EP1874944A1 - Verfahren zur gewinnung einer basischen aminosäure aus einer fermentationsbrühe ii - Google Patents

Verfahren zur gewinnung einer basischen aminosäure aus einer fermentationsbrühe ii

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EP1874944A1
EP1874944A1 EP06724320A EP06724320A EP1874944A1 EP 1874944 A1 EP1874944 A1 EP 1874944A1 EP 06724320 A EP06724320 A EP 06724320A EP 06724320 A EP06724320 A EP 06724320A EP 1874944 A1 EP1874944 A1 EP 1874944A1
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EP
European Patent Office
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amino acid
basic amino
acid
broth
fermentation broth
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06724320A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Jong-Soo Choi
Sung Hyun Kim
Tae-Hui Kim
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1874944A1 publication Critical patent/EP1874944A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C227/00—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C227/38—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C227/40—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • the present invention relates to a process for obtaining a basic amino acid from the fermentation broth of a basic amino acid-producing microorganism strain.
  • Basic amino acids such as L-lysine, L-histidine, L-arginine and L-omithine are predominantly produced by microbial fermentation processes (see, for example, Axel Kleemann et al., "Amino acids", in “Ullmann 's Encyclopedia of Industrial Chemistry", 5 th Edition on CD-ROM, 1997 Wiley-VCH and literature cited therein, Th. Hermann, J. Biotechnol., 104 (2003), pp. 155-172, and references cited therein; Pfefferle et al., Adv. Biochem And Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59-112 and references cited therein; and Atkinson et al., Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, 2 nd ed., Stockton Press, 1991, Chapter 20 and literature cited therein).
  • an aqueous fermentation broth is primarily obtained which, in addition to the desired basic amino acid and the biomass resulting from the microorganisms used, contains a large number of by-products and impurities, e.g. other amino acids, substrate residues, salts, cell lysis products, and other by-products.
  • the recovery of basic amino acids from the fermentation broth and their purification is frequently carried out using strongly acidic cation exchangers (see, for example, Th. Hermann, loc. Cit., Atkinson et al., Loc. Cit.).
  • the aqueous fermentation broth, before or after separation of the microorganisms and other insoluble constituents (biomass) is acidified with a strong acid such as sulfuric acid to a pH below 2, so that the basic amino acid is present as a dication.
  • the acidified aqueous broth is then passed over a strongly acidic cation exchanger, the acid groups of which are in the salt form, for example as sodium or ammonium salts, whereby the dication of the basic amino acid is adsorbed on the ion exchange resin.
  • the cation exchanger thus loaded with the basic amino acid is then usually washed with water to remove impurities.
  • the basic amino acid is eluted by treatment with a dilute aqueous base, for example, sodium hydroxide, ammonia water or an aqueous ammonium buffer, at the same time regenerating the salt form of the cation exchanger.
  • the basic amino acid optionally after acidification of the eluate, can be isolated in the usual way, for example by crystallization.
  • the liquid (effluent) draining off when the cation exchanger is loaded with the dication of the basic amino acid has a high salt concentration and is therefore often referred to as "High Density Waste Water” (HDWW).
  • High Density Waste Water (HDWW)
  • large amounts of sewage with salt load accumulate (“Low Density Waste Water” (LDWW)). This wastewater must be subjected to a complex wastewater treatment to reduce the salt load. Alternatively, you can drain the saline wastewater and dispose of the resulting concentrate or other use.
  • US Pat. No. 4,714,767 describes a multistage process for the removal of basic amino acids from an aqueous broth by means of an arrangement of a plurality of cation exchange columns connected in series, in which the last part of the effluent resulting from the loading of the first column is recycled to the subsequent separation in the loading process. It is also proposed to trace the last part of the eluate of the first column in the elution process of a later separation. In this way, the amount of water is reduced, but not the salt load.
  • the present invention is therefore based on the object to provide a process for obtaining basic amino acids from the fermentation broth of a basic amino acid-producing microorganism strain, which overcomes the disadvantages of the prior art described here and which in particular allows the reduction of the resulting wash water and salt and can be performed simultaneously with high efficiency, ie a high recovery rate of basic amino acid even at high loading and flow rates allowed.
  • this object is achieved by a process in which a) the fermentation broth is acidified with an acid whose pK s value in water is between 2 and 5 at 25 ° C., and b) the basic amino acid from the aqueous broth obtained in step a) by successive loading of a one-stage or a multistage, serial arrangement of a strongly acidic cation exchanger in its salt form with the in
  • Step a) obtained broth and eluting the basic amino acid with a basic eluent separated.
  • the present invention relates to the method of obtaining a basic amino acid from the fermentation broth of a basic amino acid-producing microorganism strain set forth herein and in the claims.
  • the process according to the invention has a number of advantages: on the one hand, because of the acid selected in step a), there is no appreciable precipitation of impurities which can block the cation exchanger and thus increase the need for washing water.
  • the amount of salt obtained in the process according to the invention and thus the salt load of the wastewater is lower than in the processes of the prior art, in which cation exchangers are used for separating and recovering the basic amino acid from the fermentation broth.
  • high yields of generally greater than 95% are achieved basic amino acid even at high loading and flow rates at the cation exchanger.
  • the fermentation broth is acidified in a first step with an acid whose pKa value at 25 ° C. is in the range from 2 to 5 and in particular in the range from 3 to 4.
  • the acid used is inert, d. H. no chemical change of the amino acid to be isolated, except for a protonation causes.
  • suitable acids include phosphoric acid, organic monocarboxylic acids preferably having 1 to 6 carbon atoms such as formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid and pentanoic acid, dicarboxylic acids having preferably 2 to 6 carbon atoms such as oxalic acid, malonic acid, maleic acid, fumaric acid, itaconic acid, Succinic acid, glutaric acid, adipic acid and sorbic acid, hydroxycarboxylic acids having preferably 1 to 3 carboxyl groups and at least one, eg 1, 2, 3 or 4 hydroxyl groups such as citric acid, glycolic acid and lactic acid and mixtures of these acids.
  • the acid is selected from the group of organic carboxylic acids and hydroxycarboxylic acids.
  • the acid is formic acid.
  • the amount of acid is preferably chosen so as to result in a pH of from 3.5 to 6.0 and especially in the range of from pH 4.0 to 5.5 in the broth.
  • 0.05 to 2 mol of acid, in particular 0.1 to 1 mol of acid and especially 0.15 to 0.5 mol of acid per kg of fermentation broth are preferably used for acidification.
  • part or most of the microorganisms contained in the fermentation broth and optionally any other solids present may be separated from the fermentation broth.
  • a separation of these components is not required in principle. Therefore, in a preferred embodiment of the invention, no separation of these components is made and the cation exchanger assembly is loaded directly with the acidified aqueous broth.
  • Separation of the microorganisms and other solid ingredients may, if desired, be employed in filtration, including cake and depth filtration, cross-flow filtration, by membrane separation techniques such as ultrafiltration and microfiltration, by centrifugation and decantation, for use in the separation of microorganisms of hydrocyclones or in any other way. It has proven useful to inactivate the microorganisms in the fermentation broth prior to separation (sterilization of the fermentation broth), for example by conventional pasteurization processes, such as by introduction of heat and / or superheated steam. For this purpose, usual heat exchanger, for example, tubular heat exchangers or plate heat exchangers are used.
