JPS62163685A - ビフイドバクテリウム菌増殖促進組成物及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規なビフィドバクテリウム菌増殖促進組成
物及びその製造法に関する。更に詳しくはラミナリオリ
ゴ糖を有効成分としたビフィドバクテリウム菌増殖促進
組成物及びβ−１，３−グルコシル糖化合物を特定のβ
−１，３−グルカナーゼで処理することを特徴としたビ
フィドバクテリウム菌増殖促進組成物の製造法に関する
。

（従来の技術） ビフィドバクテリウム菌は幼児から老人に至るまでほと
んどの人の腸内に定着しており、近年有益な様々の役割
を演じていることが明らかになってきている。例えば、
ビフィドバクテリウム菌の有用性を列挙すると以下のよ
うなことがある。

１）腸内有害菌の抑制、排除、２）有機酸の産生、３）
便秘、下痢の改善４）蛋白質の吸収促進５）ビタミンの
産生６）抗ガン作用（食品工業１下−１９８ｉ　ｐ、４
４−５１）等である。この為、ビフィドバクテリウム菌
を含有させた牛乳、ヨーグルト等の飲食品が市販され、
健康の維持、増進を目的として広く利用されるようにな
りてきた。一方、最近腸内におけるビフィドバクテリウ
ム菌の増殖を促進させる物質をビフィドバクテリウム菌
とともに、又は単独で投与することにより腸内ビフィド
バクテリウム菌数を高水準に維持しようとする試みがな
されビフィドバクテリウム菌増殖因子としてラクチュロ
ース、Ｎ−アセチルグルコサミン、パンテチン類等が知
られているが、一方でビフイドパクテリウム菌が選択的
に資化し得る糖類の研究も多くなされている。

例えば合成オリゴ糖、コンニャクマンナン分解物及びフ
ラクトオリゴ糖等。（「腸内フローラと食物因子」光岡
知足編−学会出版センター刊より）またガラクトース−
グルコースオリゴ糖（特開昭５５−１０４８８５号公報
）及び大豆オリがＩｉ（特開昭６０−６６９７８号公報
）が知られている。

（問題を解決する為の手段） しかしながら、本発明者らは、前記のような従来のビフ
ィドバクテリウム増殖促進物質とはいずれとも異なる新
規な促進物質について鋭意研究した結果、本発明に至り
た。

即ち、本発明は、ラミナリオリゴ糖を有効成分とするビ
フィドバクテリウム菌の増殖促進組成物及び　　　　　
゛　　　　　　　微生物が生産す１こるエンド型β−１
，３−グルカナーゼによりβ−１，３−グルコシル糖化
合物を処理することを特徴としたビフィドバクテリウム
菌増殖促進組成物の製造法を提供するものである。

（発明の構成） 本発明のβ−１，３−グルコシル糖化合物とは、カード
ラン（アルカリ土類金属が生産する直鎖型β−１゜３−
グルカン（Ａ、Ｂ、Ｃ，２９，７５７、′６５又は発酵
と工業３６，２、’７８　）　）、ラミナリン、パキマ
ン、酵母細胞壁及び天然の海藻類等が挙げられるが、そ
の中でも直鎖型β−１，３−グルカンであるカードシン
がより好ましい。

本発明のラミナリオリゴ糖とは、前記β−１，３−グル
コシル糖化合物をエンド型β−１，３−グルカナーゼに
より分解して得られるグルコース（Ｇ）がβ−１゜３−
結合で２〜１０、好ましくは３〜７個程度結合した水溶
性の糖である。その具体例としては、ラミナリビオース
（Ｇ２）　、ラミナリトリオース（Ｇ３）、ラミナリテ
トラオース（Ｇａ）　、ラミナリペンタオース（Ｇｓ）
　、ラミナリヘキサオース＜Ｇｂ）　、ラミナリヘプタ
オース（Ｇ７）、ラミナリオクタオース（Ｇｓ）−ｙミ
ナリノナオース（Ｇ９）、ラミナリデカンオース（Ｇ１
０）等である。特に、増殖促進効果の点から、ラミナリ
トリオース及び／又はラミナリテトラオースを有効成分
として多く含む組成のものが好ましい。

