KR102533305B1 - 바실루스속 세균의 배양 방법 및 유용 물질의 제조 방법 - Google Patents

바실루스속 세균의 배양 방법 및 유용 물질의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실루스속 세균의 아포를 효율적으로 생산할 수 있는 배양 방법을 제공하는 것을 과제로 하고, 배양 개시시의 당 또는 당원 원료의 농도가 50.1 g/ℓ∼100 g/ℓ 인 액체 배지에서 바실루스속 세균을 배양하고, 배양 도중에, 당 또는 당원 원료 및 및 함질소 화합물을 함유하고, 탄소 원자와 질소 원자의 중량비 (C/N 비) 가 5.5 ∼ 13.5 인 유가 배지를 상기 액체 배지에 공급하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법을 제공한다.

Description

바실루스속 세균의 배양 방법 및 유용 물질의 제조 방법
본 발명은, 바실루스속 세균의 배양 방법에 관한 것이다.
식품, 의약, 축산 등의 많은 분야에 있어서, 바실루스속 세균 또는 바실루스속 세균이 생산하는 유효 성분이 널리 이용되고 있다. 특히 생균을 유효 성분으로 하는 미생물 농약이나 정장제에 있어서는, 바실루스속 세균을 아포 상태에서 유통, 이용하는 것이 내구성이나 안정성의 면으로부터 일반적인 것으로 여겨진다.
일반적으로 바실루스속 세균의 배양에는 주로 당 등의 탄소원, 아미노산이나 무기 암모늄염 등의 질소원 및 미네랄 등을 함유하는 액체 배지가 사용된다.
비특허문헌 1 에 있어서는, 이들의 성분을 함유하는 액체 배지에서 회분 배양법에 의해 바실루스속 세균을 배양했을 때에, 아포가 3.5E ＋ 09 spore/㎖ 정도 얻어진 것이 개시되어 있다.
특허문헌 1 에 있어서는, 당류, 효모 엑기스, 콘 침지액 건조물, 대두 펩톤 및 농축 소주 찌꺼기를 각각 최대로 5, 10, 20, 10, 20 ％ 함유하는 배지에서, 대수 (對數) 증식기 이후의 산소 농도를 10 ％ 이하로 하는 공정을 포함하는 조건에서 배양함으로써 고농도의 바실루스속 세균의 아포를 얻을 수 있었던 것이 나타나 있다. 그러나, 바실루스속 세균의 증식에는 산소가 계 중에 충분히 존재하는 것이 바람직하고, 또 바실루스속 세균의 중에는 대수 증식기에 저산소 조건 하에서 배양하면 생육 불량을 일으키는 균주도 존재하기 때문에, 이 방법을 적용할 수 있는 균은 한정되어 있다.
특허문헌 2 에 있어서는, 프로테아제를 산생하는 바실루스속 세균을 당원 원료 및 질소원을 고농도로 함유하는 배지에서 배양하고, 프로테아제를 고산생하는 방법이 나타나 있지만, 이 방법에서는 회분 배양법에 의해 배양이 실시되어 있고, 한 번에 얻어지는 프로테아제량에는 한계가 있다.
통상적으로, 보다 고농도의 아포나 대사물을 한꺼번에 얻고자 하는 경우, 배지 중의 영양 기질 농도를 올려 배양하는 방법이 일반적으로 적용되고, 바실루스속 세균이 자화할 수 있는 기질을 늘려 배양해 가면 그것에 비례하여 균 농도나 대사물은 증가하지만, 어느 일정한 농도를 초과하여 배양하면 산소 요구량의 증대에 배양계의 산소 공급 능력이 따라가지 못하게 되어 생육 불량을 일으키거나, 배양에 요하는 시간이 장기화되는 등의 문제가 발생한다. 특히 글루코오스가 20 g/ℓ 를 초과하는 배지에서 바실루스속 세균을 배양한 경우, 아포의 형성이 저해되는 것도 비특허문헌 1 에서 보고되어 있다.
그래서, 바실루스속 세균의 아포 형성을 저해하지 않고, 한 번에 고농도의 바실루스속 세균의 아포나 대사물을 얻기 위하여, 유가 (流加) 배양 (반회분 배양) 이 실시된다. 이 수법에서는 배양 과정에서 소실된 영양 기질을 적절한 농도 및 적절한 타이밍으로 첨가함으로써, 첨가하지 않은 경우에 비하여 고농도의 균체나 대사물을 얻을 수 있다.
비특허문헌 1 에서는 유가 배양에 의해, 회분 배양시보다 대폭으로 균체의 생산성이 향상되어, 고농도의 바실루스 세균의 아포가 얻어진 것이 개시되어 있다. 그러나, 이 문헌에 있어서는, 글루코오스가 20 g/ℓ 이상 함유되는 배지에서는 아포화가 저해되는 것이 나타나 있고, 배양 개시시의 당 농도를 낮게 하여, 당원 원료 및 질소원이 저농도로 추이하도록 유가되어 있지만, 이것에 의해, 첨가 시간이 장기화되어 최종적으로 60 시간의 배양 시간이 필요해진다. 또, 여기서 사용되고 있는 배지 성분은, 화학적으로 순수한 화합물을 조합한 배지, 즉 완전 합성 배지를 사용하고 있고, 산업 이용을 위하여 대규모로 바실루스속 세균을 배양하여 아포를 얻기 위해서는 다대한 비용이 든다. 그 때문에, 예를 들어 식품 등의 대규모 제조의 공정에서 배출되는 잔류물, 혹은 탈지 대두분이나 효모 엑기스 등, 제조에 큰 노력을 요하지 않는 혼합물로 이루어지는 원료를 사용하여 배양하는 것이 바람직하지만, 이것들을 고농도로 함유하는 배지를 사용하여 바실루스속 세균 아포를 효율적으로 얻는 방법에 대해서는 지금까지 보고예가 없다.
특허문헌 3 에 있어서는, 배양 중인 글루코오스의 소비에 따라, 글루코오스를 종 (終) 농도가 1 ％ 가 되도록 일정 간격으로 배지에 유가하는 방법이 나타나 있지만, 바실루스속 세균의 배양에 있어서는 당류의 유가뿐만 아니라 질소 함유 화합물을 동시에 첨가하는 편이 증식에 유리하다.
특허문헌 4 에 있어서는, 3-하이드록시부티르산의 산생을 위하여 바실루스·리체니포르미스 (Bacillus licheniformis) 를 당을 고농도로 함유하고, 탄소 원자와 질소 원자의 중량비 (C/N 비) 가 12.4 ∼ 24 로 구성되는 배지에서 유가 배양을 실시하는 방법이 나타나 있지만, 바실루스속 세균의 아포를 고농도로 얻기 위해서는 당을 필요 이상으로 고농도로 함유하는 배지에서 배양하는 것은 적절하지 않다.