  • step b) From the aqueous broth obtained in step a), the basic amino acid is subsequently separated off in step b) with the aid of a cation exchanger arrangement.
  • the separation in step b) according to the invention comprises at least one loading step in which the basic amino acid is adsorbed on the strongly acidic ion exchanger, and at least one elution step by which the basic amino acid is desorbed from the ion exchanger. These steps can be repeated several times in the order listed and water washing steps can be performed between the steps.
  • the cation exchange assembly used in the method of the invention comprises one or more, e.g. 2, 3 or 4, in series stages, usually in the form of ion exchange columns containing as stationary phase one or more strong acid cation exchangers.
  • ion exchange resins which have strongly acidic groups come into consideration as strongly acidic cation exchangers.
  • the average number of acidic groups is usually in the range of 1 to 4 meq / ml of ion exchange resin.
  • the average particle size of the ion exchanger particles is typically in the range of 0.1 to 1 mm, wherein larger and smaller particle sizes may be suitable depending on the dimensions of the ion exchanger arrangement.
  • the polymer particles may e.g. be gel-like or have a macroporous structure.
  • Such ion exchangers are known and are sometimes offered commercially for the purification of amino acids, for example under the trade names Lewatit® K or Lewatit® S from Bayer Aktiengesellschaft, eg Lewatit® K 2629, Lewatit® S110, Lewatit® S110H, Lewatit® S1467, Lewatit® S1468, Lewatit® S2568, Lewatit® S2568H, Amberjet®, Amberlyst® or Amberlite® from Rohm & Haas, eg Amberjet® 1200, Amberjet® 1500, Amberlite® 200, Amberlite® 250, Amberlite® IRV120, Amberlite® IR 120, Amberlite® IR 200C, Amberlite® CG 6000, Amberlyst® 119 Wet, Dowex® from Dow Chemicals, eg Dowex® 50X1-100, Dowex® 50X2-100, Dowex® 50X2- Dowex® 50X2-400, Dowex® 50X4-100, Dowex®
  • the cation exchanger assembly may be operated intermittently and then has one or more, e.g. 2, 3 or 4 fixed ion exchanger fixed beds connected in series. It may also be operated continuously and will typically have from 5 to 50 and especially from 15 to 40 ion exchange beds, e.g. Part of a "True Moving Bed” arrangement (see K. Tekeuchi J. Chem., Japan 11 (1978, pp.
  • the cation exchanger material present in the ion exchanger arrangement is present in its salt form, ie the strongly acidic groups of the cation exchanger are present in deprotonated form and coordinate a corresponding number of cations for charge neutrality.
  • the cations are alkali metal cations, in particular sodium ions or particularly preferably ammonium ions (NH 4 + ).
  • the acidified aqueous broth is passed in the customary manner through the cation exchanger arrangement.
  • the loading can be done both descending and ascending, the former being preferred.
  • the loading preferably takes place at a specific flow rate in the range of 0.1 h -1 to 2 h -1 .
  • the loading is preferably carried out at a temperature in the range of 20 to 7O 0 C and especially in the range from 30 to 6O 0 C.
  • the amount of aqueous broth is normally selected such that at least 35% and especially at least 42% of the aqueous in the broth contained basic amino acid are adsorbed.
  • the amount of aqueous broth is typically 0.8 times to 2 times the bed volume.
  • the effluent obtained at the outlet of the cation exchanger arrangement may still contain basic amino acid, so that the effluent, if appropriate after adjustment of the pH, can be passed to an ion exchanger in a subsequent stage.
  • the loading process can be followed by a wash session.
  • water is passed through the cation exchanger arrangement.
  • the amount of wash water at this stage is usually 0.05 to 0.3 times the bed volume.
  • the resulting wash water may contain small amounts of the basic amino acid and can then be combined with the accumulating during loading effluents.
  • such a washing step is not required so that a preferred embodiment of the process of the invention does not involve a wash step and elution occurs immediately after loading.
  • the loading or the optionally performed washing step is followed by the elution of the basic amino acid.
  • an aqueous solution of a base eluent
  • the base concentration in the eluent is usually in the range of 1 to 10% by weight, and more preferably in the range of 2 to 8% by weight.
  • Suitable bases are, for example, ammonia, alkali metal hydroxides and carbonates, with sodium hydroxide solution and in particular ammonia being preferred.
  • the amount of aqueous base is usually 0.5 to 3 times the amount of the bed volume. With regard to the temperatures and flow rate, that stated for loading applies.
  • the elution can be carried out both ascending and descending.
  • the elution can be carried out in the same direction as the loading or opposite thereto.
  • Elution may be followed by another wash step to remove any impurities present.
  • water is passed through the cation exchanger arrangement.
  • the amount of wash water at this stage is usually 0.05 to 0.3 times the bed volume.
  • the effluent obtained during the wash step is fed as wastewater with low salt load of a conventional wastewater treatment or other workup.
  • the eluate obtained in the elution is worked up in a conventional manner to recover the amino acid. In general, this will concentrate the eluate, e.g. by removing the water in a conventional evaporator arrangement.
  • a concentrated aqueous solution of the basic amino acid is obtained, from which it can be isolated by precipitation or crystallization, for example after addition of hydrochloric acid as the hydrochloride.
  • Methods for this purpose are known to the person skilled in the art and comprehensively described in the literature (eg Hermann T. Industrial Production of amino acids by coryneform bacteria, J. of Biotechnology, 104 (2003), 155-172).
  • the aqueous condensate produced during concentration can be discarded or returned to the process. For example, the condensate may be recycled to the basic amino acid elution step in a subsequent amino acid separation.
  • the condensate it is preferable to pass the condensate through the cation exchanger arrangement following elution with the aqueous base.
  • the resulting process often still contains small amounts of basic amino acid and is usually attributed to the elution of a subsequent amino acid separation.
  • the inventive method is basically applicable for the isolation of all basic amino acids, in particular natural amino acids such as lysine, ornithine, histidine or arginine and is used in particular for the isolation of fermentatively produced L-lysine.
  • the type of fermentation process as well as the microorganism strain used for the production of the amino acid play no part in the process according to the invention, so that the process according to the invention for the isolation of the basic amino acid from any fermentation broths is suitable.
  • such processes involve culturing a strain of microorganism which produces the desired basic amino acid in a fermentation medium containing as substrate at least one carbon source, e.g. Molasses and / or raw sugar, and a source of nitrogen, e.g. Ammonia or ammonium salts such as ammonium sulfate, and optionally minerals and trace elements.
  • substrate components may be used as such or in the form of a complex mixture, e.g. as cornstreep cerebrospinal fluid.
  • microorganism strain naturally depends on the type of amino acid to be produced. As a rule, these are strains which overproduce the desired basic amino acid.
  • ornithine and histidine are usually strains of the genus Corynebacterium or Brevi bacterium, for example the species Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium lactofermentum, in the case of arginine to strains of the species Bacillus s ⁇ btilis or Brevibacterium flavum, although more recently strains of other genera are used.
  • the fermentation will be carried out so far that the content of basic amino acid in the fermentation broth in the range of 50 to 200 g / L and in particular in the range of 80 to 150 g / L.
  • the fermentation broth usually still contains residual amounts of substrate, eg unused sugar (usually less than 40 g / l) and by-products of the fermentation, for example acidic or neutral amino acids or other basic amino acids, peptides and the like.
