JPH0670795A - １，５−アンヒドログルシトールの定量法 - Google Patents
１，５−アンヒドログルシトールの定量法Info
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- JPH0670795A JPH0670795A JP13225693A JP13225693A JPH0670795A JP H0670795 A JPH0670795 A JP H0670795A JP 13225693 A JP13225693 A JP 13225693A JP 13225693 A JP13225693 A JP 13225693A JP H0670795 A JPH0670795 A JP H0670795A
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- Japan
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- anhydroglucitol
- sample
- quantifying
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 検体中の１，５−アンヒドログルシトールを
定量する方法において、検体中に存在するマルトースを
α−グルコシダーゼを用いて効果的に除去した後に１，
５−アンヒドログルシトールを定量する方法を提供す
る。 【構成】 検体中に存在するマルトースに対してＢａｃ
ｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のα−グルコシダーゼ
を作用させてあらかじめグルコースに変換してマルトー
スによる影響を除去した後、検体中の１，５−アンヒド
ログルシトールを測定する。
定量する方法において、検体中に存在するマルトースを
α−グルコシダーゼを用いて効果的に除去した後に１，
５−アンヒドログルシトールを定量する方法を提供す
る。 【構成】 検体中に存在するマルトースに対してＢａｃ
ｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のα−グルコシダーゼ
を作用させてあらかじめグルコースに変換してマルトー
スによる影響を除去した後、検体中の１，５−アンヒド
ログルシトールを測定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、糖尿病の診断マーカー
である１，５−アンヒドログルシトール（以下１，５−
ＡＧと称する）の簡便で迅速で自動分析装置への適用も
可能な酵素的測定方法に関するものである。
である１，５−アンヒドログルシトール（以下１，５−
ＡＧと称する）の簡便で迅速で自動分析装置への適用も
可能な酵素的測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】１，５−ＡＧはヒト髄液および血液中に
存在し、ある種の疾患、特に糖尿病において著しい濃度
低下が報告されている化合物であり（赤沼安夫、戸辺一
之：日本内科学会誌、８０ １１９８〜１２０４ １９
９１）、糖尿病の診断マーカーとして重要と目されるも
のである。
存在し、ある種の疾患、特に糖尿病において著しい濃度
低下が報告されている化合物であり（赤沼安夫、戸辺一
之：日本内科学会誌、８０ １１９８〜１２０４ １９
９１）、糖尿病の診断マーカーとして重要と目されるも
のである。
【０００３】実用的な検体中の１，５−ＡＧ測定法とし
ては、除タンパクの後にイオン交換カラムにより検体中
に存在する１，５−ＡＧ以外の糖類を除去した後、ピラ
ノースオキシダーゼ（以下ＰＲＯＤと言う）またはＬ−
ソルボースオキシターゼにより１，５−ＡＧを酸化し生
成する過酸化水素を定量する方法が知られている（特開
昭６３−１８５３７９号を参照。以下、このような測定
法をカラム酵素法と言う）。
ては、除タンパクの後にイオン交換カラムにより検体中
に存在する１，５−ＡＧ以外の糖類を除去した後、ピラ
ノースオキシダーゼ（以下ＰＲＯＤと言う）またはＬ−
ソルボースオキシターゼにより１，５−ＡＧを酸化し生
成する過酸化水素を定量する方法が知られている（特開
昭６３−１８５３７９号を参照。以下、このような測定
法をカラム酵素法と言う）。
【０００４】１，５−ＡＧの測定の対象となる検体は主
として糖尿病患者の血清または血漿である。その糖尿病
患者の血中においてグルコース濃度は健常者に比べて高
く、その値は健常者が６０〜１００ｍｇ／ｄｌ程度であ
るのに対し、糖尿病患者においては１００〜１０００ｍ
ｇ／ｄｌの範囲で広く分布している。一方血中の１，５
−ＡＧ濃度は、健常者が１．６４〜２．６８ｍｇ／ｄｌ
であるのに対し、糖尿病患者においては０．１８〜０．
２１ｍｇ／ｄｌという著しく低い数値を示す（日本臨床
４７巻１９８９年増刊号広範囲血液・尿化学検査免疫学
的検査上巻４３９〜４２２川合）。また、１，５−ＡＧ
の血中濃度はグルコースに比較して糖尿病患者において
約４７０分の１以下になる。加えて、グルコースと１，
５−ＡＧは化学構造が近似しているため、現在の技術水
準ではグルコースと１，５−ＡＧの共存下での１，５−
ＡＧの選択的測定は不可能であり、グルコースを選択的
に除去するか、あるいはグルコースを適切に修飾する検
体前処理操作が不可欠である。
として糖尿病患者の血清または血漿である。その糖尿病
患者の血中においてグルコース濃度は健常者に比べて高
く、その値は健常者が６０〜１００ｍｇ／ｄｌ程度であ
るのに対し、糖尿病患者においては１００〜１０００ｍ
ｇ／ｄｌの範囲で広く分布している。一方血中の１，５
−ＡＧ濃度は、健常者が１．６４〜２．６８ｍｇ／ｄｌ
であるのに対し、糖尿病患者においては０．１８〜０．
２１ｍｇ／ｄｌという著しく低い数値を示す（日本臨床
４７巻１９８９年増刊号広範囲血液・尿化学検査免疫学
的検査上巻４３９〜４２２川合）。また、１，５−ＡＧ
の血中濃度はグルコースに比較して糖尿病患者において
約４７０分の１以下になる。加えて、グルコースと１，
５−ＡＧは化学構造が近似しているため、現在の技術水
準ではグルコースと１，５−ＡＧの共存下での１，５−
ＡＧの選択的測定は不可能であり、グルコースを選択的
に除去するか、あるいはグルコースを適切に修飾する検
体前処理操作が不可欠である。
【０００５】カラム酵素法による測定では、除タンパク
及び内因性の１，５−ＡＧ以外の糖類を除去する分離操
作の著しい繁雑さが欠点となっている。また、糖尿病患
者に対して、熱源の補給、循環血液量および組織間液の
減少時における組織外液の補給・補正、代謝性アシドー
シスの補正を目的としてマルトース加乳酸リンゲル液を
輸液として適用することが多く、この場合には糖尿病患
者の血液中にマルトースが増加する。このような糖尿病
患者からの検体中のマルトースは分離カラムによっても
完全に除去し得ず、１，５−ＡＧ測定値が著しい正誤差
を受ける報告がなされている（臨床化学２１：４３−４
８ １９９２）。
及び内因性の１，５−ＡＧ以外の糖類を除去する分離操
作の著しい繁雑さが欠点となっている。また、糖尿病患
者に対して、熱源の補給、循環血液量および組織間液の
減少時における組織外液の補給・補正、代謝性アシドー
シスの補正を目的としてマルトース加乳酸リンゲル液を
輸液として適用することが多く、この場合には糖尿病患
者の血液中にマルトースが増加する。このような糖尿病
患者からの検体中のマルトースは分離カラムによっても
完全に除去し得ず、１，５−ＡＧ測定値が著しい正誤差
を受ける報告がなされている（臨床化学２１：４３−４
８ １９９２）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】以上に示した従来のカ
ラム酵素法における欠点である内因性のマルトースの影
響の問題を解消した、自動分析装置に適合可能な１，５
−ＡＧを測定する方法を提供することが本発明の目的で
ある。本発明の他の目的は、内因性のマルトースの影響
の問題を解消するとともに従来のカラム酵素法における
操作の繁雑さの欠点を解消する１，５−ＡＧの定量法及
びそれに用いるキットを提供することにある。
ラム酵素法における欠点である内因性のマルトースの影
響の問題を解消した、自動分析装置に適合可能な１，５
−ＡＧを測定する方法を提供することが本発明の目的で
ある。本発明の他の目的は、内因性のマルトースの影響
の問題を解消するとともに従来のカラム酵素法における
操作の繁雑さの欠点を解消する１，５−ＡＧの定量法及
びそれに用いるキットを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、検体中の１，５−Ａ
ＧをＰＲＯＤを用いて定量する際に、検体中に存在する
マルトースにあらかじめＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微
生物由来のα−グルコシダーゼを作用させてグルコース
に変換し次いで該グルコースを検体中に存在する他の糖
類と共に選択的に除去し、しかる後に１，５−ＡＧを測
定することによって内因性のマルトースの影響を受ける
ことなく正確に１，５−ＡＧを測定し得ることを見出し
た。
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、検体中の１，５−Ａ
ＧをＰＲＯＤを用いて定量する際に、検体中に存在する
マルトースにあらかじめＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微
生物由来のα−グルコシダーゼを作用させてグルコース
に変換し次いで該グルコースを検体中に存在する他の糖
類と共に選択的に除去し、しかる後に１，５−ＡＧを測
定することによって内因性のマルトースの影響を受ける
ことなく正確に１，５−ＡＧを測定し得ることを見出し
た。
【０００８】更には、検体中に存在するマルトースをＢ
ａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のα−グルコシダ
ーゼの作用によりグルコースに変換し、次いで該グルコ
ースを、検体中の他の糖類と共に、ヘキソキナーゼ（以
下ＨＫと称する）とアデノシン−５′−三リン酸（以下
ＡＴＰと称する）によりリン酸化して選択的に除去し、
その後に検体中の１，５−ＡＧにＰＲＯＤを作用させて
１，５−ＡＧを定量する方法において、該リン酸化及び
１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反応を特にｐＨが７．２〜
８．５の範囲内で行うことにより、あるいはＰＲＯＤと
してＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ Ｎ
ｏ．５２由来のＰＲＯＤを用いることにより、ＡＴＰを
過剰量用いて速やかにリン酸化を実施することができ且
つそのままＡＴＰの過剰量存在下にＡＴＰによりＰＲＯ
Ｄが阻害作用を受けることなく１，５−ＡＧにＰＲＯＤ
を作用させて１，５−ＡＧを測定することができ、従っ
て、極めて簡便に且つ迅速に１，５−ＡＧを定量するこ
とが可能となり自動分析装置に適用可能な１，５−ＡＧ
の定量法が達成し得ることを見出した。本発明はこれら
の知見に基づいて完成されたものである。
ａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のα−グルコシダ
ーゼの作用によりグルコースに変換し、次いで該グルコ
ースを、検体中の他の糖類と共に、ヘキソキナーゼ（以
下ＨＫと称する）とアデノシン−５′−三リン酸（以下
ＡＴＰと称する）によりリン酸化して選択的に除去し、
その後に検体中の１，５−ＡＧにＰＲＯＤを作用させて
１，５−ＡＧを定量する方法において、該リン酸化及び
１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反応を特にｐＨが７．２〜
８．５の範囲内で行うことにより、あるいはＰＲＯＤと
してＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ Ｎ
ｏ．５２由来のＰＲＯＤを用いることにより、ＡＴＰを
過剰量用いて速やかにリン酸化を実施することができ且
つそのままＡＴＰの過剰量存在下にＡＴＰによりＰＲＯ
Ｄが阻害作用を受けることなく１，５−ＡＧにＰＲＯＤ
を作用させて１，５−ＡＧを測定することができ、従っ
て、極めて簡便に且つ迅速に１，５−ＡＧを定量するこ
とが可能となり自動分析装置に適用可能な１，５−ＡＧ
の定量法が達成し得ることを見出した。本発明はこれら
の知見に基づいて完成されたものである。
【０００９】本発明の第１の要旨は、検体中の１，５−
ＡＧをＰＲＯＤを用いて定量する方法において、検体中
に存在するマルトースをＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微
