JPH0479879A - 納豆菌の液体培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、納豆菌及びその変異株の培養法に関し、特に
液体培地を用いる菌の増殖及びその胞子化を行う、納豆
菌の液体培養法に関するものである。

納豆菌は、発酵食品としての納豆をつくるほか、その胞
子、その変異株又は変異株の胞子が家禽や家畜の飼料に
生育促進用添加物として用いられている。

【従来の技術Ｊ 従来、納豆菌及びその変異株の増殖方法には、蒸煮した
大豆に接種する固体培養法のほか、天然培地、半合成培
地又は合成培地を用いる固体培養法及び液体培養法があ
る。

一般的に胞子形成菌の胞子形成は、それぞれの菌種の増
殖に良好な培地で培養した場合、栄養細胞の対数増殖期
の末期に胞子形成が行われる。胞子形成に適した培地組
成については、これまで種々の菌体について検討され、
ある種の菌体については、Ｃａ”、Ｆｅ１、Ｍｎ２　＋
″等の添加が有効であり、また胞子形成に際してはＴＣ
Ａサイクル（クエン酸サイクル）の活動が必要であるこ
となどが知られている（例えば、蜂須賀養悦：「芽胞学
」、東海大学出版会列）。

特開昭５８−１７９４３９号公報には、変異納豆菌を液
体培養又は固体培養して動物用飼料又は飼料添加物とし
て用いることが提案されている。

また、特開平２−６５７７７号公報には納豆菌を突然変
異させて得られた納豆菌変異株よりγ−ＧＴＰａｓｅ活
性が１００単位以上で糸引性のない変異納豆菌が提案さ
れている。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、納豆菌の保存あるいは飼料添加物として
の利用には、菌の増殖と共にその胞子化が必要であり、
従来の液体培養法では栄養細胞の増殖は良好であっても
、胞子の形成は少ないか又は全く胞子を形成しない場合
が多かった。

特に、ブロイラーの飼料として、その出荷前には抗生物
質の使用が禁止されており、それに代わる飼料添加物と
して納豆菌胞子の使用が行われており、胞子化納豆菌の
効率的な生産方法が要望されている。

従来研究されてきた胞子形成用培地は、個々の菌体につ
いてのもので、その規則性及び汎用性は不明であり、特
に納豆菌について耐熱性の胞子形成に関する手段につい
ての報告は見られない。

本発明の目的は、工業的生産が容易な液体培養法で、納
豆菌の増殖及び胞子形成を効率よ（達成する方法を提供
するにある。

〔課題を解決するため手段］ 本発明は、納豆菌及びその変異株を大量に培養し、また
その胞子化によって納豆の製造や動物用飼料添加物とし
て利用するために、液体培養法を用い、その培地の炭素
源／窒素源の比を特定範囲に規定することによって上記
の目的を達成したものである。

すなわち、本発明は、納豆菌又はその変異株の液体培養
法において、培地中のクルコース換算炭素源のプロティ
ン換算窒素源に対する比が１．５〜７である培養液を用
いることを特徴とする納豆菌の液体培養法である。

（納豆菌） 本発明に用いられる納豆菌はその目的に応じて任意の菌
を用いることができるが、通常の糸引性を有する納豆菌
の場合、液体培養法では納豆菌の増殖によって培養液の
粘度上昇が生じるので、培養装置及び培養方法を工夫す
る必要がある。好ましくはその変異株で糸引性のないも
のが用いられる。

変異株の製造は１例えばＸ線やγ線等の放射線あるいは
紫外線を通常の納豆菌に照射する方法、例えばアクリジ
ンオレンジ等の突然変異源を接触させる方法、遺伝子操
作による方法など公知の方法が採用できる。

（培地） 培地としては天然培地、半合成培地１合成培地のいずれ
でもよいが、本発明においては、その炭素源と窒素源の
比率（Ｃ／Ｎ）は１．５〜７の範囲内に調整される。

ここで炭素源Ｃは、炭素源として培養液に使用した成分
をグルコース換算した量であり、窒素源Ｎは窒素源とし
て培養液に使用した成分をプロティン換算した量であっ
て、Ｃ／Ｎはこの両者の比であり、培地中の全炭素と全
窒素の比を意味するものではなく、したがって、窒素源
として使用した有機物はＣ／ＮのＣには含まれない。

窒素源としては、グルコース、サッカロース、デキスト
リン、グリセリン、澱粉、ｒｆＭ蜜などを挙げることが
できる。

窒素源としては、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス
、乾燥酵母、大豆粕、アンモニウム塩、尿素、硝酸塩、
有機・無機窒素化合物が挙げられる。

従来納豆菌の培養に用いられる培地は窒素源を主体とし
ており、そのＣ／Ｎは１．５未満で、納豆菌の増殖率が
高く、生菌数は増加するが、胞子化率は低くなる。一方
、Ｃ／Ｎ比が高くなると胞子化率が向上するが、増殖率
すなわち生菌数は低下し、あるＣ／Ｎ比より上では胞子
化率も低下し、Ｃ／Ｎ比が７を超えると生成胞子数が激
減し実用性がない、好ましいＣ／Ｎ比は３〜５である。

本発明に用いられる培地には、従来菌の培養に有効に添
加されてきた各種の無機塩及びビタミン類等を添加する
ことができる。特に従来菌類の胞子化の際のＴＣＡサイ
クルに関与する各種酵素の補助因子であるＣａ２＋、Ｆ
ｅ２“、Ｍｎ２°等の添加は有効である。

