JPH09252A - ノイラミニダーゼ２１９及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記の理化学的性質を有する新規なノイラミ
ニダーゼ２１９。 （１）作用および特異性：糖蛋白質、糖脂質、オリゴ糖
及び多糖類の糖鎖の非還元末端に存在するシアル酸残基
を遊離させる反応を触媒する。 （２）至適ｐＨ：７．０ （３）至適温度：４０℃ （４）分子量：約９３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る測定） 【効果】 本発明により、アルテロモナス・スピーシー
ズＪＴ０２１９を好気的条件下で培養することによって
ノイラミニダーゼ２１９を大量に、且つ夾雑蛋白質の少
ない状態で提供することができる。また、ノイラミニダ
ーゼ２１９は至適ｐＨが中性付近にあることから、生体
成分に作用させる上でよりマイルドな条件で用いること
ができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なノイラミニダーゼ
２１９、その製造方法ならびにノイラミニダーゼ２１９
生産能を有する微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】ノイラミニダーゼは、糖蛋白質、糖脂
質、オリゴ糖及び多糖類の糖鎖の非還元末端に存在する
シアル酸残基を遊離させる反応を触媒する酵素である。
ノイラミニダーゼは、血清等の生体液中のシアル酸含有
物質の定量に用いられることはよく知られ、ノイラミニ
ダーゼの供給源としては工業的規模で製造可能であり、
しかも活性の一定したものが得られること等の長所のた
め、微生物由来のものが大半を占めている。

【０００３】従来、微生物由来のノイラミニダーゼに関
しては、ビブリオ・コレラ（Vibriocholerae）、クロス
トリディウム・パーフリンゲン（Clostridium perfring
ens）、ストレプトコッカス スピーシーズ（Streptoco
ccus sp.）、ストレプトマイセス・スピーシーズ（Stre
ptomyces sp.）等の微生物による培養液中への生産が知
られており、コリネバクテリウム・ディフテリア（Cory
nebacterium diphtheriae）、クレブシエラ・アエロゲ
ネス（Klebsiella aerogenes）等では大部分が膜結合型
として存在することが知られている。ノイラミニダーゼ
は、シアル酸含有物質中のシアル酸を定量するときに用
いられたり、シアル酸を除去したアシアロ体の調製に広
く用いられている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、新規
なノイラミニダーゼ２１９、その製造方法および該製造
方法に用いる新規な微生物を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を鑑み鋭意ノイラミニダーゼ生産菌を探索した結果、ア
ルテロモナス属に属する微生物が、新規ノイラミニダー
ゼ２１９を産生し、且つ高い酵素生産能を有することを
見出し、本発明を完成した。現在までに本属からノイラ
ミニダーゼ生産菌の報告はない。即ち、本発明は、下記
の理化学的性質を有する新規なノイラミニダーゼ２１９
である。

【０００６】（１）作用及び特異性：糖蛋白質、糖脂
質、オリゴ糖及び多糖類の糖鎖の非還元末端に存在する
シアル酸残基を遊離させる反応を触媒する。 （２）至適ｐＨ：７．０ （３）至適温度：４０℃ （４）分子量：約９３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る測定） さらに、本発明は、アルテロモナス属に属し、ノイラミ
ニダーゼ２１９生産能を有する微生物を培地に培養し、
培養物からノイラミニダーゼ２１９を採取することを特
徴とするノイラミニダーゼ２１９の製造方法である。

【０００７】さらにまた、本発明は、ノイラミニダーゼ
２１９生産能を有するアルテロモナス・スピーシーズＪ
Ｔ０２１９である。以下、本発明を詳細に説明する。本
発明の新規なノイラミニダーゼ２１９は、アルテロモナ
ス・スピーシーズＪＴ０２１９を培地に培養し、菌体外
にノイラミニダーゼ２１９を生産させ、これを採取する
ことにより得ることができる。

【０００８】本発明のノイラミニダーゼ２１９の一例で
ある、後述の実施例１で得られるノイラミニダーゼ２１
９の酵素的諸性質を以下に述べる。 （１）作用 糖鎖の非還元末端にα配位ケトシド結合したシアル酸を
加水分解的に遊離する。

【０００９】（２）基質特異性 （試験方法）α２−３シアリルラクトース、α２−６シ
アリルラクトース、コロミン酸、糖脂質（ガングリオシ
ドＧＭ３、ＧＤ３）、糖蛋白質（ムチン、フェツイン）
を基質として用い、これらに含まれるシアル酸量を１０
０ｎｍｏｌに統一し、０．００１〜０．００５単位のノ
イラミニダーゼ２１９によって基質から遊離するシアル
酸量を測定することで各基質への作用の差を比較する。