일본 공개특허공보 2007-236286호 일본 공개특허공보 평11-103855호 일본 공개특허공보 평06-254584호 일본 공표특허공보 평09-502097호
Advances in Microbiology, 2014, 4, 444-454
상기와 같이, 고농도의 바실루스속 세균의 아포나 대사물 등의 유용 물질을 액체 배양에 의해 단시간에 얻기 위해서는, 바실루스속 세균이 고농도의 아포나 대사물을 생성하는 데 있어서 필요한 배양 기질이 과부족없이 공급되는 조건 하에서 배양할 필요가 있고, 이것들을 만족하는 새로운 조건을 알아낼 필요가 있었다. 따라서, 본 발명은, 일반적인 세균용 액체 배지에서는 고농도로 아포나 대사물을 얻는 것이 어려운 바실루스속 세균에 대해, 효율적으로 아포나 대사물 등의 유용 물질을 생산할 수 있는 배양 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 실시한 결과, 배양 초기의 당원 원료의 농도가 높은 배지에 대해, 당 또는 당원 원료를 함유하는 탄소원과, 암모늄염이나 암모니아 혹은 탈지 대두분이나 콘 침지액 등을 함유하는 질소원을 일정한 조성비 내에 설정한 배지를 공급하여 유가 배양을 실시함으로써, 바실루스속 세균의 생육을 저해하지 않고 증식시키고, 또한, 종래의 방법에서는 얻어지지 않았던 고농도의 바실루스 세균 아포나 대사물 등의 유용 물질을 얻을 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
본 발명은 이하와 같다.
[1] 배양 개시시의 당 또는 당원 원료의 농도가 50.1 g/ℓ ∼ 100 g/ℓ 인 액체 배지에서 바실루스속 세균을 배양하고, 배양 도중에, 당 또는 당원 원료 및 함질소 화합물을 함유하고, 탄소 원자와 질소 원자의 중량비 (C/N 비) 가 5.5 ∼ 13.5 인 유가 배지를 상기 액체 배지에 공급하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 바실루스속 세균의 배양 방법.
[2] 탄소 원자와 질소 원자의 중량비 (C/N 비) 가 5.5 ∼ 12 인 유가 배지를 상기 액체 배지에 공급하여 배양하는 것을 특징으로 하는, [1] 에 기재된 바실루스속 세균의 배양 방법.
[3] 배양 종료시까지 유가 배지에 의해 공급되는 당 또는 당원 원료의 총량이, 유가 전의 배지 1 ℓ 당, 100 g 이하인, [1] 또는 [2] 에 기재된 바실루스속 세균의 배양 방법.
[4] 상기 유가 배지의 공급을, 바실루스속 세균의 산소 소비 속도가 최대가 되는 시점의 전후 7 시간 사이에서 실시하는, [1] ∼ [3] 중 어느 하나에 기재된 바실루스속 세균의 배양 방법.
[5] 상기 유가 배지의 공급을, 배양 개시 후 3 시간 ∼ 30 시간 사이에서 실시하는, [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 바실루스속 세균의 배양 방법.
[6] 상기 유가 배지는 당 또는 당원 원료 및 함질소 화합물을 함유하는 용액을 가열 멸균하여 얻어진 것인, [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 바실루스속 세균의 배양 방법.
[7] 당 또는 당원 원료가 비환원당인, [1] ∼ [6] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[8] 비환원당이, 수크로오스, 트레할로오스, 케스토오스, 멜레치토오스, 겐티아노오스, 네오바이퍼코스, 풍기테트라오스, 플란테오스, 라피노오스, 스타키오스 및 바이퍼코스로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, [7] 에 기재된 바실루스속 세균의 배양 방법.
[9] 함질소 화합물이, 암모늄염, 암모니아로 이루어지는 무기 질소 화합물군 및, 아미노산, 펩티드, 단백질, 우레아, 탈지 대두분, 대두 유래 성분, 효모 유래 성분, 콘 침지액, 콘 침지액 건조 분말, 콘 유래 성분, 동식물 단백질 또는 그 분해물로 이루어지는 유기 질소 화합물 군에서 적어도 1 종 선택되는, [1] ∼ [8] 중 어느 하나에 기재된 바실루스속 세균의 배양 방법.
[10] 액체 배지의 용존 산소 농도를 10 ％ 이상으로 유지하는 것을 특징으로 하는, [1] ∼ [9] 중 어느 하나에 기재된 바실루스속 세균의 배양 방법.
[11] 액체 배지의 온도를 20 ∼ 60 ℃ 의 사이에서 제어하여 바실루스속 세균의 증식을 컨트롤하는, [1] ∼ [10] 중 어느 하나에 기재된 바실루스속 세균의 배양 방법.
[12] 바실루스속 세균의 대수 증식기에 28 ∼ 32 ℃ 에서 배양을 실시하고, 그 후, 35 ∼ 39 ℃ 에서 배양을 실시하는, [11] 에 기재된 바실루스속 세균의 배양 방법.
[13] 바실루스속 세균이 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스·아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스·푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실루스·심플렉스 (Bacillus simplex), 바실루스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실루스 라테로스포러스 (Bacillus laterosporus), 바실루스 알베이 (Bacillus alvei), 바실루스·포필리에 (Bacillus popilliae), 바실루스·리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스·브레비스 (Bacillus brevis), 바실루스·스테아로서모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 바실루스·알카로필러스 (Bacillus alcalophilus), 바실루스·코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실루스·서큘란스 (Bacillus circulans), 바실루스·시아멘시스 (Bacillus siamensis), 바실루스 로터스 (Bacillus lautus), 바실루스 클라우지 (Bacillus clausii), 바실루스·메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실루스·투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis), 바실루스·세레우스 (Bacillus cereus), 바실루스·피르무스 (Bacillus firmus), 바실루스·벨러젠시스 (Bacillus velezensis), 바실루스·피치노티 (Bacillus pichinotyi), 바실루스·아시도칼다리우스 (Bacillus acidocaldarius), 바실루스·알칼리콜라 (Bacillus alkalicola), 바실루스·아조토포르만스 (Bacillus azotoformans), 바실루스·안트라시스 (Bacillus anthracis), 바실루스·바디우스 (Bacillus badius), 바실루스·바타비엔시스 (Bacillus bataviensis), 바실루스·시클로헵타니쿠스 (Bacillus cycloheptanicus), 바실루스·아네우리닐리티커스 (Bacillus aneurinilyticus), 바실루스·미굴라너스 (Bacillus migulanus), 바실루스·아비살리스 (Bacillus abyssalis), 바실루스·에스투아리 (Bacillus aestuarii), 바실루스·폴리믹사 (Bacillus polymyxa), 또는 바실루스·에스피 (Bacillus sp.) 로 이루어지는 군에서 선택되는, [1] ∼ [12] 중 어느 하나에 기재된 바실루스속 세균의 배양 방법.
[14] [1] ∼ [13] 어느 한 항에 기재된 배양 방법을 이용하여, 상기 액체 배지 중에 유용 물질을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 유용 물질의 제조 방법.
[15] 상기 유용 물질이 바실루스속 세균의 아포인, [14] 에 기재된 유용 물질의 제조 방법.
[16] 상기 유용 물질이 바실루스속 세균의 대사물인, [14] 에 기재된 유용 물질의 제조 방법.
[17] 상기 대사물이 고리형 리포펩티드인, [16] 에 기재된 유용 물질의 제조 방법.