  • the pH is often in the range of> 6 to 7.5 and in particular in the range of 6.2 to 7.2.
  • the fermentation broth usually still contains residual amounts of substrate, eg unused sugar (usually less than 40 g / l) and by-products of the fermentation, for example acidic or neutral amino acids or other basic amino acids, peptides and the like.
  • the fermentation processes can be carried out continuously or batchwise as a batch or fed-batch process.
  • it is a fermentation broth prepared by a fed-batch process, i. the majority of the substrates are fed to the microorganism-containing broth during the course of the fermentation.
  • Such methods and suitable microorganism strains are known to those skilled in the art, e.g. from the cited prior art (see in particular Pfefferle et al., and Th. Herrmann, loc.cit) and from WO 95/16042, WO 96/06180, WO 96/16042, WO 96/41042, WO 01/09306, EP-A 175309, EP-A 327945, EP-A 551614, EP-A 837134, US 4346170, US 5305576, US 6025165, US 6653454, DE 253199, GB 851396, GB 849370 and GB 1118719 (production of L-lysine) EP-A 393708, GB 1098348, US 3668072, US 3574061, US 3532600, US 2988489, JP 2283290, JP 57016696 (L-ornithine), US 3902967, US 4086137, GB 2084566 (arginine)
  • HDWW Wastewater with high salt load
  • Lys-HCl L-lysine monohydrochloride
  • BV bed volume (volume of cation exchanger in the arrangement)
  • Comparative Example 1 and Examples 1 and 2 a cylindrical column having dimensions of 125 mm (ID) ⁇ 495 mm (H) and loaded with 3000 ml of a strongly acidic cation exchange resin was used as the cation exchanger assembly.
  • the cation exchanger used was a sulfonated, crosslinked polystyrene of the gel type having an average particle size of about 0.6 mm (DIAION SK1 B from Samyang Co. Ltd. Korea) and a total capacity of> 2 meq / ml.
  • the cation exchanger used was a sulfonated, crosslinked polystyrene of the gel type having an average particle size of about 0.6 mm (DIAION SK1 B from Samyang Co. Ltd. Korea) and a total capacity of> 2 meq / ml.
  • Cation exchanger assembly was equilibrated with 6% by weight aqueous ammonia prior to use.
  • Example 3 a SepTor pilot system (Model 30-6, Tom's Liquid Separation, Holland) loaded with 22.8 L of strongly acidic cation exchange resin was used as the cation exchanger assembly.
  • the cation exchanger used was a sulfonated, crosslinked polystyrene of the gel type having an average particle size of about 0.6 mm (DIAION SK1 B from Samyang Co. Ltd. Korea) and a total capacity of> 2 meq / ml.
  • a fermentation broth with a lysine content of 12.5% by weight and a biomass content of 3% by weight was acidified to a pH of 1.5 with 5.8 g of concentrated sulfuric acid per 100 g of broth.
  • 5.5 L of the acidified fermentation broth was passed from bottom to top through the cation exchanger assembly at a temperature of 45 ° C at a specific flow rate of 1 hr -1
  • the amount of lysine contained in the broth passed was equivalent to 210 g Lys-HCl per liter of ion - exchange resin
  • the column with 3.4 L of water at a specific flow rate of 2 h '1 the column is rinsed then allowed to run empty the presence... Falling effluents were collected and the amount of lysine determined. From this, an amount of adsorbed lysine was calculated to be 95.7 g per liter of resin.
  • the lysine content of the eluate was determined. From this, a recovery rate of 98% based on adsorbed Lys-HCl was calculated.
  • a fermentation broth with a lysine content of 12.5% by weight and a biomass content of 3% by weight was acidified to a pH of 4.1 with 1 g of 87% strength by weight formic acid per 100 g of broth.
  • 5.5 I of the acidified fermentation broth was at a temperature of 45 0 C at a specific flow rate of 1 h "1 from top to passed down through the cation.
  • the amount of lysine in the feed-through liquor corresponded to 210 g of Lys-HCl per liter ion exchange resin.
  • the resulting effluents were collected and the amount of lysine determined, from which an amount of adsorbed lysine was calculated to be 88.2 g per liter of resin.
  • the eluate was collected and the lysine content determined. From this, a recovery rate of 98% based on adsorbed Lys-HCl was calculated. A washing step was not required.
  • a fermentation broth with a lysine content of 12.5% by weight and a biomass fraction of 3% by weight was acidified to a pH of 3.6 with 3 g of 87% strength by weight formic acid per 100 g of broth and the cell mass was centrifuged separated. The resulting broth contains ⁇ 0.5 wt% cells. 4 l of this aqueous broth were passed from top to bottom through the cation exchanger arrangement at a specific flow rate of 1 h -1 at a temperature of 45 ° C. The amount of lysine in the broth passed through corresponded to 170 g of Lys-HCl per ion exchange resin.
  • dropping effluent was collected and the amount of lysine determined, from which an amount of adsorbed lysine was calculated to be 107 g per liter of resin.
  • 6 L of a 6% w / v aqueous ammonia solution was passed through the cation exchanger arrangement from top to bottom at a specific flow rate of 1 h -1 at a temperature of 45 ° C.
  • the lysine content of the eluate was determined. From this, a recovery rate of 95% based on adsorbed Lys-HCl was calculated.
  • a fermentation broth with a lysine content of 12.5% by weight and a biomass content of 3% by weight was acidified to a pH of 3.2 with 6 g of 87% strength by weight formic acid per 100 g of broth and the cell mass was centrifuged separated.
  • the resulting broth contains ⁇ 0.5 wt% cells. 19.1 l of this aqueous broth were passed from top to bottom through the cation exchanger arrangement at a temperature of 45 ° C. at a specific flow rate of 0.36 h -1 .
  • the amount of lysine in the passed broth corresponded to 105 g Lys-HCl per ion exchange resin
  • the resulting effluent was collected and the amount of lysine determined, from which an amount of adsorbed lysine was calculated to be 100 g per liter of resin.
  • the lysine content of the eluate was determined. From this, a recovery rate of 95% based on adsorbed Lys-HCl was calculated.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus der Fermentationsbrühe eines die basische Aminosäure produzierenden Mikroorganis menstamms, bei dem man a) die Fermentationsbrühe mit einer Säure, deren pKs-Wert in Wasser bei 25°C im Bereich von 2 bis 5 liegt, ansäuert und b) die basische Aminosäure aus der in Schritt a) erhaltenen wässrigen Brühe durch sukzessives Beladen einer einstufigen oder einer mehrstufigen, seriellen Anord nung eines stark sauren Kationenaustauschers in seiner Salzform mit der in Schritt a) erhaltenen Brühe und Eluieren der basischen Aminsäure mit einem ba sischen Eluens abtrennt.

Description

Verfahren zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus einer Fermentationsbrühe Il
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus der Fermentationsbrühe eines die basische Aminosäure produzierenden Mikroorganismenstamms.
Basische Aminosäuren wie L-Lysin, L-Histidin, L-Arginin und L-Omithin werden über- wiegend durch mikrobielle Fermentationsverfahren hergestellt (s. z.B. Axel Kleemann et al., „Amino acids", in „Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry", 5th Edition on CD-ROM, 1997 Wiley-VCH und dort zitierte Literatur; Th. Hermann, J. Biotechnol. 104 (2003), S. 155 - 172 und dort zitierte Literatur; Pfefferle et al., Adv. Biochem. Eng./Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59 - 112 und dort zitierte Literatur; sowie Atkinson et al., in Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, 2nd ed., Stockton Press, 1991 , Kapitel 20 und dort zitierte Literatur).
