CN103492560A - 逆向β氧化途径 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用已赋予形成逆向β氧化途径的新用途的基因进行工程化以产生各种化学品的重组微生物。一般而言，通过修饰所需许多循环的各种调节点逆向表达和驱动β氧化循环，然后通过终止酶的作用来将CoA硫酯中间体转化成有用产物。

Description

逆向β氧化途径
在先相关申请
本申请要求2011年2月7日提交的61/440,192的优先权，其通过引用方式全部并入本文中。
联邦政府赞助研究声明
本发明是在国家科学基金会（National Science Foundation）授予的CBET-1134541和CBET-1067565的政府赞助下进行。政府对本发明具有某些权力。
技术领域
本发明涉及使用已赋予形成逆向β氧化途径的新用途的基因进行工程化以产生醇类、羧酸类、烷烃类或烯烃类的重组微生物。
一般而言，逆向驱动所需许多循环的β氧化循环，然后通过不同类型的终止酶的作用能够将CoA硫酯中间体转化成有用产物：i)硫酯酶、或酰基-CoA:乙酰基-CoA转移酶、或磷酸转酰基酶和羧酸酯激酶（其形成羧酸类）或者ii)形成醇的辅酶-A硫酯还原酶（其制备醇类）或者iii)形成醛的CoA硫酯还原酶和醇脱氢酶（其一起形成醇类）或者iv)形成醛的CoA硫酯还原酶和醛脱羰基酶（其一起形成烷烃类或端烯烃类）或者v)形成链烯烃的酶（例如OleA、OleB、OleC、OleD，其一起形成内烯烃类或端烯烃类或三烯类或者烯醇类）。
羧酸类包括不同链长的单羧酸类、β-酮酸类、β-羟基酸类和反式-Δ2-脂肪酸。醇类包括不同链长的正醇类、β-酮醇类、1,3-二醇类和反式-Δ2-醇类。烷烃类包括不同链长的脂肪族烷烃类。脂肪族烯烃类（也称为链烯烃类）包括端链烯烃类、内链烯烃类、三烯类和烯醇类。
背景技术
近年来，对诸如乙醇的可再生燃料的生物制备进行了许多尝试。然而，乙醇并不是理想的燃料，有许多问题，例如高吸湿性、高蒸汽压和低能量密度。这些质量问题使得乙醇不能与液体运输燃料的储存、分配和使用中所使用的现有设施相容。
较长链(C≥4)醇类（例如正丁醇）、脂肪酸甲酯(FAME)和烃类（烷烃类和烯烃类）提供较乙醇多种优势，包括吸湿性降低、挥发性降低和更高的能量密度。这些质量优势使得正丁醇和其它高级醇类与目前储存、分配和使用的基础设施更加相容。
上述长链染料和化学品由短链代谢中间体通过需要延长碳链的途径来生成。然而，迄今为止生物上的成就并不令人满意，特别是引入非天然基因来驱动较长链分子的合成。
因此，本领域需要更好的制备较长链(C≥4)燃料（例如醇类、脂肪酸甲酯、FAME和烃类）的生物方法，它比目前可获得的方法更加有效和实惠。理想的方法也可生产能够用作其它工业的原料的化学品，例如羧酸类和醇类。
发明内容
我们已经开发出以产生诸如醇类、羧酸类、烷烃类和烯烃类的化学品的工程化微生物的替代途径，其将β-氧化循环的功能性逆转用作合成具有各种链长度和官能度的醇类和羧酸类的代谢平台(图1A)。
该途径使用辅酶-A(CoA)硫酯中间体操作以及直接使用酰基链延长的乙酰基-CoA（而不是首先需要对丙二酰基-CoA进行ATP-依赖性激活），其特征在于能够在最大碳和能量效率下合成产物。在大肠杆菌中工程化β-氧化循环的逆转以及联合内源性脱氢酶和硫酯酶使用以合成正醇类、脂肪酸和3-羟基-、3-酮基-和反式-Δ2-羧酸类。
通过在比之前所报道的更高效率下产生更长链的直链正醇类(C≥4)和细胞外长链脂肪酸(C>10)来证实工程化途径的更优的性质。β-氧化、醛/醇脱氢酶、硫酯酶、脱羧酶的普遍存在的性质具有使这些产物能够在其它工业有机体中有效合成的潜能，例如酿酒酵母、运动发酵单胞菌、枯草杆菌等。
尽管本文中我们已经例证正丁醇、4-C3-羟基-、3-酮基-和反式-Δ2-羧酸类、较长链(C>4)正醇类和长链(C>10)脂肪酸，我们也已经证实通过明智使用起始材料和酶，取决于在工程化微生物中表达何种终止酶，我们也能够制备其它羧酸类、醇类、烷烃类和烯烃类。
我们已经工程化在大肠杆菌中制备正丁醇的β-氧化循环的一次逆转，据认为在没有外源性基因下该生物体不能够制备该醇。该途径，本文称为“内源性”或“天然”基因途径，并不是基于来自天然生成正丁醇的生物体的转移途径，而是通过途径操作赋予天然基因和蛋白产生丁醇的新用途。
通常，驱动逆转的β-氧化循环的包括以下三步骤：1)在缺乏它的天然诱导底物（即缺乏脂肪酸）和存在非脂肪酸碳源（例如存在葡萄糖）下功能性表达β氧化循环；2)在逆向/生物合成方向（如与它的天然分解代谢/降解方向相反）中驱动β氧化循环；以及3)表达在β氧化循环中用作合适中间体的终止酶以制备所需产物。
更详细而言，重组工程化为：
1)在缺乏天然诱导底物（即缺乏脂肪酸）和存在非脂肪酸碳源（例如存在葡萄糖）下表达β-氧化循环：为了表达β-氧化循环，首先i)突变fadR和atoC(c)使能够在缺乏脂肪酸下表达编码β氧化酶的基因；ii)arcA敲除(ΔarcA)使能够在厌氧/微好氧条件下表达编码β氧化循环酶/蛋白的基因（在制备燃料和化学品中使用微好氧/厌氧条件，但导致通过ArcA表达β氧化基因）；以及iii)使用cAMP-依赖性突变体(crp*)来替代天然环状AMP受体蛋白(crp)在存在抑制降解产物的碳源，例如葡萄糖下使能够表达编码β氧化循环酶/蛋白的基因（葡萄糖是在发酵过程中最广泛使用的碳源并且抑制β氧化基因）。
2)在逆向/生物合成方向（如与它的天然分解代谢/降解方向相反）中驱动β氧化循环。除了功能性表达β-氧化循环之外，我们提议以下改变方式来达到该途径逆向操作：iv)微好氧/厌氧条件的使用通过三羧酸类(TCA)循环抑制/最小化乙酰基-CoA的代谢以及制备在逆向/生物合成方向中驱动β氧化循环可获得的乙酰基-CoA；v)pta(或ackA或两者)、poxB、adhE、yqhD和eutE敲除阻断/降低乙酸盐（Δpta或AackA和poxB）和乙醇(ΔadhE、ΔyqhD和ΔeutE)由乙酰基-CoA合成，因而制备可用于在逆向/生物合成方向中驱动β氧化循环的乙酰基-CoA；vi)硫解酶的过表达，在β氧化循环的逆转中第一步使能够引导乙酰基-CoA至该途径内，因此在逆向方向中进行它的操作；vii)IdhA、mgsA和frdA敲除分别阻断/减少乳酸盐（ΔldhA和ΔmgsA）和琥珀酸盐(ΔfrdA)由丙酮酸盐和磷酸烯醇丙酮酸合成，制备用于合成乙酰基-CoA的更多的磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸盐，因而制备可用于在逆向/生物合成方向中驱动β氧化循环的乙酰基-CoA；viii)丙酮酸盐：黄素氧还蛋白氧化还原酶(ydbK)和酰基-CoA脱氢酶(ydiO和ydiQRST)的过表达使能够偶联丙酮酸盐氧化(丙酮酸盐→乙酰基-CoA+CO2+Fdred)和反式-Δ2-烯酰基-CoA还原(反式-Δ2-烯酰基-CoA+Fdred→酰基-CoA)，因此在逆向方向中驱动β氧化。