[18] 상기 고리형 리포펩티드가, 이투린, 서펙틴, 플리파스타틴, 펜기신, 바실로마이신, 리체니신, 커스타킨, 마이코서브틸린, 콜리스틴, 푸자리시딘, 파에니박테린, 폴리믹신 및 푸밀라시딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, [17] 에 기재된 유용 물질의 제조 방법.
본 발명에 의하면, 바실루스속 세균을 고농도로 증식시켜, 높은 비율로 아포나 대사물 등의 유용 물질을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 바실루스속 세균의 배양 방법은, 배양 개시시의 당 또는 당원 원료의 농도가 50.1 g/ℓ ∼ 100 g/ℓ 인 액체 배지에서 바실루스속 세균을 배양하고, 배양 도중에, 당 또는 당원 원료 및 함질소 화합물을 함유하고, 탄소 원자와 질소 원자의 중량비 (C/N 비) 가 5.5 ∼ 13.5 인 유가 배지를 상기 액체 배지에 공급하여 배양하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바실루스속 세균의 배양 방법을 이용함으로써, 액체 배지 중에 높은 비율로 아포나 대사물 등의 유용 물질을 생성시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 바실루스속 세균으로는 바실루스속으로 분류되는 세균이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스·아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스·푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실루스·심플렉스 (Bacillus simplex), 바실루스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실루스 라테로스포러스 (Bacillus laterosporus), 바실루스 알베이 (Bacillus alvei), 바실루스·포필리에 (Bacillus popilliae), 바실루스·리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스·브레비스 (Bacillus brevis), 바실루스·스테아로서모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 바실루스·알카로필러스 (Bacillus alcalophilus), 바실루스·코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실루스·서큘란스 (Bacillus circulans), 바실루스·시아멘시스 (Bacillus siamensis), 바실루스 로터스 (Bacillus lautus), 바실루스 클라우지 (Bacillus clausii), 바실루스·메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실루스·투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis), 바실루스·세레우스 (Bacillus cereus), 바실루스·피르무스 (Bacillus firmus), 바실루스·벨러젠시스 (Bacillus velezensis), 바실루스·피치노티 (Bacillus pichinotyi), 바실루스·아시도칼다리우스 (Bacillus acidocaldarius), 바실루스·알칼리콜라 (Bacillus alkalicola), 바실루스·아조토포르만스 (Bacillus azotoformans), 바실루스·안트라시스 (Bacillus anthracis), 바실루스·바디우스 (Bacillus badius), 바실루스·바타비엔시스 (Bacillus bataviensis), 바실루스·시클로헵타니쿠스 (Bacillus cycloheptanicus), 바실루스·아네우리닐리티커스 (Bacillus aneurinilyticus), 바실루스·미굴라너스 (Bacillus migulanus), 바실루스·아비살리스 (Bacillus abyssalis), 바실루스·에스투아리 (Bacillus aestuarii), 바실루스·폴리믹사 (Bacillus polymyxa), 또는 바실루스·에스피 (Bacillus sp.) 를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 유용 물질이란, 동식물 생육 촉진 작용, 살균·정균 작용, 유전자 활성화 작용 등의 생리 활성을 나타내는 물질, 각종 효소, 락트산, 아미노산 등 산업상 활용할 수 있는 물질, 낫토나 요구르트 등 식품 등으로서 사용되는 발효물 그 자체를 의미하고, 구체적으로는, 바실루스속 세균의 아포나, 바실루스속 세균의 대사물을 들 수 있다. 바실루스속 세균의 대사물은, 배양에 의해 생산되는 생균 이외의 유효 성분으로, 항균성이나 계면 활성 작용을 갖는 고리형 펩티드나, 프로테아제, 리파아제와 같은 효소를 들 수 있다.
바실루스속 세균의 대사물인 고리형 리포펩티드로는, 이투린, 서펙틴, 플리파스타틴, 펜기신, 바실로마이신, 리체니신, 커스타킨, 마이코서브틸린, 콜리스틴, 푸자리시딘, 파에니박테린, 폴리믹신 및 푸밀라시딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.
바실루스속 세균의 배양에 사용되는 배지는 적어도 탄소원과 질소원을 함유한다.
배양에 사용하는 탄소원은 바실루스속 세균이 이화 (異化) 할 수 있는 것을 사용할 수 있지만, 이화 가능한 탄소원으로서, 바실루스속 세균이 이화할 수 있는 당 (글루코오스, 락토오스, 글리세롤, 아라비노오스, 리보오스, 자일로오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 만노오스, 이노시톨, 만니톨, 소르비톨, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 셀로비오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 자일리톨 등) 혹은 당원 원료가 예시된다. 당원 원료란, 바실루스속 세균을 함유하는 많은 미생물이 생산하는 아밀라아제나 셀룰라아제 등의 효소에 의해 상기 서술한 이화할 수 있는 당을 유리 (遊離) 하는 기질로서, 전분, 셀룰로오스, 펙틴, 키틴 등의 다당 및 볏짚, 밀짚, 왕겨, 식품 폐기물, 건설 발생 목재, 제재 공장 잔재 등의 바이오매스를 예로 하는 원료를 가리킨다. 이 중에서는, 비환원당이 바람직하고, 구체적으로는, 수크로오스, 트레할로오스, 케스토오스, 멜레치토오스, 겐티아노오스, 네오바이퍼코스, 풍기테트라오스, 플란테오스, 라피노오스, 스타키오스 및 바이퍼코스로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 비환원당이 예시된다.
배양에 사용하는 질소원은 바실루스속 세균이 이화할 수 있는 것을 사용할 수 있지만, 이화 가능한 질소원으로서, 아미노산, 펩티드, 동식물 단백질 및 그 분해물, 우레아, 탈지 대두분 등의 대두 유래 성분, 효모 유래 성분, 콘 침지액, 콘 침지액 건조 분말, 콘 유래 성분, 질산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 아세트산암모늄 등의 암모늄염, 암모니아, 질산나트륨, 질산칼륨, 글루타민산나트륨, 우레아 등의 함질소 화합물이 예시된다.
그 밖의 배지 성분으로는, 아포 형성이나 대사물 등의 유용 물질의 생산에 악영향을 미치지 않는 한, 바실루스속 세균의 배양에 통상적으로 사용되는 미량 금속염 등의 배지 성분을 첨가해도 되고, 추가로, 필요에 따라, 아미노산 또는 비타민 등을 첨가할 수 있다.
배양 개시시의 배지에 함유되는 당 또는 당원 원료의 양은 50.1 ∼ 100 g/ℓ 이다. 바실루스속 세균의 배양에 있어서, 당 또는 당원 원료를 이와 같은 높은 농도로 함유하는 배지에서 배양함으로써, 배양 초기에 증식이 보다 활발한 바실루스속 세균을 얻을 수 있는 한편, 이들 당 또는 당원 원료는 증식시에 효율적으로 소비되기 때문에, 배양 후기에는 잔존되지 않고, 효율적으로 아포 형성이나 대사물 등의 유용 물질의 생산을 유도할 수 있다. 또한, 50.1 g/ℓ 미만의 농도의 배지에서 배양하면, 조기에 당원이 다 소비되어, 충분한 증식이 얻어지기 전에 아포화가 진행된다. 또 100 g/ℓ 보다 고농도의 배지에서 배양하면 생육이나 아포 형성에 대해 저해적으로 작용하기 때문에, 상기의 범위 내의 당 또는 당원 원료를 함유한 배지 조성으로 배양하는 것이 필요하다.
