JPH04271791A - 紅藻類アマノリ属海藻オリゴ糖の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、紅藻類アマノリ属海藻
オリゴ糖　（以下、海苔オリゴ糖と言う）　の製造方法
に関し、詳しくは微生物の生産する多糖類分解酵素を用
いて紅藻類アマノリ属海藻　（以下、単に海苔と言う）
　由来の多糖類を分解し海苔オリゴ糖を製造する方法に
関するものである。さらに、本発明は上記多糖類分解酵
素の製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、健康食品に対する志向が高くなっ
てきたことに伴い、ミネラルやビタミン類を豊富に含ん
でいる海藻類由来のオリゴ糖、例えば海苔オリゴ糖など
を健康食品として利用することが注目され始めている。 しかし、海苔オリゴ糖の製造法については特に確立され
た方法はなく、従来の海苔オリゴ糖の生産は、海苔を熱
水およびエタノールで処理することにより、炭水化物の
主要成分であるポルフィランなどの硫酸多糖を抽出し、
これを酸加水分解してオリゴ糖としていた。しかしなが
ら、海苔からの多糖抽出は時間がかかる割には収量が少
なく、海苔オリゴ糖を生産するうえで、かならずしも経
済的な方法とは言えないものである。

【０００３】また、海苔から分離した菌の培養において
は、一般に炭素源に海苔もしくは海苔から抽出した多糖
類を用いている。しかし、この場合海苔は乾燥および粉
末化に煩雑な処理が必要であり、しかもジャーファメン
ターや連続遠心機等の管に海苔粉末が詰まり、大量培養
を行うためには非常に困難をきたしている。また、海苔
多糖類においても抽出に多大な時間を要し、収量も少な
いことなどから、目的の菌株を大量培養することは困難
であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは紅藻類ア
マノリ属に属する海藻を直接酵素的に分解し、紅藻類ア
マノリ属海藻オリゴ糖を製造すべく鋭意研究し、そのよ
うな目的に合致する酵素を効率的に産生する微生物を海
水より新たにスクリーニングし、その微生物を用いて紅
藻類アマノリ属海藻オリゴ糖を容易に且つ経済的に製造
する方法を完成した。

【０００５】また、海苔から分離した微生物の培養にお
いては、一般に炭素源として海苔またはそれから抽出し
た多糖類を使用しているが、これらの炭素源は前述の通
り種々の欠点を有しているので本発明者らは、上記新た
にスクリーニングした微生物を培養して多糖類分解酵素
を製造するに当たって上記欠点を有しない培養方法を開
発し、本発明を完成した。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、紅藻類アマノ
リ属に属する海藻にビブリオ属に属する微生物の産生す
る多糖類分解酵素を作用させて紅藻類アマノリ属海藻オ
リゴ糖を製造することを特徴とする紅藻類アマノリ属海
藻オリゴ糖の製造方法である。さらに、本発明は、ビブ
リオ属に属し多糖類分解酵素生産能を有する微生物を炭
素源として寒天を含有する培地に培養し、培養物から多
糖類分解酵素を採取することを特徴とする多糖類分解酵
素の製造方法である。

【０００７】以下に、本発明を詳細に説明する。先ず、
本発明の海苔オリゴ糖の製造方法で用いる微生物につい
て説明すると、その形態学的性質及び生理学的性質は下
記に示す通りである。　　　　　　　　　　　　　　　
　菌株の菌学的性質 形態学的性質 １）　グラム染色性　　−−−−−−−−−−　　陰性
２）　細胞の形状　　−−−−−−−−−−−−　　桿
菌３）　コロニーの色調　　−−−−−−−−　　乳白
色４）　運動性の有無　　−−−−−−−−−−　　有
り５）　鞭毛の有無　　−−−−−−−−−−−−　　
極鞭毛６）　発光の有無　　−−−−−−−−−−−−
　　無し生理学的性質 １）　Ｏ−Ｆテスト　　−−−−−−−−−−　　発酵
型２）　オキシダーゼテスト　　−−−−　　陽性　　
　　　　　　　　　　　　　　　　 ３）　ゼラチンの分解　　−−−−−−−−　　陽性４
）　ＤＮＡの分解　　−−−−−−−−−−　　陽性５
）　好塩性　　−−−−−−−−−−−−−−−−　　
陽性ＧＣ含量　　−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−　　４９．４ｍｏｌ％上記表１に示す菌株の性質
に基づいて清水らの方法［海洋微生物研究法、学会出版
センター、　２２８〜２３９　（１９８５）］に従って
同定を行った結果、上記微生物は発酵型、好塩型、非発
光性のグラム陰性菌であるなどの理由によりビブリオ属
に属るものであることが判明し、そして、この微生物を
ビブリオ・エスピー　（Ｖｉｂｒｉｏｓｐ．）Ｎｏ．６
３８０　と命名した。この菌株は工業技術院微生物工業
技術研究所に、微工研菌寄第１１９４８号として寄託し
ている。