【００１０】具体的には、１００ｎｍｏｌのシアル酸を
含む基質溶液２５μｌと０．００３単位／５μｌの酵素
液を５０ｍＭ イミダゾール塩酸バッファー（ｐＨ７．
５）＋２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂中、３７℃、１０分間作用
させた後、遊離したシアル酸量をＴＢＡ法で定量し、各
基質から遊離されたシアル酸量を、α２−３シアリルラ
クトースを基質とした場合を基準として比較する。 （結果）結果は表１の通りである。

【００１１】

【表１】 ─────────────────────────── 基 質 相対反応速度（％） ─────────────────────────── α２−３シアリルラクトース 100 α２−６シアリルラクトース 97 コロミン酸 18 ガングリオシドＧＭ３ 27 ガングリオシドＧＤ３ 31 フェツイン 53 ムチン 42 ───────────────────────────

【００１２】表１から、本発明のノイラミニダーゼ２１
９は、α２−３，α２−６、α２−８結合したシアル酸
を含むシアリルラクトース、コロミン酸、糖脂質、糖蛋
白質によく作用し、これらのシアロ糖複合体の各種Ｎ−
アセチルノイラミン酸ケトシドを加水分解できる。 （３）作用最適ｐＨ 最適ｐＨは、３７℃、１０分間の反応で、ｐＨ７．０で
ある（図１）。 （４）安定ｐＨ範囲 ４℃、２４時間では、ｐＨ５〜１０においても活性の低
下はほとんど見られない。

【００１３】（５）力価の測定方法 ノイラミニダーゼの酵素活性は、反応液中に遊離される
シアル酸量をチオバルビツール酸（ＴＢＡ）法によって
求めた。すなわち、５０ｍＭ イミダゾール塩酸バッフ
ァー（ｐＨ７．５）中、１％濃度（ｗ／ｖ）にコロミン
酸を溶解した基質溶液２５μｌと５μｌの酵素液を加え
て３７℃、１０〜２０分間作用させる。この反応溶液に
２５ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを１２５μｌ加え
て３７℃、３０分間インキュベートした後、２％（ｗ／
ｖ）亜ヒ素酸ナトリウム溶液を１００μｌを添加、０．
１Ｍ チオバルビツール酸１ｍｌを加え、沸騰水浴中、
７分３０秒間加熱後、氷冷し、ｎ−ブタノール：塩酸
（９５：５）２ｍｌを加え、遠心分離後の紫紅色に呈色
した上清の５４９ｎｍにおける吸光度を測定する。上記
測定条件で、１分間に１μｍｏｌのシアル酸を遊離させ
る酵素量を１単位とした。

【００１４】（６）作用最適温度 ｐＨ７．０、１０分間の反応で、４０℃に至適温度があ
る（図２）。 （７）温度安定性 ｐＨ７．０、１０分間の反応で４５℃までは安定である
が５０℃以上では部分的に失活する。

【００１５】（８）分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で分子量は約９３，０００
である。上記のノイラミニダーゼ２１９の製造に用いる
微生物としては、例えばアルテロモナス・スピーシーズ
ＪＴ０２１９が挙げられる。このアルテロモナス・スピ
ーシーズＪＴ０２１９は海洋性細菌であり、大分県北部
の沿岸海水から分離されたものである。この微生物、Ｊ
Ｔ０２１９の天然界からのスクリーニング方法を以下に
示す。

【００１６】海水、海砂、もしくは海泥を微生物源とし
て、直接、コロミン酸、バクト イースト ニトロゲン
ベース W/O アミノアシッド、および海水からなる
滅菌培地に接種する。本培地で増殖した微生物は常法に
したがってシングルコロニーアイソレーションした後、
得られた微生物の培養液を酵素源として、常法によりノ
イラミニダーゼ活性を測定し、本酵素活性を示す菌株よ
り本菌株を得ることができる。

【００１７】このようにして得られるＪＴ０２１９の菌
学的性質を以下に示す。 菌学的性質： １）形態 （１）細胞の形態は桿菌で、大きさは１．４×０．７〜
２．５×１．８μｍ （２）運動性を示し、鞭毛（極単毛）を有する。 （３）グラム染色性は陰性 （４）胞子は形成しない。