3)将CoA硫酯中间体转化成所需终产物。一般而言，存在若干种从逆向β-氧化循环中分离反应中间体以及生成所需终产物的终止酶(图1A)：
i)CoA硫酯水解酶/硫酯酶、或酰基-CoA:乙酰基-CoA转移酶、或磷酸转酰基酶和用于羧酸类的羧酸酯激酶（即短、中和长链单羧酸类、β-酮酸类、β-羟基酸类、反式-Δ2-脂肪酸）；
ii)用于醇类的形成醇的CoA硫酯还原酶（即短、中和长链正醇类、β-酮醇类、1,3-二醇类、反式-Δ2-醇类）；
iii)形成醛的CoA硫酯还原酶和醇脱氢酶，其一起形成醇类（即短、中和长链正醇类、β-酮醇类、1,3-二醇类、反式-Δ2-醇类）。根据需要，取决于所需终产物，能够过表达一种或多种这些终止酶。
iv)形成醛的CoA硫酯还原酶和醛脱羰基酶（其一起形成不同链长的烷烃类或端烯烃类）；以及
v)形成链烯烃的酶（其一起形成脂肪族内烯烃类或端烯烃类或三烯类或者烯醇类）。
根据需要，对于特定产物，终止酶能够为天然或非天然，但优选逆向β氧化循环使用天然基因。
4.调节产物链长。硫酯中间体的链长决定终产物的长度，以及使用具有所需链长特异性的合适终止酶能够控制。此外，通过降低或增加具有所需链长特异性的硫解酶的活性能够抑制或促进链延长。这两种方法能够一起或单独使用。例如：
i)fadA、fadI和paaJ的敲除以避免链延长超出循环的1-至-2圈（取决于作为引物/起始分子的乙酰基-CoA或丙酰基-CoA的使用，生成4-和6-碳中间体和产物，或者5-和7-碳中间体和产物）和短链硫解酶yqeF或atoB或者诸如fucO或yqhD的短链醇脱氢酶的过表达；
ii)fadB、fadI和paaJ的过表达以促进长链硫解酶tesA、tesB、fadM、ybgC或yciA或长链醇脱氢酶（例如ucpA、ybbO、yiaY、betA、ybdH或eutG）的链延长和过表达；本文所使用的术语“合适的”是指对特定链长的给定中间体（即酰基-CoA、烯酰基-CoA、羟基酰基-CoA和酮基酰基-CoA）具有所需特异性的酶。请注意，通过操作硫解酶（如上所述）能够控制硫酯中间体的链长，因此终止酶仅得到所需链长的硫酯。
Figure BDA0000385869470000041
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如本文所使用，所提及的细胞或细菌或菌株和所有这些类似称呼包括其子代。也理解，由于加入亲本的故意或偶然突变，所有子代在DNA含量上可能不完全相同。在筛选原始转化细胞中具有相同功能或生物活性的突变子代包含在内。如果使用不同的名称，则可通过语境进行明确。
如本文所使用的术语“可操作相连”或“可操作连接”是指功能性偶联核酸序列。
如本文所使用的“重组”是涉及、源于、或含有遗传工程化的物质。换而言之，以一些方法故意操纵基因组。
“降低的活性”或“失活”在本文中定义为如与合适的对照种类相比，在蛋白活性上降低至少75%。优选地，得到活性至少80%、85%、90%、95%降低，以及在最优选的实施方案中，活性消失（100%，也称为“敲除”或“无效”突变体）。使用抑制剂、通过突变、或通过抑制表达或翻译等能够使蛋白失活。使用移码突变、早终止密码子、关键残基的点突变、或缺失或插入等通过完全抑制活性蛋白的转录和/或翻译能够完全使基因产品失活(100%)。
“过表达”或“过表达的”本文定义为如与合适的对照种类相比较，至少150%的蛋白活性，以及优选200%、500%、1000%或更多。通过使蛋白突变以产生更具活性形式或者对抑制抵抗的形式、通过去除抑制剂、或加入激活剂等能够达到过表达。通过去除阻遏剂、加入基因的多种拷贝至细胞、或上调内源性基因等也能够达到过表达。
术语“内源性”或“天然”是指源于所考虑种类的基因，而不考虑亚种或菌株，但基因可以为天然或人工突变的，或者在导致所述基因的过表达或控制表达的启动子控制下放置的。因此，梭状芽孢杆菌的基因不是埃希氏杆菌属的内源性基因，但是表达大肠杆菌的基因的质粒或许可认定为埃希氏杆菌属的内源性基因，即使它现在可能过表达。
当在权利要求或说明书中连同术语“包含”使用时，词语“一(个)种”的使用除非本文另有说明外表示一(个)种或多于一(个)种。
术语“约”是指指定值正或负测定值的误差限度或者如果没有规定测定方法则为正或负10%。
除非另有明确说明，在权利要求中术语“或者”的使用表示“和/或”，其是指仅为可选择项或者可选择项相互排他。
术语“包含”、“具有”和“包括”（和它们的变化形式）是开放式连接动词，并且当在权利要求中使用时允许加入其它元素。“由…组成”是封闭式的，以及“基本上由…组成”是指不能加入其它物质元素，例如不能作用于逆向β氧化途径、或区分培养基、缓冲剂、盐类等的背景突变。
如本文所使用的“较长链”醇、脂肪酸等是指3或更多个碳，以及优选4或更多个碳。
附图说明
图1A提出使用β-氧化循环的功能性逆转用于先进燃料和化学品的组合合成的代谢平台。在本研究中所报道的β-氧化循环的工程化逆转由以下酶（小括号中为基因名称）构成：①硫解酶(yqeF、fadA、atoB)；②羟基酰基-CoA脱氢酶(fadB、fadJ)；③烯酰基-CoA水合酶(fadB、fadJ)（注意：在该种类中②和③融合）；④酰基-CoA脱氢酶(ydiO、fadE)。每一次逆向循环生成比初始酰基-CoA硫酯长两个碳的酰基-CoA（表示为Cn+2）。在工程化途径中使用以下一种或多种能够将中间体转化成不同链长的醇类和羧酸类的功能性不同的组：如所规定，i)形成醇的CoA硫酯还原酶或者ii)形成醛的CoA硫酯还原酶和醇脱氢酶（⑤）；或者iii)CoA硫酯水解酶/硫酯酶、或酰基-CoA:乙酰基-CoA转移酶、或磷酸转酰基酶和羧酸酯激酶（⑥）。在该研究中证实其合成的产物显示在方框中。缩略语：R表示连接引物或起始分子的酰基-CoA基团的侧链（例如对于乙酰基-CoA，R=H以及对于丙酰基-CoA，R=CH3）。点线表示多步骤，而没有箭头的虚线连接不同链长的相同代谢物。在本领域中工程化的β-氧化循环的逆转和该提出的脂肪酸生物合成途径2之间正醇生成的比较示出在图4中。