배양 개시시의 배지에 함질소 화합물의 양은 바람직하게는 8 ∼ 72 g/ℓ 이고, 배양 개시시의 배지의 C/N 비는 바람직하게는 5.5 ∼ 13.5 이다.
배양 도중에 공급되는 유가 배지도 상기의 당 또는 당원 원료 및 함질소 화합물을 함유하는 배지를 사용할 수 있지만, 본 발명에 있어서는 유가 배지 중의 탄소 원자와 질소 원자의 중량비 (C/N 비) 가 5.5 ∼ 13.5, 바람직하게는 5.5 ∼ 12 가 되도록 조정된다. 이 범위에 C/N 비를 조정함으로써, 세균의 생육을 저해하지 않고 고농도의 아포 생산이나 대사물 등의 유용 물질의 생산을 실현할 수 있다. 한편, 당 또는 당원 원료의 비율이 높은 (C/N 비가 13.5 를 초과하는) 배지에서 배양한 경우, 배양 종기에 배지 중에 당 또는 당원 원료가 잔존된다. 이 잔존당은 바실루스속 세균 생세포의 아포화를 저해하는 것을 알 수 있다. 또, 질소원 화합물의 비율이 높은 (C/N 비가 5.5 미만인) 배지에서 배양한 경우, 생육에 필요한 탄소원이 부족하여 증식에 불리하다.
또한, C/N 비는 이하와 같이 산출된다.
C/N 비 ＝ 각 배지 성분에 함유되는 탄소 함량의 합계 ÷ 각 배지 성분에 함유되는 질소 함량의 합계.
배지 성분 중 천연계 원료의 탄소 함량은, 각각 전체 당량의 40 ％ 중량 및 전체 단백질량의 50 ％ 중량으로 하여 개산할 수 있다. 전체 당량은, 산 중에서 100 ℃, 2.5 시간 가수 분해 후, 소모기법으로 환원당 농도로서 정량할 수 있다. 전체 단백질량은 먼저 크옐달법에 의한 전체 질소량의 정량 후, 환산 계수 6.25 를 곱함으로써 개산할 수 있다.
배양 종료시까지 유가되는 배지의 양은 특별히 제한되지 않지만, 유가 배지에 의해 공급되는 당 또는 당원 원료의 총량이, 유가 전의 배지 1 ℓ 당, 100 g 이하가 되도록 하는 것이 바람직하다.
유가 배지는 비환원당 또는 비환원당을 함유하는 당원 원료 및 함질소 화합물을 함유하는 용액을 가열 멸균하여 얻어진 것인 것이 바람직하다.
배지 성분에 대해서는 통상적으로, 배양 개시 전에 오토클레이브 등의 가열 멸균 처리를 실시하는데, 환원성을 갖는 당과 질소원이 공존하는 조건에서 오토클레이브를 실시하면 그것들이 기질이 되어 메일라드 반응을 일으키고, 생육에 필요한 영양 성분이 다른 화합물로 변환되어, 본래의 영양원으로서의 기능을 잃는다. 이로써, 바실루스속 세균은 효율적인 증식이 곤란해져, 충분한 균체나 대사물 등의 유용 물질이 얻어지 않게 된다. 그 때문에, 당원과 질소원은 따로 따로 가열 멸균을 실시하여, 충분히 냉각된 후에 양자를 혼합하고, 배양에 제공하는 방법이 일반적이다. 이 혼합 공정에서는, 멸균 상태가 유지된 계를 개방하는 점에서, 컨태미네이션의 리스크가 향상되고, 또 필요한 설비나 작업 공정도 증가한다.
이에 반하여, 본 발명의 방법에서는, 수크로오스 등의 비환원당을 사용함으로써, 탄소원과 질소원을 동시에 가열 멸균해도 메일라드 반응 등을 일으키지 않기 때문에, 배지의 조제가 용이하다.
유가 배지의 공급은, 1 회만의 공급이어도 되고, 복수 회, 예를 들어, 2 ∼ 6 회에 걸쳐 단속적으로 공급해도 되지만, 영양원의 소비 속도에 맞춰 연속적으로 유가 배지의 공급을 실시하는 것이 바람직하다.
유가 배지의 공급은, 바실루스속 세균의 증식이 활발하고 산소나 영양원의 소비가 보다 활발한 시점에 실시하는 것이 바람직하다. 배양 초기에 첨가를 시작하면 영양 농도가 높아져, 증식이 활발해져 급격하게 산소가 소비되어 산소 공급이 불충분해지거나 삼투압 효과에 의해 생육 불량을 일으킨다. 또, 증식이 활발한 시기를 지난 후에 유가를 실시하여 충분한 아포나 대사물 등의 유용 물질을 얻고자 한 경우, 보다 긴 배양 시간을 요한다. 일반적으로 아포는 영양이 부족 상태가 되면 형성되기 때문에, 유가를 배양 후기까지 계속하면 배지 중에 배양 기질이 다량으로 잔존하게 되어, 아포가 형성되지 않는다. 따라서, 예를 들어, 유가 배지의 투여를, 미생물의 산소 소비 속도가 최대가 되는 시점 (예를 들어, 배양 개시 8 시간 경과 시점) 의 전후 7 시간 사이에서 실시하는 것이 바람직하고, 배양 개시 후 3 시간 ∼ 30 시간 사이에서 실시하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 배양 개시 후 5 ∼ 20 시간에서 유가 배지의 투여를 개시하고, 배양 개시 후 13 ∼ 25 시간 사이에서 유가 배지의 투여를 종료한다. 또한, 토탈의 배양 시간으로는 예를 들어 24 ∼ 48 시간이다.
또한 배양액 중의 용존 산소 농도는, 격막 갈바니 전극식 센서 등에 의해, 리얼 타임으로 모니터링을 할 수 있다.
배양 조건으로는, 통상적인 바실루스속 세균의 액체 배양에 사용되는 조건이면되는데, 예를 들어, 20 ∼ 60 ℃, 바람직하게는 20 ∼ 40 ℃ 로 제어하고, 바실루스속 세균의 증식을 컨트롤하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 대수 증식기에 28 ∼ 32 ℃, 바람직하게는 30 ℃ ± 1 ℃ 에서 배양하여 바실루스속 세균의 증식과 당 또는 당원 원료의 소비를 컨트롤하고, 그 후, 35 ∼ 39 ℃, 바람직하게는 37 ℃ ± 1 ℃ 에서 배양함으로써, 보다 효율이 좋은 아포 형성을 실현할 수 있다.
또한 배양은 호기 조건 (예를 들어, 산소 농도 10 ％ 이상, 바람직하게는 15 ∼ 50 ％) 에서 교반하면서 실시하는 것이 바람직하고, 배지의 pH 는 6.5 ∼ 8.5 가 바람직하고, 7.0 ∼ 8.0 이 보다 바람직하다.