次に微生物が生産する工／ド型β−１，３−グルカナー
ゼの調製方法について述べる。反応に用いるエンド型β
−１，３−グルカナーゼは、β−１，３−グルコシル糖
化合物を加水分解し、ラミナリオリゴ糖を生成するもの
で６３はいずれの起源からのものでもよいが、ストレプ
トマイ七ス属に属する微生物からのものが好ましい。又
通常市販のβ−１，３−グルカナーゼも使用できなくは
ないが、エキソ型β−１，３−グルカナーゼを混入して
いる為、グルコースが多量に生成され、こｎではビフィ
ドバクテリウム菌の選択糖源にならない。従って、イオ
ン交換クロマトグラフィーあるいは分子ふるい等で両酵
素を分画して使用すれば良い。本発明で特に好ましく用
いられるストレグトマイセス属に属する微生物としては
、例エハストレグトマイセスｉｐ　、ＤＩＣ−１０８が
挙げられる。ＤＩＣ−１０８菌株は、培養液中にエンド
型とエキソ型の両タイプのβ−１，３−グルカナーゼを
生産するが、エキソ型のβ−１，３−グルカナーゼは適
当な条件で加熱処理を行うことによりすみやかに失活さ
せることが出来、エンド型のβ−１，３−グルカナーゼ
のみを得ることが可能であるのでより好ましいが、これ
に限定されるものではない。

尚、ストレゾトマイセス・エスピーＩ）ＩＣ−１０８の
菌学的性質については１％開昭５９−１７９９６号公報
に既に記載されているが、詳細には以下の様な性質を有
するものである。

〔ストレプトマイセス・ｓｐ、ＤＩｃ−１０８の菌学的
性質〕（１）形態的特徴 使用した培地（ｒｓｐ培地を含む）上での栄養菌糸の生
育は優ｎてお夛、デンプン無機塩、オートミール寒天、
イースト麦芽寒天培地上で豊富な気菌糸を形成する。

胞子形成気菌糸は直状又は直曲状である。胞子は楕円体
で大きさは、短径×長径０．７〜０．８μ×１、０〜１
．２μである。走査型電子顕微鏡による観察では胞子の
表面構造はイＩ状（Ｗａ　ｒ　ｔ　ｙ　）である。

（２）各種培地における生育状態 １）シュクロース硝酸塩寒天培地（３７℃）薄茶色の基
土菌糸状に灰色の気菌糸を形成し、溶解性色素は認めら
れない。

２）グルコース・アスノクラギン寒天培地（３７℃）薄
黄白色の生育で気菌糸の形成はみとめられな旨。また溶
解性色素は認められない。

３）グリセリン・アスノ々ライン寒天培地（ｘｓｐ培地
−煮５３７℃） 薄黄色の生育で気菌糸の着生はみとめられなり。

又、溶解性色素は認められな−。

４）スターチ・無機塩寒天培地（ｒｓｐ培地３７℃）無
色の発育上に緑灰色の気菌糸を着生し、溶解性色素は認
められない。

５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ培地−７，３７℃）薄茶
色の発育上に培養７日目では気菌糸は着生せず、１４４
日目白灰色の気菌糸を着生する。溶解性色素は認められ
ない。

６）栄養寒天培地（３７℃） 緑灰黒色の発育上に薄縁灰色の気菌糸を着生し、溶解性
色素は認められな込。

７）イースト麦芽寒天培地（ＩＳＰ培地−２，３７℃）
薄茶色の生育上に薄縁灰色の気菌糸を着生する。

水溶性色素の生成は認められない。

８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ培地−３，３７℃）
無色の生育上に緑茶灰色の気菌糸を着生し、水溶性色素
の生成は認められな込。

（３）　　生理的性質 １）生育温度範囲 酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生育試験では、
３０℃〜５０℃で生育するが、至適温度は３７℃〜４５
℃である。

２）ゼラチンの液化：陰性 ３）脱脂乳の凝固及び 脱脂乳のペプトン化：陰性 ４）メラニン色素の生成（ペプトン・イースト・鉄寒天
培地、ＩＳＰ培地６）：陰性 ５）デンプンの分解性：＊性（分解ゾーンに白いリング
を形成） ６）炭素源の利用性（プリドハム、コ０ドリープ寒天培
地−９，３７℃） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−フルクトース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ
−マンニトール、カラクトースをよく利用して生育し、
シュクａ−ス、ラフィノース、プリジンは利用しない。

