光滑湿润,边缘整齐。
b. 生理生化特征: 能有效还原硝酸盐,不能降解纤维素,在LB培养基中生长极缓慢,而添加了β-葡聚糖后能迅速生长。图1b为S09的扫描电镜镜检图,观察呈短杆状,无鞭毛,大小约为0.5 μm × 2.5 μm,革兰氏染色为阴性。该菌株好氧,最适生长和产酶温度为28-30°C,在37°C 下也能生长,最适pH为6.0-7.0。 
实施例3:类芽孢杆菌S09发酵粗酶液的制备 
配制种子培养基:KH2PO4 1‰,NaNO2.5‰,CaCl2 0.1‰,MgSO4 0.15‰,FeSO4·7H2O 0.01‰,索拉胶3‰,H2O1000mL,pH6.5。将培养基于121°C高压灭菌20min后,冷却至室温,挑取接种固体培养基上的S09单菌落,28°C振荡培养3天,为种子液。
配制发酵培养基:蛋白胨1%,酵母膏0.5%,NaCl 1%,索拉胶0.75%, pH6.5,将培养基于121°C高压灭菌20min,冷却至室温,加入2%的种子培养液,28°C,220rpm,振荡培养30h,于7000rpm离心15min去除菌体,收集上清液,得粗酶液。 
实施例4:类芽孢杆菌S09发酵粗酶液的酶活性质测定 
所得的粗酶液以索拉胶为底物,用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定β-葡聚糖酶的活力。DNS在碱性条件下与还原糖发生氧化还原反应,反应产物煮沸后显红棕色,在540~550波长处有最大吸收,且在一定程度范围内颜色深浅与还原糖含量成线性关系。利用比色法测定反应产物的光吸收值,推算出酶反应生成的还原糖含量,进而推算出相应的酶活。
酶活测定方法:0.5%索拉胶50μl,加粗酶液稀释样10μl混匀,在65°C,pH5.5条件下反应15min后,加入DNS试剂60μl,混匀,煮沸10min。取100μl加入酶标板孔中,用酶标仪测定OD550值。酶活单位定义为:每分钟从反应底物中降解释放1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位,简称为U。 
DNS试剂配制方法为:称取2g 3,5-二硝基水杨酸溶于60ml 2mol/L的NaOH溶液中,称取40g酒石酸甲钠溶于100ml热水中,溶解后与DNS溶液混合,再向混合液中加入1g苯酚,1g亚硫酸钠,充分搅拌至溶解后定容至200ml,储存于棕色瓶中,避光保存。 
对上述发酵培养的粗酶液分别以昆布多糖、大麦葡聚糖以及索拉胶为底物,用DNS法测还原糖的含量,表明粗酶液的酶活力分别为5-10U/ml,35-40U/ml和15-18U/ml。当以索拉胶为底物时测的酶的最适反应温度为67°C,最适反应pH值为5.5。该粗酶液具有较高的耐温性,在70°C保温30min仍保持80%以上的活性。在pH4-9亦具有良好的酸碱稳定性。 
(1)菌体生长曲线与产酶量关系测定方法: 
接种平板上的单菌落到种子培养基中,28°C振荡培养2天后,按1-2%的接种量接种到发酵培养基中,每隔2h取样测定菌液的OD600和上清液的酶活。类芽孢杆菌S09菌体生长与产酶量关系曲线如图3所示。
表1  类芽孢杆菌S09发酵粗酶液对不同底物的酶活 
底物 糖苷键型 酶活(U/ml)
昆布多糖 β-1,3,少量β-1,6 5-10
大麦葡聚糖 β-1,3,β-1,4 35-40
索拉胶 β-1,3,少量α-1,3 15-18
注:以上数据误差均在允许范围之内。 
(2)β-葡聚糖酶对不同β-葡聚糖底物酶活的测定方法:
用50mM,pH5.5的醋酸缓冲液配制0.5%的不同底物,取50μl底物,与10μl酶液混匀后,于65°C保温反应15min,立即加入60μlDNS试剂混匀,煮沸反应10min后,取100μl测各个样品的OD550。β-葡聚糖酶的不同底物酶活如表1所示。
(3)β-葡聚糖酶最适反应温度的测定方法: 
用50mM,pH5.5的醋酸缓冲液配制的0.5%浓度的索拉胶50μl,与10μl酶液混匀后,分别放入不同温度(20°C-95°C)的水浴锅中反应15min后,按照上述方法测定酶活。β-葡聚糖酶最适反应温度如图4所示。
(4)β-葡聚糖酶最适反应pH的测定方法: 