Bei derartigen Fermentationsverfahren erhält man primär eine wässrige Fermentationsbrühe, welche neben der gewünschten basischen Aminosäure und der aus den einge- setzten Mikroorganismen resultierenden Biomasse eine Vielzahl an Nebenprodukten und Verunreinigungen, z.B. andere Aminosäuren, Substratreste, Salze, Produkte der Zelllyse, und sonstige Nebenprodukte enthält.
Die Gewinnung basischer Aminosäuren aus der Fermentationsbrühe und ihre Aufreini- gung erfolgt häufig unter Anwendung von stark sauren Kationentauschern (s. z.B. Th. Hermann, loc.cit; Atkinson et al., loc. cit.). Zu diesem Zweck wird die wässrige Fermentationsbrühe, vor oder nach Abtrennung der Mikroorganismen und sonstiger unlöslicher Bestandteile (Biomasse), mit einer starken Säure wie beispielsweise Schwefelsäure auf einen pH-Wert unterhalb 2 angesäuert, so dass die basische Aminosäure als Dikation vorliegt. Die angesäuerte wässrige Brühe wird dann über einen stark sauren Kationen- tauscher, dessen Säuregruppen in der Salzform vorliegen, z.B. als Natrium- oder Ammoniumsalze, geleitet, wodurch das Dikation der basischen Aminosäure auf dem lonen- austauscherharz adsorbiert wird. Der so mit der basischen Aminosäure beladene Kationenaustauscher wird üblicherweise danach zur Entfernung von Verunreinigungen mit Wasser gewaschen. Anschließend wird die basische Aminosäure durch Behandlung mit einer verdünnten wässrigen Base, beispielsweise Natronlauge, Ammoniakwasser oder ein wässrigen Ammoniumpuffer, eluiert, wobei gleichzeitig die Salzform des Kationenaustauschers regeneriert wird. Aus dem so gewonnenen Eluat kann die basische Aminosäure, gegebenenfalls nach Ansäuern des Eluats, in üblicher weise isoliert werden, z.B. durch Kristallisation. Naturgemäß weist die beim Beladen des Kationenaustauschers mit dem Dikation der basischen Aminosäure ablaufende Flüssigkeit (Ablauf bzw. Effluent) eine hohe Salzkonzentration auf und wird daher häufig auch als "High Density Waste Water" (HDWW) bezeichnet. Auch bei dem sich gegebenenfalls anschließenden Waschschritt fallen große Abwassermengen mit Salzfracht an ("Low Density Waste Water " (LDWW)). Diese Abwässer müssen zur Verringerung der Salzfracht einer aufwändigen Abwasserbehandlung unterzogen werden. Alternativ kann man die salzhaltigen Abwässer entwässern und das dabei anfallende Konzentrat entsorgen oder einer anderen Verwendung zuführen. Beide Maßnahmen sind jedoch mit einem zusätzlichen apparativen Aufwand und einem hohen Energieaufwand verbunden und tragen daher zu einem nicht unbeträchtlichen Anteil zu den Kosten der fermentativen Aminosäureherstellung bei. Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, die Salzfracht und die Abwassermenge, welche bei einer Aufarbeitung von basische Aminosäure enthaltenden Fermentationsbrühen mittels Kationenaustauscher anfallen, zu reduzieren.
Ein weiterer Nachteil ist die beim Ansäuern auftretende Niederschlagsbildung, die zu einem Verstopfen der Kationenaustauscheranordnung führen kann. Zudem sind zusätzliche Waschschritte erforderlich, um die Verunreinigungen von den Kationenaustauschermaterialien zu entfernen.
Die US 4,714,767 beschreibt ein mehrstufiges Verfahren zur Abtrennung basischer A- minosäuren aus einer wässrigen Brühe mittels einer Anordnung von mehreren, in Serie geschalteten Kationenaustauschersäulen, bei dem man den letzten Teil des beim Beladen der ersten Säule anfallenden Effluenten in den Beladungsvorgang einer späteren Abtrennung zurückführt. Auch wird vorgeschlagen, den letzten Teil des Eluats der ersten Säule in den Elutionsvorgang einer späteren Abtrennung zurückzuführen. Auf diese Weise wird die Wassermenge reduziert, nicht jedoch die Salzfracht.
Hsiao et al., Biotechnology and Bioengineering Vol. 49 (1996) S. 341 - 347, schlagen zur Verringerung der Abwassermenge die Rückführung der am Kationenaustauscher anfallenden salzhaltigen Effluente in das Fermentationsmedium vor. Neben der Gefahr, dass hierdurch Fermentationsinhibitoren, welche im Metabolismus der Mikroorganismen üblicherweise als Nebenprodukte gebildet werden, im Fermentationsmedium akkumulieren, hat sich gezeigt, dass hierbei die Bindungskapazität des Kationenaustauschers herbgesetzt wird, sodass die durch die verringerte Abwassermenge erreichte Kostenersparnis durch die Kosten für eine größere Kationenaustauscheranordnung aufgezehrt werden.
I. Lee et al., Enzyme and Microbiol. Technol. 30 (2002) S. 798 803, schlagen zur Verrin- gerung der Salzfracht bei der Aufarbeitung Lysin-haltiger Fermentationsbrühen den Einsatz der lonenausschlusschromatographie anstelle des üblicherweise eingesetzten Ka- tionenaustauschers vor. Hierzu wird zunächst der Feststoffanteil der Fermentationsbrühe mittels Mikrofiltration entfernt. Die so erhaltene wässrige, Lysin-haltige Brühe wird auf den isoelektrischen Punkt (pH 9,74) eingestellt und dann durch einen Kationentauscher geleitet. Da die ionischen Bestandteile der Brühe nicht absorbiert werden, finden sich diese im Effluenten wieder. Die Aminosäure wird anschließend mit Wasser eluiert. Es hat sich jedoch gezeigt, dass eine hohe Wiedergewinnungsrate an L-Lysin von mehr als 90% nur dann erreicht wird, wenn sowohl die Menge an Lysin-haltigem Feed als auch die Durchflussrate gering sind. Trotz der geringeren Salzfracht ist daher diese Aufarbeitungsform nicht wirtschaftlich.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung basischer Aminosäuren aus der Fermentationsbrühe eines die basische Aminosäure produzierenden Mikroorganismenstamms bereitzustellen, das die hier geschilderten Nachteile des Standes der Technik überwindet und das insbesondere die Verringe- rung der anfallenden Waschwasser und Salzmenge ermöglicht und gleichzeitig mit hoher Effizienz durchgeführt werden kann, d.h. eine hohe Wiedergewinnungsrate an basischer Aminosäure auch bei hohen Beladungs- und Fließraten erlaubt.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass diese Aufgabe durch ein Verfahren ge- löst wird, bei dem man a) die Fermentationsbrühe mit einer Säure, deren pKs-Wert in Wasser bei 25°C im Bereich von 2 bis 5 liegt, ansäuert und b) die basische Aminosäure aus der in Schritt a) erhaltenen wässrigen Brühe durch sukzessives Beladen einer einstufigen oder einer mehrstufigen, seriellen Anord- nung eines stark sauren Kationenaustauschers in seiner Salzform mit der in
Schritt a) erhaltenen Brühe und Eluieren der basischen Aminsäure mit einem basischen Eluens abtrennt.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung das hier und in den Ansprüchen dargelegte Verfahren zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus der Fermentationsbrühe eines die basische Aminosäure produzierenden Mikroorganismenstamms.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit einer Reihe von Vorteilen verbunden: zum einen tritt aufgrund der in Schritt a) gewählten Säure keine nennenswerte Ausfällung von Verunreinigungen auf, welche den Kationenaustauscher blockieren können und auf diese Weise den Bedarf an Waschwasser erhöhen. Zudem ist die beim erfindungsgemäßen Verfahren anfallende Salzmenge und damit die Salzfracht des Abwassers geringer als in den Verfahren des Standes der Technik, bei denen Kationenaustauscher zur Abtrennung und Gewinnung der basischen Aminosäure aus der Fermentationsbrühe ge- nutzt werden. Zudem erreicht man hohe Ausbeuten von in der Regel größer 95% an basischer Aminosäure auch bei hohen Beladungs- und Durchflussraten am Kationenaustauscher.
