JPWO2016163534A1 - バチルス属細菌芽胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]バチルス属細菌を、C/N比(炭素含量と窒素含量の重量比)が4.0より大きく9.5未満である液体培地を用いて培養する工程を含む、バチルス属細菌の芽胞の製造方法。
[2]培養に用いる液体培地のC/N比が4.5以上9.5未満である、[1]に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
[3]培養に用いる液体培地のC/N比が4.5以上7.5以下である、[1]に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
[4]培養に用いる液体培地のC/N比が6.0以上7.5以下である、[1]に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
[5]液体培地における炭素含量が50g/L以下である、[1]〜[4]のいずれかに記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
[6]液体培地における炭素含量が25g/L以下である、[1]〜[4]のいずれかに記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
[7]液体培地におけるカリウム含量が2.0g/L未満である、[1]〜[6]のいずれかに記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
[8]液体培地におけるカリウム含量が1.9g/L以下である、[1]〜[6]のいずれかに記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
[9]液体培地に含まれる炭素源および窒素源はバチルス属細菌が異化しうる炭素源および窒素源である、[1]〜[8]のいずれかに記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
[10]バチルス属細菌が異化しうる炭素源は、でんぷん、グルコース、ラクトース、グリセロール、アラビノース、リボース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、グルコサミン、N-アセチルグルコサミン、セロビオース、マルトース、スクロース、トレハロース、キシリトール、アルコール、有機酸、有機酸塩、およびアルカンからなる群より選択される一種類以上の炭素源であり、バチルス属細菌が異化しうる窒素源は、大豆由来成分、酵母由来成分、コーン由来成分、動植物タンパク質およびその分解物、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アンモニア、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、グルタミン酸ナトリウム、尿素等からなる群より選択される一種類以上の窒素源である、[9]に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
[11]バチルス属細菌が、バチルス・シンプレックス(Bacillus simplex)、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・シュリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・ポピリエ(Bacillus popilliae)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・ファーマス(Bacillus firmus)、バチルス・ベレゼンシス(Bacillus velezensis)、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・ピチノティ(Bacillus pichinotyi)、バチルス・アシドカルダリウス(Bacillus acidocaldarius)、バチルス・アルカロフィラス(Bacillus alcalophilus)、バチルス・アルカリコラ(Bacillus alkalicola)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・アゾトフォーマンス(Bacillus azotoformans)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バチルス・シアメンシス(Bacillus siamensis)、バチルス・バディウス(Bacillus badius)、バチルス・バタビエンシス(Bacillus bataviensis)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・シクロヘプタニカス(Bacillus cycloheptanicus)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・ アネウリニリティカス(Bacillus aneurinilyticus)、バチルス・ミグラヌス(Bacillus migulanus)、バチルス・アビッサリス(Bacillus abyssalis)、バチルス・アエスツアリイ(Bacillus aestuarii)、バチルス・ポリミグザ(Bacillus polymyxa)、またはバチルス・エスピー(Bacillus sp.)である、[1]〜[10]のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
[12]バチルス属細菌が、バチルス・シアメンシス(Bacillus siamensis)、バチルス・シンプレックス(Bacillus simplex)またはバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)である、[1]〜[10]のいずれかに記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
この中では、バチルス・シンプレックス(Bacillus simplex)、バチルス・シアメンシス(Bacillus siamensis)またはバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)が好ましい。
C/N比は以下の通り算出される。
C/N比=各培地成分に含まれる炭素含量の合計÷各培地成分に含まれる窒素含量の合計。
なお、上記C/N比の液体培地で培養する前に、前培養を行ってもよい。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
500ml三角フラスコを用い、表1に記載の終濃度となるよう、グルコース(和光純薬)、脱脂大豆粉(味の素ヘルシーサプライ)、酵母エキス(Difco)、CSL(Corn Steep Liquor:ROQUETTE)、ペプトン(Difco)、KH2PO4(和光純薬)を含有し、さらにMnCl2(和光純薬)を100ppm、NaCl(和光純薬)を400ppm、MgCl2(和光純薬)を250ppm、CaCl2(和光純薬)を75ppm、FeSO4(和光純薬)を0.3ppm含有させた培地をそれぞれ100mlずつ作製し、シリコ栓をしてオートクレーブ滅菌を行った(グルコースはメイラード反応を避けるため、別途滅菌の上、無菌的に混合した)。
得られた前培養液より3mlを、表1に記載の各種培地に無菌的に稙菌し、37℃、150rpmで40時間〜72時間晩振とう培養を行い、培養液を得た。
培養後、光学顕微鏡および細菌用セルカウンターを用いて、培養液中の菌体濃度および菌体の芽胞化率を計測した。
培養液中に増殖したバチルス・シンプレックス菌を滅菌水、0.01%Tween20液等で希釈したのちに、菌体濃度(栄養細胞および芽胞)、芽胞濃度を細菌用セルカウンターでカウントした。芽胞化率は芽胞濃度÷菌体濃度で算出した。
C/N比=各培地成分に含まれる炭素含量の合計÷各培地成分に含まれる窒素含量の合計。
各培地成分の炭素含量の測定は、酸中で加水分解したのちソモギー法にて還元糖濃度を定量後、全糖量に0.4を掛けて算出した。
各培地成分の窒素含量の測定は、ケルダール法により行った。
