CN104830881A - 一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用。糖胺聚糖裂解酶的编码基因ssgaglyase，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase能够选择性降解CS、HA、DS，且有较高的酶解活性，最终降解产物均为二糖，不能降解HP和HS。为系统的研究新型糖胺聚糖裂解酶提供参考，为糖胺聚糖的后续研究开发奠定了基础。

Description

一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)是广泛存在与动物结缔组织中的一类多糖。GAG属于直链多糖，由氨基己糖和糖醛酸及其它们异构化或硫酸化残基以双糖单位重复构成，其结构通式为[己糖醛酸-己糖胺]_n，重复双糖结构的个数(n)随种类而异，一般在30和250之间。GAG根据其单糖组成及糖苷键连接形式的不同，可分为硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate，DS)、硫酸角质素(kermatan sulfate，KS)、透明质酸(hyaluronic acid，HA)、肝素(heparin，HP)及硫酸乙酰肝素(heparin sulfate，HS)等类别。其中HA广泛存在于动物结缔组织的细胞外基质中，在胚胎、滑液、玻璃体等组织中尤为丰富，起到润滑、防震和增稠剂的作用。CS常以蛋白聚糖聚集体形式存在于动物鼻骨、喉骨、软骨等组织中(Lauder RM，Chondroitin sulphate:A complex molecule with potential impacts ona wide range of biological systems.Complementary therapies in medicine，2009,17:56-62.)，具有治疗风湿病、关节炎、骨质疏松症等多种药理学活性。HP主要存在于肺、肝、皮肤和其它结缔组织的肥大细胞中，是一种天然的抗凝剂，临床上用作抗凝血酶的增强剂。

大量研究表明，GAG糖链的长度，单糖残基和硫酸根基团的排列形式决定了糖链与各类蛋白因子结合的能力，进而影响其所在蛋白聚糖的生物学活性。其中，由于低分子量的GAG具有粘度小、溶解性好、易吸收等特点，相对于普通的GAG，有着更高的生物活性。因此，低分子量GAG制备工艺的研究是当前的一个热点话题。低分子量GAG的制备(Higashi K，et al.Photochemical preparation of a novel low molecμLar weight heparin.CarbohydratePolymer，2012，87:1737-1743.)通常包括化学解聚法、物理解聚法、生物解聚法、化学酶法合成等方法。其中生物解聚法主要是指酶裂解法，因其具有反应效率高、污染小、成本低等优点，具有广阔的应用前景(Akio Hamai，et al.Two Distinct Chondroitin SμLfate ABC Lyases.J.Biol.Chem.1997,272:9123-9130.)。

糖胺聚糖裂解酶是一类主要存在于微生物体内，能将硫酸皮肤素、硫酸软骨素、透明质酸等糖胺聚糖裂解为寡糖及不饱和二糖的裂解酶(Stern R,Jedrzejas MJ.Hyaluronidases：their genomics structure,and mechanisms of action.Chemical Reviews,2006,106：818-839.)。根据其底物特异性的不同，可以分为透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)、硫酸软骨素酶(chondroitin sμLfate lyase，ChSase)、肝素裂解酶(heparin lyase)等。其中微生物来源的HAase通过作用于β-1,4糖苷键来降解HA，终产物是不饱和寡糖(Xueping Guo，et al.A NovelHyaluronidase Produced by Bacillus sp.A50.PLoS One.2014,9:94156)。此外还可在一定程度上催化作用于CS。ChSase能将CS裂解为不饱和二糖及寡糖，根据其作用底物的差异主要分为ChSase ABC、ChSase AC、ChSase B及ChSase C等多种类型。肝素酶主要从一些利用肝素为碳源的细菌中分离得到，肝素黄杆菌是商品肝素酶的唯一来源。已从肝素黄杆菌中分离纯化出的肝素酶有三种，分别为肝素酶I、II、III，这三种酶具有不同的酶切识别位点。针对糖胺聚糖裂解酶的开发已成为目前的研究热点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用。本发明还构建了该核酸分子的重组表达载体以及表达该重组蛋白的宿主细胞。