Erfindungsgemäß säuert man in einem ersten Schritt die Fermentationsbrühe mit einer Säure an, deren pKS-Wert bei 25°C im Bereich von 2 bis 5 und insbesondere im Bereich von 3 bis 4 liegt. Es versteht sich von selber, dass die eingesetzte Säure inert ist, d. h. keine chemische Veränderung der zu isolierenden Aminosäure, abgesehen von einer Protonierung, bewirkt.
Beispiele für geeignete Säuren umfassen Phosphorsäure, organische Monocarbonsäu- ren mit vorzugsweise 1 bis 6 C-Atomen wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Butyrsäure und Pentansäure, Dicarbonsäuren mit vorzugsweise 2 bis 6 C-Atomen wie Oxalsäure, Malonsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Itaconsäure, Bernsteinsäure, Glutar- säure, Adipinsäure und Sorbinsäure, Hydroxycarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 3 Carboxylgruppen sowie mit wenigstens einer, z.B. 1 , 2, 3 oder 4 Hydroxylgruppen wie Zitronensäure, Glykolsäure und Milchsäure und Mischungen dieser Säuren. Bevorzugt ist die Säure aus der Gruppe der organischen Carbonsäuren und der Hydroxycarbonsäuren ausgewählt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Säure um Ameisensäure.
Die Menge an Säure wird vorzugsweise so gewählt, dass in der Brühe ein pH-Wert von 3,5 bis 6,0 und insbesondere im Bereich von pH 4,0 bis 5,5 resultiert. Vorzugsweise setzt man zum Ansäuern 0,05 bis 2 mol Säure, insbesondere 0,1 bis 1 mol Säure und speziell 0,15 bis 0,5 mol Säure pro kg Fermentationsbrühe ein.
Gegebenenfalls kann man vor oder nach dem Ansäuern einen Teil oder die Hauptmenge der in der Fermentationsbrühe enthaltenen Mikroorganismen und gegebenenfalls sonstige, vorhandene Feststoffe aus der Fermentationsbrühe abtrennen. Eine Abtrennung dieser Bestandteile ist prinzipiell nicht erforderlich. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung keine Abtrennung dieser Bestandteile vorgenommen und die Kationenaustauscheranordnung wird direkt mit der angesäuerten wässrigen Brühe beladen.
Das Abtrennen der Mikroorganismen und sonstiger fester Bestandteile kann, sofern gewünscht, in für die Abtrennung von Mikroorganismen üblicher Weise durch Filtration einschließlich Kuchen- und Tiefenfiltration, Cross-Flow-Filtration, durch Membrantrennverfahren wie Ultra- und Mikrofiltration, durch Zentrifugation und Dekantieren, durch Einsatz von Hydrozyklonen oder in sonstiger Weise erfolgen. Es hat sich bewährt, vor der Abtrennung die Mikroorganismen in der Fermentationsbrühe zu inaktivieren (Sterili- sieren der Fermentationsbrühe), beispielsweise durch übliche Pasteurisierungsverfah- ren wie durch Eintrag von Wärme und/oder Heißdampf. Hierzu können übliche Wärme- tauscher, beispielsweise Rohrbündelwärmetauscher oder Plattenwärmetauscher eingesetzt werden.
Aus der in Schritt a) erhaltenen wässrigen Brühe wird anschließend in Schritt b) die ba- sische Aminosäure mit Hilfe einer Kationenaustauscheranordnung abgetrennt. Die Abtrennung in Schritt b) umfasst erfindungsgemäß wenigstens einen Beladungsschritt, bei der die basische Aminosäure auf dem stark sauren Ionenaustauscher adsorbiert wird, und wenigstens einen Elutionschritt, durch den die basische Aminosäure vom Ionenaustauscher desorbiert wird. Diese Schritte können in der angegebenen Reihenfolge mehr- fach wiederholt werden und es können zwischen den Schritten Waschschritte mit Wasser durchgeführt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Kationenaustauscheranordnung umfasst einen oder mehrere, z.B. 2, 3 oder 4, in Serie geschaltete Stufen, üblicherweise in Form von lonenaustauschersäulen, die als stationäre Phase einen oder mehrere stark saure Kationenaustauscher enthalten.
Als stark saure Kationenaustauscher kommen grundsätzlich alle lonenaustauscherharze in Betracht, die stark saure Gruppen, in der Regel Sulfonatgruppen, aufweisen. In der Regel handelt es sich um partikelförmige, mäßig oder stark vernetzte organische Polymere, häufig auf der Basis von Polystyrol, die an der Oberfläche der Polymerpartikel eine Vielzahl stark saure Gruppen aufweisen. Die durchschnittliche Anzahl der sauren Gruppen liegt üblicherweise im Bereich von 1 bis 4 meq/ml lonentauscherharz. Die mittlere Teilchengröße der lonentauscherpartikel liegt typischerweise im Bereich von 0,1 bis 1 mm, wobei größere als auch kleinere Teilchengrößen je nach Abmessung der lonen- tauscheranordnung geeignet sein können. Die Polymerteilchen können z.B. gel-artig sein oder eine makroporöse Struktur aufweisen.