또한, 상기 당 또는 당원 원료의 농도가 50.1 g/ℓ ∼ 100 g/ℓ 인 액체 배지에서 배양하기 전에, 전배양을 실시해도 된다.
이와 같이 하여, 높은 아포화율 (예를 들어, 50 ％ 이상, 바람직하게는 80 ％ 이상) 의 바실루스속 세균의 균체나 바실루스속 세균의 대사물이 얻어진다. 이와 같은 높은 아포화율의 바실루스속 세균의 균체나 바실루스속 세균의 대사물은, 적절히 배지의 농축 또는 제거, 건조 등의 조작을 실시한 후, 원하는 목적으로 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것이 아니다.
실시예, 참고예, 비교예에서 사용한 배지의 조성을 표 1 에 나타낸다. 배지 성분 중 글루코오스 (Glucose), 수크로오스 (Sucrose), CSL 의 탄소 함량은, 각각 전체 당량의 40 ％ 중량 및 전체 단백질량의 50 ％ 중량으로서 산출하였다. 전체 당량은, 산 중에서 100 ℃, 2.5 시간 가수 분해 후, 소모기법으로 환원당 농도로서 정량하였다. 전체 단백질량은 먼저 크옐달법에 의한 전체 질소량의 정량 후, 환산 계수 6.25 를 곱함으로써 산출하였다.
Figure 112019041319282-pct00001
참고예 1. 당원 원료의 비교 (글루코오스 및 수크로오스)
500 ㎖ 용량 삼각 플라스크에 제조한 표 1 의 배지 조건 1 에 기재된 종농도가 되도록, 글루코오스 (와코 순약), CSL (ROQUETTE), MnCl2 (와코 순약), KH2PO4 (와코 순약) 를 함유시킨 배지를 각각 100 ㎖ 씩 제조하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (글루코오스는 별도 멸균 후 무균적으로 혼합하였다). 보통 한천 평판 배지 상에 생육시킨 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis) MBI-600 의 콜로니로부터 1 백금이를 덜어, 표 1 의 배지 조건 1 에 기재된 배지에 무균적으로 직균 (稙菌) 하고, 30 ℃, 150 rpm 으로 하룻밤 진탕 배양을 실시하여, 전배양액을 얻었다.
5 ℓ 용량 배양조를 사용하여, 표 1 의 배지 조건 2 (시험 번호 2) 및 3 (시험 번호 3) 에 기재된 종농도가 되도록 2 ℓ 의 배지를 2 개 제조하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (글루코오스는 별도 멸균 후 무균적으로 혼합하고, 수크로오스 (와코 순약) 는 모든 배지 성분과 미리 혼합하여 멸균하였다).
상기에서 얻어진 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis) MBI-600 의 전배양액으로부터 각각 100 ㎖ 를, 5 ℓ 용량 배양조에 무균적으로 직균하고, 30 ℃, 500 rpm 의 조건에서 배양을 개시하여, 용존 산소 농도가 10 ％ 를 하회하지 않도록 산소 공급량을 조정하였다. 용존 산소 농도란, 단위 체적당 배양액에 용존되어 있는 산소의 양을 백분율로 나타낸 수치로서, 이것을 계측하기 위하여 예를 들어, 탁상형 배양 장치 (MDL-8C) (주식회사 마루비시 바이오엔지사 제조) 등의 기기로 측정할 수 있다.
34 시간 배양 후, 얻어진 배양액에 대해, 멸균수로 희석한 후, 보통 부용 한천 배지 (에이켄 화학 주식회사) 에 도포하여 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 (靜置) 배양하고, 형성된 콜로니 수를 계측하여 균체 수를 측정하였다. 또, 먼저 조제한 희석액을 80 ℃ 에서 30 분 가열한 후에 동일하게 보통 부용 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하고, 형성된 콜로니 수를 계측하여 내열균 수를 측정하고, 이들 결과로부터 아포 형성률을 산출하였다. 그 결과를 표 2 에 나타낸다.
Figure 112019041319282-pct00002
본 배양 시험에 있어서, 탄소원으로서 글루코오스를 사용하고, 질소원과 별도로 멸균한 배지와 탄소원으로서 수크로오스를 사용하여 질소원과 동시에 멸균한 배지에서 바실루스·서브틸리스 MBI-600 (Bacillus subtilis MBI-600) 을 배양했을 때, 내열균 수에 큰 차는 관찰되지 않았다.
실시예 1. 유가 배양법에 의한 배양에서의 균 수의 비교
500 ㎖ 용량 삼각 플라스크에 제조한 표 1 의 배지 조건 1 에 기재된 종농도가 되도록 조정한 배지를 각각 100 ㎖ 씩 제조하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (글루코오스는 별도 멸균 후 무균적으로 혼합하였다). 이것에 대해 보통 한천 평판 배지 상에 생육시킨 바실루스·서브틸리스 MBI-600 (Bacillus subtilis MBI-600) 의 콜로니로부터 1 백금이를 덜어, 무균적으로 직균하고, 30 ℃, 150 rpm 으로 하룻밤 진탕 배양을 실시하여, 전배양액을 얻었다.
5 ℓ 용량 배양조를 사용하여, 표 1 의 배지 조건 3 에 기재된 종농도가 되도록 2 ℓ 의 배지를 2 개 제조하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (모든 배지 성분은 미리 혼합하여 오토클레이브 멸균하였다).
500 ㎖ 용량 듀란병을 사용하여 표 1 의 배지 조건 4 에 기재된 종농도가 되도록 0.4 ℓ 의 배지를 1 개 제조하였다. 이것을 배지 조건 3 의 배지가 들어간 5 ℓ 용량 배양조에 유가할 수 있도록 미리 튜브로 접속하고, 오토클레이브를 실시하였다 (모든 배지 성분은 미리 혼합하여 오토클레이브 멸균하였다).
얻어진 전배양액으로부터 각각 100 ㎖ 를, 상기 2 ℓ 의 배지를 포함하는 5 ℓ 용량 배양조에 무균적으로 직균하고, 37 ℃ 의 조건에서 배양을 개시하였다. 배양 개시로부터 5 시간 후에, 5 ℓ 용량 배양조 중의 일방에 배지 조건 4 의 배지를 2 시간마다 100 ㎖ 씩 4 회에 나누어 첨가하였다. 첨가를 개시하고 나서 배양 온도를 30 ℃ 로 낮춰 배양하였다. 이 때, 배양액 중의 용존 산소 농도가 10 ％ 를 하회하지 않도록 회전 수를 컨트롤하여 산소 공급량을 조정하였다. 산소 소비 속도는 배양 개시 약 8 시간 후에 최대가 되었다. 배양 개시로부터 24 시간 경과 후, 배양 온도를 37 ℃ 로 올려 배양하였다.
34 시간 배양 후, 얻어진 배양액에 대해, 멸균수로 희석한 후, 보통 부용 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하고, 형성된 콜로니 수를 계측하여 균체 수를 측정하였다. 또, 먼저 조제한 희석액을 80 ℃ 에서 30 분 가열한 후에 동일하게 보통 부용 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하고, 형성된 콜로니 수를 계측하여 내열균 수를 측정하고, 이들의 결과로부터 아포 형성률을 산출하였다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다.