图1B编码所提出的β-氧化循环的逆转的操纵子通过调节器FadR、ArcAB、FNR、CRP-cAMP、AtoSC的调节。操纵子的激活和阻遏分别通过“↓”和“┴”表示。
图2用于合成正丁醇和短链羧酸类的β-氧化循环的工程化的一次逆转，(a)在菌株RB02(fadR atoC(c)crp*ΔarcAΔadhEΔptaΔfrdA)中基因过表达和敲除（表示在x轴下）对正丁醇和乙醇的合成的作用。在30℃下在使用葡萄糖(1%w/v)基本培养基的摇瓶中进行实验24小时。按照克正丁醇/克消耗的总葡萄糖计算正丁醇产率；(b)通过菌株RB02ΔyqhDΔeutE[yqeF+fucO+]产生正丁醇的动力学。在含有使用5%(w/v)葡萄糖补充的基本培养基的发酵器中培养细胞。溶解的氧气控制在5%饱和，温度在30℃下，以及pH为7。(c)在菌株RB02、RB02ΔfadB和RB02ΔydiO中在过表达硫酯酶I(TesA)和II(TesB)下β-丁酮酸（左图）、β-羟基丁酸（中图）和反式-2-丁烯酸（右图）的合成。在37℃下在使用葡萄糖(1%w/v)基本培养基的摇瓶中进行实验48小时。
图3通过β-氧化循环的工程化逆转对较长链(C>4)羧酸类(a和b)和正醇类(c和d)的合成，(a)在过表达不同硫酯酶(FadM、YciA、TesA、TesB)下长链(C>10)游离脂肪酸在菌株RB03[fadBA+]的细胞外培养基中的积累。产物产率显示在条柱上（克游离脂肪酸/克消耗的总葡萄糖×100）。在37℃下在使用葡萄糖(2%w/v)基本培养基的摇瓶中进行实验48小时。(b)通过菌株RB03[fadBA.fadM+]的脂肪酸合成的动力学。在使用葡萄糖(3%w/v)基本培养基的发酵器中培养细胞。溶解的氧气控制在2%饱和，温度在37℃下，以及pH为7。(c)在过表达醇脱氢酶(YiaY、BetA和EutG)下在菌株RB03[fadBA+]中正醇类的合成。产物产率显示在条柱上（克正醇/克消耗的总葡萄糖×100）。在37℃下在使用葡萄糖(2%w/v)基本培养基的摇瓶中进行实验48小时；(d)在0.5g/L丙酸盐的存在下醇脱氢酶过表达(YiaY、BetA和EutG)对通过菌株RB03[fadBA+]合成的正醇类的长链分布的作用。如在图"c"中所述进行实验。
图4是通过脂肪酸生物合成途径（顶部）和β-氧化循环的工程化逆转（底部）的正醇合成的比较。反应①-⑤如在图1中所示。脂肪酸生物合成途径使用酰基-ACP中间体以及涉及β-酮基酰基-酰基-载体蛋白合酶（⑧）以及3-酮酰基还原酶、烯酰基还原酶和3-羟基酰基脱水酶（⑨）。也显示在脂肪酸生物合成中在链延长时丙二酰基-ACP、2-C供体的合成（⑦）。由这些酰基-ACP中间体的正醇类的产生需要它们转化成游离酸（⑩）以及能够达到在它们还原为醇类（⑥）之前酰化在脂肪酸生物合成途径中在链延长时作为2-C供体的酰基-ACP中间体和丙二酰基-ACP的使用限制它的ATP效率，使得它成为消耗ATP的途径，如在以下由葡萄糖合成正醇的平衡等式中所显示：
n/4C6H12O6+ATP→CnHn+2O+n/2CO2+(n/2-I)H2O，
n为正醇的链长。
图5是通过β-氧化循环的工程化逆转来合成烃类以及通过生成和消耗还原当量的最佳偶联的核心途径的有效操作。末端途径"5"和"6"使能够使用形成醛的CoA硫酯还原酶和醛脱羰基酶（途径"5"，导致不同链长的烷烃类或端烯烃类的形成）和形成链烯烃的酶（途径"6"，导致脂肪族内烯烃类或端烯烃类或三烯类或者烯醇类的形成）由CoA-硫酯中间体合成烃类。也应当注意的是通过保存还原当量（如与以氢气形式释放它们的相反：例如PDH*、PNO、YdbK、NADH-依赖性FDH）、使用NAD(P)H-依赖性反式-烯酰基-CoA还原酶（反应4）和在反式-烯酰基-CoA还原（反应4）和丙酮酸氧化之间直接偶联的丙酮酸盐异化。
图6是示出质粒pZS acrM synpcc7942_1593的图谱的示意图。该质粒表达密码子优化的不动杆菌属acrM基因（编码形成醛的CoA硫酯还原酶）和密码子优化的聚球蓝细菌属synpcc7942_1593基因（编码醛脱羰基酶）。这两种酶形成末端途径，它导致由β-氧化逆转的CoA-硫酯中间体形成不同链长的烷烃类或端烯烃类。
图7包括示出携带分别编码薄肌眼虫和牙密螺旋体NAD(P)H-依赖性反式烯酰基-CoA脱氢酶的基因的质粒pZS Egter(A)和pZS Tdter(B)的图谱的示意图。
图8包括示出质粒pZS ydbK(A)pZS ydbKydiQRST(B)和pZS ydiO(C)的图谱的示意图。这些质粒携带编码大肠杆菌丙酮酸盐:黄素氧还蛋白氧化还原酶(YdbK)、酰基-CoA脱氢酶(YdiO)和需要的电子转移黄素蛋白以及铁氧还蛋白(YdiQRST)的基因。
具体实施方式
在大肠杆菌中我们已经工程化脂肪酸氧化循环（也称为β-氧化）的功能性逆转以及联合内源性脱氢酶和硫酯酶来使用它以生成不同链长的正醇类和脂肪酸(图1)。
工程化途径使用辅酶-A(CoA)硫酯中间体操作和直接使用用于酰基-链延长的乙酰基-CoA（而不是首选需要对丙二酰基-CoA进行ATP-依赖性激活），其特征在于能够在最大碳和能量效率下进行合成。
经取代和未经取代的正醇类和羧酸类（图2和3）的合成产率和滴定度比之前报道的高证实经工程化途径的较好性质。β-氧化循环的普遍存在的性质应当使能够在工业生物体中有效合成非天然产物的宿主，而不用补充外源性基因，该方法在此称为同源性代谢工程化。
我们简单地证实使用加入细菌的非天然酶制备烷烃类和烯烃类，并且已经构建它的载体。
实施例1：材料和方法
本文描述的材料和方法仅示例，但技术在本领域为标准，并且本文中能够使用不同的方法替代。重要的是工程化以作用途径逆转、引导碳流动和上调终止酶。
试剂化学品得自FISHER SCIENTIFICTM(Pittsburg,PA)和SIGMA-ALDRICH CO.TM(St.Louis,MO)。