Derartige lonentauscher sind bekannt und werden z.T. kommerziell für die Aufreinigung von Aminosäuren angeboten, beispielsweise unter den Handelsbezeichnungen Lewa- tit® K oder Lewatit® S der Fa. Bayer Aktiengesellschaft, z.B. Lewatit® K 2629, Lewatit® S110, Lewatit® S110H, Lewatit® S1467, Lewatit® S1468, Lewatit® S2568, Lewatit® S2568H, Amberjet®, Amberlyst® oder Amberlite® der Fa. Rohm & Haas, z.B. Amber- jet® 1200, Amberjet® 1500, Amberlite® 200, Amberlite® 250, Amberlite® IRV120, Am- berlite® IR 120, Amberlite® IR 200C, Amberlite® CG 6000, Amberlyst® 119 Wet, Do- wex® der Firma Dow Chemicals, z.B. Dowex® 50X1-100, Dowex® 50X2-100, Dowex® 50X2-200, Dowex® 50X2-400, Dowex® 50X4-100, Dowex® 50X4-200, Dowex® 50X4- 400, Dowex® 50X8-100, Dowex® 50X8-200, Dowex® 50X8-400, Dowex® 40X1-100, Dowex® 40X1-100, Dowex® 40X1-100, Dowex® HCR-S, Dowex® HCR-W2, Dowex® MSC-1 , Dowex® 650C, Dowex® G26, Dowex® 88, Dowex® Monosphere 88, Dowex® Monosphere 99K/320, Dowex® Monosphere 99K/350, Dowex® Monosphere 99Ca/320, Dowex® Marathon C, Dowex® 032, Dowex® 406, Dowex® 437, Dowex® C500ES, Dowex® XUS 43518, Dowex® XUS 40406.00, Diaion® der Fa. Mitsubishi Corp., z.B. Diaion® SK1 B, Diaion® SK1 BS, Diaion® SK104, Diaion® SK112, Diaion® SK116, Diaion® 1-3561 , Diaion® 1-3565, Diaion® 1-3570, Diaion® 1-3573, Diaion® 1-3577, Diai- on® 1-3581 , Duolite® D 5427, Duolite® D 5552 (organisch basierte Kationenaustauscher), weiterhin Adsorbosphere® SCX, Bakerbond® SCX, Partisil® SCX, Spherisorb® SCX, Supelcosil® LC3-SCX, Ultralsil® SCX und Zorbax® 300 SCX (Silica-basierter Kationenaustauscher).
Die Kationenaustauscheranordnung kann absatzweise betrieben werden und weist dann ein oder mehrere, z.B. 2, 3 oder 4 in Serie geschaltete, stationäre lonentauscher- festbetten auf. Sie kann auch kontinuierlich betrieben werden und weist dann in der Regel 5 bis 50 und insbesondere 15 bis 40 lonentauscherbetten auf, die z.B. Bestandteil einer "True Moving Bed"-Anordnung (siehe K. Tekeuchi J. Chem. Eng. Japan 11 (1978 S. 216-220), einer "Continuos Circulating Annular"-Anordnung (siehe J. P. Martin, Dis- cuss. Farraday Soc. 1949, S. 7) oder einer "Simulated Moving Bed"-Anordnung, wie beispielsweise in US 2,985,589 und WO 01/72689 sowie von GJ. Rossiter et al. Pro- ceedings of AIChE Conference, Los Angeles, CA, Nov. 1991 oder HJ. Van Walsem et al. J. Biochtechnol. 59 (1997) S 127-123 beschrieben, sein können.
Vor dem Beladen des Kationenaustauschers mit der abzutrennenden basischen Aminosäure liegt das in der lonenaustauscheranordnung enthaltene Kationenaustauschermaterial in seiner Salzform vor, d.h. die stark sauren Gruppen des Kationenaustauschers liegen in deprotonierter Form vor und koordinieren zur Ladungsneutralität eine entspre- chende Anzahl an Kationen. In der Regel handelt es sich bei den Kationen um Alkalimetallkationen, insbesondere um Natriumionen oder besonders bevorzugt um Ammoniumionen (NH4 +).
Zum Beladen des Kationenaustauscher mit der basische Aminosäure leitet man die an- gesäuerte wässrige Brühe in üblicher weise durch die Kationenaustauscheranordnung. Die Beladung kann sowohl absteigend als auch aufsteigend erfolgen, wobei ersteres bevorzugt ist. Die Beladung erfolgt vorzugsweise mit einer spezifischen Fließrate im Bereich von 0,1 h"1 bis 2 h"1. Die Beladung erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 7O0C und insbesondere im Bereich von 30 bis 6O0C. Die Menge an wässriger Brühe wird üblicherweise so gewählt, dass wenigstens 35% und insbesondere wenigstens 42 % der in der wässrigen Brühe enthaltenen basischen Aminosäure adsorbiert werden. Die Menge an wässriger Brühe beträgt in der Regel die 0,8-fache bis 2- fache Menge des Bettvolumens. Je nach Adsorptionsgrad kann der am Ausgang der Kationenaustauscheranordnung anfallende Effluent noch basische Aminosäure enthal- ten, so dass der Effluent, ggf. nach Einstellung des pH-Werts, in einer nachfolgenden Stufe auf einen lonentauscher geleitet werden kann. Dem Beladungsvorgang kann sich ein Wasch seh ritt anschließen. Hierzu wird Wasser durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Menge an Waschwasser beträgt auf dieser Stufe üblicherweise das 0,05- bis 0,3 -fache des Bettvolumens. Die dabei anfallenden Waschwässer können geringe Mengen der basischen Aminosäure enthalten und können dann mit dem beim Beladen anfallenden Effluenten vereinigt werden. Anders als in den Verfahren des Standes der Technik ist ein solcher Waschschritt nicht erforderlich, so dass eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens keinen Waschritt umfasst und die Elution unmittelbar im Anschluss an das Beladen erfolgt .
Dem Beladungs- bzw. dem gegebenenfalls durchgeführten Waschschritt schließt sich die Elution der basischen Aminosäure an. Hierzu leitet man eine wässrige Lösung einer Base (Eluent) durch die Kationenaustauscheranordnung. Hierdurch wird die basische Aminosäure desorbiert und eluiert und der Kationenaustauscher regeneriert, d.h. die sauren Gruppen des Kationenaustauschers werden wieder in die Salzform überführt. Die Basenkonzentration in dem Eluenten liegt üblicherweise im Bereich von 1 bis 10 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 2 bis 8 Gew.-%. Geeignete Basen sind beispielsweise Ammoniak, Alkalimetallhydroxide und -carbonate, wobei Natronlauge und insbesondere Ammoniak bevorzugt werden. Die Menge an wässriger Base beträgt in der Regel die 0,5- bis 3-fache Menge des Bettvolumens. Bezüglich der Temperaturen und Fließrate gilt das für das Beladen gesagte. Die Elution kann sowohl aufsteigend als auch absteigend durchgeführt werden. Die Elution kann in der gleichen Richtung wie die Beladung oder entgegengesetzt hierzu durchgeführt werden.
Der Elution kann sich ein weiterer Waschschritt anschließen, um gegebenenfalls vorhandene Verunreinigungen zu entfernen. Hierzu wird Wasser durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Menge an Waschwasser beträgt auf dieser Stufe üblicherweise das 0,05- bis 0,3-fache des Bettvolumens. Der beim Waschritt anfallende Effluent wird als Abwasser mit geringer Salzfracht einer üblichen Abwasserbehandlung oder einer sonstigen Aufarbeitung zugeführt.
Das bei der Elution anfallende Eluat wird zur Gewinnung der Aminosäure in üblicher Weise aufgearbeitet. In der Regel wird man hierzu das Eluat aufkonzentrieren, z.B. durch Entfernen des Wasser in einer üblichen Verdampferanordnung.