７）細胞壁組成 ＩＳＰに記載されている糖組成ＴｙｐｅとしてはＴｙｐ
ｅＩに属する。

尚、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
申請し、微工研菌寄第６５９３号として受託されている
。

本発明による酵素生産の為の培養には、通常の固体培地
又は液体培地が使用され、液体培養の為の培地の炭素源
としては、β−１，３−グルコシル糖化合物であれば利
用できる。

例えば、カードラン、ノ中キマン、ラミナリン。

リケナン、酵母細胞壁又はその部分加水分解物、リーラ
コシン、カミース、ノ譬うミａン等が挙げられ、又窒素
源としては硫安、塩安、リン安、硝酸ナトリウム、尿素
、ペグトン、カゼイン等、有機窒素、無機窒素、いずれ
も利用できる。

天然栄養源としては、例えば各種糖蜜、コーンステイー
グリカー、オートミール、味液、魚粉、肉エキス、酵母
、酵母エキス、ポテトエキス、麦芽エキス等があげられ
る。

無機物としては、例えばリン酸二カリウム、リン酸−ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、倣貴金属類などが挙げら
れる。その他、必要に応じてビタミン類等を添加するこ
ともできる。これらの使用濃度としては、０．１〜４０
ｉｉチが用いられる。

また醗酵中の発泡を抑制するため、０．０００１〜１、
　Ｏ重ｆ！に％の消泡剤を添加してもよい。消泡剤とし
ては、シリコーン、大豆油など通常の消泡剤を用いる。

培養方法は、振とう培養、通気培養などの好気的液体培
養が遇しておシ、ＰＨｓ、ｏ〜８．０、培養温度２０℃
〜５０℃で１〜６日、望ましくはｐＨ６，５〜７．５．
３５〜４０℃で２日前後培養する。

エンド型のβ−１，３−グルカナーゼは、菌体外に生産
する酵素であるので、培養終了後、口過又は遠心分離し
て除菌し、上清液を回収する。そして必要に応じてｍ縮
し、硫安、硫酸ナトリウムによる塩析、又はアセトン、
エタノール、メタノール、イソグロパノールなどの有機
溶剤を加え、酵素を沈澱物として取得し、乾燥、保存す
る。

本発明で好ましく用いられる前記ＤＩＣ−１０８株から
のエンド型β−１，３−グルカナーゼの性質を次に示す
。

エンド型β−１，３−グルカナーゼ （１）　　作用 β−１，３−グルコシル糖化合物、例えばカードラン、
ラミナリン、ノ譬キマン、酵母細胞壁及びその部分分解
物に作用してエンドタイグの加水分解作用を示す。Ｇ５
（ラミナリペンタオース）を基質とした時の主分解生成
物はＧ２とＧ３である。（図−１，２参照） （２）　　作用ｐＪ（範囲及び最適作用−１＝−３〜９
の範囲で作用し、最適作用−（は６付近にある。（図−
３参照） （３）　　作用１ｍ度範囲及び最適作用温度：約り０℃
〜約７０℃まで作用し、最適作用温度は約６５℃である
。（図−４参照） （４）　　熱安定性： ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）中、１時間の熱処
理によシ活性は、約５０係低下し友。

（５）　　精製方法： 本酵素は、培養り過液から硫安６５チ飽和で沈澱物とし
て回収後、ＤＩＡＥ　−Ｓ＠ｐｈａｄ＠ｘ　　Ａ　−２
５カラムクロマトグラフイー（０，０１Ｍ　　）！Ｊス
ーＨＣｔバッファ、ｐｉ１７．５）を行ない食塩濃度０
．２Ｍで溶出される両分を集める。そして脱塩後ＣＭ　
−８・ｐｈ鳳ｄ＠ｘ　Ｃ−２５カラムクロマトグラフイ
ー（０，０１Ｍ酢酸バッフイー、ｐｍ（６，０）を行っ
て未吸着画分を集め、再度ＤＥＡＥ−８ｓｐｈａｄ＠ｘ
Ａ　−２５カラムクロマトグラフイー（０〜０．２５Ｍ
のリニアグラディエンド）により活性画分を集める。次
いでＧ−１０（１”ルロ過クロマトグラフィーにより、
はぼ均一な酵素タン／４り質を得る。