生物由来のα−グルコシダーゼの作用によりグルコース
に変換し、次いで、検体中に存在する１，５−ＡＧ以外
の他の糖類と共に１，５−ＡＧが残留するようにグルコ
ースを選択的に除去した後、検体中の１，５−ＡＧをＰ
ＲＯＤを用いて定量することを特徴とする１，５−ＡＧ
の定量法である。
ＡＧをＰＲＯＤを用いて定量する方法において、検体中
に存在するマルトースをＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微
生物由来のα−グルコシダーゼの作用によりグルコース
に変換し、次いで、検体中に存在する１，５−ＡＧ以外
の他の糖類と共に１，５−ＡＧが残留するようにグルコ
ースを選択的に除去した後、検体中の１，５−ＡＧをＰ
ＲＯＤを用いて定量することを特徴とする１，５−ＡＧ
の定量法である。
【００１０】本発明の第２の要旨は、検体中の１，５−
ＡＧをＰＲＯＤを用いて定量する方法において、検体中
に存在するマルトースをＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微
生物由来のα−グルコシダーゼの作用によりグルコース
に変換し；該グルコースを、検体中に存在する１，５−
ＡＧ以外の他の糖類と共に、ＨＫと過剰量のＡＴＰによ
りｐＨが７．２〜８．５の範囲内でリン酸化することに
より、検体中の１，５−ＡＧが残留するように選択的に
除去し；次いでそのまま検体中の１，５−ＡＧにＰＲＯ
ＤをｐＨが７．２〜８．５の範囲内で作用させて１，５
−ＡＧを定量することを特徴とする１，５−ＡＧの定量
法である。本発明の第３の要旨は、検体中の１，５−Ａ
ＧをＰＲＯＤを用いて定量する方法において、検体中に
存在するマルトースをＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生
物由来のα−グルコシダーゼの作用によりグルコースに
変換し；該グルコースを、検体中に存在する１，５−Ａ
Ｇ以外の他の糖類と共に、ＨＫと過剰量のＡＴＰにより
リン酸化することにより、検体中の１，５−ＡＧが残留
するように選択的に除去し；次いでそのまま検体中の
１，５−ＡＧにＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕ
ｎｇｉ Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤを作用させて１，５
−ＡＧを定量することを特徴とする１，５−ＡＧの定量
法である。本発明の第４の要旨は、検体中の１，５−Ａ
Ｇの定量に用いるキットであって、以下の構成試薬 ｉ） Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のα−グ
ルコシダーゼ； ｉｉ） ＨＫ； ｉｉｉ） ＡＴＰ； 及びｉｖ）ＰＲＯＤ； を含む１，５−ＡＧ定量用キットである。
ＡＧをＰＲＯＤを用いて定量する方法において、検体中
に存在するマルトースをＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微
生物由来のα−グルコシダーゼの作用によりグルコース
に変換し；該グルコースを、検体中に存在する１，５−
ＡＧ以外の他の糖類と共に、ＨＫと過剰量のＡＴＰによ
りｐＨが７．２〜８．５の範囲内でリン酸化することに
より、検体中の１，５−ＡＧが残留するように選択的に
除去し；次いでそのまま検体中の１，５−ＡＧにＰＲＯ
ＤをｐＨが７．２〜８．５の範囲内で作用させて１，５
−ＡＧを定量することを特徴とする１，５−ＡＧの定量
法である。本発明の第３の要旨は、検体中の１，５−Ａ
ＧをＰＲＯＤを用いて定量する方法において、検体中に
存在するマルトースをＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生
物由来のα−グルコシダーゼの作用によりグルコースに
変換し；該グルコースを、検体中に存在する１，５−Ａ
Ｇ以外の他の糖類と共に、ＨＫと過剰量のＡＴＰにより
リン酸化することにより、検体中の１，５−ＡＧが残留
するように選択的に除去し；次いでそのまま検体中の
１，５−ＡＧにＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕ
ｎｇｉ Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤを作用させて１，５
−ＡＧを定量することを特徴とする１，５−ＡＧの定量
法である。本発明の第４の要旨は、検体中の１，５−Ａ
Ｇの定量に用いるキットであって、以下の構成試薬 ｉ） Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のα−グ
ルコシダーゼ； ｉｉ） ＨＫ； ｉｉｉ） ＡＴＰ； 及びｉｖ）ＰＲＯＤ； を含む１，５−ＡＧ定量用キットである。
【００１１】以下本発明を詳細に説明する。本発明にお
ける検体とは、１，５−ＡＧの濃度を測定したいもので
あれば特に制限はなく、例えばすでに触れた通り血清ま
たは血漿などがあげられる。本発明の１，５−ＡＧの定
量法では、始めに検体中に存在するマルトースにα−グ
ルコシダーゼを作用させてマルトースをグルコースに変
換する。検体中に元来存在する内因性マルトースの影響
を回避して、１，５−ＡＧの測定を汎用の自動分析装置
に適用するには、検体中のマルトースを短時間にグルコ
ースに変換し、さらにグルコースを短時間に消去し得る
ことが必須である。本発明者は鋭意検討を重ねた結果、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のα−グルコシ
ダーゼは、従来知られた例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼあるいは、Ｒｈ
ｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．由来のグルコアミラーゼと比較し
てマルトースに対して高い親和性、反応性を示し、検体
中のマルトースを速やかにグルコースに変換することが
可能であることを見出した。特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グル
コシダーゼが好ましい。このα−グルコシダーゼは、例
えばＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＡＴＣＣ １２０１６からＳｔａｒｃｈ／Ｓｔ
ａｅｒｋｅ １９８７，３９（８），２７１−２７３に
記載された方法により取得することができる。このα−
グルコシダーゼは既に市販されており例えば東洋紡Ｃｏ
ｄｅ Ｎｏ． ＡＧＨ−２１１として入手出来る。Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
由来のα−グルコシダーゼは次に示す理化学的特性を有
する。 （１）外観：白色粉末（凍結乾燥） （２）分子量：ゲル濾過及びＳＤＳ−ゲル電気泳動によ
る測定で約６２，０００ （３）等電点：５．２ （４）ミカエリス定数：５．７×１０-4Ｍ（ｐ−ニトロ
フェニル−α−グルコース） （５）阻害剤：重金属イオン（Ｆｅ2+，Ｃａ2+） （６）最適ｐＨ：６〜７ （７）ｐＨ安定性：ｐＨ７〜８で安定 （８）熱安定性：６０℃以下（ｐＨ７．０，１５分間）
で安定
ける検体とは、１，５−ＡＧの濃度を測定したいもので
あれば特に制限はなく、例えばすでに触れた通り血清ま
たは血漿などがあげられる。本発明の１，５−ＡＧの定
量法では、始めに検体中に存在するマルトースにα−グ
ルコシダーゼを作用させてマルトースをグルコースに変
換する。検体中に元来存在する内因性マルトースの影響
を回避して、１，５−ＡＧの測定を汎用の自動分析装置
に適用するには、検体中のマルトースを短時間にグルコ
ースに変換し、さらにグルコースを短時間に消去し得る
ことが必須である。本発明者は鋭意検討を重ねた結果、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のα−グルコシ
ダーゼは、従来知られた例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼあるいは、Ｒｈ
ｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．由来のグルコアミラーゼと比較し
てマルトースに対して高い親和性、反応性を示し、検体
中のマルトースを速やかにグルコースに変換することが
可能であることを見出した。特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グル
コシダーゼが好ましい。このα−グルコシダーゼは、例
えばＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＡＴＣＣ １２０１６からＳｔａｒｃｈ／Ｓｔ
ａｅｒｋｅ １９８７，３９（８），２７１−２７３に
記載された方法により取得することができる。このα−
グルコシダーゼは既に市販されており例えば東洋紡Ｃｏ
ｄｅ Ｎｏ． ＡＧＨ−２１１として入手出来る。Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
由来のα−グルコシダーゼは次に示す理化学的特性を有
する。 （１）外観：白色粉末（凍結乾燥） （２）分子量：ゲル濾過及びＳＤＳ−ゲル電気泳動によ
る測定で約６２，０００ （３）等電点：５．２ （４）ミカエリス定数：５．７×１０-4Ｍ（ｐ−ニトロ
フェニル−α−グルコース） （５）阻害剤：重金属イオン（Ｆｅ2+，Ｃａ2+） （６）最適ｐＨ：６〜７ （７）ｐＨ安定性：ｐＨ７〜８で安定 （８）熱安定性：６０℃以下（ｐＨ７．０，１５分間）
で安定
【００１２】検体中に存在するマルトースにα−グルコ
シダーゼを作用させる際に用いるα−グルコシダーゼの
量は、検体中マルトースを完全にグルコースに加水分解
できる量であり、通常１０〜２００Ｕ／ｍｌ添加すれば
十分である。実際の測定の際には２０〜１００Ｕ／ｍｌ
の量で用いられる。α−グルコシダーゼを作用させる時
のｐＨは特に制限はなく、α−グルコシダーゼの作用に
適したｐＨであればいずれでもよい。その後のリン酸化
反応、即ち、マルトースをα−グルコシダーゼによりグ
ルコースに変換後、検体中に存在する他の糖類と共に、
ＨＫとＡＴＰによりリン酸化反応により選択的に除去す
る操作を行う時のｐＨ範囲と同じｐＨ範囲でα−グルコ
シダーゼを作用させるのが操作の簡便性の点で好まし
い。後述するように、リン酸化反応を行う際のｐＨ範
囲、例えばｐＨ７．２〜８．５の範囲、あるいはｐＨ６
〜９の範囲でα−グルコシダーゼを検体中のマルトース
に作用させるのが好ましい。温度は通常、室温が適して
いる。
シダーゼを作用させる際に用いるα−グルコシダーゼの
量は、検体中マルトースを完全にグルコースに加水分解
できる量であり、通常１０〜２００Ｕ／ｍｌ添加すれば
十分である。実際の測定の際には２０〜１００Ｕ／ｍｌ
の量で用いられる。α−グルコシダーゼを作用させる時
のｐＨは特に制限はなく、α−グルコシダーゼの作用に
適したｐＨであればいずれでもよい。その後のリン酸化
反応、即ち、マルトースをα−グルコシダーゼによりグ
ルコースに変換後、検体中に存在する他の糖類と共に、
ＨＫとＡＴＰによりリン酸化反応により選択的に除去す
る操作を行う時のｐＨ範囲と同じｐＨ範囲でα−グルコ
シダーゼを作用させるのが操作の簡便性の点で好まし
い。後述するように、リン酸化反応を行う際のｐＨ範
囲、例えばｐＨ７．２〜８．５の範囲、あるいはｐＨ６
〜９の範囲でα−グルコシダーゼを検体中のマルトース
に作用させるのが好ましい。温度は通常、室温が適して
いる。
【００１３】検体中に存在するマルトースをグルコース
に変換後、検体中に存在する１，５−ＡＧ以外の他の糖
類と共に、１，５−ＡＧが残留するように選択的に除去
する（以下、この選択的除去を第１段反応と称すること
がある）。検体中に存在する１，５−ＡＧ以外の他の糖
類とは主にグルコースを指すが、例えばＨＫによってリ
ン酸化される他の糖類、フルクトース、５−ケト−Ｄ−
フルクトース、マンノース、２−デオキシグルコース、
グルコサミンなども対象とされる。検体中の１，５−Ａ
Ｇ以外の糖類の選択的除去は、自動分析装置への適用の
ためにグルコースなどの糖類を反応溶液中でなんらかの
固相に依存することなく消去できる方法を選択するのが
好ましい。そのような方法として、従来知られているも
のに、６Ｎ塩酸を用いて糖類を酸分解する方法、水素化
ホウ素ナトリウムによる還元処理、グルコースオキシダ
ーゼを用いてグルコースをグルコン酸に変換する方法、
ＨＫを用いて糖類をリン酸化する方法などがあるが、こ
れらのうちでは、糖類の選択的除去反応に関与する物質