Auf diese Weise erhält man eine konzentrierte wässrige Lösung der basischen Aminosäure, aus der diese durch Fällung oder Kristallisation, z.B. nach Zusatz von Salzsäure als Hydrochlorid, isoliert werden kann. Verfahren hierzu sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur umfassend beschrieben (z.B. Hermann T. Industrial Production of amino aeids by coryneform bacteria, J. of Biotechnology, 104(2003), 155-172). Das beim Aufkonzentrieren anfallende wässrige Kondensat kann verworfen oder in den Prozess zurückgeführt werden. Beispielsweise kann das Kondensat in den Elutions- schritt der basischen Aminosäure in einer nachfolgenden Aminosäureabtrennung zu- rückgeführt werden. Vorzugsweise wird man hierzu das Kondensat im Anschluss an die Elution mit der wässrigen Base durch die Kationenaustauscheranordnung leiten. Der dabei anfallende Ablauf enthält häufig noch geringen Mengen an basischer Aminosäure und wird üblicherweise in die Elution einer nachfolgenden Aminosäureabtrennung zurückgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich für die Isolierung aller basischen Aminsäuren, insbesondere natürlicher Aminosäuren wie Lysin, Ornithin, Histidin oder Arginin anwendbar und wird insbesondere zur Isolierung von fermentativ hergestelltem L-Lysin eingesetzt.
Die Art des Fermentationsprozessese sowie der zur Herstellung der Aminosäure eingesetzte Mikroorganismenstamm spielen für das erfindungsgemäße Verfahren keine Rolle, so dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung der basischen Aminosäure aus beliebigen Fermentationsbrühen geeignet ist. In der Regel handelt es sich um sol- che Verfahren, bei denen man einen Mikroorganismenstamm, der die gewünschte basische Aminosäure produziert, in einem Fermentationsmedium kultiviert, das als Substrat mindestens eine Kohlenstoffquelle, z.B. Melasse und/oder Rohzucker, und eine Stickstoffquelle, z.B. Ammoniak oder Ammoniumsalze wie Ammoniumsulfat, sowie gegebenenfalls Mineralstoffe und Spurenelemente enthält. Diese Substratbestandteile können als solche oder in Form einer komplexen Mischung, z.B. als Corn-Streep-Liquor, eingesetzt werden.
Die Art des Mikroorganismenstamms richtet sich naturgemäß nach der Art der zu produzierenden Aminosäure. In der Regel handelt es sich um Stämme, welche die ge- wünschte basische Aminosäure überproduzieren. Im Falle des L-Lysins, des Ornithins und des Histidins handelt es sich in der Regel um Stämme der Gattung Corynebacteri- um oder Brevi bacterium, z.B der Spezies Corynebacterium glutamicum oder Brevibac- terium lactofermentυm, im Falle des Arginins um Stämme der Spezies Bacillus sυbtilis oder Brevibacterium flavum, wobei jedoch in jüngerer Zeit auch Stämme anderer Gat- tungen eingesetzt werden.
In der Regel wird man die Fermentation so weit führen, dass der Gehalt an basischer Aminosäure in der Fermentationsbrühe im Bereich von 50 bis 200 g/L und insbesondere im Bereich von 80 bis 150 g/L liegt. Der Anteil an Biomasse, d.h. Mikroorganismen (als Biotrockenmasse) und sonstige unlösliche Bestandteile biologischen Ursprungs (z.B. Zellulosefasern aus der Glukosequelle), liegt üblicherweise im Bereich von 3 bis 7 Gew.- %. Daneben enthält die Fermentationsbrühe in der Regel noch Restmengen an Substrat, z.B. nicht verbrauchter Zucker (üblicherweise weniger als 40 g/l) sowie Nebenprodukte der Fermentation, z.B. saure oder neutrale Aminosäuren oder sonstige basische Aminsäuren, Peptide und dergleichen. Der pH-Wert liegt häufig im Bereich von > 6 bis 7,5 und insbesondere im Bereich von 6,2 bis 7,2. Daneben enthält die Fermentationsbrühe in der Regel noch Restmengen an Substrat, z.B. nicht verbrauchter Zucker (üblicherweise weniger als 40 g/l) sowie Nebenprodukte der Fermentation, z.B. saure oder neutrale Aminosäuren oder sonstige basische Aminsäuren, Peptide und dergleichen.
Die Fermentationsverfahren können kontinuierlich oder absatzweise als Batch- oder Fed-Batch-Verfahren durchgeführt werden. In der Regel handelt es sich um eine Fermentationsbrühe, die nach einem Fed-Batch-Verfahren hergestellt wurde, d.h. die Hauptmenge der Substrate wird der Mikroorganismen-haltigen Brühe im Verlauf der Fermentation zugeführt.
Derartige Verfahren und geeignete Mikroorganismenstämme sind dem Fachmann bekannt, z.B. aus dem eingangs zitierten Stand der Technik (siehe insbesondere Pfefferle et al. und Th. Herrmann, loc.cit) sowie aus WO 95/16042, WO 96/06180, WO 96/16042, WO 96/41042, WO 01/09306, EP-A 175309, EP-A 327945, EP-A 551614, EP-A 837134, US 4346170, US 5305576, US 6025165, US 6653454, DE 253199, GB 851396, GB 849370 und GB 1118719 (Herstellung von L-Lysin), EP-A 393708, GB 1098348, US 3668072, US 3574061 , US 3532600, US 2988489, JP 2283290, JP 57016696 (L-Ornithin), US 3902967, US 4086137, GB 2084566 (Arginin) US 3875001 und US 3902966 (Histidin) bekannt.
Die Maßnahmen zur technischen Durchführung und Steuerung derartiger Fermenatio- nen sind dem Fachmann geläufig und kann der einschlägigen Literatur, beispielsweise Storhas (s.o.) und J.E. Bailey et al. Biochemical Engineering Fundamentals, 2. ed. MacGraw-Hill 1986, Kapitel 9, entnommen werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele erläutert, die bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellen und nicht einschränkend zu verstehen sind.
Verwendete Abkürzungen:
HDWW: Abwasser mit hoher Salzfracht
LDWW: Abwasser mit geringer Salzfracht
ID: Innendurchmesser H: Höhe
Lys-HCI: L-Lysin-Monohydrochlorid BV: Bettvolumen (Volumen des Kationenaustauschers in der Anordnung)
SV: spezifische Fließrate (Fließgeschwindigkeit in 1 BV/H)
Einsatzmaterialien:
Alle Versuche wurden mit einer L-Lysin-haltigen Fermentationsbrühe durchgeführt, die in an sich bekannter Weise durch Fermentation mit C. glutamicum hergestellt wurde. Die Fermentationsbrühe wies einen Gehalt an Lys-HCI von 110 bis 130 g/l und einen Gehalt an Biomasse (als Biotrockenmasse gerechnet) von 2,5 -3,5 Gew.-% auf. Der Salzgehalt lag zwischen 3 und 5 Gew.-%.
Kationenaustauscheranordnung
In Vergleichsbeispiel 1 und den Beispielen 1 und 2 diente als Kationenaustauscheranordnung jeweils eine zylindrische Säule mit den Abmessungen 125 mm (ID) x 495 mm (H), die mit 3000 ml eines stark sauren Kationenaustauscherharzes beladen war. Als Kationenaustauscher diente ein sulfoniertes, vernetztes Polystyrol vom Geltyp mit einer mittleren Teilchengröße von etwa 0,6 mm (DIAION SK1 B der Firma Samyang Co. Ltd. Korea) und einer Gesamtkapazität > 2 meq/ml. Die
Kationenaustauscheranordnung wurde vor ihrer Benutzung mit 6 gew.-%igem wässrigem Ammoniak äquilibriert.