【００１８】 ２）生理的性質 （１）生育温度 ４℃では生育しない ３０℃では生育する ３５℃では生育する ４０℃では生育する （２）集落の色調 特徴的集落色素を産生せず。 （３）Ｏ−Ｆテスト Ｏ （４）カタラーゼテスト 陽性 （５）オキシダーゼテスト 陽性 （６）グルコースの資化性 有り （７）デンプン分解能 無し （１０）硝酸塩還元能 有り （１１）発光性 無し （１２）酸素に対する態度 好気性 （１３）ＰＨＢの蓄積 グルコースを基質 無し （１４）β−ヒドロキシ酪酸の利用能 無し （１５）ＮａＣｌ要求性 有り （１６）リパーゼ活性 有り （１７）ゼラチンの液化 有り （１８）脱窒によるガスの生成 無し （１９）キノン系 Ｑ−８ （２０）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）^* ４１ （２１）アルギン酸の分解 − （２２）資化性 Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−ガラクトース − シュークロース ＋ マルトース ＋ セロビオース ＋ ラクトース − サリシン − Ｄ−グルコン酸塩 − Ｎ−アセチルグルコサミン ＋ コハク酸塩 ＋ フマル酸塩 − クエン酸塩 − グリセロール − Ｌ−チロシン ＋ プトレスシン − 注）^* ：ＨＰＬＣ法によって行なった。

【００１９】このＪＴ０２１９菌株の上記の菌学的性質
について、バージーズ マニュアルオブ デタミネイテ
ィブ バクテリオロジー第９改正（１９９４）を用いて
検討した結果、ＪＴ０２１９菌株はアルテロモナス属に
属する微生物であると同定された。次いでこのＪＴ０２
１９菌株の菌株的性質をアルテロモナス属に属する類縁
の公知種と比較検討したところ、アルテロモナス・ハロ
プランクティス（A. haloplanktis)に最も近いと考えら
れるが、40℃における生育、セロビオース、フマル酸
塩、クエン酸塩の資化性において異なる。したがって、
ＪＴ０２１９菌株は、アルテロモナス属に属する公知種
とは明らかに区別され、新菌種であると認定し、アルテ
ロモナス・スピーシーズＪＴ０２１９と同定した。この
アルテロモナス・スピーシーズＪＴ０２１９は、工業技
術院生命工学工業技術研究所に平成７年５月３０日に寄
託し、その寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−５１１８であ
る。

【００２０】本発明においてアルテロモナス・スピーシ
ーズＪＴ０２１９を培養するには、通常のこの分野の微
生物の一般的な栄養培地を使用できるが、ＮａＣｌ要求
性の細菌であるため、０．５％以上、好ましくは３％程
度のＮａＣｌを培地に加える必要があり、天然海水や人
工海水に栄養源として０．２〜２%程度のコロミン酸あ
るいはＮ−アセチルマンノサミンと０．１〜１％程度の
酵母エキスを添加した培地が望ましい。

【００２１】培養は、２０〜３０℃で２０〜４８時間好
気的に行なわれ、これにより培養液中にノイラミニダー
ゼ２１９が生成、蓄積される。培養液からのノイラミニ
ダーゼ２１９の採取時期は、ノイラミニダーゼ２１９の
産生量が菌の増殖とともに増加するので適宜、設定すれ
ば良い。培養物中に産生されるノイラミニダーゼ２１９
は、培養終了後の培養物をそのまま遠心分離して菌体を
除去し、得られる上清を粗酵素液として採取することも
できる。この粗酵素液はさらに酵素の分野で通常用いら
れている方法で精製することができる。この精製方法と
しては、例えば、硫安分画法や限外濾過膜を用いて酵素
を濃縮した後、イオン交換カラムクロマトグラフィー、
ゲル濾過カラムクロマトグラフィー等で行なえば良い。

【００２２】本発明のアルテロモナス・スピーシーズＪ
Ｔ０２１９よりノイラミニダーゼ２１９を生産する具体
的方法は、該微生物を天然海水中に１％Ｎ-アセチルマ
ンノサミン、０．６７％ バクト イースト ニトロゲ
ン ベース ｗ／ｏ アミノアシッド（Ｄｉｆｃｏ社
製）を加えた培地中で培養温度１５〜３５℃、好ましく
は２０〜３０℃、ｐＨ６．８〜８．８、好ましくは７．
２〜８．２、培養時間、１０〜４８時間、好ましくは１
６〜３６時間培養することにより行われる。