500ml三角フラスコを用い、表3に記載の培地条件1〜3の終濃度となるよう、グルコース(和光純薬)、脱脂大豆粉(味の素ヘルシーサプライ)、酵母エキス(Difco)、CSL(ROQUETTE)、ペプトン(Difco)、KH2PO4(和光純薬)を含有し、さらにそれぞれMnCl2(和光純薬)を100ppm、NaCl(和光純薬)を400ppm、MgCl2(和光純薬)を250ppm、CaCl2(和光純薬)を75ppm、FeSO4(和光純薬)を0.3ppm含有させた培地をそれぞれ100mlずつ作製し、シリコ栓をしてオートクレーブ滅菌を行った(グルコースはメイラード反応を避けるため、別途滅菌の上無菌的に混合した)。
5L容培養槽を用い、表5に記載の培地条件1〜3の終濃度となるよう、グルコース(和光純薬)、脱脂大豆粉(味の素ヘルシーサプライ)、酵母エキス(Difco)、CSL(ROQUETTE)、ペプトン(Difco)、KH2PO4(和光純薬)を含有し、さらにそれぞれMnCl2(和光純薬)を100ppm、NaCl(和光純薬)を400ppm、MgCl2(和光純薬)を250ppm、CaCl2(和光純薬)を75ppm、FeSO4(和光純薬)を0.3ppm含有させた培地をそれぞれ2,000mlずつ作成し、オートクレーブ滅菌を行った(グルコースはメイラード反応を避けるため、別途滅菌の上無菌的に混合した)。
5L容培養槽を用い、表7に記載の培地条件1〜3の終濃度となるよう、グルコース(和光純薬)、脱脂大豆粉(味の素ヘルシーサプライ)、酵母エキス(Difco)、CSL(ROQUETTE)、ペプトン(Difco)、KH2PO4(和光純薬)を含有し、さらにそれぞれMnCl2(和光純薬)を100ppm、NaCl(和光純薬)を400ppm、MgCl2(和光純薬)を250ppm、CaCl2(和光純薬)を75ppm、FeSO4(和光純薬)を0.3ppm含有させた培地をそれぞれ2,000mlずつ作成し、オートクレーブ滅菌を行った(グルコースはメイラード反応を避けるため、別途滅菌の上無菌的に混合した)。
5L容培養槽を用い、表9に記載の培地条件1〜3の終濃度となるよう、グルコース(和光純薬)、脱脂大豆粉(味の素ヘルシーサプライ)、酵母エキス(Difco)、CSL(ROQUETTE)、ペプトン(Difco)、KH2PO4(和光純薬)を含有し、さらにそれぞれMnCl2(和光純薬)を100ppm、NaCl(和光純薬)を400ppm、MgCl2(和光純薬)を250ppm、CaCl2(和光純薬)を75ppm、FeSO4(和光純薬)を0.3ppm含有させた培地をそれぞれ2,000mlずつ作成し、オートクレーブ滅菌を行った(グルコースはメイラード反応を避けるため、別途滅菌の上無菌的に混合した)。
Claims (12)
- バチルス属細菌を、C/N比(炭素含量と窒素含量の重量比)が4.0より大きく9.5未満である液体培地を用いて培養する工程を含む、バチルス属細菌の芽胞の製造方法。
- 培養に用いる液体培地のC/N比が4.5以上9.5未満である、請求項1に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
- 培養に用いる液体培地のC/N比が4.5以上7.5以下である、請求項1に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
- 培養に用いる液体培地のC/N比が6.0以上7.5以下である、請求項1に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
- 液体培地における炭素含量が50g/L以下である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
- 液体培地における炭素含量が25g/L以下である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
- 液体培地におけるカリウム含量が2.0g/L未満である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
- 液体培地におけるカリウム含量が1.9g/L以下である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
- 液体培地に含まれる炭素源および窒素源はバチルス属細菌が異化しうる炭素源および窒素源である、請求項1〜8のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
- バチルス属細菌が異化しうる炭素源は、でんぷん、グルコース、ラクトース、グリセロール、アラビノース、リボース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、グルコサミン、N-アセチルグルコサミン、セロビオース、マルトース、スクロース、トレハロース、キシリトール、アルコール、有機酸、有機酸塩、およびアルカンからなる群より選択される一種類以上の炭素源であり、バチルス属細菌が異化しうる窒素源は、大豆由来成分、酵母由来成分、コーン由来成分、動植物タンパク質およびその分解物、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アンモニア、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、グルタミン酸ナトリウム、尿素等からなる群より選択される一種類以上の窒素源である、請求項9に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
- バチルス属細菌が、バチルス・シンプレックス(Bacillus simplex)、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・シュリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・ポピリエ(Bacillus popilliae)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・ファーマス(Bacillusfirmus)、バチルス・ベレゼンシス(Bacillus velezensis)、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・ピチノティ(Bacillus pichinotyi)、バチルス・アシドカルダリウス(Bacillus acidocaldarius)、バチルス・アルカロフィラス(Bacillus alcalophilus)、バチルス・アルカリコラ(Bacillus alkalicola)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・アゾトフォーマンス(Bacillus azotoformans)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バチルス・シアメンシス(Bacillus siamensis)、バチルス・バディウス(Bacillus badius)、バチルス・バタビエンシス(Bacillus bataviensis)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・シクロヘプタニカス(Bacillus cycloheptanicus)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・ アネウリニリティカス(Bacillus aneurinilyticus)、バチルス・ミグラヌス(Bacillus migulanus)、バチルス・アビッサリス(Bacillus abyssalis)、バチルス・アエスツアリイ(Bacillus aestuarii)、バチルス・ポリミグザ(Bacillus polymyxa)、またはバチルス・エスピー(Bacillus sp.)である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
- バチルス属細菌が、バチルス・シアメンシス(Bacillus siamensis)、バチルス・シンプレックス(Bacillus simplex)またはバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の芽胞の製造方法。
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