In Beispiel 3 diente als Kationenaustauscheranordnung eine SepTor pilot Anlage (Model 30-6, Toms Liquid Separation, Holland), die mit 22,8 L stark saurem Kationenaustauscherharz beladen war. Als Kationenaustauscher diente ein sulfoniertes, vernetztes Polystyrol vom Geltyp mit einer mittleren Teilchengröße von etwa 0.6 mm (DIAION SK1 B der Firma Samyang Co. Ltd. Korea) und einer Gesamtkapazität > 2 meq/ml.
Vergleichsbeispiel 1
Eine Fermentationsbrühe mit einem Lysingehalt von 12,5 Gew.-% und einem Biomasseanteil von 3 Gew.-% wurde mit 5,8 g konzentrierter Schwefelsäure je 100 g Brühe auf einen pH-Wert von 1 ,5 angesäuert. 5,5 L der angesäuerten Fermentationsbrühe wurden bei einer Temperatur von 45 °C mit einer spezifischen Fließrate von 1 h"1 von unten nach oben durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Lysinmenge in der durchgeleiteten Brühe enthaltene Lysinmenge entsprach 210 g Lys-HCI je Liter lonen- austauscherharz. Danach wurde die Säule mit 3,4 L Wasser mit einer spezifischen Fliessrate von 2 h'1 nachgespült. Anschließend ließ man die Säule leer laufen. Der an- fallende Effluent wurden aufgefangen und hierin die Menge an Lysin bestimmt. Hieraus errechnete sich eine Menge an adsorbiertem Lysin zu 95,7 g je Liter Harz.
Anschließend wurde zur Elution des L-Lysins 6 I einer 3 w/v-%-igen wässrigen Ammoni- aklösung von oben nach unten mit einer spezifischen Fließrate von 1 h"1 durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet.
Der Lysingehalt des Eluates wurde bestimmt. Hieraus errechnete man eine Wiedergewinnungsrate von 98%, bezogen auf adsorbiertes Lys-HCI.
Beispiel 1
Eine Fermentationsbrühe mit einem Lysingehalt von 12,5 Gew.-% und einem Biomasseanteil von 3 Gew.-% wurde mit 1 g 87 gew.-%iger Ameisensäure je 100 g Brühe auf einen pH-Wert von 4,1 angesäuert. 5,5 I der angesäuerten Fermentationsbrühe wurden bei einer Temperatur von 45 0C mit einer spezifischen Fließrate von 1 h"1 von oben nach unten durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Lysinmenge in der durchgeleiteten Brühe entsprach 210 g Lys-HCI je Liter lonenaustauscherharz. Der anfallende Effluent wurden aufgefangen und hierin die Menge an Lysin bestimmt. Hieraus errech- nete sich eine Menge an adsorbiertem Lysin zu 88,2 g je Liter Harz.
Anschließend wurde zur Elution des L-Lysins 6 L einer 3 w/v-%-igen wässrigen Ammoniaklösung von oben nach unten mit einer spezifischen Fließrate von 1 h"1 durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Säule wurde mit 0,7 L Wasser bei einer spezifischen Fliessrate von 1 h"1 nachgespült.
Das Eluat wurde aufgefangen und der Lysingehalt bestimmt. Hieraus errechnete man eine Wiedergewinnungsrate von 98%, bezogen auf adsorbiertes Lys-HCI. Ein Waschschritt war nicht erforderlich.
Beispiel 2
Eine Fermentationsbrühe mit einem Lysingehalt von 12,5 Gew.-% und einem Biomasseanteil von 3 Gew.-% wurde mit 3 g 87 gew.-%iger Ameisensäure je 100 g Brühe auf einen pH von 3,6 angesäuert und die Zellmasse mittels Zentrifugation abgetrennt. Die daraus resultierende Brühe enthält < 0,5 Gew-% Zellen. 4 I dieser wässrigen Brühe wurden bei einer Temperatur von 45°C mit einer spezifischen Fließrate von 1 h"1 von oben nach unten durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Lysinmenge in der durchgeleiteten Brühe entsprach 170 g Lys-HCI je I lonenaustauscherharz. Der an- fallende Effluent wurde aufgefangen und die Menge an Lysin bestimmt. Hieraus errechnete sich eine Menge an adsorbiertem Lysin zu 107 g je Liter Harz. Anschließend wurde zur Elution des L-Lysins 6 L einer 6 w/v-%-igen wässrigen Ammoniaklösung von oben nach unten mit einer spezifischen Fließrate von 1 h"1 bei einer Temperatur von 45 0C durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet.
Der Lysingehalt des Eluates wurde bestimmt. Hieraus errechnete man eine Wiedergewinnungsrate von 95%, bezogen auf adsorbiertes Lys-HCI.
Beispiel 3
Eine Fermentationsbrühe mit einem Lysingehalt von 12,5 Gew.-% und einem Biomasseanteil von 3 Gew.-% wurde mit 6 g 87 gew.-%iger Ameisensäure je 100 g Brühe auf einen pH von 3,2 angesäuert und die Zellmasse mittels Zentrifugation abgetrennt. Die daraus resultierende Brühe enthält < 0,5 Gew.-% Zellen. 19,1 I dieser wässrigen Brühe wurden bei einer Temperatur von 45°C mit einer spezifischen Fließrate von 0,36 h"1 von oben nach unten durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Lysinmenge in der durchgeleiteten Brühe entsprach 105 g Lys-HCI je I lonenaustauscherharz. Der anfallende Effluent wurde aufgefangen und die Menge an Lysin bestimmt. Hieraus errechnete sich eine Menge an adsorbiertem Lysin zu 100 g je Liter Harz.
Anschließend wurde zur Elution des L-Lysins 45,6 L einer 6 w/v-%-igen wässrigen Ammoniaklösung von oben nach unten mit einer spezifischen Fließrate von 0,36 h"1 bei einer Temperatur von 45 0C durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet.
Der Lysingehalt des Eluates wurde bestimmt. Hieraus errechnete man eine Wiedergewinnungsrate von 95%, bezogen auf adsorbiertes Lys-HCI.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus der Fermentationsbrühe eines die basische Aminosäure produzierenden Mikroorganismenstamms, umfassend: a) Ansäuern der Fermentationsbrühe mit einer Säure, deren pKs-Wert in Wasser bei 25°C im Bereich von 2 bis 5 liegt, und b) Abtrennen der basischen Aminosäure aus der in Schritt a) erhaltenen wässrigen Brühe durch sukzessives Beladen einer ein- oder mehrstufigen, seriellen Anordnung eines stark sauren Kationenaustauschers in seiner
Salzform mit der in Schritt a) erhaltenen Brühe und Eluieren der basischen Aminosäure mit einem basischen Eluens.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Säure aus der Gruppe der organischen Carbonsäuren und der Hydroxycarbonsäuren ausgewählt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Säure Ameisensäure ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man zum Ansäu- ren 0,05 bis 2 mol Säure pro kg Fermentationsbrühe einsetzt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man die Fermentationsbrühe auf einen pH-Wert im Bereich von 3,5 bis 6,0 ansäuert.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, wobei die sauren Gruppen des Ionenaustauschers vor dem Beladen in Form von Natrium- und/oder Ammonium-Salzgruppen vorliegen.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, wobei man die basische Aminosäure mit wässrigem Ammoniak oder Natronlauge oder einem Gemisch davon eluiert.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die basische Aminosäure Lysin ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend zusätzlich die Isolierung der basischen Aminosäure durch Kristallisation aus dem Eluat.
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