及び反応生成物が１，５−ＡＧ定量反応に影響を与えず
に済ませることができ、かつ短時間で反応が終了させる
ことができる、ＨＫを用いて糖類をリン酸化する方法が
最も好ましい。グルコースをグルコース−６−リン酸に
変換するのをはじめとして糖類をリン酸化する際に用い
るＨＫは国際生化学連合の分類に従い、ＥＣ ２．７．
１．１と分類されるものを用いるのが好ましい。この変
換反応では該酵素と合わせてＡＴＰ及びマグネシウムイ
オンが用いられる。マグネシウムイオンの供給源は、マ
グネシウムの脂肪酸塩などの有機酸塩、ハロゲン化塩、
硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸塩を用いること
ができ、その中でも好ましいのは、酢酸塩、塩酸塩など
である。
に変換後、検体中に存在する１，５−ＡＧ以外の他の糖
類と共に、１，５−ＡＧが残留するように選択的に除去
する（以下、この選択的除去を第１段反応と称すること
がある）。検体中に存在する１，５−ＡＧ以外の他の糖
類とは主にグルコースを指すが、例えばＨＫによってリ
ン酸化される他の糖類、フルクトース、５−ケト−Ｄ−
フルクトース、マンノース、２−デオキシグルコース、
グルコサミンなども対象とされる。検体中の１，５−Ａ
Ｇ以外の糖類の選択的除去は、自動分析装置への適用の
ためにグルコースなどの糖類を反応溶液中でなんらかの
固相に依存することなく消去できる方法を選択するのが
好ましい。そのような方法として、従来知られているも
のに、６Ｎ塩酸を用いて糖類を酸分解する方法、水素化
ホウ素ナトリウムによる還元処理、グルコースオキシダ
ーゼを用いてグルコースをグルコン酸に変換する方法、
ＨＫを用いて糖類をリン酸化する方法などがあるが、こ
れらのうちでは、糖類の選択的除去反応に関与する物質
及び反応生成物が１，５−ＡＧ定量反応に影響を与えず
に済ませることができ、かつ短時間で反応が終了させる
ことができる、ＨＫを用いて糖類をリン酸化する方法が
最も好ましい。グルコースをグルコース−６−リン酸に
変換するのをはじめとして糖類をリン酸化する際に用い
るＨＫは国際生化学連合の分類に従い、ＥＣ ２．７．
１．１と分類されるものを用いるのが好ましい。この変
換反応では該酵素と合わせてＡＴＰ及びマグネシウムイ
オンが用いられる。マグネシウムイオンの供給源は、マ
グネシウムの脂肪酸塩などの有機酸塩、ハロゲン化塩、
硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸塩を用いること
ができ、その中でも好ましいのは、酢酸塩、塩酸塩など
である。
【００１４】本発明者の研究によれば、第１段反応にお
けるリン酸化反応に続いて、１，５−ＡＧとＰＲＯＤと
の反応（以下第２段反応と称することがある）を、ｐＨ
７．２〜８．５の範囲で行うことによって、過剰量のＡ
ＴＰの存在下においてもＰＲＯＤがＡＴＰによる阻害作
用を受けることなく１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反応が
効率良く進行すること、従って第１段反応におけるリン
酸化反応を過剰量のＡＴＰを用いてｐＨ７．２〜８．５
の範囲で実施することによって迅速にリン酸化反応を行
うことができ、更にそのまま過剰量のＡＴＰの存在下に
ｐＨ７．２〜８．５の範囲で１，５−ＡＧとＰＲＯＤと
を引き続き反応させることによって、第１段反応とそれ
に続く第１段反応である１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反
応を連続的に極めて短時間で実施できることが明らかに
なった（これらの方法自体については、既に特願平５−
０２２６１３として特許出願した）。また、第２段反応
における１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反応において、Ｐ
ＲＯＤとして特にＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆ
ｕｎｇｉ Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤを用いることによ
っても、過剰量のＡＴＰの存在下においてもＰＲＯＤが
ＡＴＰによる阻害反応を受けず、従って第１段反応とそ
れに続く第２段反応を連続的に短時間で実施できること
も明らかになった（これらの方法自体については、既に
特願平４−３２４２５９として特許出願した）。
けるリン酸化反応に続いて、１，５−ＡＧとＰＲＯＤと
の反応（以下第２段反応と称することがある）を、ｐＨ
７．２〜８．５の範囲で行うことによって、過剰量のＡ
ＴＰの存在下においてもＰＲＯＤがＡＴＰによる阻害作
用を受けることなく１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反応が
効率良く進行すること、従って第１段反応におけるリン
酸化反応を過剰量のＡＴＰを用いてｐＨ７．２〜８．５
の範囲で実施することによって迅速にリン酸化反応を行
うことができ、更にそのまま過剰量のＡＴＰの存在下に
ｐＨ７．２〜８．５の範囲で１，５−ＡＧとＰＲＯＤと
を引き続き反応させることによって、第１段反応とそれ
に続く第１段反応である１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反
応を連続的に極めて短時間で実施できることが明らかに
なった（これらの方法自体については、既に特願平５−
０２２６１３として特許出願した）。また、第２段反応
における１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反応において、Ｐ
ＲＯＤとして特にＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆ
ｕｎｇｉ Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤを用いることによ
っても、過剰量のＡＴＰの存在下においてもＰＲＯＤが
ＡＴＰによる阻害反応を受けず、従って第１段反応とそ
れに続く第２段反応を連続的に短時間で実施できること
も明らかになった（これらの方法自体については、既に
特願平４−３２４２５９として特許出願した）。
【００１５】従って、本発明においては、第１段反応に
おけるリン酸化反応を過剰量のＡＴＰを用いて迅速に行
うことが可能である。リン酸化反応において用いること
のできる過剰量のＡＴＰとは通常、検体中の想定される
グルコース量に対し、モル比でＡＴＰが２．５倍以上、
好ましくは２．５〜２５００倍、より好ましくは１０〜
１０００倍の量である。実際の測定系を組む際にはＡＴ
Ｐの量は、少なくとも５ｍＭ以上に調製すれば十分であ
る。リン酸化反応において実際に用いられるＨＫ、ＡＴ
Ｐ及びマグネシウムイオンの好適な量は、例えば、ＨＫ
は５〜１００Ｕ／ｍｌ、ＡＴＰは５〜５００ｍＭ、マグ
ネシウムイオンは５〜５０ｍＭである。リン酸化反応の
際のｐＨは、１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反応の際のｐ
Ｈ範囲と同様に７．２〜８．５が好ましく、特に７．５
〜８．０が好ましい。また、ＰＲＯＤとしてＢａｓｉｄ
ｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ Ｎｏ．５２由来の
ＰＲＯＤを用いる場合には、リン酸化反応のｐＨはｐＨ
６〜９の範囲が好ましく、特に７．０〜８．０の範囲が
好ましい。リン酸化反応の際の温度は室温が好ましい。
尚、第１段反応におけるリン酸化反応と前述した検体中
のマルトースとα−グルコシダーゼとの反応は、同一の
反応系で一緒に実施することができ、同一の反応系で実
施するのが操作の簡便性において好ましい。
おけるリン酸化反応を過剰量のＡＴＰを用いて迅速に行
うことが可能である。リン酸化反応において用いること
のできる過剰量のＡＴＰとは通常、検体中の想定される
グルコース量に対し、モル比でＡＴＰが２．５倍以上、
好ましくは２．５〜２５００倍、より好ましくは１０〜
１０００倍の量である。実際の測定系を組む際にはＡＴ
Ｐの量は、少なくとも５ｍＭ以上に調製すれば十分であ
る。リン酸化反応において実際に用いられるＨＫ、ＡＴ
Ｐ及びマグネシウムイオンの好適な量は、例えば、ＨＫ
は５〜１００Ｕ／ｍｌ、ＡＴＰは５〜５００ｍＭ、マグ
ネシウムイオンは５〜５０ｍＭである。リン酸化反応の
際のｐＨは、１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反応の際のｐ
Ｈ範囲と同様に７．２〜８．５が好ましく、特に７．５
〜８．０が好ましい。また、ＰＲＯＤとしてＢａｓｉｄ
ｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ Ｎｏ．５２由来の
ＰＲＯＤを用いる場合には、リン酸化反応のｐＨはｐＨ
６〜９の範囲が好ましく、特に７．０〜８．０の範囲が
好ましい。リン酸化反応の際の温度は室温が好ましい。
尚、第１段反応におけるリン酸化反応と前述した検体中
のマルトースとα−グルコシダーゼとの反応は、同一の
反応系で一緒に実施することができ、同一の反応系で実
施するのが操作の簡便性において好ましい。
【００１６】グルコースなどの１，５−ＡＧ以外の糖類
が選択的に除去された検体中に残留する１，５−ＡＧに
ＰＲＯＤを反応させる第２段反応により１，５−ＡＧを
測定する。本発明で用いるＰＲＯＤとしては、ＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢの命名法委員会でＥＣ１．１．３．１０に分
類し得るものであれば特に制限はなく、ＰＲＯＤ生産能
力を有する菌株由来のさまざまなＰＲＯＤを用いること
ができる。例えば特開昭６１−２３９８８６号公報に記
載されているポリポラス・オブッサス（Ｐｏｌｙｐｏｒ
ｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ）ＡＴＣＣ２６７３３に代表され
るポリポラス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）属に属する微生物
の菌株由来のＰＲＯＤ、特開昭５８−４３７８５号公報
に記載されているコリオラス・ベルシカラ（Ｃｏｒｉｏ
ｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）ＩＦＯ４９３７に代表
されるコリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属に属する微生
物の菌株由来のＰＲＯＤ、特開昭６２−７９７８０号公
報に記載されているピクノポラス・コクシネウス（Ｐｙ
ｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）ＩＦＯ４９２
３に代表されるピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）
属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、特開平２−４
２９８０号公報に記載されているバシジオマイセタウス
・フンギ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇ
ｉ）Ｎｏ．５２（微工研菌寄第１０１０６号）由来のＰ
ＲＯＤ、特開昭５８−４３７８５号公報に記載されてい
るダイダレオプシス・スチラシナ（Ｄａｅｄａｌｅｏｐ
ｓｉｓ ｓｔｙｒａｃｉｎａ）ＩＦＯ４９１０に代表さ
れるダエダレオプシス（Ｄａｓｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ）
属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、プロイロタス
・オストレアタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｅｓｏｓｔｒｅｔｕ
ｓ）Ｚ−６４（ＮＲＲＬ１２５０７）に代表されるプロ
イロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属に属する微生物の菌
株由来のＰＲＯＤ、グロエオフィルム・セピアリウム
（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｅｐｉａｒｉｕｍ）Ｚ
−４１（ＮＲＲＬ１２５０６）に代表されるグロエオフ
ィルム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属に属する微生物
の菌株由来のＰＲＯＤ、または特開昭６１−１７７９８
６号公報に記載されているイルペックス・ラクテウス