培养基使用通过NeidhArdt(1974)设计的基本培养基，使用Na2HPO4替代K2HPO4，以及使用20g/L葡萄糖、40g/L碳酸氢钙、100μΜ FeSO4、5mM泛酸钙、3.96mM Na2HPO4、5mM(NH4)2SO4和30mM NH4C1来补充。在SIXFORSTM多发酵体系中进行的发酵也包括1mM甜菜碱。
质粒构建标准重组DNA工序用于基因克隆、质粒分离和电穿孔。操作方案和标准方法按照DNA纯化(QIAGEN,TMCA,USA)、限制性核酸内切酶消化(NEW ENGLANDBIOLABS,TMMA,USA)和DNA扩增(STRATAGENE,TMCA,USA和INVITROGEN,TMCA,USA)。对于质粒构建，使用设计在用于随后重组至所需质粒内的基因插入物的各端上产生15bp的同源性的引物将基因由MG1655基因组DNA扩增。使用限制性核酸内切酶消化将质粒直线化，然后使用IN-FUSION DRY-DOWN PCR CLONING KITTM(CLONTECH,TMMountain View,CA,USA)将其与合适基因重新结合，并且随后用于转化化学活性FUSION BLUETM细胞(CLONTECH,TMMountain View,CA,USA)。
侵染在含有合适抗生素的LB板上生长的转化体以用于分离，然后通过PCR进行预筛选。然后分别进行菌落通过预筛选以用于质粒纯化。通过PCR以及限制性核酸内切酶消化验证证实纯化的质粒具有合适的插入物，在各种情况下质粒包括质粒启动子、各基因的核糖体结合位点、MG1655基因和质粒终止子。所得质粒（和菌株）列出在表3和4中。
代谢物鉴定通过一维(ID)质子核磁共振(NMR)光谱测定代谢产物的同一性。将60μL的D2O和1μL的600mM NMR内标TSP[3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-D4，钠盐]加入540μL的样品（培养基上清液）中。然后将所得溶液转移至5mm-NMR管，在25℃下在使用以下参数的装备有Penta探针的Varian500-MHz Inova分光计(VARIAN,INC.,TMPalo Alto,CA)中进行ID质子NMR光谱：8,000-Hz扫探宽度、2.8-s采集时间、256次采集、6.3-μs脉冲宽度、1.2-s脉冲重复延时和2s的预饱和。使用FELIXTM2001软件(ACCELRYSSOFTWARE INC.,TMBurlington,MA)来分析所得光谱。通过它们的化学位移和J-耦合值来识别峰，这两个值由单独的实验获得，其中使用代谢物标准品（2mM最终浓度）来强化样品。
在通过Atsumi(2008)报道的方法修改之后通过气相色谱－质谱(GC-MS)来进行正醇类的鉴定。在具有HP-5ms毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)的AGILENTTM6890GC/5973MS(AGILENT TECHNOLOGIES,TMPalo Alto,CA)仪器上进行分析。使用500μl GC标准级己烷(Fluka)来萃取1ml的培养肉汤的上清液。在250℃下使用20:1分流注入0.5μl的萃取样品。烘箱温度开始保持在75℃下2min，然后以5℃/min的梯度升温至280℃，并保持2min。氦气(MATHESON TRI-GAS,TMLongmont,CO)用作具有14-lb/in2入口压力的载气。注入器和检测器维持在255℃下。
在装备有DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)和直接连接MS的SHIMADZUTMAuto-System GC2010(SHIMADZU,TMJapan)上进行脂肪酸的鉴定。使用以下方法：50℃的起始温度维持2min，然后以每分钟4℃上升至220℃，并维持10min2。提取和衍生工序描述在代谢物鉴定部分中。
代谢物定量通过高效液相色谱法(HPLC)来进行葡萄糖、有机酸、乙醇和丁醇的定量。使用装备有操作条件优化至峰值间距（0.3mL/min流速、30mM H2SO4流动相、柱温42℃）的HPX-87H有机酸柱(BIO-RAD,TMHercules,CA)的SHIMADZUTMProminence SIL20系统(SHIMADZU SCIENTIFIC INSTRUMENTS,INC.,TMColumbia,MD)，通过离子排阻HPLC来分析样品（培养基上清液）。
在装备有火焰电离检测器(GC-FID)的VARIANTMCP-3800气相色谱仪(VARIANASSOCIATES,INC.,TMPalo Alto,CA)中通过气相色谱法(GC)来进行较长链(C>4)正醇类的定量。样品萃取工序如上代谢物鉴定部分中所述。使用VF-5ht柱（15m，0.32mm内径，0.10μm膜厚；VARIAN ASSOCIATES,INC.,TMPalo Alto,CA）来进行醇化合物的分离。烘箱温度开始保持在40℃下1min，然后以30℃/min的梯度上升至130℃，并保持4min。然后以15℃/min的梯度上升至230℃，并保持4min。氦气(1ml min-1,MATHESONTRI-GAS,TMLongmont,CO)用作载气。注入器和检测器维持在250℃下。将0.5-μ1样品以不分流进样模式进样。
如之前所报道(Dellomonaco2010)，在己烷-甲基叔丁醚(MTBE)萃取(Lalman2004)和使用氯仿:甲醇:盐酸[10:1:1,vol/vol/vol]的混合物进行FA酯交换之后在VARIANTMCP-3800气相色谱仪(VARIAN ASSOCIATES,INC.,TMPalo Alto,CA)中进行脂肪酸的定量。根据以下方法定量所得脂肪酸甲酯：50℃下保持1min，30℃/min至160℃，15℃/min至200℃，200℃下保持1.5min，10℃/min至225℃，以及225℃下保持15min。