本发明技术方案如下：

一种糖胺聚糖裂解酶的编码基因ssgaglyase，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，在质粒上插入了含有上述糖胺聚糖裂解酶的编码基因ssgaglyase。

根据本发明优选的，所述的质粒为pET28a(+)质粒。

一种重组细胞，将上述重组载体转化入宿主细胞中获得。

根据本发明优选的，所述的宿主细胞为细菌、酵母或丝状真菌。

进一步优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌。最优的，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

上述糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase在生产低分子量糖胺聚糖中的应用。

根据本发明优选的，所述的低分子量糖胺聚糖为硫酸软骨素和/或透明质酸。

有益效果

本发明所述的糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase能够选择性降解CS、HA、DS，且有较高的酶解活性，最终降解产物均为二糖，不能降解HP和HS。为系统的研究新型糖胺聚糖裂解酶提供参考，为糖胺聚糖的后续研究开发奠定了基础。

附图说明

图1、设计简并引物克隆部分基因序列的电泳结果照片；

图中：M为marker；1、2、3出现非特异性条带；4、5出现明亮的单一条带，为正确克隆的产物；

图2、目的基因克隆电泳结果照片；

图中：M、M＇为marker；1、2、3、4、5、6为正确克隆的产物；

图3、重组蛋白的表达纯化的结果照片；

图中：M为marker；1为菌液上清，2为含空白质粒的对照菌液上清；3为菌体沉淀；4、5、6、7为纯化得到的蛋白溶液；

图4A、实验组吸光度随反应时间的变化曲线；

图4B、对照组吸光度随反应时间的变化曲线；

图5A、重组蛋白酶解CS的产物分析图谱；

图5B、重组蛋白酶解HA的产物分析图谱；

图6、重组质粒pET28a(+)-His-SSGAGlyase物理构建图谱。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图，对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

发明人从土壤中筛选出一株产糖胺聚糖裂解酶菌株，通过对其形态分析和16SrRNA基因序列的比对，鉴定该菌株属于节杆菌属(Arthrobacter sp.)，并命名为SSAs-1。

实施例1 全新糖胺聚糖裂解酶编码基因的克隆

1、扩增模板的制备

使用Bacterial DNA Kit试剂盒(购自OMEGA Bio-tek公司)提取菌株SSAs-1的全基因组，作为PCR扩增全新GAG裂解酶编码基因的模板。

2、简并引物的设计

通过与同源关系较近已知的糖胺聚糖裂解酶氨基酸序列的比对，确定GNWWSWEIG和WYECGNGENN为该类糖胺聚糖裂解酶家族保守序列，并据此设计PCR简并引物，引物序列如下：

上游引物JP-L1：5’-GGCAACTGGTGGTCMTGGGAG-3’；

下游引物JP-L2：5’-CCAACAARAGCGGYAACGGCGT-3’。

3.扩增部分目的基因

使用Taq酶(购自Thermo Scientific公司)扩增目的基因，PCR扩增程序如下：

95℃预变性10min；95℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃延伸10min；

PCR扩增体系如下：

DNA模板(100ng/μL)，1μL；JP-L1(20μM)，1μL；JP-L2(20μM)，1μL；dNTPs(10mM)，1μL；Taq(2U/μL)，1μL；10×Taq buffer，5μL；ddH₂O，加至50μL。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，结果如图1所示。

将电泳回收的PCR扩增产物经DNA序列检测，该序列长度为879bp。

4、应用DNA walking技术克隆剩余基因序列(参见Yao-Guang Liu，et al.High-efficiencythermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.BioTechniques，2007，44:649–656)，利用SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，设计DNA walking引物，DNA walking引物序列如下：

DW-L1：TTGGCGATCAGGTCCGGGCTG

DW-L2：GCTGAAGGAACTCGCCGCTTC

使用Genome walking Kit(购自TAKARA BIO INC.公司)试剂盒，扩增编码糖胺聚糖裂解酶的未知基因片段并测序确定DNA序列，预测编码目标基因的起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG)，从而确定目标基因序列的长度为2370bp。