Figure 112019041319282-pct00003
본 배양 시험에 있어서, 탄소원으로서 수크로오스를 사용하고, 전체 배지 성분을 동시 멸균한 배지에서 유가 배양한 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis) 의 균 농도는, 유가 배양하지 않은 것에 비하여 대체로 1.5 배의 균 농도의 증가가 관찰되고, 내열 아포도 증가하였다.
실시예 2. 환원당 또는 비환원당을 동시 멸균한 배지를 사용한 배양 시험
500 ㎖ 용량 삼각 플라스크에 표 1 의 배지 조건 1 에 기재된 종농도가 되도록 조정한 배지를 100 ㎖ 씩 제조하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (글루코오스는 별도 멸균 후 무균적으로 혼합하였다). 이것에 대해 보통 한천 평판 배지 상에 생육시킨 바실루스·서브틸리스 MBI-600 (Bacillus subtilis MBI-600) 의 콜로니로부터 1 백금이를 덜어, 무균적으로 직균하고, 30 ℃, 150 rpm 으로 하룻밤 진탕 배양을 실시하여, 전배양액을 얻었다.
5 ℓ 용량 배양조에, 표 1 의 배지 조건 2 및 3 에 기재된 종농도가 되도록 각각 조정한 배지를 2 ℓ 씩 제조하였다 (글루코오스 및 수크로오스는 모든 배지 성분과 미리 혼합하여 멸균하였다).
500 ㎖ 용량 듀란병을 사용하여, 표 1 의 배지 조건 4 및 5 에 기재된 종농도가 되도록 각각 조정한 배지를 0.4 ℓ 씩 제조하였다. 배지 조건 4 의 배지는 배지 조건 2 의 성분이 들어간 5 ℓ 용량 배양조에, 배지 조건 5 의 배지는 배지 조건 3 의 성분이 들어간 5 ℓ 용량 배양조에 유가할 수 있도록 미리 튜브로 접속하고, 오토클레이브를 실시하였다 (글루코오스 및 수크로오스는 모든 배지 성분과 미리 혼합하여 멸균하였다).
얻어진 전배양액으로부터 각각 100 ㎖ 를, 상기 2 ℓ 의 배지를 포함하는 5 ℓ 용량 배양조에 무균적으로 직균하고, 37 ℃ 의 조건에서 배양을 개시하였다. 배양 개시로부터 5 시간 후에, 배지 조건 3 의 배지에는 배지 조건 4 를, 배지 조건 2 의 배지에는 배지 조건 5 의 배지를 2 시간마다 100 ㎖ 씩 4 회에 나누어 첨가하였다. 첨가를 개시하고 나서 배양 온도를 30 ℃ 로 낮춰 배양하였다. 이 때, 배양액 중의 용존 산소 농도가 10 ％ 를 하회하지 않도록 회전 수를 컨트롤하여 산소 공급량을 조정하였다. 유가를 개시했을 때, 배지 조건 2 에서 배양한 배양액의 글루코오스 농도는 40 g/ℓ 를 하회하고 있고, 또 산소 소비 속도는 배양 개시 약 8 시간 후에 최대가 되었다. 배양 개시로부터 24 시간 경과 후, 배양 온도를 37 ℃ 로 올려 배양하였다.
34 시간 배양 후, 얻어진 배양액에 대해, 멸균수로 희석한 후, 보통 부용 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하고, 형성된 콜로니 수를 계측하여 균체 수를 측정하였다. 또, 먼저 조제한 희석액을 80 ℃ 에서 30 분 가열한 후에 동일하게 보통 부용 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하고, 형성된 콜로니 수를 계측하여 내열균 수를 측정하고, 이들의 결과로부터 아포 형성률을 산출하였다. 그 결과를 표 4 에 나타낸다.
Figure 112019041319282-pct00004
본 배양 시험에 있어서, 탄소원으로서 글루코오스를 사용하고, 전체 배지 성분을 동시 멸균한 배지에서 유가 배양한 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis) 의 균 농도는, 탄소원으로서 수크로오스를 사용하여 유가 배양한 것에 비하여 얻어지는 내열 아포균 수는 적었다.
실시예 3. 바실루스·투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis) 의 유가 배양 시험
500 ㎖ 용량 삼각 플라스크에 표 1 의 배지 조건 1 에 기재된 종농도가 되도록 조정한 배지를 100 ㎖ 씩 제조하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (글루코오스는 별도 멸균 후 무균적으로 혼합하였다). 이것에 대해 보통 한천 평판 배지 상에 생육시킨 바실루스·투린기엔시스 NBRC 101235 (Bacillus thuringiensis NBRC 101235) 의 콜로니로부터 1 백금이를 덜어, 무균적으로 직균하고, 30 ℃, 150 rpm 으로 하룻밤 진탕 배양을 실시하여, 전배양액을 얻었다.
5 ℓ 용량 배양조에, 표 1 의 배지 조건 2 에 기재된 종농도가 되도록 조정한 배지를 2 ℓ 씩 합계 3 개 제조하였다 (글루코오스는 별도 멸균 후 무균적으로 혼합하였다).
500 ㎖ 용량 듀란병을 사용하여, 표 1 의 배지 조건 4 및 5 에 기재된 종농도가 되도록 각각 조정한 배지를 0.4 ℓ 씩 제조하였다. 배지 조건 4 및 5 의 배지는 배지 조건 2 의 성분이 들어간 각각의 5 ℓ 용량 배양조에 유가할 수 있도록 미리 튜브로 접속하고, 오토클레이브를 실시하였다 (글루코오스는 별도 멸균 후 무균적으로 혼합하고, 수크로오스는 모든 배지 성분과 미리 혼합하여 멸균하였다). 또, 유가 배양을 실시하지 않는 배지 조건 2 의 배지를 컨트롤로 하였다.
얻어진 전배양액으로부터 각각 100 ㎖ 를, 상기 2 ℓ 의 배지를 포함하는 5 ℓ 용량 배양조에 무균적으로 직균하고, 37 ℃ 의 조건에서 배양을 개시하였다. 배양 개시로부터 6 시간 후에, 5 ℓ 용량 배양조 중의 2 개에 각각 배지 조건 4 또는 배지 조건 5 의 배지를 2 시간마다 100 ㎖ 씩, 4 회에 나누어 각각 첨가하였다. 첨가를 개시하고 나서 배양 온도를 30 ℃ 로 낮춰 배양하였다. 이 때, 배양액 중의 용존 산소 농도가 10 ％ 를 하회하지 않도록 회전 수를 컨트롤하여 산소 공급량을 조정함과 함께, 각각의 발효조에 10 ％ 염산 수용액 및 2 M 수산화나트륨 용액을 첨가하여 배양 중의 배양액의 pH 가 6.7 ∼ 7.3 이 되도록 조절하였다. 유가를 개시했을 때, 배지 조건 2 에서 배양한 배양액의 글루코오스 농도는 40 g/ℓ 를 하회하고 있고, 또 산소 소비 속도는 배양 개시 약 8 시간 후에 최대가 되었다. 배양 개시로부터 24 시간 경과 후, 배양 온도를 37 ℃ 로 올려 배양하였다.