酶测定对于酶活性的测定，在厌氧条件下使用9g/L氯化钠洗涤24小时摇瓶培养物的细胞两次，并储存在-80℃下直至使用。在厌氧条件下如下制备所有测定的细胞提取物。将40单位的OD550nm重悬在具有1mM DTT的1mL的100mM Tris-HCl缓冲剂(pH7.0)中。在使用DISRUPTOR GENIETM(SCIENTIFIC INDUSTRIES,INC.,TMBohemia,NY)进行细胞破坏之后，通过离心分离(13,000×g,4℃,10min)来去除细胞碎片，并将上清液用作细胞提取物。在BIOMATETM5分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,TMMA,USA)中监控所有测定中吸光度改变。建立所有测定的反应线性（蛋白浓度和时间），并将非酶速率由观察到的初始反应速率减去。酶活性记录为μmol底物/分钟/mg细胞蛋白，并表示为至少三次细胞制剂的平均值。使用BSA作为标准品的Bradford测定试剂(THERMO SCIENTIFIC,TMMA,USA)来测定蛋白浓度。
使用乙酰乙酰基-CoA和CoA作为底物测定乙酰基-CoA乙酰基转移酶(THL)活性，测定在303nm下乙酰乙酰基-CoA浓度增加。通过监控β-羟基丁酰基-CoA由乙酰乙酰基-CoA形成所导致的NADH浓度增加来测定在340nm下β-羟基丁酰基-CoA脱氢酶活性。通过监控β-羟基丁酰基-CoA由巴豆酰基-CoA形成所导致巴豆酰基-CoA在263nm处降低来测定巴豆酸酶活性。通过监控在300nm下作为电子供体的二茂铁离子在巴豆酰基-CoA还原的方向中监控丁酰基-CoA脱氢酶活性。此外，使用0.2mM NAD(P)H替代二茂铁离子和在340nm处测定吸光度的测定也在进行。通过监控在340nm下NAD(P)+还原在丁醛氧化的方向中测定丁醛脱氢酶活性。为了测定丁醇脱氢酶活性，在30℃的厌氧条件下监控在340nm处丁醇由丁醛形成所导致的NAD(P)H浓度降低。
实施例2：β-氧化循环的一次逆转
鉴于正丁醇作为先进生物燃料和化学工业基本材料的应用，我们选择它作为第一种产品来证明工程化β-氧化循环的逆转作为燃料和化学品生产的有效平台的可行性（图1）。
通过联合天然醇脱氢酶的β-氧化循环的一次逆转能够实现正丁醇的合成（图1a，反应①-⑤）。该工程化途径表示在梭状芽孢杆菌中正丁醇途径的大肠杆菌替代物。
鉴于atoB编码的乙酰基-CoA乙酰基转移酶对于短链酰基-CoA分子的特异性以及在atoB和yqeF（预测酰基转移酶）之间高序列相似性，为途径的反应①选择这些基因。通过由fadB和fadJ编码的3-羟基酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶能够催化接下来两步（图1a中的反应②和③）。通过酰基-CoA脱氢酶(fadE或ydiO)能够催化在该β-氧化循环的一次逆转中第四步（反应④）。
在大肠杆菌基因组中在四种操纵子中安排以上基因，并进行多水平的调节(图1b)。因此，将这些调节途径工程化以促进β-氧化循环的逆转。
通过fadR和atoC(c)突变达到fad和ato基因（分别通过FadR和AtoC调节：图1b）的组成型表达(Dellomonaco2010)。因为在燃料和化学品的生产中使用的厌氧/微好氧条件可导致大部分靶操纵子受到ArcA的抑制(图1b)，所以arcA基因也缺失。
通过环状-AMP受体蛋白(CRP)-cAMP复合物也激活多种目标操纵子(图1b)，所以在葡萄糖的存在下进行碳降解产物遏制。通过使用cAMP-依赖性突变体crp*替代天然crp基因来遏制该调节机制(Eppler&Boos,1999)。尽管预测这些基因操作使能够表达β-氧化循环(图1b)，但在菌株fadR atoC(c)Δcrp crp*ΔarcA(RB01)或它的亲本fadR atoC(c)中未观察到丁醇合成（表2）。表5提供在crp、fadR和atoSC基因座处引入突变的细节。
鉴于其它发酵产物的重要积累（表2），也阻断在乙醇、乙酸盐和琥珀酸盐的合成中所涉及的途径（分别为ΔadhE、Δpta和ΔfrdA敲除）以尝试引入碳至工程化途径。尽管这些竞争性副产物的合成大大降低，但是菌株RB02(RB01ΔadhEΔptaΔfrdA)也没有产生正丁醇（表2）。
酶活性测定证实与在野生型MG1655中可忽略不计的活性相比，在菌株RB02中β-氧化循环的逆转的功能性表达（表1a）。然而，正丁醇脱氢酶的水平也非常低（表1a），可能抑制正丁醇合成。
为了解决该问题，在菌株RB02中过表达与梭状芽孢杆菌丁醛/丁醇脱氢酶具有高序列和结构相似性的两种内源性醛/醇脱氢酶：即L-1,2-丙二醇氧化还原酶(fucO)和醛/醇脱氢酶(yqhD)（表7）。尽管YqhD可能催化丁醛至正丁醇的转化，但fucO的过表达导致更高的正丁醇滴定度和产率(图2a)。然而，两种酶均证实为功能性酶，并且能够使用一者或两者。
尽管在RB02中观察到高水平的硫解酶活性（表1a），这些测定值解释短和长链酰基-CoA分子具有特异性的酶。为了尝试转化乙酰基-CoA至正丁醇途径，过表达对短链分子（atoB和yqeF：图1a，反应①）具有较高亲和力的乙酰基-CoA乙酰基转移酶。所得菌株RB02[atoB+]和RB02[yqeF+]合成可观量的正丁醇(图2a)。
目前尚未知在大肠杆菌代谢中功能的yqeF的过表达生成较高浓度的正丁醇和较低浓度的主要发酵副产物乙醇(图2a)。在野生型MG1655中在过表达atoB或yqeF后未观察到正丁醇合成。
基于以上结果，通过同时过表达yqeF以引导乙酰基-CoA至β-氧化循环的工程化逆转内和fucO以改善丁酰基-CoA至正丁醇的转化应当实现碳通量朝向正丁醇分配增加。实际上，在高正丁醇比乙醇比率(>5:1)下菌株RB02[yqeF+fucO+]产生显著量的正丁醇(1.9g/L)(图2a)。在野生型背景中或者在含有pta、adhE和frdA缺失的菌株中在同时过表达yqeF和fucO下未观察到正丁醇产生，强调fadR atoC(c)Δcrp crp*ΔarcA基因型的重要性。
因为菌株RB02[yqeF+fucO+]的工程化涉及具有可能多效性作用的多种球状调节器的操作，所以进行所提出的β-氧化循环的逆转的表征以建立它对正丁醇合成的作用（表1）。活性测定显示在菌株RB02[yqeF+fucO+]中假设途径所涉及的关键酶的高水平表达和在野生型MG1655中可忽略的活性（表1a）。基因敲除和基因互补实验以及发酵产物的定量（表1b）证实：在通过β-氧化途径的工程化一次逆转的正丁醇的合成中所涉及的主要基因为（小括号为编码的活性）：yqeF（预测的酰基转移酶）、fadB(3-羟基酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶)、ydiO(预测的酰基-CoA脱氢酶)和fucO(L-1,2-丙二醇氧化还原酶/正丁醇脱氢酶)。