【０００８】次に、このようにして分離した微生物を培
地中で培養し、培地中に多糖類分解酵素を蓄積させこれ
を培養物から回収すことにより多糖類分解酵素を製造す
る。この微生物の培養に用いられる培地は炭素源、窒素
源及び無機塩類を含有する培地であるが、炭素源として
は、従来この分野の微生物に使用している海苔又は海苔
由来の多糖類に代えて、海苔の構成多糖であるポルフィ
ラと似た構造　（ガラクトースとアンヒドロガラクトー
スの繰り返し構造）　を有している寒天を使用する。こ
れによりジャーファメンターや連続遠心機の管に詰まる
こともなく、酵素の製造が容易に且つ良好に行うことが
できる。窒素源としては、クエン酸鉄アンモニウム、塩
化アンモニウム等が使用される。無機塩類としては、Ｎ
ａＣｌ，ＫＣｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，ＣａＣｌ２・
２Ｈ２Ｏ，Ｋ２ＨＰＯ４，等が使用され、緩衝液として
はトリス−　塩酸緩衝液（ｐＨ７．８　）等が使用され
る。また、微生物の培養条件は、温度１９〜２０℃、ｐ
Ｈ７．５　〜８．０　である。

【０００９】このようにして得られる粗酵素状態の多糖
類分解酵素は、上記の培養法等により培養して得られる
もので、その最適酵素反応条件は次の通りである。 （１）　至適ｐＨ：図１に本酵素の各ｐＨにおける相対
活性量を示す。この図から明らかなように、ｐＨ６．０
〜７．５の範囲で相対活性量が高く相対活性量が最大に
なるｐＨは７．０である。従って、至適ｐＨは７．０で
ある。

【００１０】（２）　至適温度　：　　図２に本酵素の
各温度における相対活性量を示す。この図から明らかな
ように、温度３５℃相対活性量が最大となる。従って、
至適温度は３５℃である。　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　次に、多糖類分解酵素を紅
藻類アマノリ属に属する海藻に作用させて海藻オリゴ糖
を製造する。

【００１１】上記酵素反応は、０．０５Ｍ　リン酸ナト
リウム緩衝液中で行われ、ｐＨ６．０　〜７．５　、温
度３０℃〜４０℃の範囲で行われる。上記紅藻類アマノ
リ属に属する海藻としては、スサビノリ、コスジノリ、
オニマノリ、クロノリ、ウップルイノリ、マルバアサク
サノリ、アサクサノリ、チシマクロノリ等が用いられ、
その使用量は反応液に対し１０ｇ／Ｌである。そして、
上記酵素の使用量は反応液に対し２００　ｕｎｉｔ／Ｌ
である。

【００１２】酵素処理液からの海苔オリゴ糖の分離、回
収は遠心分離法及び限外濾過法により行った。以下、本
発明を実施例により具体的に説明する。但し、これら実
施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではな
い。