（培養条件） 本発明の方法において、培養温度は通常２５〜５０°Ｃ
であり、培養時の培養液のｐＨは６〜９の範囲内にある
ことが好ましい。

菌種により、また用いる培養器により異なるが、菌の増
殖すなわち対数増殖期は６〜３０時間であり、胞子の形
成は対数増殖期の末期から開始され、胞子形成の完了に
は通常６〜２０時間を要する。したがって胞子形成を目
的とする培養期間は通常１２〜４８時間である。

本発明の方法では培養時の撹拌が大きな影響を有する。

すなわち対数増殖期においては菌の増殖に必要な溶存酸
素を培養液に与える程度の攪拌で足り、そのままでも対
数増殖期の末期から胞子形成が開始される。

ところが対数増殖期の末期以降の胞子形成期において酸
素供給量を増加させることにより胞子形成が促進され、
胞子形成率を大幅に向上させることが見出された。

酸素供給量の増加は一般には撹拌速度、攪拌翼の回転数
、振盪速度のよって撹拌強度を上げることによって得ら
れるが、空気の吹込みその他の手段によることもできる
。酸素供給量の増加は少な（とも１．５倍とすることが
好ましい。

［実施例］ 以下の実験において、先ず培地のＣ／Ｎ比の影響を調べ
た。

実験例１ 容量５００ｍｊの三角フラスコに下記の培地成分を水道
水１００ａ＋ｊに溶解し、それぞれＣ／Ｎ比の異なる培
地を調製した。

可溶性澱粉　　　２．５　　ｗ／ｖ％ 酵母エキス　　　０．２　　ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４０−１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４４Ｈａ０　　　０．１　　ｗ／ｖ％ポリペプ
トン　　０．０１２５〜２．５ｗ／ｖ％各培地をｌＮ−
Ｎａ０Ｈｆｆｌ液を用いてｐＨ７に調整した後、　１２
０℃で１０分間オートクレーブにて加熱殺菌処理した。

市販納豆から分離採取した納豆菌に紫外線を照射し、糸
引性を有しない変異株を得、それぞれの培地に接種し、
培養温度３５℃、振盪器回転数１８Ｏｒｐｍで４２時間
振盪培養を行い、培養液を採取して生菌数と胞子数を測
定した。実験は４回行い、各測定値の平均値を採用した
。

結果を第１表に示す。

第　　１　　表 なお、各培地のＣ／Ｎ比は、可溶性澱粉のグルコース係
数を０．６、酵母エキスのプロティン係数を０．７、ポ
リペプトンのプロティン係数を０．８として計算した。

生菌数は、培養液を生理食塩水で適宜に希釈し、一般に
寒天培地と称する肉汁、肉エキス及びペプトン等を主体
とした培地に摂取し、発生したコロニー数をコロニーカ
ウンターで測定した。

また、胞子数は、培養液を８０℃で１０分間加熱したの
ち、生理食塩水で適宜に希釈し、生菌数と同様にして求
めた。

第１表の結果から明らかなように、Ｃ／Ｎ比が低くなる
と生菌数は増加するが、胞子数はＣＺＮ比３〜５付近を
ピークとしてかえって減少している。

実験例２ 実験例１と同様の培地を用い、Ｃ／Ｎ比が１．６〜６．
８の培地について、対数増殖期がほぼ終了する培養開始
後２２時間後に、培養液を半分に減らし、同じ振盪条件
で更に２０時間培養した。培養液量を半減することによ
って、培養器の撹拌強度を示す液相容量係数にＬａは６
０〜７０％向上したと推定され、培養液への酸素供給速
度がそれによって増大している。

得られた培養液について実験例１と同様に生菌数及び胞
子数を測定した平均値を第２表に示す。

第　　２　　表 実験例１と同様にして第３表のＣ／Ｎ比の培地を用い、
培養初期より液量を半分とした以外は、実験例１と同様
にして４２時間培養した。

得られた培養液について実験例１と同様に生菌数及び胞
子数を測定した平均値を第３表に示す。

第　　３　表 第２表の結果を第１表と比較すると生菌数に大きな変化
は見られないが、対数増殖期以降の酸素供給の増加によ
って、胞子化率がきわめて顕著に向上したことが明らか
である。

実験例３ 第３表の結果を第１表の結果と比較すると、培養当初よ
り酸素供給速度を高めておくことは、胞子化率において
若干の向上は認められるが、第２表の結果のような顕著
な胞子化率の向上は認められなかった。

〔発明の効果］ 本発明は納豆菌を特定のＣ／Ｎ比の培地で液体培養する
ことにより、従来に比して胞子化率が高く、増殖した納
豆菌及び胞子の採集が容易であり、特に対数増殖期の末
期から培地への酸素供給速度を増大せしめることによっ
て、納豆菌の胞子化率を飛躍的に高めることができ、納
豆菌の保存性及び飼料用としての利用性を高めることが
できる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）納豆菌又はその変異株の液体培養法において、培
   地中のグルコース換算炭素源のプロテイン換算窒素源に
   対する比が１．５〜７である培養液を用いることを特徴
   とする納豆菌の液体培養法。
2. （２）納豆菌又はその変異株の液体培養法において、培
   地中のグルコース換算炭素源のプロテイン換算窒素源に
   対する比が１．５〜７である培養液を用い、培養液中の
   酸素濃度が納豆菌の呼吸活性に必要な量となる酸素供給
   速度で培養し、対数増殖期の末期に酸素供給速度を高め
   て胞子化せしめることを特徴とする納豆菌の液体培養法
   。