据预计，YdiO催化烯酰基-CoA至酰基-CoA的还原（反应④）。该反应的逆转通过FadE来催化，并且是在β-氧化循环的分解操作中唯一不可逆步骤5。与我们的提案一致，在菌株RB02[yqeF+fucO+]中ydiO缺失完全阻止了正丁醇合成（表1b）。尽管之前提出ydiO编码在脂肪酸的厌氧分解代谢时可替代FadE的酰基-CoA脱氢酶20，但在YdiO和大肠杆菌蛋白之间序列比较没有揭示与FadE显著相似性（表9）。相反，YdiO与巴豆甜菜碱基-CoA还原酶具有高同一性(CaiA)。CaiA催化巴豆甜菜碱基-CoA至γ-巴豆甜菜碱基-CoA的还原，该反应类似于在β-氧化循环的逆转中通过YdiO的催化。而且，转移电子至CaiA需要操纵子fixABCX，它编码与YdiQRST具有高序列相似性的黄素蛋白和铁氧还蛋白（表9）。该分析表明通过ydiQRST编码的铁氧还蛋白和黄素蛋白涉及在烯酰基-CoA至酰基-CoA的还原中YdiO电子转移。标准吉布斯能量计算揭示：如果铁氧还蛋白是烯酰基-CoA至酰基-CoA的转化还原能量的来源，则β-氧化循环的工程化逆转热力学上可行（表10）。然后我们提出烯酰基-CoA至酰基-CoA的还原由YdiO-YdiQRST介导。
通过联合过表达fucO和yqeF以及缺失yqhD和eutE（与adhE具有高序列相似性的醛脱氢酶）来实现副产物乙醇合成的进一步降低、因而增加正丁醇产率。所得菌株(RB02ΔyqhDΔeutE[yqeF+fucO+])以0.28g正丁醇/g葡萄糖的产率在24小时内合成2.2g/L的正丁醇(图2a)。当使用较高葡萄糖起始浓度在生物反应器中生长时，该菌株以高滴定度(～14g/L)、产率(0.33克正丁醇/克葡萄糖)和速率（～2克正丁醇/克细胞干重/小时）产生正丁醇(图2b)。
在没有引入外源性基因和在缺乏丰富营养物质下所得到的该性能的数量级高于所报道的用于正丁醇生产工程化的任何其它生物体以及也由于天然正丁醇制造者所报道的产率和单位生产率。在该菌株中工程化的β-氧化循环的逆转在73.4mmol乙酰基-CoA/克细胞干重/小时的最大碳通量下操作（在图2b中12-18小时），这超过在天然或工程化发酵途径的文献中报道的通量。总而言之，这些结果证实β-氧化途径的工程化逆转是生产燃料和化学品的较优代谢平台，并且能够支撑在工业生物体中非天然产物的有效合成，而不引入外源性基因（即内源性代谢工程化）。
β-氧化循环的工程化的逆转生成多组CoA硫酯中间体，它们能够转化成对应醇类和羧酸类(图1A)。为了示出由除酰基-CoA之外的中间体的产物合成，我们使用硫酯酶I(TesA)和硫酯酶II(TesB)作为终止酶。当在菌株RB02中过表达这些硫酯酶时，产生少量的3-羟基丁酸、3-丁酮酸和反式-2-丁烯酸(图2c)。通过同时过表达硫酯酶和yqeF-编码的短链酰基转移酶能显著增加这些产物的水平(图2c)。在缺失fadB(～500mg/L3-丁酮酸)和ydiO(分别～150mg/L和200mg/L的3-羟基丁酸和反式-2-丁烯酸)下实现产物滴定度的进一步增加(图2c)。
实施例3：制备较长链(C>4)
通过过表达FadA，其为β-氧化复合物(FadBA)的一部分并且其具有更大链长特异性的3-酮基酰基-CoA硫解酶，能够便于β-氧化途径工程化逆转的多循环操作，因而便于合成较长链长(C>4)的CoA-硫酯中间体（和产物）。
在菌株RB03(RB02ΔyqhDΔfucOΔfadD)中FadBA以及硫酯酶(TesA、TesB、FadM或YciA)的过表达导致在细胞外培养基中长链脂肪酸的积累(图3a)。在菌株RB03中fadD敲除防止再利用合成的脂肪酸。硫酯酶的选择使得可控制脂肪酸侧链的长度和功能。例如，当FadM过表达时，C16和C18饱和脂肪酸是唯一的产物，而YciA和TesA过表达分别支持3-羟基(C14:30H)和未饱和(C18:1)脂肪酸的合成(图3a)。
当使用较高葡萄糖起始浓度在生物反应器中生长时，使用没有丰富营养素的矿物盐培养基菌株RB03[fadBA.fadM+]在高滴定度(～7g/L)和产率（(0.28克脂肪酸/克总消耗的葡萄糖）下产生长链细胞外脂肪酸(图3b)。这些结果比之前报道使用工程化脂肪酸生物合成途径的好（表9）。在菌株MG1655ΔadhEΔptaΔfrdKΔfadD中在过表达FadM下没有观察到细胞外游离脂肪酸的产生（表6C），这正是β-氧化循环的活性逆转的要求。在菌株RB03[fadBA.fadM+]中总游离脂肪酸（即细胞外+细胞内）的测定值和对应对照显示：工程化的逆转占据总游离脂肪酸的90-95%的合成（表6C）。
通过过表达合适终止酶也证实较长链(C>4)正醇类的合成(图3c)。我们验证能够作为存在于生物体中合成较长链直链正醇类的形成醛的酰基-CoA还原酶和醇脱氢酶的可能替代物的天然酶（表7）。在过表达YiaY后得到比之前报道更高的产物滴定度(0.33g/L)和产率(8.3%w/w)（表8）。
通过补充具有作为丙酰基-CoA（在图1A中R=CH3）的前体的丙酸盐的培养基来证实奇数链正醇类的合成。观察到在正醇类的分布中明显的位移：作为发酵产物出现的奇数链醇类1-戊醇、1-庚醇和1-壬醇，并且偶数链醇类的合成显著降低(图3d)。
实施例4：烷烃类/烯烃类的合成
通过由形成醛的脂肪酰基CoA还原酶和脂肪醛脱羰基酶构成的两步途径能够将通过β-氧化循环的逆转生成的CoA-硫酯中间体转化成烷烃类(图5)。另一方面，通过使用“头-头”缩合机制、随后为还原和脱羰步骤的途径也可由酰基-CoA合成链烯烃类。
烷烃生物合成途径：将使用两步骤途径，其包括通过形成脂肪醛的酰基-CoA还原酶的作用还原酰基-CoA，随后为通过醛脱羰基酶将所得醛脱羰为烷烃(图5)。该途径不同于目前所报道由脂肪酰基-ACP（酰基-酰基载体蛋白）合成烷烃类的途径。与所报道的酰基-ACP还原酶不同，我们的途径使用酰基-CoA还原酶。在合成脂肪醇类中，我们已经使用天然形成脂肪醛的酰基-CoA还原酶。此外，我们使用来自乙酸钙不动杆菌(acr1)和不动杆菌属菌株M-1(acrM)的异源性形成脂肪醛的酰基-CoA还原酶(Ishige等，2002)。
尽管两种酶对大量酰基-CoA均具有活性，但对棕榈酰基-CoA的活性非常高：这是重要的一方面，这是由于我们经工程化产生脂肪酸的菌株合成作为主要产物的棕榈酸(图3b)，这表明用于形成脂肪醛的酰基-CoA还原酶的棕榈酰基-CoA的可行性。