5、根据DNA walking实验结果设计目的基因上下游引物，

SS-L1：ATGACGCGTGAACTTTCCCGAC

SS-L2：CTAGCGGTGCAGCGTGACCTC

并以全基因组为模板PCR扩增全部目的基因。测序得到目的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，并验证了目标基因序列的长度为2370bp。

其中，全基因组提取按照质粒提取试剂盒Bacterial DNA Kit(购自OMEGA Bio-tek公司)说明书操作。

DNA walking技术克隆未知基因序列按照Genome walking Kit(购自TAKARA BIO INC.公司)说明书操作。

实施例2 重组表达载体的构建

1、PCR扩增两端分别带有XhoⅠ和SalⅠ酶切位点的目的基因。设计引物序列如下：

SSGAGlyase-L1：

5＇AGCAAATGGGTCGCGGATCCACGCGTGAACTTTCCCGACGACACATCCTC 3＇；

SSGAGlyase1-L2：

5＇GCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTAGCGGTGCAGCGTGACCTC 3＇。

以菌株SSAs-1全基因组为模板，使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(购自NewEngland Biolabs公司)扩增目的基因，得到带有Xho Ⅰ和Sal Ⅰ(详见引物SSGAGlyase-L1/L2序列中下标横线位置)酶切位点的目的基因ssgaglyase(电泳结果如图2所示)。

2、限制性内切酶Xho Ⅰ和Sal Ⅰ(购自Thermo Scientific公司)双酶切pET28a(+)质粒。

100μL反应体系：pET28a(+)质粒，50μL；Xho Ⅰ，5μL；Sal Ⅰ，5μL；Buffer，10μL；H₂O，30μL。

37℃水浴1h，制得双酶切的pET28a质粒。

3、将目的基因和双酶切的pET28a质粒通过Gibson连接(Gibson,D.G.，et al.Enzymaticassembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nat.Methods，2009，6：343–345.)构建重组质粒。

20μL反应体系：Gibson连接液(5×isothermal reaction buffer，320μL；10U/μL T5Exonuclease，0.64μL；2U/μL Phusion DNA polymerase 20μL；40U/μL Taq DNA ligase，160μL；ddH₂O 459.36μL；total 960μL)12μL；双酶切pET28a(+)质粒，3μL；目的基因，3μL；H₂O，2μL。

50℃水浴1h，制得连接反应液。

4、连接反应液直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自北京天根生化科技有限公司)，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中筛选转化子，未被转化的细胞不能在该平板上生长。挑取单个克隆的转化子，用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I(购自OMEGA Bio-tek公司)提取转化子细胞中的质粒。电泳检测经Sal Ⅰ线性化的各个转化子质粒，其中大小约为7500bp的质粒为连接成功的重组质粒。经DNA测序，将含有DNA序列完全正确的目标酶分子基因片段的重组载体命名为该重组质粒命名为pET28a(+)-His-ssgaglyase(重组质粒物理图谱见图6)。

其中目的基因扩增按照Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(购自New EnglandBiolabs公司)说明书操作

其中大肠杆菌转化按照DH5α感受态细胞(购自北京天根生化科技有限公司)说明书操作。

其中，质粒提取按照质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I(购自OMEGA Bio-tek公司)说明书操作。

实施例3 重组蛋白的表达和纯化

将重组质粒pET28a(+)-His-ssgaglyase转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自北京天根生化科技有限公司)中，在氨苄青霉素钠(50μg/mL)的LB平板上培养12h，筛选转化子，挑选转化子单菌落进行菌落PCR验证，获得阳性转化子。