（Ｉｒｐｅｘ ｌａｃｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０１２３に
代表されるイルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属に属する微生
物の菌株由来のＰＲＯＤ、オーリキュラリア・ポリトリ
カ（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ｐｏｌｙｔｒｉｃｈａ）
Ｚ−２２９（微工研菌寄第７１１９号）に代表されるオ
ーリキュラリア（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）属に属する
微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、コプリナス・ミカセウス
（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｍｉｃａｃｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０
１２２に代表されるコプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属
に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、またはトラメテ
ス・シンナバリナス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｃｉｎｎａｂ
ａｒｉｎｕｓ）ＩＦＯ６１３９に代表されるトラメテス
（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属に属する微生物の菌株由来のＰ
ＲＯＤなどが挙げられる。
が選択的に除去された検体中に残留する１，５−ＡＧに
ＰＲＯＤを反応させる第２段反応により１，５−ＡＧを
測定する。本発明で用いるＰＲＯＤとしては、ＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢの命名法委員会でＥＣ１．１．３．１０に分
類し得るものであれば特に制限はなく、ＰＲＯＤ生産能
力を有する菌株由来のさまざまなＰＲＯＤを用いること
ができる。例えば特開昭６１−２３９８８６号公報に記
載されているポリポラス・オブッサス（Ｐｏｌｙｐｏｒ
ｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ）ＡＴＣＣ２６７３３に代表され
るポリポラス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）属に属する微生物
の菌株由来のＰＲＯＤ、特開昭５８−４３７８５号公報
に記載されているコリオラス・ベルシカラ（Ｃｏｒｉｏ
ｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）ＩＦＯ４９３７に代表
されるコリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属に属する微生
物の菌株由来のＰＲＯＤ、特開昭６２−７９７８０号公
報に記載されているピクノポラス・コクシネウス（Ｐｙ
ｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）ＩＦＯ４９２
３に代表されるピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）
属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、特開平２−４
２９８０号公報に記載されているバシジオマイセタウス
・フンギ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇ
ｉ）Ｎｏ．５２（微工研菌寄第１０１０６号）由来のＰ
ＲＯＤ、特開昭５８−４３７８５号公報に記載されてい
るダイダレオプシス・スチラシナ（Ｄａｅｄａｌｅｏｐ
ｓｉｓ ｓｔｙｒａｃｉｎａ）ＩＦＯ４９１０に代表さ
れるダエダレオプシス（Ｄａｓｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ）
属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、プロイロタス
・オストレアタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｅｓｏｓｔｒｅｔｕ
ｓ）Ｚ−６４（ＮＲＲＬ１２５０７）に代表されるプロ
イロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属に属する微生物の菌
株由来のＰＲＯＤ、グロエオフィルム・セピアリウム
（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｅｐｉａｒｉｕｍ）Ｚ
−４１（ＮＲＲＬ１２５０６）に代表されるグロエオフ
ィルム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属に属する微生物
の菌株由来のＰＲＯＤ、または特開昭６１−１７７９８
６号公報に記載されているイルペックス・ラクテウス
（Ｉｒｐｅｘ ｌａｃｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０１２３に
代表されるイルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属に属する微生
物の菌株由来のＰＲＯＤ、オーリキュラリア・ポリトリ
カ（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ｐｏｌｙｔｒｉｃｈａ）
Ｚ−２２９（微工研菌寄第７１１９号）に代表されるオ
ーリキュラリア（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）属に属する
微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、コプリナス・ミカセウス
（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｍｉｃａｃｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０
１２２に代表されるコプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属
に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、またはトラメテ
ス・シンナバリナス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｃｉｎｎａｂ
ａｒｉｎｕｓ）ＩＦＯ６１３９に代表されるトラメテス
（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属に属する微生物の菌株由来のＰ
ＲＯＤなどが挙げられる。
【００１７】これらのなかでも、ポリポラス・オブッサ
ス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ）ＡＴＣＣ２
６７３３などのポリポラス属に属する微生物由来のＰＲ
ＯＤ、バシジオマイセタウス・フンギ（Ｂａｓｉｄｉｏ
ｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇ）Ｎｏ．５２由来のＰＲＯ
Ｄが好ましい。本発明では過剰量のＡＴＰを用いたリン
酸化反応を行い、次いでそのままＡＴＰを除去すること
なく、ｐＨが７．２〜８．５の範囲内で検体中の１，５
−ＡＧとＰＲＯＤとの酵素反応を実施することができ
る。この酵素反応はｐＨが７．２〜８．５、好ましくは
７．５〜８．０の範囲内で行うことにより、検体中に残
存するＡＴＰによりＰＲＯＤが阻害作用を受けず且つ
１，５−ＡＧに対してＰＲＯＤが良好な反応性を示す。
あるいは、ＰＲＯＤとしてＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏ
ｕｓ ｆｕｎｇｉ Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤを用いる
ことによって、このＰＲＯＤはＡＴＰによる阻害作用を
受けにくいため、過剰量のＡＴＰを用いたリン酸化反応
を行いそのまま引き続いて連続的に同様に１，５−ＡＧ
とＰＲＯＤとの反応を実施できる。この場合のｐＨは好
ましくはｐＨ６〜９、更に好ましくは７．０〜８．０の
範囲が採用される。またこの酸素反応の際には実際に５
〜５００ｍＭの濃度範囲のＡＴＰが存在していてもよ
い。
ス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ）ＡＴＣＣ２
６７３３などのポリポラス属に属する微生物由来のＰＲ
ＯＤ、バシジオマイセタウス・フンギ（Ｂａｓｉｄｉｏ
ｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇ）Ｎｏ．５２由来のＰＲＯ
Ｄが好ましい。本発明では過剰量のＡＴＰを用いたリン
酸化反応を行い、次いでそのままＡＴＰを除去すること
なく、ｐＨが７．２〜８．５の範囲内で検体中の１，５
−ＡＧとＰＲＯＤとの酵素反応を実施することができ
る。この酵素反応はｐＨが７．２〜８．５、好ましくは
７．５〜８．０の範囲内で行うことにより、検体中に残
存するＡＴＰによりＰＲＯＤが阻害作用を受けず且つ
１，５−ＡＧに対してＰＲＯＤが良好な反応性を示す。
あるいは、ＰＲＯＤとしてＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏ
ｕｓ ｆｕｎｇｉ Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤを用いる
ことによって、このＰＲＯＤはＡＴＰによる阻害作用を
受けにくいため、過剰量のＡＴＰを用いたリン酸化反応
を行いそのまま引き続いて連続的に同様に１，５−ＡＧ
とＰＲＯＤとの反応を実施できる。この場合のｐＨは好
ましくはｐＨ６〜９、更に好ましくは７．０〜８．０の
範囲が採用される。またこの酸素反応の際には実際に５
〜５００ｍＭの濃度範囲のＡＴＰが存在していてもよ
い。
【００１８】１，５−ＡＧにＰＲＯＤを作用させること
により、過酸化水素が発生する。その過酸化水素をパー
オキシダーゼ、すなわち国際生化学連合の分類によって
ＥＣ１．１１．１．７と分類される酵素を用いて、２，
２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸）、ｏ−フェニレンジアミン、５−アミノサ
リチル酸、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジン
並びに４−アミノアンチピリン及びＮ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシスルホプロピル）−ｍ−トルイジンの
組み合わせなどの公知のパーオキシダーゼ用基質に作用
させ、基質から生成する色素を吸光度測定する。過酸化
水素を測定するのに用いるパーオキシダーゼは、ホース
ラディッシュパーオキシダーゼが好ましい。吸光度測定
に用いる色素を生成する基質は、４−アミノアンチピリ
ン及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジンの組み合わせが好ましい。４−ア
ミノアンチピリン及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シスルホプロピル）−ｍ−トルイジンを用いる際の吸光
度測定域の波長は、５００ｎｍ〜８００ｎｍであり、こ
の範囲で２波長以上の波長を用いて測定することもでき
る。
により、過酸化水素が発生する。その過酸化水素をパー
オキシダーゼ、すなわち国際生化学連合の分類によって
ＥＣ１．１１．１．７と分類される酵素を用いて、２，
２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸）、ｏ−フェニレンジアミン、５−アミノサ
リチル酸、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジン
並びに４−アミノアンチピリン及びＮ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシスルホプロピル）−ｍ−トルイジンの
組み合わせなどの公知のパーオキシダーゼ用基質に作用
させ、基質から生成する色素を吸光度測定する。過酸化
水素を測定するのに用いるパーオキシダーゼは、ホース
ラディッシュパーオキシダーゼが好ましい。吸光度測定