34 시간 배양 후, 얻어진 배양액에 대해, 멸균수로 희석한 후, 보통 부용 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하고, 형성된 콜로니 수를 계측하여 균체 수를 측정하였다. 또, 먼저 조제한 희석액을 80 ℃ 에서 30 분 가열한 후에 동일하게 보통 부용 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하고, 형성된 콜로니 수를 계측하여 내열균 수를 측정하고, 이들의 결과로부터 아포 형성률을 산출하였다. 그 결과를 표 5 에 나타낸다.
Figure 112019041319282-pct00005
본 배양 시험에 있어서, 바실루스·튜링겐시스 (Bacillus thuringiensis) 에 대해 유가 배양을 실시함으로써, 유가를 실시하지 않은 조건에 비하여 많은 내열 아포가 얻어졌다. 또, 환원당인 글루코오스보다 비환원당인 수크로오스를 함유하는 배지를 유가한 편이 보다 많은 내열 아포가 얻어졌다.
비교예 1. 탄소원만의 유가 배양
500 ㎖ 용량 삼각 플라스크에 제조한 표 1 의 배지 조건 1 에 기재된 종농도가 되도록 조정한 배지를 각각 100 ㎖ 씩 제조하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (글루코오스는 별도 멸균 후 무균적으로 혼합하였다). 이것에 대해 보통 한천 평판 배지 상에 생육시킨 바실루스·서브틸리스 MBI-600 (Bacillus subtilis MBI-600) 의 콜로니로부터 1 백금이를 덜어, 무균적으로 직균하고, 30 ℃, 150 rpm 으로 하룻밤 진탕 배양을 실시하여, 전배양액을 얻었다.
5 ℓ 용량 배양조를 사용하여, 표 1 의 배지 조건 2 에 기재된 종농도가 되도록 2 ℓ 의 배지를 제조하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (글루코오스는 별도 멸균 후 무균적으로 혼합하였다).
500 ㎖ 용량 듀란병을 사용하여 글루코오스를 125 g/ℓ의 종농도가 되도록 0.4 ℓ 의 배지를 1 개 제조하였다. 이것을 배지 조건 2 의 배지가 들어간 5 ℓ 용량 배양조에 유가할 수 있도록 미리 튜브로 접속하고, 오토클레이브를 실시하였다 (글루코오스는 별도 멸균 후 무균적으로 혼합하였다).
얻어진 전배양액 100 ㎖ 를, 상기 배지에 무균적으로 직균하고, 37 ℃ 의 조건에서 배양을 개시하였다. 배양 개시로부터 5 시간 후에 글루코오스 용액을 2 시간마다 100 ㎖ 씩 4 회에 나누어 첨가하였다. 첨가를 개시하고 나서 배양 온도를 30 ℃ 로 낮춰 배양하였다. 이 때, 배양액 중의 용존 산소 농도가 10 ％ 를 하회하지 않도록 회전 수를 컨트롤하여 산소 공급량을 조정하였다. 유가를 개시했을 때, 배지 조건 2 에서 배양한 배양액의 글루코오스 농도는 40 g/ℓ 를 하회하고 있고, 또 산소 소비 속도는 배양 개시 약 8 시간 후에 최대가 되었다. 배양 개시로부터 24 시간 경과 후, 배양 온도를 37 ℃ 로 올려 배양하였다.
34 시간 배양 후, 얻어진 배양액에 대해, 멸균수로 희석한 후, 보통 부용 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하고, 형성된 콜로니 수를 계측하여 균체 수를 측정하였다. 또, 먼저 조제한 희석액을 80 ℃ 에서 30 분 가열한 후에 동일하게 보통 부용 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하고, 형성된 콜로니 수를 계측하여 내열균 수를 측정하고, 이들의 결과로부터 아포 형성률을 산출하였다. 그 결과를 표 6 에 나타낸다.
Figure 112019041319282-pct00006
본 배양 시험에 있어서, 탄소원인 글루코오스만을 유가한 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis) 의 균 농도는, 탄소원과 질소원을 동시에 함유하는 배지를 사용하여 유가 배양했을 때 (표 4 의 2 ＋ 5) 에 비하여, 얻어지는 아포 농도가 낮아지는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. 유가 배양법에 의한 배양에서의 이투린량의 비교
500 ㎖ 용량 삼각 플라스크에 제조한 표 1 의 배지 조건 1 에 기재된 종농도가 되도록 조정한 배지를 각각 100 ㎖ 씩 제조하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (글루코오스는 별도 멸균 후 무균적으로 혼합하였다). 이것에 대해 보통 한천 평판 배지 상에 생육시킨 바실루스·서브틸리스 MBI-600 (Bacillus subtilis MBI-600) 의 콜로니로부터 1 백금이를 덜어, 무균적으로 직균하고, 30 ℃, 150 rpm 으로 하룻밤 진탕 배양을 실시하여, 전배양액을 얻었다.
5 ℓ 용량 배양조를 사용하여, 표 1 의 배지 조건 2 에 기재된 종농도가 되도록 2 ℓ 의 배지를 2 개 제조하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (모든 배지 성분은 미리 혼합하여 오토클레이브 멸균하였다).
500 ㎖ 용량 듀란병을 사용하여 표 1 의 배지 조건 4 에 기재된 종농도가 되도록 0.4 ℓ 의 배지를 1 개 제조하였다. 이것을 배지 조건 2 의 배지가 들어간 5 ℓ 용량 배양조에 유가할 수 있도록 미리 튜브로 접속하고, 오토클레이브를 실시하였다 (모든 배지 성분은 미리 혼합하여 오토클레이브 멸균하였다).
얻어진 전배양액으로부터 각각 100 ㎖ 를, 상기 배지 조건 2 의 배지 2 ℓ 를 포함하는 5 ℓ 용량 배양조에 무균적으로 직균하고, 30 ℃ 의 조건에서 배양을 개시하였다. 배양 개시로부터 5 시간 후에, 5 ℓ 용량 배양조 중의 일방에 배지 조건 4 의 배지를 2 시간마다 100 ㎖ 씩 4 회에 나누어 첨가하고, 배양을 계속하였다. 이 때, 배양액 중의 용존 산소 농도가 10 ％ 를 하회하지 않도록 회전 수를 컨트롤하여 산소 공급량을 조정하였다. 산소 소비 속도는 배양 개시 약 12 시간 후에 최대가 되었다.
54 시간 배양 후, 얻어진 배양액에 대해, 멸균수로 희석한 후, 보통 부용 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하고, 형성된 콜로니 수를 계측하여 균체 수를 측정하였다. 또, 먼저 조제한 희석액을 80 ℃ 에서 30 분 가열한 후에 동일하게 보통 부용 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양하고, 형성된 콜로니 수를 계측하여 내열균 수를 측정하고, 이들의 결과로부터 아포 형성률을 산출하였다. 그 결과를 표 7 에 나타낸다.
또 얻어진 배양액에 대해, 냉각 원심기 (주식회사 토미 정공 MX-307) 를 사용하여, 10,000 rpm, 20 ℃, 30 분 원심 분리를 실시하여, 상청을 회수하였다.