（６）分子量： セファデックスＧ−１００ｆルクａマドグラフイーによ
る分子量は約２７，０００と推定された。

次にエンド型β−１，３−グルカナーゼを用いてラミナ
リオリゴ掘を製造する方法について１説明する。

！−１．３−グルコシル糖化合物をａ間約０．１〜約３
０重投チ、−２〜−４１０、好ましくは一５〜ｐｔｔ　
７の水酷液又は緩衝液にて懸濁し、エンド型β−１，３
−グルカナーゼをＩＬ当り１００〜２００単位添加し、
反応温度２０℃〜７０℃、好ましくは４０℃〜６０℃で
１５分〜２４時間、好ましくは２時間〜８時間攪拌しな
がら反応させる。尚ここで言うエンド型β−１，３グル
カナーゼ活性の１重位とは、０．ＯＩＭのリン酸バッフ
ァー（ｐＨ６，０）にカードラン１重ｆｔ％を懸濁させ
、それに適量の酵素を加えて水でｓ、　ｏ　ＩＲｔとし
、４５℃で反応させる。この条件で１時間に１ｍｇのグ
ルコースに相当する還元力を生成する酵素量を言う。

反応後、未分解のβ−１，３−グルコシル糖化合物は、
プ７ナーにて口過又は遠心分離にて除き、上清は冷蔵庫
内又は０〜１０℃の条件下で少なくとも一昼夜放置する
と、Ｇ６以上の可溶性ラミナリオリゴ糖は大部分が白色
沈殿物として取り出すことができる。

こうして得らｎた上清を濃縮乾固又は凍結乾燥すると０
２〜Ｇ５のラミナリオリゴ糖の白色粉床を得ることがで
きる。又、目的に応じて活性炭カラムにより６塘を単離
することももちろん任意に行いうる。

（発明の効果） 本発明のラミナリオリゴ糖は、ビフィズス菌に対して以
下に述べる試験結果が示すように、ラミナリビオース、
ラミナリトリオース及びラミナリテトラオースといった
ラミナリオリゴ糖の単独はもちろんのこと、それらを含
有したラミナリオリコ９抛組酸物においても優れた増殖
促進効果を示すものである。

とくにラミナリトリオース、ラミナリテトラオースは大
腸萌等有害菌に対しては資化され難く、ビフィドバクテ
リウム菌に選択的なＷ源として極めて有効である。

しかもラミナリオリゴ糖は、グルコースがβ−１，３で
直鎖的に結合し友ものである為、その構造上人体内で分
解又は消化吸収されてその効力を失うことなく腸内に到
達し、腸内のビフィズス菌に対して増殖効果を示すもの
と考えられる。

従って、飲食物（乳酸飲料、お菓子類）、薬剤、健康食
品等に添加して用いることにより、ビフィドバクテリウ
ム遍の高濃度維持が可能となる。

尚、本発明によるラミナリオリゴ糖のビフィドバクテリ
ウム菌に対する増殖促進効果は、ビフィドバクテリウム
菌の種類とほとんど関係なく、例えば、ビフィドバクテ
リウム・プリーベ、同ビフィダム、同インファンティス
、同アドレスセンチイス等、すべての人腸内定着ビフィ
ドバクテリウム函で共通して優れた増殖効果を示すもの
である。

次に具体的な実施例を示して詳しく説明する。

文中〔チ〕は重量基準であるものとする。

実施例１ ■エンド型β−１，３グルカナーゼの調製ストレプトマ
イセス・ｓｐ、ＤＩＣ−１０８（微工研菌沓第６５９３
号）を酵母エキス０．２　Ｗ／マチ、ポリペブト７０．
２　ｖ／ｖ　％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，ＩＷ／マチ
、Ｋ２ＨＰＯ４０，２Ｗ／ｖ％、からなる培地３５ｔに
植画し、同時に別殺菌したカードラン３５０ｇを加えて
７０　Ｌ　Ｊａｒにて３５℃で４０時間通気攪拌培養し
た。得られた培養液２３１を遠心分離してその上清液を
硫安０．６５飽和で塩析し、エンド型β−１，３グルカ
ナーゼ活性を含有した粗酵素標品（１）を得た。

粗酵素（Ｉ）を０．０１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５，０
）にて溶解した（この時タンノリ１度を５１１１９／Ｉ
ｌｊ以下に調製する）溶液を役付三角フラスコに入れト
ルエン−滴を加えて、４５℃のウォーターパス中で一昼
夜放置した。熱処理した酵素浴液中にはエキソ型β−１
，３−グルカナーゼ活性は全く見られず、エンド型β−
１，３−グルカナーゼ（ＩＩ）が約２５，０００単位得
られた。