に用いる色素を生成する基質は、４−アミノアンチピリ
ン及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジンの組み合わせが好ましい。４−ア
ミノアンチピリン及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シスルホプロピル）−ｍ−トルイジンを用いる際の吸光
度測定域の波長は、５００ｎｍ〜８００ｎｍであり、こ
の範囲で２波長以上の波長を用いて測定することもでき
る。
【００１９】上記反応において用いられるＰＲＯＤ、ホ
ースラディッシュパーオキシダーゼ、４−アミノアンチ
ピリン及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプ
ロピル）−ｍ−トルイジンの好適な量は、ＰＲＯＤは５
〜５００Ｕ／ｍｌ、ホースラディッシュパーオキシダー
ゼは２〜２０Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリンは０．
１〜１０ｍＭ、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスル
ホプロピル）−ｍ−トルイジンは０．１〜１０ｍＭであ
る。また、反応に有効なｐＨ範囲は７．２〜８．５、好
ましくは７．５〜８．０、あるいは６〜９、好ましくは
７．０〜８．０の範囲である。
ースラディッシュパーオキシダーゼ、４−アミノアンチ
ピリン及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプ
ロピル）−ｍ−トルイジンの好適な量は、ＰＲＯＤは５
〜５００Ｕ／ｍｌ、ホースラディッシュパーオキシダー
ゼは２〜２０Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリンは０．
１〜１０ｍＭ、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスル
ホプロピル）−ｍ−トルイジンは０．１〜１０ｍＭであ
る。また、反応に有効なｐＨ範囲は７．２〜８．５、好
ましくは７．５〜８．０、あるいは６〜９、好ましくは
７．０〜８．０の範囲である。
【００２０】検体中の１，５−ＡＧを測定する第１段反
応及び第２段反応を含む反応全体において、反応温度は
通常は室温であり、具体的には５〜４０℃、好ましくは
２５〜４０℃であり、反応時間は２〜６０分、好ましく
は２〜３０分である。反応液の調製の際は、反応全体を
例えばｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．５〜８．０
で進行させるため、試薬を構成する反応液のうち、緩衝
液であるものについては、該反応液のｐＨを７．０〜
８．０、好ましくは７．５〜８．０、最大幅６〜９の範
囲で安定させるため、バッファーとしてリン酸バッファ
ー、トリス塩酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファーなど
を用いる。ＨＥＰＥＳバッファーであれば５０〜５００
ｍＭの濃度が好ましい。またイオン強度調節のためハロ
ゲン化アルカリ金属塩、好ましくは塩化ナトリウムなど
を用いる事ができる。本発明の方法で１，５−ＡＧを測
定するときは、上記した各成分を１つの溶液に加えて用
いてもよく、例えば、第１段反応に用いる試薬及び検体
中のマルトースをグルコースに変換する試薬であるα−
グルコシダーゼを一緒にした溶液を第１試薬とし、ＰＲ
ＯＤ及び過酸化水素を測定するための発色系試薬を第２
試薬として用いることができる。あるいはこれ以外の方
法として各成分を適宜な組み合わせとなるように分割し
て用いても良い。それらは溶液状でも凍結乾燥させても
良いが、長期の保存を意図する場合は凍結乾燥すること
が好ましい。また、測定反応を阻害しない濃度範囲内な
らば界面活性剤の添加も可能であり、測定系を凍結乾燥
する場合には、安定化剤を適当量加えても良い。本発明
では、リン酸化反応、酵素反応それに続く過酸化水素の
発生量を測定するための発色反応を、自動分析装置を用
いて実施できる。本発明において自動分析装置として用
いることのできるものは、具体的に機種を挙げて例示す
れば、日立７０５０型、日立７０５型、日立７３６型、
日立７１５０型などであるが、例示の機種に限定され
ず、これらに類するものであればいずれでもよい。
応及び第２段反応を含む反応全体において、反応温度は
通常は室温であり、具体的には５〜４０℃、好ましくは
２５〜４０℃であり、反応時間は２〜６０分、好ましく
は２〜３０分である。反応液の調製の際は、反応全体を
例えばｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．５〜８．０
で進行させるため、試薬を構成する反応液のうち、緩衝
液であるものについては、該反応液のｐＨを７．０〜
８．０、好ましくは７．５〜８．０、最大幅６〜９の範
囲で安定させるため、バッファーとしてリン酸バッファ
ー、トリス塩酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファーなど
を用いる。ＨＥＰＥＳバッファーであれば５０〜５００
ｍＭの濃度が好ましい。またイオン強度調節のためハロ
ゲン化アルカリ金属塩、好ましくは塩化ナトリウムなど
を用いる事ができる。本発明の方法で１，５−ＡＧを測
定するときは、上記した各成分を１つの溶液に加えて用
いてもよく、例えば、第１段反応に用いる試薬及び検体
中のマルトースをグルコースに変換する試薬であるα−
グルコシダーゼを一緒にした溶液を第１試薬とし、ＰＲ
ＯＤ及び過酸化水素を測定するための発色系試薬を第２
試薬として用いることができる。あるいはこれ以外の方
法として各成分を適宜な組み合わせとなるように分割し
て用いても良い。それらは溶液状でも凍結乾燥させても
良いが、長期の保存を意図する場合は凍結乾燥すること
が好ましい。また、測定反応を阻害しない濃度範囲内な
らば界面活性剤の添加も可能であり、測定系を凍結乾燥
する場合には、安定化剤を適当量加えても良い。本発明
では、リン酸化反応、酵素反応それに続く過酸化水素の
発生量を測定するための発色反応を、自動分析装置を用
いて実施できる。本発明において自動分析装置として用
いることのできるものは、具体的に機種を挙げて例示す
れば、日立７０５０型、日立７０５型、日立７３６型、
日立７１５０型などであるが、例示の機種に限定され
ず、これらに類するものであればいずれでもよい。
【００２１】本発明の１，５−ＡＧの定量法に用いるキ
ットとしては、以上に詳細に説明した定量法から明らか
なように、以下の構成試薬 ｉ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のα−グル
コシダーゼ；ｉｉ）ＨＫ；ｉｉｉ）ＡＴＰ；及びｉｖ）
ＰＲＯＤを含むキッドが代表的なものとして挙げられ
る。これらの構成試薬に更に、過酸化水素を測定するた
めに必要な前述した発色系試薬、ｐＨ調整に必要な緩衝
液などを加えることができる。構成試薬の１つであるＢ
ａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のα−グルコシダ
ーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシダーゼが好まし
い。ＰＲＯＤとしては、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕ
ｓｕｓ由来あるいはＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ
ｆｕｎｇｉ Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤが好ましい。こ
れらの構成試薬は、溶液状でも凍結乾燥状態で用いても
いずれでもよい。
ットとしては、以上に詳細に説明した定量法から明らか
なように、以下の構成試薬 ｉ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のα−グル
コシダーゼ；ｉｉ）ＨＫ；ｉｉｉ）ＡＴＰ；及びｉｖ）
ＰＲＯＤを含むキッドが代表的なものとして挙げられ
る。これらの構成試薬に更に、過酸化水素を測定するた
めに必要な前述した発色系試薬、ｐＨ調整に必要な緩衝
液などを加えることができる。構成試薬の１つであるＢ
ａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のα−グルコシダ
ーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシダーゼが好まし
い。ＰＲＯＤとしては、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕ
ｓｕｓ由来あるいはＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ
ｆｕｎｇｉ Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤが好ましい。こ
れらの構成試薬は、溶液状でも凍結乾燥状態で用いても
いずれでもよい。
【００２２】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
する。勿論、本発明はこれらの実施例によって限定され
るものではない。 実施例１ マルトース消去性の比較 マルトース ４００、３６０、３２０、２８０、２４
０、２００、１６０、１２０、８０、４０、０ｍｇ／ｄ
ｌ水溶液；グルコース １５００、１３５０、１２０
０、１０５０、９００、７５０、６００、４５０、３０
０、１５０、０ｍｇ／ｄｌ水溶液；及び１，５−ＡＧ
５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、
２．０、１．５、１．０、０．５、０．０ｍｇ／ｄｌ水
溶液；を標準検体として用いてマルトース及びグルコー
スの消去反応を調べた。また更に１，５−ＡＧ定量反応
を下記の条件において比較した。
する。勿論、本発明はこれらの実施例によって限定され
るものではない。 実施例１ マルトース消去性の比較 マルトース ４００、３６０、３２０、２８０、２４
０、２００、１６０、１２０、８０、４０、０ｍｇ／ｄ
ｌ水溶液；グルコース １５００、１３５０、１２０
０、１０５０、９００、７５０、６００、４５０、３０
０、１５０、０ｍｇ／ｄｌ水溶液；及び１，５−ＡＧ
５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、
２．０、１．５、１．０、０．５、０．０ｍｇ／ｄｌ水
溶液；を標準検体として用いてマルトース及びグルコー
スの消去反応を調べた。また更に１，５−ＡＧ定量反応
を下記の条件において比較した。
【００２３】試薬条件は、第１試薬中にマルトース加水
分解酵素であるα−グルコシダーゼを添加しないものを
第１−Ａ試薬；第１試薬中にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ
Ｎｏ．ＡＧＨ−２０１）を４０ＫＵ／ｌ添加したもの
を第１−Ｂ試薬；第１試薬中にＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓ
ｐ．由来のグルコアミラーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．
ＡＧＨ−１１１）を４０ＫＵ／ｌ添加したものを第１−
Ｃ試薬；第１試薬中に上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼ及びＲｈｉｚｏｐｕ
ｓ ｓｐ．由来のグルコアミラーゼを４０ＫＵ／ｌづつ
添加したもの第１−Ｄ試薬；第１試薬中にＢａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα
−グルコシダーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２
１１）を４０ＫＵ／ｌ添加したものを第１−Ｅ試薬と
し、他の共通試薬条件及び第２試薬条件は以下に示す組
成とした。第１−Ａ試薬、第１−Ｂ試薬、第１−Ｃ試薬、第１−Ｄ試薬及び第１−Ｅ試薬に おける共通組成 ＨＥＰＥＳ ２００ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ｍＭ 酢酸マグネシウム １０ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）− ｍ−トルイジン １ｍＭ パーオキシターゼ ５ＫＵ／ｌ ヘキソキナーゼ ２０ＫＵ／ｌ ＡＴＰ １００ｍＭ ｐＨ７．５第２試薬の組成 ＨＥＰＥＳ ２００ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ｍＭ ４−アミノアンチピリン ４ｍＭ Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ由来のＰＲＯＤ ６２．５ＫＵ／ｌ ｐＨ７．５