对于途径的第二步，我们使用来自细长聚球蓝细菌PCC7942(PCC7942_orf1593)和通过Schirmer(2010)报道的其它同源种类的醛脱羰基酶。
编码上述酶的基因簇集在相同表达载体(图6)中，将它转化至已经显示能够由酰基-CoA产生长链脂肪酸的菌株内。将异源性基因经密码子优化以用于在大肠杆菌中表达。通过使用不同表达载体、启动子和核糖体结合位点等来评估在途径中各酶的表达水平的作用。一旦已经验证烷烃产生，则携带烷烃生物合成途径的载体(图6)将连同携带β-氧化酶的第二载体表达。
定量通过克隆基因编码的蛋白活性以及使用酶动力学的体外分析来表征对应反应，并使用生物化学测定法和NMR光谱来鉴定反应底物和产物。在这些测定法中使用具有不同链长的底物。
链烯烃生物合成途径：合成链烯烃最好的表征的途径通过称为酰基-CoA的“头-头”缩合机制来进行，并导致在中间碳上具有内部双键的长链烯烃(C21-C31)。
该途径的最佳功能化要求表达来自诸如野油菜黄单胞杆菌的细菌的形成链烯烃的酶OleABCD的簇。目前体外研究已经显示：在途径的第一步中，通过非脱羧克莱森缩合机制OleA催化脂肪酰基的缩合。显示，纯化的OleA对长度为C8至C16的脂肪酰基-CoA具有活性，对棕榈酰基-CoA具有最大活性。其它三种基因编码α/β-水解酶超家族(OleB)的成员、AMP依赖性连接酶/合酶超家族或乙酰基-CoA合成酶-类似的超家族(OleC)的成员、以及短链脱氢酶/还原酶超家族(OleD)的成员。
基因acr1、acrM、PCC7942_orf1593、oleABCD克隆至一种表达载体中，并且通过使用如上所述的不同启动子和核糖结合位点来评估在途径中对各酶的表达水平的作用。第二载体用于表达β-氧化酶。载体被转化至显示能够由酰基-CoA产生长链脂肪酸的菌株内。定量通过克隆基因编码的蛋白的活性，以及使用酶动力学的体外分析来表征对应反应，并使用生物化学测定法和NMR光谱来鉴定反应底物和产物。
实施例5：改善逆转循环的效率
还原当量的合成和消耗是工程化途径有效操作的关键方面，我们提出通过操作负责反式-烯酰基-CoA还原和丙酮酸盐氧化的酶来改善它的功能(图1A和图5)。这包括通过保留还原当量的途径对丙酮酸盐的异化（与以氢气的形式释放它们不同）、使用NAD(P)H-依赖性反式-烯酰基-CoA还原酶和在反式-烯酰基-CoA还原和丙酮酸盐氧化之间直接偶联。
在大肠杆菌中通过三种主要途径能够将丙酮酸盐转化成乙酰基-CoA(图5)：i)丙酮酸盐甲酸盐-裂解酶(PFL)，其生成作为副产物的甲酸盐；ii)丙酮酸脱氢酶(PDH)，其生成CO2和NADH，以及iii)YdbK，预测的丙酮酸盐:黄素氧还蛋白氧化还原酶，也生成CO2以及转移电子至醌池。尽管通过甲酸氢化酶(FHL)的作用能够使通过PFL生成的甲酸盐不成比例产生CO2和氢气，但该酶没有生成NAD(P)H。
为了解决这个问题，我们使用来自甲基营养酵母(C.boidinii)的NAD-依赖性甲酸脱氢酶(FDH)来替代天然释放氢气的FHL复合物(图5)。PDH和YdbK通过b-氧化途径的工程化的逆转生成以可能使用的形式的还原当量。然而，PDH的有效功能化需要使用厌氧条件或者使用厌氧活性丙酮酸脱氢酶复合物(PDH*)替代天然PDH(Kim等，2007)。在YdbK的情况下，我们提出将反式-烯酰基-CoA的丙酮酸盐氧化和YdiO-催化的还原直接偶联。我们也评估异源性丙酮酸-NADP氧化还原酶(PNO)由薄肌眼虫的线粒体和由顶覆虫隐孢子虫的表达，其将丙酮酸盐转化成乙酰基-CoA、CO2和NADPH(Rotte等，2001)。
评估两种酶对反式-烯酰基-CoA的还原，即来自薄肌眼虫的NAD(P)H-依赖性反式-烯酰基-CoA还原酶（Hoffmeister等，2005）和预测的大肠杆菌酰基-CoA脱氢酶(YdiO)。在YdiO的情况下，我们目前发现对于b-氧化途径的逆转需要该酶(Dellomonaco等，2011)。通过操作通量、通过转氢酶以及在埃姆登-迈耶霍夫-帕那斯(Embden-Meyerhof-Parnas)途径、磷酸戊糖途径和恩特纳－杜德洛夫(Entner-Doudoroff)途径之间的碳通量分配也评估以NADPH或NADH的形式的还原当量的可行性。
编码上述一些酶的基因已经克隆在合适的表达载体中（图7和图8）以及转化至通过β-氧化循环的工程化的逆转能够产生醇类、羧酸类、烷烃类和烯烃类的菌株内。使用酶动力学的体外分析表征编码的活性和对应反应，并使用生物化学测定法和NMR光谱表征反应底物和产物。
结论：在该项处理中工程化的β-氧化循环的功能性逆转代表合成先进燃料和化学品的最近和高效平台。它优越的性质示出在由葡萄糖合成正醇类的以下平衡等式中：n/4C6H12O6→CnHn+2O+n/2CO2+(n/2-1)H2O+n/2ATP，n为正醇的链长(图1a)。由此可见，工程化的途径具有由葡萄糖得到正醇类的最大产率的可能性（66.7%，以C-摩尔计）并且并入正醇分子内的每2-C生成1ATP。该ATP产率等于在自然界中发现的有效的同一发酵途径，例如乙醇和乳酸发酵。β-氧化循环的工程化的逆转的高碳和能效是可能的，这是因为在链延长时它直接使用乙酰基-CoA作为C2供体（与首先需要对丙二酰基-CoA的ATP-依赖性相反），并且它使用酰基-CoA中间体，其是醇类和其它重要产物的前体(图1a)。
通过替代代谢途径，例如脂肪酸生物合成和酮酸途径合成正醇类的效率更差。例如，脂肪酸生物合成途径的使用使得合成一份子正醇净消耗1ATP(图4)。该低效率是由于在丙二酰基-ACP的合成中消耗ATP（在图4中反应⑦）、链延长时C2供体、以及使用酰基-ACP中间体，在它们能够还原为醇类之前其需要转化成游离酸和酰化（另一ATP-消耗步骤）（在图4中反应⑩和
Figure BDA0000385869470000181
）。目前提出的酮酸途径比β-氧化循环的逆转的效率更差：例如，正己醇的最大理论产率，使用酮酸途径所报道最长直链正醇为仅50%C-摩尔(2葡萄糖→正己醇+ATP+2[H]+6CO2)。