配制100mM的不同pH值(2.2-10.6)的缓冲液,其中pH2.2-5.5为磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液,pH6.0-8.5为磷酸钠缓冲液,pH9.0-10.6为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。取1%的索拉胶25μl与不同pH的缓冲液25μl充分混匀后,加入10μl酶液,于65°C反应15min后按照上述方法测各样品的酶活。β-葡聚糖酶最适反应pH如图5所示。
(5)β-葡聚糖酶热稳定性的测定方法: 
将酶液于不同温度下保温10min或30min后迅速冰浴冷却,取10μl加入50μl 0.5%的索拉胶,65°C反应15min.测剩余酶活。β-葡聚糖酶的热稳定性如图6所示。
(6)β-葡聚糖酶酸碱稳定性的测定方法: 
将酶液与方法(4)中所述的不同pH的缓冲液等体积混匀,在4°C放置2h后,取10μl加入50μl 0.5%的索拉胶,65°C反应15min.测剩余酶活。β-葡聚糖酶的酸碱稳定性如图7所示。
图3显示发酵产酶量与菌体生长曲线说明产酶量随菌体量的增加而增加,在发酵30h时已经几乎达到最大值,经测定为15-18U/ml。图4显示粗酶液的最适反应温度为65-70°C;图5显示粗酶液最适反应pH为5.5;图6显示粗酶液在70°C保温30min后仍保持大于70%的酶活力;图7则显示粗酶液在pH4-9的范围内孵育2h后仍能保持大于40%的酶活力。以上的酶性质测定说明粗酶液具有良好的热稳定性和酸碱稳定性。 
实施例5:β-葡聚糖酶粗酶制剂的制备 
将类芽孢杆菌S09的发酵粗酶液7000r/min离心10min去除菌体后,收集上清液,边搅拌边加入硫酸铵到饱和度为30%后,4°C静置沉淀2h,离心去除沉淀,收集上清,继续添加硫酸铵至饱和度为80%,静置过夜。于4°C高速离心收集沉淀,将沉淀重溶于pH5.5,20mM的醋酸缓冲液中,于4°C透析酶液。将透析后的酶液加入20%的甘油后于-20°C冻存,得β-葡聚糖酶粗酶制剂,可应用于酿酒工业、饲养业及生物防治等领域。
Figure IDA00001827145100011

Claims (3)

1.一种类芽孢杆菌,其特征在于它于2012年5月30日保藏于“中国典型微生物保藏中心”,保藏登记号为CCTCC NO:M2012196,命名为类芽孢杆菌S09,分类命名为类芽孢杆菌(Paenibacillussp),该菌的16SrRNA基因序列在Genbank上的登录号为JQ945736。
2.一种类芽孢杆菌的选育方法,其特征是所述方法包括以下步骤:
(1)配制筛选培养基:将质量浓度为KH2PO4 0.5-1‰,NaNO2-3‰,CaCl2 0.07-0.15‰,MgSO4 0.1-0.3‰,FeSO4·7H2O 0.007-0.015‰,索拉胶3-8‰溶于H2O中,pH为6-7.5,固体培养基添加0.9-1.5%的琼脂;
(2)将培养基于115°C~121°C灭菌15-30分钟,然后冷却;
(3)将采集的用于筛选的土样或水样加入液体培养基中,于28-37°C摇床中振荡培养2-4天用于富集索拉胶降解菌,培养基中索拉胶粘度降低的菌液用于后续筛选;
(4)将富集培养的菌液做十倍梯度稀释,涂布到固体筛选培养基上,于28°C ~37°C培养箱中培养2-4天;
(5)将平板上的单菌落做好标记,影印至新的固体培养基上,将原平板上的菌落刮下,用质量浓度为1-3% CTAB溶液覆盖平板15-30min后观察;
(6)将形成透明圈的菌落挑出,重新接种到液体筛选培养基中,于28-37°C摇床中振荡培养2-4天,将使培养基中索拉胶粘度下降的菌筛出并保存。
3.一种用权利要求1所述的类芽孢杆菌生产的β-葡聚糖酶,其特征在于所述的β-葡聚糖酶通过以下步骤制成:
(1)种子培养基为:质量浓度为0.3-0.5%的索拉胶,pH6-7,110-121°C高压灭菌15-30min,接种固体培养基上的类芽孢杆菌S09单菌落,28-37°C振荡培养2-3天;
(2)发酵培养基为:质量浓度为0.5-1%的索拉胶, pH6-7,110-121°C高压灭菌15-30min;按2-4%接种量接种种子液,28-37°C,200-225rpm,振荡培养24-36h,7000rpm,10-20min离心去除菌体,收集上清液,得葡聚糖酶的粗酶液。
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