分解酵素であるα−グルコシダーゼを添加しないものを
第１−Ａ試薬；第１試薬中にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ
Ｎｏ．ＡＧＨ−２０１）を４０ＫＵ／ｌ添加したもの
を第１−Ｂ試薬；第１試薬中にＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓ
ｐ．由来のグルコアミラーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．
ＡＧＨ−１１１）を４０ＫＵ／ｌ添加したものを第１−
Ｃ試薬；第１試薬中に上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼ及びＲｈｉｚｏｐｕ
ｓ ｓｐ．由来のグルコアミラーゼを４０ＫＵ／ｌづつ
添加したもの第１−Ｄ試薬；第１試薬中にＢａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα
−グルコシダーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２
１１）を４０ＫＵ／ｌ添加したものを第１−Ｅ試薬と
し、他の共通試薬条件及び第２試薬条件は以下に示す組
成とした。第１−Ａ試薬、第１−Ｂ試薬、第１−Ｃ試薬、第１−Ｄ試薬及び第１−Ｅ試薬に おける共通組成 ＨＥＰＥＳ ２００ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ｍＭ 酢酸マグネシウム １０ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）− ｍ−トルイジン １ｍＭ パーオキシターゼ ５ＫＵ／ｌ ヘキソキナーゼ ２０ＫＵ／ｌ ＡＴＰ １００ｍＭ ｐＨ７．５第２試薬の組成 ＨＥＰＥＳ ２００ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ｍＭ ４−アミノアンチピリン ４ｍＭ Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ由来のＰＲＯＤ ６２．５ＫＵ／ｌ ｐＨ７．５
【００２４】反応条件は標準検体容量７μｌ、第１試薬
容量２８０μｌ、第２試薬容量７０μｌとし主波長５４
６ｎｍ、副波長７００ｎｍで日立７１５０型自動分析装
置を用いて２ポイントアッセイにて行った。図１〜図３
に第１−Ａ試薬（マルトース加水分解酵素を添加しない
もの）を使用した場合の結果を示す。図４〜図６に第１
−Ｂ試薬（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来の
α−グルコシダーゼを４０ＫＵ／ｌ添加したもの）を使
用した場合の結果を示す。図７〜図９に第１−Ｃ試薬
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．由来のグルコアミラーゼを
４０ＫＵ／ｌ添加したもの）を使用した場合の結果を示
す。図１０〜図１２に第１−Ｄ試薬（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼ及びＲｈ
ｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．由来のグルコアミラーゼを４０Ｋ
Ｕ／ｌづつ添加したもの）を使用した場合の結果を示
す。図１３〜図１５に第１−Ｅ試薬（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グ
ルコシダーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１
１）を４０ＫＵ／ｌ添加したもの）を使用した場合の結
果を示す。
容量２８０μｌ、第２試薬容量７０μｌとし主波長５４
６ｎｍ、副波長７００ｎｍで日立７１５０型自動分析装
置を用いて２ポイントアッセイにて行った。図１〜図３
に第１−Ａ試薬（マルトース加水分解酵素を添加しない
もの）を使用した場合の結果を示す。図４〜図６に第１
−Ｂ試薬（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来の
α−グルコシダーゼを４０ＫＵ／ｌ添加したもの）を使
用した場合の結果を示す。図７〜図９に第１−Ｃ試薬
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．由来のグルコアミラーゼを
４０ＫＵ／ｌ添加したもの）を使用した場合の結果を示
す。図１０〜図１２に第１−Ｄ試薬（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼ及びＲｈ
ｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．由来のグルコアミラーゼを４０Ｋ
Ｕ／ｌづつ添加したもの）を使用した場合の結果を示
す。図１３〜図１５に第１−Ｅ試薬（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グ
ルコシダーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１
１）を４０ＫＵ／ｌ添加したもの）を使用した場合の結
果を示す。
【００２５】図１に示したように、第１試薬にマルトー
ス加水分解酵素であるα−グルコシダーゼを添加しない
場合において、１，５−ＡＧを反応させた場合では５ｍ
ｇ／ｄｌまで原点を通る良好な直線性を示し、図２に示
したようにグルコースを反応させた場合では１５００ｍ
ｇ／ｄｌまでほぼ試薬ブランクと同一の吸光度が得られ
た。しかし、図３に示したようにマルトースを反応させ
た場合では、著しい反応吸光度を得た。これは、マルト
ースが１，５−ＡＧとして計りこまれる事を意味するも
のである。図４〜図６に示したように、第１試薬にＳａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来のα−グルコシダ
ーゼを４０ＫＵ／ｌ添加した場合において、１，５−Ａ
Ｇの定量性、グルコースの消去性は未添加の場合と同様
であり、マルトースを反応させた場合においてもほぼ同
様の結果を得た。これはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼではマルトースが除去
できないことを示すものである。図７〜図９に示したよ
うに、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．由来のグルコアミラー
ゼを４０ＫＵ／ｌ添加した場合においても、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼを
４０ＫＵ／ｌ添加した場合と同様に、１，５−ＡＧの定
量性、グルコースの消去性は未添加の場合と同様であ
り、マルトースを反応させた場合の著しい反応吸光度は
解消されなかった。これは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．
由来のグルコアミラーゼでもマルトースが除去できない
ことを示すものである。
ス加水分解酵素であるα−グルコシダーゼを添加しない
場合において、１，５−ＡＧを反応させた場合では５ｍ
ｇ／ｄｌまで原点を通る良好な直線性を示し、図２に示
したようにグルコースを反応させた場合では１５００ｍ
ｇ／ｄｌまでほぼ試薬ブランクと同一の吸光度が得られ
た。しかし、図３に示したようにマルトースを反応させ
た場合では、著しい反応吸光度を得た。これは、マルト
ースが１，５−ＡＧとして計りこまれる事を意味するも
のである。図４〜図６に示したように、第１試薬にＳａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来のα−グルコシダ
ーゼを４０ＫＵ／ｌ添加した場合において、１，５−Ａ
Ｇの定量性、グルコースの消去性は未添加の場合と同様
であり、マルトースを反応させた場合においてもほぼ同
様の結果を得た。これはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼではマルトースが除去
できないことを示すものである。図７〜図９に示したよ
うに、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．由来のグルコアミラー
ゼを４０ＫＵ／ｌ添加した場合においても、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼを
４０ＫＵ／ｌ添加した場合と同様に、１，５−ＡＧの定
量性、グルコースの消去性は未添加の場合と同様であ
り、マルトースを反応させた場合の著しい反応吸光度は
解消されなかった。これは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．
由来のグルコアミラーゼでもマルトースが除去できない
ことを示すものである。
【００２６】図１０〜図１２に示したように、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼ
及びＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．由来のグルコアミラーゼ
を４０ＫＵ／ｌづつ添加した場合においても、それぞれ
単独使用の場合と同様な結果を得た。これは、この２種
の酵素のコンビネーションにおいてもマルトースを除去
できないことを示すものである。図１３〜図１５に示し
たように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシダーゼ（東洋紡Ｃｏ
ｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）を４０ＫＵ／ｌ添加した
場合においては、１，５−ＡＧの定量性、グルコースの
消去性は未添加の場合と同様であり、なおかつマルトー
スが２００ｍｇ／ｄｌの濃度まで、得られる反応吸光度
をほぼ試薬ブランクと同程度に抑えることが可能であっ
た。これは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシダーゼ（東洋紡Ｃ
ｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）は他のマルトース加水
分解酵素とは異なり、マルトースに対して高い親和性、
反応性を有するものであり、本酵素を第１試薬に添加し
た場合短時間に内因性のマルトースを消去できることを
差し示すものである。
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼ
及びＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．由来のグルコアミラーゼ
を４０ＫＵ／ｌづつ添加した場合においても、それぞれ
単独使用の場合と同様な結果を得た。これは、この２種
の酵素のコンビネーションにおいてもマルトースを除去
できないことを示すものである。図１３〜図１５に示し
たように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシダーゼ（東洋紡Ｃｏ
ｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）を４０ＫＵ／ｌ添加した
場合においては、１，５−ＡＧの定量性、グルコースの
消去性は未添加の場合と同様であり、なおかつマルトー
スが２００ｍｇ／ｄｌの濃度まで、得られる反応吸光度
をほぼ試薬ブランクと同程度に抑えることが可能であっ
た。これは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシダーゼ（東洋紡Ｃ
ｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）は他のマルトース加水
分解酵素とは異なり、マルトースに対して高い親和性、
反応性を有するものであり、本酵素を第１試薬に添加し
た場合短時間に内因性のマルトースを消去できることを
差し示すものである。
【００２７】実施例２ マルトース消去性の確認 正常者血清及び糖尿病患者血清にマルトースを０〜２０
０ｍｇ／ｄｌ添加したものを検体として１，５−ＡＧの
測定を行った。第１試薬における試薬条件は以下に示す