尽管在此报道的研究关注大肠杆菌的工程化，但是β-氧化、醛/醇脱氢酶和硫酯酶的普遍存在的性质肯定能够使用天然代谢工程化方法以达到在其它工业生物体中合成正醇类和脂肪酸。β-氧化循环的功能性逆转也在具有各链长和功能的大量分子中组合生物合成具有极大前景。例如，硫酯酶和醛/醇脱氢酶也能够作用于工程化途径的其它硫酯中间体以生成产物的宿主，例如β-酮酸类和β-酮醇类、β-羟基酸类和1,3-二醇类和反式-Δ2-脂肪酸以及反式-Δ2-醇类(图1a)、以及烷烃类和烯烃类(图5)。
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以下参考文献全部通过引用方式并入本文中。
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Claims (21)

1.一种工程化微生物，其包括产生醇类、羧酸类和烃类的逆向β氧化循环，所述微生物包括：i)在缺乏脂肪酸和存在非脂肪酸碳源下所述β-氧化循环的表达；ii)在逆向/生物合成方向中所述β-氧化循环的功能运行；iii)将逆向β氧化循环中间体转化成所需醇、羧酸、或烃的一种或多种终止酶的过表达。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物产生醇类并且已过表达i)形成醇的辅酶-A硫酯还原酶或者ii)形成醛的CoA硫酯还原酶和醇脱氢酶，以将所述逆向β氧化循环的中间体转化成醇类。
3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物产生羧酸类并且已过表达硫酯酶、或酰基-CoA:乙酰基-CoA转移酶、或磷酸转酰基酶和羧酸酯激酶，以将所述逆向β氧化循环的中间体转化成羧酸类。
4.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物产生烷烃类或端烯烃类并且已过表达形成醛的CoA硫酯还原酶和醛脱羰基酶，以将所述逆向β氧化循环的中间体转化成烷烃类或端烯烃类。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物产生烯烃类并且已过表达一种或多种形成链烯烃的酶，以将所述逆向β氧化循环的中间体转化成烯烃类。
6.根据权利要求1所述的微生物，其包括fadR、atoC(c)、ΔarcA、Δcrp、crp*、ΔadhE、Δpta、ΔfrdAΔldhAΔmgsA。
7.根据权利要求6所述的微生物，其进一步包括ydbK和ydiO-ydiQRST的过表达。
8.根据权利要求6所述的微生物，其进一步包括ydbK、cysJ以及NAD(P)H-依赖性酰基-CoA脱氢酶和NAD(P)H-依赖性反式烯酰基-CoA还原酶中至少一者或两者的过表达。
9.根据权利要求6所述的微生物，其进一步包括aceEF-lpdA或厌氧活性丙酮酸脱氢酶或NAD-依赖性甲酸脱氢酶或丙酮酸-NADP氧化还原酶以及NAD(P)H-依赖性酰基-CoA脱氢酶和NAD(P)H-依赖性反式烯酰基-CoA还原酶中至少一者或两者的过表达。
10.根据权利要求1所述的微生物，其包括fadR、atoC(c)、ΔarcA、Δcrp、crp*、ΔadhE、ΔptaΔyqhD、ΔeutE、yqeF+、fucO+。
11.根据权利要求1所述的微生物，其包括fadR、atoC(c)、ΔarcA、Δcrp、crp*、ΔadhE、ΔptaΔyqhD、ΔeutE、atoB+、fucO+。
12.根据权利要求6所述的微生物，其进一步包括以下之一：i)ΔfadD、fadBA+；ii)fadBA+、yiaY+；iii)ΔfadD、fadBA+、yiaY+；iv)fadBA+、eutG+；v)ΔfadD、fadBA+、eutG+；vi)fadBA+、betA+；vii)ΔfadD、fadBA+、betA+；viii)ΔfadD、fadBA+、fadM或者ix)ΔfadD、fadBA+、yciA+。
13.根据权利要求6所述的微生物，其进一步包括fadA、fadI和paaJ的敲除以及短链CoA硫酯水解酶或硫酯酶、或短链磷酸转酰基酶和短链羧酸酯激酶、或短链酰基-CoA:乙酰基-CoA转移酶、或形成醇的短链CoA硫酯还原酶、或形成醛的短链CoA硫酯还原酶和长链醇脱氢酶、或形成醛的CoA硫酯还原酶和醛脱羰基酶、或形成醛的短链CoA硫酯还原酶和短链醛脱羰基酶、或形成链烯烃的酶中一者或多者的过表达。
14.根据权利要求6所述的微生物，其进一步包括fadB、fadI和paaJ的过表达以及长链CoA硫酯水解酶或硫酯酶、或长链磷酸转酰基酶和长链羧酸酯激酶、或长链酰基-CoA:乙酰基-CoA转移酶、或形成醇的长链CoA硫酯还原酶、或形成醛的长链CoA硫酯还原酶和长链醇脱氢酶、或形成醛的长链CoA硫酯还原酶和长链醛脱羰基酶、或形成链烯烃的酶中一者或多者的过表达。
15.根据权利要求1所述的微生物，其选自：
Figure FDA0000385869460000031
Figure FDA0000385869460000041
16.一种制备醇类或羧酸类的方法，所述方法包括使权利要求1-15中任一项所述的微生物在含有营养物质的肉汤中生长足以允许产生醇或羧酸或者烷烃或烯烃的时间，以及分离所述醇或羧酸或者烷烃或烯烃。
17.根据权利要求6所述的方法，其中使所述微生物在30-40℃的温度下在包含0-100μΜ FeSO4和0-5mM泛酸钙的肉汤中在微好氧(<10%O2)或厌氧条件下生长。
18.一种制备产物的方法，所述方法包括使微生物在30-40℃的温度下在使用0-100μΜFeSO4和0-5mM泛酸钙补充的葡萄糖基本培养基中在微好氧(<10%O2)或厌氧条件下生长足以允许产生产物的时间，以及分离所述产物，其中所述微生物和产物选自：
Figure FDA0000385869460000042
Figure FDA0000385869460000051
Figure FDA0000385869460000061
19.根据权利要求18所述的方法，其进一步包括使用丙酸盐补所述充培养基以产生奇数链长产物。
20.一种细菌，其包括fadR、atoC(c)、ΔarcA、Δcrp、crp*、ΔadhE、Δpta、ΔfrdAΔldhAΔmgsA。
21.一种埃希氏菌属，其包括fadR、atoC(c)、ΔarcA、Δcrp、crp*、ΔadhE、Δpta、ΔfrdAΔldhAΔmgsA。
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