挑选阳性转化子，过夜培养后，按体积比1:100接入含有50μg/mL氨苄青霉素钠的液体LB培养基中，37℃，225r/min震荡培养至OD₆₀₀约为0.6-0.8(约4h)，加入IPTG(终浓度0.2mM/L)，20℃，225r/min，诱导12h。8000g离心收集菌体并用上样缓冲液(20mmol Tris-Hcl，PH＝7.6；0.5mol NaCl；5mmol咪唑)重悬，超声破碎(工作3s，间歇5s，振幅35％，能量1500KJ，4℃)30min，将破碎菌体离心(12000g，4℃)30min，上清用0.22um滤膜过滤。上样到Ni-Sepharose 6 Fast Flow(购自GE healthcare)柱中纯化，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对诱导后重组蛋白的表达情况进行鉴定(如图3所示)。

其中大肠杆菌转化按照BL21感受态细胞(购自北京天根生化科技有限公司)说明书操作。

其中目的蛋白纯化步骤按照GE healthcare手册中亲和色谱方法纯化。

实施例4 重组蛋白活性的验证

以0.1％CS溶液(0.02mol/L Tris-HCL配制，pH7.5)为底物，使用紫外分光光度计(安捷伦Cary60)通过酶动力学检测重组蛋白SSGAGlyase对糖胺聚糖的裂解活性，观察波长232nm处吸光度随着反应时间的变化。本方法主要依据CS经酶解后形成不饱和二糖结构，其最大吸收波长为232nm。

设定紫外分光光度计检测波长232nm。取2mL 0.1％CS溶液作为实验组加入到紫外分光光度计的石英比色皿中，静置1min。向比色皿中加入0.01mg纯化后蛋白，迅速混匀，检测A232随反应时间的变化。

取0.01mg纯化蛋白煮沸3min灭活,13000g离心1min，取上清在相同条件下做对照组实验(如图4所示)。实验结果表明，重组表达并纯化的蛋白具有降解CS的活性，并且降解效率高，活性明显。

实施例5 重组蛋白的性质研究

1、酶最适反应pH

用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液配制不同pH值的CS溶液，使反应缓冲体系的pH分别为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5。加入相同量的酶液，测定不同pH条件下的酶活力。结果表明，该酶反应的最适pH值为6.0-7.0。

2、酶最适反应温度

分别在15℃，25℃，30℃，33℃，37℃，40℃，45℃，50℃，55℃下，在2mL 0.1％CS溶液(0.02mol/L Tris-HCL配制，pH7.5)中加入0.01mg酶，测定酶活力。结果表明，酶反应最适的温度为37-45℃。

3、酶的稳定性研究

取部分酶液在37℃放置，持续测定酶活力。结果表明，酶液在25h后失活。

将一定量的酶液在60℃，70℃，80℃，90℃，100℃的条件下分别加热1min，2min，3min后，测定各组酶液的酶活，摸索最佳的酶的灭活条件。结果表明，酶液在70℃条件下加热3min后失活。

实施例6 重组蛋白底物特异性测定与产物二糖机构分析

分别取2mL 0.1％HA溶液，2mL 0.1％CS溶液，2mL 0.1％HP溶液，2mL 0.1％DS溶液(均采用0.02mol/L Tris-HCL配制，pH7.5)，各加入0.01mg纯化后重组蛋白，37℃水浴反应1h。反应结束后，煮沸3min灭活，13000g离心1min，取上清通过P2分子筛(购自BIO-RAD)分离纯化。

降解产物分离结果表明，该酶可以降解透明质酸，硫酸软骨素，硫酸皮肤素，纯化后产物通过质谱分析检测分子量，发现终产物均为二糖(如图5所示)。

其中P2分子筛分离纯化按照Bio-Gel Polyacrylamide Gel(购自BIO-RAD)说明书操作。

Claims (9)

1.一种糖胺聚糖裂解酶的编码基因ssgaglyase，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，在质粒上插入了含有权利要求1所述糖胺聚糖裂解酶的编码基因ssgaglyase。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述的质粒为pET28a(+)质粒。

5.一种重组细胞，将权利要求3所述重组载体转化入宿主细胞中获得。

6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为细菌、酵母或丝状真菌。

7.如权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌。最优的，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.权利要求2所述糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase在生产低分子量糖胺聚糖中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的低分子量糖胺聚糖为硫酸软骨素和/或透明质酸。