■ラミナリオリゴ糖の調製 カードラン５０．９を０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐ
ｌ’１６．０）１．ＯＡにて懸濁させ、実施例１の■で
得られた酵素（ＩＩ）を２００単位側えて４５℃で２時
間分解反応を行なった。

分解反応後の組成物を高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）にて分析したところ、Ｇ２１３．７１Ｇ　　２
０．５チ、Ｇ１１．０チ、Ｇ５４８．９％、Ｇ６２．８
％、Ｇ、　２．８％その他０．３　％のラミナリオリコ
９糖組酸物（冊（図−５参照）が得られた。

尚、ＨＰＬＣによるラミナリオリゴ糖の分析は分離条件 で行なりた・ 実施例２ 実施例１の■と全く同じ反応条件で、分解時間を８時間
行なった後、反応液は活性炭カラム（Ｖｏｔ。

１．０００１１１４）を通加させた。カラムを水５ｔに
て水洗後、５０＊ＥｔｏＨ１０Ａで脱着させ、脱着液を
エバポレーターにてａ縮径、凍結乾燥させた。得られた
白色粉末１ｔＩ（ＰＬＣにて分析したところ、０２４８
．７１　Ｇ、　４８．９　％その他２．４　％　カらな
るラミナリオリゴ１！（ＩＶ）（図−６参照）が得られ
た。

試験例１ 供試菌株としてビフィドバクテリウム属菌ではビフィド
バクテリウム　ブレーベ（Ｂｌｆｌｄｏｂａｅｔｅｒｌ
ｕｍｂｒ・マｅ）、ビフィドバクテリウム　ピッイブラ
ム（Ｂ、　ｂｌｆｉｄｕｍ　）　ＡＴＣＣ１５６９６、
ビフイドパクテリウムアドレスセンチイス（Ｂ、　ａｄ
ｏｌｅｓｅｅｎｔ１ｇ’）　ＡＴＣＣ１５７０３１！−
用いた。比較歯株としてはラクトバシルス　カゼイ（Ｌ
ａｅｔｏｂａｅｌｌｌｕｓ　ｃａｎａｌ　）　、ストレ
プトコッカスフェカリス（Ｓｔｒ＠ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
　ｆａ＠ｃａｌ１ｇ）、大腸菌としてＥｍｃｈ＠ｒｌａ
ｈｌａ　ｃａｌｌ　ＪＣ−：２、Ｅ、ｃｏｌｌＩＦＯ−
１２７３４、及びＥ、　ｅｏｌ　ｌ　ＩＦＯ−３５４３
を用いた。

試験方法としては矢沢らの方法（Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒ
ｍ。

Ｂｕｌｌ、　２６（１１）３３０６−３３１１（′７８
）　）に準じて行なった。

既ち、６菌に対するそれぞれの２信置度の培地を高圧滅
菌し、別に高圧滅菌した糖溶液を同容量加え、静置培養
にて３７℃で１〜４日間培誉した。

その培養液をよく混相し、６５０ｎｍＫおける吸光度（
濁度）を測定した。

結果を表−１に示した。

試験に用いたラミナリオリゴ糖（ｍはとくに大腸菌に対
して資化され難く、糖濃度を高めることにより、ビフィ
ズス菌に対する増殖促進効果は大きくなった。

試験例２ ラミナリオリゴ糖（２）及び（財）よシ各オリが糖を単
離し、前記したビフィドバクテリウム菌の混合物と大腸
菌の利用性について検討した。

図−７に示したように、ラミナリトリオースが最も大腸
菌を増殖させないで、ビフィドバクテリウム菌を増殖さ
せることができる、即ち選択性に優れたラミナリオリゴ
糖であり、ビフィドバクテリウム菌の増殖物質として優
れたものであることが認められた。

【図面の簡単な説明】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ラミナリオリゴ糖を有効成分とするビフィドバクテ
   リウム菌の増殖促進組成物。 ２、微生物が生産するエンド型β−１，３−グルカナー
   ゼによりβ−１，３−グルコシル糖化合物を処理するこ
   とを特徴としたビフィドバクテリウム菌増殖促進組成物
   の製造法。