【００１３】

【実施例１】この実施例ではビブリオ・エスピー　（Ｖ
ｉｂｒｉｏｓｐ．）　Ｎｏ．６３８０を培養して多糖類
分解酵素を製造する方法について説明する。 　　上記組成の培地２００ｍｌに、凍結乾燥保存菌体ビ
ブリオ・エスピー　Ｎｏ．６３８０株（　微工研菌寄第
１１９４８号）　を接種し、ｐＨ７．８　、温度２０℃
で２日間振とう培養した。 〔酵素液の調整〕上述の培養液２００　ｍｌを４℃の温
度で１０，０００ｒｐｍ　にて１０分間遠心分離して、
上澄液１９０ｍｌを得た。この上澄液を多糖類分解酵素
とした。 〔多糖類分解酵素の活性〕上記酵素液　１００μｌ　と
基質であるスサビノリ５ｍｇおよび０．０５Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液　（ｐＨ７．０）　５００μｌ　をエッ
ペンドルフチュウブに入れ、３０℃で３０分間反応させ
た後、沸騰水浴中で１０分間加熱して酵素反応を停止さ
せ、ついで急冷後反応物を遠心分離し、その上澄液中の
遊離全糖量をフェノール硫酸法で比色定量し、ガラクト
ース量として酵素活性を示した。その結果、培養液１ｍ
ｌあたり１．０単位の多糖類分解酵素が生産されている
ことがわかった。なお、酵素活性は３０℃、１分間に　
１００μｇ　の糖をスサビノリから溶出する酵素量を１
単位と定義している。

【００１４】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　反応液の組
成────────────────────────
───────────スサビノリ粉末１．０％を含む
０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液　（ｐＨ７．０）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−　　０．５ｍｌ・酵　　素　　液　　
　　−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−　　０．１ｍｌ────
─────────────────────────
──────

【００１５】

【実施例２】スサビノリ粉末１０ｇを　１，０００ｍｌ
の０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液　（ｐＨ７．０）
　に溶解後、これに実施例１で得られた多糖類分解酵素
　２００ｍｌ（２００単位）　を加え、３５℃で２時間
攪拌しながら反応させた。反応液を４℃の温度で１０，
０００ｒｐｍ　にて１０分間遠心分離して、その上澄液
を担体としてＢｉｏ−ｇｅｌ　Ｐ−２　（日本バイオラ
ット　　ラボラトリーズ（株）の商品名）　〔オリゴ糖
分画　（分画範囲１００〜１８００ダルトン）　ゲル濾
過担体〕を充填したカラムに加えた。このカラムを０．
１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液　（ｐＨ４．０）　で溶出し
、オリゴ糖の溶出パターンを得た。 この結果、図３に示すように４種類の大きさの異なる海
苔オリゴ糖混合物　（全糖量の５５〜６５％）　を得た
。

【００１６】

【実施例３】実施例１の培地組成の炭素源をスサビノリ
の代わりに寒天６ｇ／Ｌを用いる以外は、実施例１の記
載と同様の手順で培養を行い、得られた培養液から酵素
液１９０ｍｌを調製した。この酵素液について実施例１
と同様に酵素活性試験を行った結果、図４に示すように
炭素源に寒天を用いた場合も、スサビノリを用いた場合
の８割以上の多糖類分解酵素を生産することができた。

【００１７】

【発明の効果】本発明によれば、海苔から多糖　（ポル
フィラン）　を抽出することなく、海苔に直接微生物の
産生する多糖類分解酵素を作用させてオリゴ糖を直接得
ることができる。また、前記多糖類分解酵素を市販の寒
天を炭素源として用いて容易に生産することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】多糖類分解酵素の各ｐＨにおける相対活性量及
び至適ｐＨを示す図である。

【図２】多糖類分解酵素の各温度における相対活性量及
び至適温度を示す図である。

【図３】海苔オリゴ糖のカラムクロマトにおける溶出パ
ターンを示す図である。

【図４】炭素源としてスサビノリおよび寒天を用いた場
合の多糖類分解酵素の相対活性量を示す図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　紅藻類アマノリ属に属する海藻にビブ
   リオ属に属する微生物の産生する多糖類分解酵素を作用
   させて紅藻類アマノリ属海藻オリゴ糖を製造することを
   特徴とする紅藻類アマノリ属海藻オリゴ糖の製造方法。
2. 【請求項２】　　ビブリオ属に属する微生物が、ビブリ
   オ・エスピー　（Ｖｉｂｒｉｏｓｐ．）　Ｎｏ．６３８
   ０である請求項１記載の紅藻類アマノリ属海藻オリゴ糖
   の製造方法。
3. 【請求項３】　　ビブリオ属に属し多糖類分解酵素生産
   能を有する微生物を炭素源として寒天を含有する培地に
   培養し、培養物から多糖類分解酵素を採取することを特
   徴とする多糖類分解酵素の製造方法。