とおりである。第１試薬組成 ＨＥＰＥＳ ２００ ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ ｍＭ 酢酸マグネシウム １０ ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）− ｍ−トルイジン １ ｍＭ パーオキシターゼ ５ ＫＵ／ｌ ヘキソキナーゼ ２０ ＫＵ／ｌ ＡＴＰ １００ ｍＭ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ 由来のα−グルコシダーゼ （東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１） ０又は４０ 又は８０ＫＵ／ｌ ｐＨ７．５
０ｍｇ／ｄｌ添加したものを検体として１，５−ＡＧの
測定を行った。第１試薬における試薬条件は以下に示す
とおりである。第１試薬組成 ＨＥＰＥＳ ２００ ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ ｍＭ 酢酸マグネシウム １０ ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）− ｍ−トルイジン １ ｍＭ パーオキシターゼ ５ ＫＵ／ｌ ヘキソキナーゼ ２０ ＫＵ／ｌ ＡＴＰ １００ ｍＭ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ 由来のα−グルコシダーゼ （東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１） ０又は４０ 又は８０ＫＵ／ｌ ｐＨ７．５
【００２８】第２試薬は実施例１と同一の条件にて測定
を行った。すなわち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシダーゼ
（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）を添加しな
い場合と４０ＫＵ／ｌあるいは８０ＫＵ／ｌ添加した場
合の比較を行い、マルトース消去性の確認を行った。反
応条件は検体容量７μｌ、第１試薬容量２８０μｌ、第
２試薬容量７０μｌとし主波長５４６ｎｍ、副波長７０
０ｎｍで日立７１５０型自動分析装置を用いて２ポイン
トアッセイにて行った。
を行った。すなわち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシダーゼ
（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）を添加しな
い場合と４０ＫＵ／ｌあるいは８０ＫＵ／ｌ添加した場
合の比較を行い、マルトース消去性の確認を行った。反
応条件は検体容量７μｌ、第１試薬容量２８０μｌ、第
２試薬容量７０μｌとし主波長５４６ｎｍ、副波長７０
０ｎｍで日立７１５０型自動分析装置を用いて２ポイン
トアッセイにて行った。
【００２９】図１６に、正常者血清にマルトースを０〜
２００ｍｇ／ｄｌ添加したものを検体として１，５−Ａ
Ｇの測定を行った結果を示す。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシ
ダーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）を添
加しない場合は、マルトースによる著しい正誤差が認め
られるにもかかわらず、本酵素を４０ＫＵ／ｌあるいは
８０ＫＵ／ｌ添加した場合ではほぼ完全にマルトースの
影響を回避していることが確認される。図１７に、糖尿
病患者血清にマルトースを０〜２００ｍｇ／ｄｌ添加し
たものを検体として１，５−ＡＧの測定を行った結果を
示す。糖尿病患者血清にマルトースを添加した場合にお
いても、正常者血清にマルトースを添加した場合と同様
に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ由来のα−グルコシダーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ
Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）を添加しない場合は、マルトー
スによる著しい正誤差が認められるにもかかわらず、本
酵素を４０ＫＵ／ｌあるいは８０ＫＵ／ｌ添加した場合
ではほぼ完全にマルトースの影響を回避していることが
確認される。
２００ｍｇ／ｄｌ添加したものを検体として１，５−Ａ
Ｇの測定を行った結果を示す。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシ
ダーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）を添
加しない場合は、マルトースによる著しい正誤差が認め
られるにもかかわらず、本酵素を４０ＫＵ／ｌあるいは
８０ＫＵ／ｌ添加した場合ではほぼ完全にマルトースの
影響を回避していることが確認される。図１７に、糖尿
病患者血清にマルトースを０〜２００ｍｇ／ｄｌ添加し
たものを検体として１，５−ＡＧの測定を行った結果を
示す。糖尿病患者血清にマルトースを添加した場合にお
いても、正常者血清にマルトースを添加した場合と同様
に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ由来のα−グルコシダーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ
Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）を添加しない場合は、マルトー
スによる著しい正誤差が認められるにもかかわらず、本
酵素を４０ＫＵ／ｌあるいは８０ＫＵ／ｌ添加した場合
ではほぼ完全にマルトースの影響を回避していることが
確認される。
【００３０】実施例３ Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕ
ｓｕｓ由来のＰＲＯＤを用いた場合のマルトース消去性
におけるカラム酵素法との比較 実施例２と同様に、正常者血清及び糖尿病患者血清にマ
ルトースを０〜２００ｍｇ／ｄｌ添加したものを検体と
してＰｏｌｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ由来のＰＲＯ
Ｄを用いた本発明の方法及びカラム酵素法にて１，５−
ＡＧの測定を行った。カラム酵素法は、日本化薬株式会
社ラナＡＧ（登録商標）を用いて、使用説明書の記載の
通りの操作で測定を行った。
ｓｕｓ由来のＰＲＯＤを用いた場合のマルトース消去性
におけるカラム酵素法との比較 実施例２と同様に、正常者血清及び糖尿病患者血清にマ
ルトースを０〜２００ｍｇ／ｄｌ添加したものを検体と
してＰｏｌｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ由来のＰＲＯ
Ｄを用いた本発明の方法及びカラム酵素法にて１，５−
ＡＧの測定を行った。カラム酵素法は、日本化薬株式会
社ラナＡＧ（登録商標）を用いて、使用説明書の記載の
通りの操作で測定を行った。
【００３１】図１８に、正常者血清にマルトースを０〜
２００ｍｇ／ｄｌ添加したものを検体として１，５−Ａ
Ｇの測定を行った結果を示す。性能の比較のため、実施
例２に示した本発明におけるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシダ
ーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）を８０
ＫＵ／ｌ添加した場合の測定結果を合せて示す。カラム
酵素法においては、マルトースによる極めて著しい正誤
差を認めるにも拘らず、本発明の方法においては、ほぼ
完全にマルトースによる正誤差を回避している。図１９
に、糖尿病患者血清にマルトースを０〜２００ｍｇ／ｄ
ｌ添加したものを検体として１，５−ＡＧの測定を行っ
た結果を示す。この場合も正常者血清にマルトースを添
加した場合と同様に、カラム酵素法においては、マルト
ースによる極めて著しい正誤差を認めるにも拘らず、本
発明の方法においては、ほぼ完全にマルトースによる正
誤差を回避している。
２００ｍｇ／ｄｌ添加したものを検体として１，５−Ａ
Ｇの測定を行った結果を示す。性能の比較のため、実施
例２に示した本発明におけるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシダ
ーゼ（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）を８０
ＫＵ／ｌ添加した場合の測定結果を合せて示す。カラム
酵素法においては、マルトースによる極めて著しい正誤
差を認めるにも拘らず、本発明の方法においては、ほぼ
完全にマルトースによる正誤差を回避している。図１９
に、糖尿病患者血清にマルトースを０〜２００ｍｇ／ｄ
ｌ添加したものを検体として１，５−ＡＧの測定を行っ
た結果を示す。この場合も正常者血清にマルトースを添
加した場合と同様に、カラム酵素法においては、マルト
ースによる極めて著しい正誤差を認めるにも拘らず、本
発明の方法においては、ほぼ完全にマルトースによる正
誤差を回避している。
【００３２】実施例４ Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕ
ｓ ｆｕｎｇｉ Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤを用いた場
合のマルトース消去性におけるカラム酵素法とのの比較 Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ Ｎｏ．
５２由来のＰＲＯＤを第２試薬中に同量用いた以外は、
実施例３と同様の条件により正常者血清及び糖尿病患者
血清に、マルトースを０〜２００ｍｇ／ｄｌ添加したも
のと検体として、本発明の方法及びカラム酵素法にて、
１，５−ＡＧの測定を行なった。図２０に正常者血清に
マルトースを０〜２００ｍｇ／ｄｌ添加した場合、図２
１に糖尿病患者血清にマルトースを０〜２００ｍｇ／ｄ
ｌ添加した場合の１，５−ＡＧの測定結果を示す。実施
例３の場合と同様にカラム酵素法では著しいマルトース
による正誤差を認めるにもかかわらず、本発明の方法に
おいては、ほぼ完全にマルトースによる正誤差を回避し
ている。
ｓ ｆｕｎｇｉ Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤを用いた場
合のマルトース消去性におけるカラム酵素法とのの比較 Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ Ｎｏ．
５２由来のＰＲＯＤを第２試薬中に同量用いた以外は、
実施例３と同様の条件により正常者血清及び糖尿病患者
血清に、マルトースを０〜２００ｍｇ／ｄｌ添加したも
のと検体として、本発明の方法及びカラム酵素法にて、
１，５−ＡＧの測定を行なった。図２０に正常者血清に
マルトースを０〜２００ｍｇ／ｄｌ添加した場合、図２
１に糖尿病患者血清にマルトースを０〜２００ｍｇ／ｄ
ｌ添加した場合の１，５−ＡＧの測定結果を示す。実施
例３の場合と同様にカラム酵素法では著しいマルトース
による正誤差を認めるにもかかわらず、本発明の方法に
おいては、ほぼ完全にマルトースによる正誤差を回避し
ている。
【００３３】
【発明の効果】以上の実施例にも示した通り、本発明の
測定方法は自動分析装置への適用に即し、しかも内因性
のマルトースの影響を回避したものである。すなわち、
本発明の方法により、従来不可能であったマルトースの
影響の無い１，５−ＡＧの完全自動化測定が可能とな
り、その他多くの臨床検査項目と同様に多数の検体を迅
速、正確、かつ多量に処理することが出来るようになっ
た。
測定方法は自動分析装置への適用に即し、しかも内因性
のマルトースの影響を回避したものである。すなわち、
本発明の方法により、従来不可能であったマルトースの
影響の無い１，５−ＡＧの完全自動化測定が可能とな
り、その他多くの臨床検査項目と同様に多数の検体を迅
速、正確、かつ多量に処理することが出来るようになっ
た。
【図１】第１−Ａ試薬（マルトース加水分解酵素を添加
しないもの）を使用した場合の１，５−ＡＧの定量性を
示すグラフである。
しないもの）を使用した場合の１，５−ＡＧの定量性を
示すグラフである。
【図２】第１−Ａ試薬を使用した場合のグルコース消去
性を示すグラフである。
性を示すグラフである。
【図３】第１−Ａ試薬を使用した場合のマルトースの影
響を示すグラフである。
響を示すグラフである。
【図４】第１−Ｂ試薬（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼを４０ＫＵ／ｌ添加し
たもの）を使用した場合の１，５−ＡＧの定量性を示す
グラフである。
ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼを４０ＫＵ／ｌ添加し
たもの）を使用した場合の１，５−ＡＧの定量性を示す
グラフである。
【図５】第１−Ｂ試薬を使用した場合のグルコース消去
性を示すグラフである。
性を示すグラフである。
【図６】第１−Ｂ試薬を使用した場合のマルトース残留
程度を示すグラフである。
程度を示すグラフである。
【図７】第１−Ｃ試薬（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．由来
のグルコアミラーゼを４０ＫＵ／ｌ添加したもの）を使
用した場合の１，５−ＡＧの定量性を示すグラフであ
る。
のグルコアミラーゼを４０ＫＵ／ｌ添加したもの）を使
用した場合の１，５−ＡＧの定量性を示すグラフであ
る。
【図８】第１−Ｃ試薬を使用した場合のグルコース消去
性を示すグラフである。
性を示すグラフである。
【図９】第１−Ｃ試薬を使用した場合のマルトースの残
留程度を示すグラフである。
留程度を示すグラフである。
【図１０】第１−Ｄ試薬（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼ及びＲｈｉｚｏｐｕ
ｓ ｓｐ．由来のグルコアミラーゼを４０ＫＵ／ｌづつ
添加したもの）を使用した場合の１，５−ＡＧの定量性
を示すグラフである。
ｓｐ．由来のα−グルコシダーゼ及びＲｈｉｚｏｐｕ
ｓ ｓｐ．由来のグルコアミラーゼを４０ＫＵ／ｌづつ
添加したもの）を使用した場合の１，５−ＡＧの定量性
を示すグラフである。
【図１１】第１−Ｄ試薬を使用した場合のグルコース消
去性を示すグラフである。
去性を示すグラフである。
【図１２】第１−Ｄ試薬を使用した場合のマルトースの
残留程度を示すグラフである。
残留程度を示すグラフである。
【図１３】第１−Ｅ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシダーゼ
（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）を４０ＫＵ
／ｌ添加したもの）を使用した場合の１，５−ＡＧの定
量性を示すグラフである。
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルコシダーゼ
（東洋紡Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＡＧＨ−２１１）を４０ＫＵ
／ｌ添加したもの）を使用した場合の１，５−ＡＧの定
量性を示すグラフである。
【図１４】第１−Ｅ試薬を使用した場合のグルコース消
去性を示すグラフである。
去性を示すグラフである。
【図１５】第１−Ｅ試薬を使用した場合のマルトースの
消去性を示すグラフである。
消去性を示すグラフである。
【図１６】正常者血清にマルトースを添加した場合の、
本発明におけるマルトース消去性を示すグラフである。
本発明におけるマルトース消去性を示すグラフである。
【図１７】糖尿病患者血清にマルトースを添加した場合
の、本発明におけるマルトース消去性を示すグラフであ
る。
の、本発明におけるマルトース消去性を示すグラフであ
る。
【図１８】正常者血清にマルトースを添加した場合の、
カラム酵素法と本発明におけるマルトース消去性を比較
したグラフである。
カラム酵素法と本発明におけるマルトース消去性を比較
したグラフである。
【図１９】糖尿病患者血清にマルトースを添加した場合
の、カラム酵素法と本発明におけるマルトース消去性を
比較したグラフである。
の、カラム酵素法と本発明におけるマルトース消去性を
比較したグラフである。
【図２０】正常者血清にマルトースを添加した場合の、
カラム酵素法を本発明（バシジオマイセタウス・フンギ
Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤを使用）におけるマルトー
ス消去性を比較したグラフである。
カラム酵素法を本発明（バシジオマイセタウス・フンギ
Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤを使用）におけるマルトー
ス消去性を比較したグラフである。
【図２１】糖尿病患者血清にマルトースを添加した場合
の、カラム酵素法と本発明（バシジオマイセタウス・フ
ンギ Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤを使用）におけるマル
トース消去性を比較したグラフである。
の、カラム酵素法と本発明（バシジオマイセタウス・フ
ンギ Ｎｏ．５２由来のＰＲＯＤを使用）におけるマル
トース消去性を比較したグラフである。
Claims (9)
- 【請求項１】 検体中の１，５−アンヒドログルシトー
ルをピラノースオキシダーゼを用いて定量する方法にお
いて、検体中に存在するマルトースをＢａｃｉｌｌｕｓ
属に属する微生物由来のα−グルコシダーゼの作用によ
りグルコースに変換し、次いで検体中に存在する１，５
−アンヒドログルシトール以外の他の糖類と共に１，５
−アンヒドログルシトールが残留するようにグルコース
を選択的に除去した後、検体中の１，５−アンヒドログ
ルシトールをピラノースオキシダーゼを用いて定量する
ことを特徴とする１，５−アンヒドログルシトールの定
量法。 - 【請求項２】 α−グルコシダーゼがＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グ
ルコシダーゼである請求項１記載の１，５−アンヒドロ
グルシトールの定量法。 - 【請求項３】 検体中の１，５−アンヒドログルシトー
ルをピラノースオキシダーゼを用いて定量する方法にお
いて、 検体中に存在するマルトースをＢａｃｉｌｌｕｓ属に属
する微生物由来のα−グルコシダーゼの作用によりグル
コースに変換し；該グルコースを、検体中に存在する
１，５−アンヒドログルシトール以外の他の糖類と共
に、ヘキソキナーゼと過剰量のアデノシン−５′−三リ
ン酸によりｐＨが７．２〜８．５の範囲内でリン酸化す
ることにより、検体中の１，５−アンヒドログルシトー
ルが残留するように選択的に除去し；次いでそのまま検
体中の１，５−アンヒドログルシトールにピラノースオ
キシダーゼをｐＨが７．２〜８．５の範囲内で作用させ
て１，５−アンヒドログルシトールを定量することを特
徴とする１，５−アンヒドログルシトールの定量法。 - 【請求項４】 ピラノースオキシダーゼが、Ｐｏｌｙｐ
ｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ由来のピラノースオキシダー
ゼである請求項３記載の１，５−アンヒドログルシトー
ルの定量法。 - 【請求項５】 検体中の１，５−アンヒドログルシトー
ルをピラノースオキシダーゼを用いて定量する方法にお
いて、 検体中に存在するマルトースをＢａｃｉｌｌｕｓ属に属
する微生物由来のα−グルコシダーゼの作用によりグル
コースに変換し；該グルコースを、検体中に存在する
１，５−アンヒドログルシトール以外の他の糖類と共
に、ヘキソキナーゼと過剰量のアデノシン−５′−三リ
ン酸によりリン酸化することにより、検体中の１，５−
アンヒドログルシトールが残留するように選択的に除去
し；次いでそのまま検体中の１，５−アンヒドログルシ
トールにＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ
Ｎｏ．５２由来のピラノースオキシダーゼを作用させ
て１，５−アンヒドログルシトールを定量することを特
徴とする１，５−アンヒドログルシトールの定量法。 - 【請求項６】 検体中の１，５−アンヒドログルシトー
ルに対してピラノースオキシダーゼを作用させて生成す
る過酸化水素の量から１，５−アンヒドログルシトール
を定量する請求項１から５のいずれかに記載の１，５−
アンヒドログルシトールの定量法。 - 【請求項７】 検体中の１，５−アンヒドログルシトー
ルの定量に用いるキットであって、以下の構成試薬： ｉ） Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のα−グ
ルコシダーゼ； ｉｉ） ヘキソキナーゼ； ｉｉｉ） アデノシン−５′−三リン酸； 及びｉｖ） ピラノースオキシダーゼ； を含む１，５−アンヒドログルシトール定量用キット。 - 【請求項８】 ピラノースオキシダーゼが、Ｐｏｌｙｐ
ｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ由来のピラノースオキシダー
ゼあるいはＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓｆｕｎｇｉ
Ｎｏ．５２由来のピラノースオキシダーゼである請求
項７記載の１，５−アンヒドログルシトール定量用キッ
ト。 - 【請求項９】 １，５−アンヒドログルシトールの定量
の際に生成する過酸化水素の量を定量するために必要な
発色系試薬を含む請求項７または８記載の１，５−アン
ヒドログルシトール定量用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5132256A JPH0767395B2 (ja) | 1992-06-30 | 1993-06-03 | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-172955 | 1992-06-30 | ||
| JP17295592 | 1992-06-30 | ||
| JP5132256A JPH0767395B2 (ja) | 1992-06-30 | 1993-06-03 | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0670795A true JPH0670795A (ja) | 1994-03-15 |
| JPH0767395B2 JPH0767395B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=26466886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5132256A Expired - Lifetime JPH0767395B2 (ja) | 1992-06-30 | 1993-06-03 | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0767395B2 (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5534007A (en) * | 1978-08-28 | 1980-03-10 | Oriental Yeast Co Ltd | Determination of amylase activity |
| JPS61257199A (ja) * | 1985-05-09 | 1986-11-14 | Unitika Ltd | アミラ−ゼ活性測定用試薬及び測定方法 |
| JPS63185397A (ja) * | 1986-09-22 | 1988-07-30 | Nippon Kayaku Co Ltd | １，５―アンヒドログルシトールの定量法 |
| JPH0466083A (ja) * | 1990-07-04 | 1992-03-02 | Showa Denko Kk | α―グルコシダーゼおよびその製造法 |
-
1993
- 1993-06-03 JP JP5132256A patent/JPH0767395B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5534007A (en) * | 1978-08-28 | 1980-03-10 | Oriental Yeast Co Ltd | Determination of amylase activity |
| JPS61257199A (ja) * | 1985-05-09 | 1986-11-14 | Unitika Ltd | アミラ−ゼ活性測定用試薬及び測定方法 |
| JPS63185397A (ja) * | 1986-09-22 | 1988-07-30 | Nippon Kayaku Co Ltd | １，５―アンヒドログルシトールの定量法 |
| JPH0466083A (ja) * | 1990-07-04 | 1992-03-02 | Showa Denko Kk | α―グルコシダーゼおよびその製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0767395B2 (ja) | 1995-07-26 |
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