고상 추출 칼럼 (니혼 워터스 주식회사 Oasis HLB 3 cc (400 ㎎) LP Extraction Cartridge) 에 0.1 ％ TFA 함유 아세토니트릴 6 ㎖ 를 첨가하여 통과시킨 후, 0.1 ％ TFA 함유 증류수 6 ㎖ 를 첨가하여 통과시켰다. 회수한 배양액 원심 상청액 2 ㎖ 를 첨가하여 통과시키고, 0.1 ％ TFA 함유 증류수 6 ㎖, 0.1 ％ TFA 함유 아세토니트릴/증류수 (20 : 80, v/v) 6 ㎖ 를 순차 통과시켜 세정하였다. 다음으로 0.1 ％ TFA 함유 아세토니트릴/증류수 (90 : 10, v/v) 5 ㎖ 를 통과시키고, 용출액을 회수하였다. 회수액이 5 ㎖ 가 되도록 0.1 ％ TFA 함유 아세토니트릴/증류수 (90 : 10, v/v) 를 첨가하고, 이하의 조건에서 HPLC 분석을 실시하였다.
HPLC : 애질런트·테크놀로지 주식회사 1260 Infinity
칼럼 : 니혼 워터스 주식회사 XBridge C18 5 ㎛ 4.6 × 250 ㎜
이동상 : A : 0.1 ％ TFA 함유 증류수, B : 0.1 ％ TFA 함유 아세토니트릴
0 ∼ 3 분 A 80 ％/B 20 ％
3 ∼ 12 분 A 80 ％/B 20 ％ → B 100 ％
12 ∼ 23 분 B 100 ％
23 ∼ 27 분 B 100 ％ → A 80 ％/B 20 ％
27 ∼ 30 분 A 80 ％/B 20 ％
유량 : 1 ㎖/분
온도 : 40 ℃
검출 : UV 205 ㎚
주입량 : 10 ㎕
표품 : Iturin A from Bacillus subtilis (Merck)
농도 : 30 ppm, 120 ppm
용매 : 0.1 ％ TFA 함유 아세토니트릴/증류수 (90 : 10, v/v)
용출 시간 12.1 분 및 12.7 분에 검출된 피크 면적에 대해, 표품과의 비교로부터, 배양액 중의 이투린 농도를 산출하였다.
결과를 표 7 에 나타낸다.
Figure 112019041319282-pct00007
본 배양 시험에 있어서, 유가 배양한 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis) 의 균 농도는, 유가 배양하지 않은 것에 비하여 균 농도는 대체로 1.8 배, 이투린 농도는 대체로 2.1 배로의 증가가 관찰되고, 내열 아포도 증가하였다.

Claims (18)

  1. 배양 개시시의 당의 농도가 50.1 g/ℓ ∼ 100 g/ℓ 인 액체 배지에서 바실루스속 세균을 배양하고, 배양 도중에, 당 및 함질소 화합물을 함유하고, 탄소 원자와 질소 원자의 중량비 (C/N 비) 가 5.5 ∼ 13.5 인 유가 배지를 상기 액체 배지에 공급하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 바실루스속 세균의 아포, 고리형 리포펩티드 또는 이들 모두를 얻기 위한 바실루스속 세균의 배양 방법으로서,
    배양 종료시까지, 유가 전의 배지 1 ℓ 당, 총량으로, 100 g 이하의 당이 상기 유가 배지에 의해 공급되고,
    상기 당이 글루코오스 및 수크로오스로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종이며,
    상기 함질소 화합물이 콘 침지액 및 콘 침지액 건조 분말로 이루어지는 유기 질소 화합물 군에서 선택되는 적어도 1 종이고,
    바실루스속 세균이 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스·아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스·푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실루스·심플렉스 (Bacillus simplex), 바실루스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실루스 라테로스포러스 (Bacillus laterosporus), 바실루스 알베이 (Bacillus alvei), 바실루스·포필리에 (Bacillus popilliae), 바실루스·리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스·브레비스 (Bacillus brevis), 바실루스·스테아로서모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 바실루스·알카로필러스 (Bacillus alcalophilus), 바실루스·코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실루스·서큘란스 (Bacillus circulans), 바실루스·시아멘시스 (Bacillus siamensis), 바실루스 로터스 (Bacillus lautus), 바실루스 클라우지 (Bacillus clausii), 바실루스·투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis), 바실루스·세레우스 (Bacillus cereus), 바실루스·피르무스 (Bacillus firmus), 바실루스·벨러젠시스 (Bacillus velezensis), 바실루스·피치노티 (Bacillus pichinotyi), 바실루스·아시도칼다리우스 (Bacillus acidocaldarius), 바실루스·알칼리콜라 (Bacillus alkalicola), 바실루스·아조토포르만스 (Bacillus azotoformans), 바실루스·안트라시스 (Bacillus anthracis), 바실루스·바디우스 (Bacillus badius), 바실루스·바타비엔시스 (Bacillus bataviensis), 바실루스·시클로헵타니쿠스 (Bacillus cycloheptanicus), 바실루스·아네우리닐리티커스 (Bacillus aneurinilyticus), 바실루스·미굴라너스 (Bacillus migulanus), 바실루스·아비살리스 (Bacillus abyssalis), 바실루스·에스투아리 (Bacillus aestuarii) 및 바실루스·폴리믹사 (Bacillus polymyxa) 로 이루어지는 군에서 선택되는, 바실루스속 세균의 배양 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    탄소 원자와 질소 원자의 중량비 (C/N 비) 가 5.5 ∼ 12 인 유가 배지를 상기 액체 배지에 공급하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 바실루스속 세균의 배양 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 유가 배지의 공급을, 바실루스속 세균의 산소 소비 속도가 최대가 되는 시점의 전후 7 시간 사이에서 실시하는, 바실루스속 세균의 배양 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 유가 배지의 공급을, 배양 개시 후 3 시간 ∼ 30 시간 사이에서 실시하는, 바실루스속 세균의 배양 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 유가 배지는 당 및 함질소 화합물을 함유하는 용액을 가열 멸균하여 얻어진 것인, 바실루스속 세균의 배양 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    액체 배지의 용존 산소 농도를 10 ％ 이상으로 유지하는 것을 특징으로 하는, 바실루스속 세균의 배양 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    액체 배지의 온도를 20 ∼ 60 ℃ 의 사이에서 제어하여 바실루스속 세균의 증식을 컨트롤하는, 바실루스속 세균의 배양 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    바실루스속 세균의 대수 증식기에 28 ∼ 32 ℃ 에서 배양을 실시하고, 그 후, 35 ∼ 39 ℃ 에서 배양을 실시하는, 바실루스속 세균의 배양 방법.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 배양 방법을 이용하여, 상기 액체 배지 중에 바실러스속 세균의 아포 및 고리형 리포펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 유용 물질을 생성시키는 것을 특징으로 하는,
    바실러스속 세균의 아포 및 고리형 리포펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 유용 물질의 제조 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 12 항에 있어서,
    상기 고리형 리포펩티드가, 이투린, 서펙틴, 플리파스타틴, 펜기신, 바실로마이신, 리체니신, 커스타킨, 마이코서브틸린, 콜리스틴, 푸자리시딘, 파에니박테린, 폴리믹신 및 푸밀라시딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 유용 물질의 제조 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
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