【００２３】目的とする酵素は主に菌体外に分泌される
ため、培養液を遠心分離して菌体を除去すれば、高いノ
イラミニダーゼ活性（約０．２単位／ｍｌ）を有する粗
酵素液が得られる。さらに、この時点での酵素の比活性
は約１５単位／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであり、この値は
現在市販されているノイラミニダーゼの中でも高品質の
ものに相当する。さらに、研究や検査に使用する際に問
題となるプロテアーゼや各種グリコシダーゼ活性をほと
んど含まないことが確認された。すなわち本発明のアル
テロモナス・スピーシーズＪＴ０２１９を用いれば、培
養液上清を直接、酵素液として用いることができること
から、ノイラミニダーゼを安価でしかも簡便に製造する
ことができるという優れた利点を有している。

【００２４】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明
する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 〔実施例１〕 本発明のノイラミニダーゼ２１９の製造 (1) 酵素の採取 天然海水１００ｍｌを１２１℃で１５分間滅菌した後、
蒸留水で１ｇのＮ−アセチルマンノサミンと０．６７ｇ
のバクト イースト ニトロゲン ベース ｗ／ｏ ア
ミノ アシッドを溶解して、滅菌フィルターを用いて無
菌的に添加した。これに、アルテロモナス・スピーシー
ズＪＴ０２１９の前培養液１ｍｌを接種し、好気的培養
条件下で２７℃で４８時間培養した。培養終了後、培地
を８，０００ｘｇで１５分間遠心し、菌体を除去して得
られた上清９０ｍｌと得た。この上清を粗酵素液とし
た。この粗酵素液の活性と比活性はそれぞれ、０．２１
単位／ｍｌ、１５単位／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎであった。

【００２５】(2) 酵素の精製 上記(1) より得られた粗酵素液を以下の操作で精製し
た。粗酵素液９０ｍｌを限外濾過膜ＰＭ−１０（アミコ
ン製）により１０倍に濃縮した。この濃縮酵素液を充分
量の２５ｍＭ イミダゾール塩酸バッファー（ｐＨ７．
５）に対して透析した後、同じバッファーで平衡化した
Ｍｏｎｏ−Ｑ（ファルマシア製）に付加し、吸着させ、
０から０．５Ｍ ＮａＣｌのリニアーグラジエントにて
溶出した。溶出された活性画分はさらに、ゲル濾過カラ
ムであるＧＦ−２５０（デュポン製）にアプライして溶
出液（２５ｍＭイミダゾール塩酸バッファー（ｐＨ７．
５）＋１００ｍＭＮａＣｌ）で１．５ｍｌ／ｍｉｎの流
速で溶出した。このようにして得られたノイラミニダー
ゼ活性を示す溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥしたところ、
電気泳動的に単一のバンドであった。このようにして精
製ノイラミニダーゼ２１９ ０．１２ｍｇを取得した。
この精製酵素の比活性は８８．５単位／ｍｇ proteinで
あり、出発粗酵素液に比べて５．９倍に上昇し、全活性
は１０．４単位、活性収率は５５％であった。

【００２６】〔試験例１〕５０ｍＭ 酢酸バッファー
（ｐＨ５．０）１５０μｌでガングリオシドＧＭ３を５
００μｇ溶解した基質溶液に０．３単位の酵素液１０μ
ｌを加えて３５℃、６０分間反応させた。反応終了後、
生じた沈澱を分別後、上清は水で置換したセップパック
Ｃ１８に付した。これを５ｍｌの水で洗浄、引き続き、
２ｍｌのメタノールで吸着物を溶出した。この画分と先
に得られた沈澱物を乾燥する事により白色粉末を得た。
５００μｇのガングリオシドＧＭ３から３５９μｇのラ
クトシルセラミドが得られた。

【００２７】

【発明の効果】本発明により、アルテロモナス・スピー
シーズＪＴ０２１９を好気的条件下で培養することによ
ってノイラミニダーゼ２１９を大量に、且つ夾雑蛋白質
の少ない状態で提供することができる。また、ノイラミ
ニダーゼ２１９は至適ｐＨが中性付近にあることから、
生体成分に作用させる上でよりマイルドな条件で用いる
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のノイラミニダーゼ２１９の各ｐＨによ
る作用性を示す。

【図２】本発明のノイラミニダーゼ２１９の各温度によ
る作用性を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する新規なノイ
   ラミニダーゼ２１９。 （１）作用および特異性：糖蛋白質、糖脂質、オリゴ糖
   及び多糖類の糖鎖の非還元末端に存在するシアル酸残基
   を遊離させる反応を触媒する。 （２）至適ｐＨ：７付近 （３）至適温度：４０℃ （４）分子量：約９３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
   る測定）
2. 【請求項２】 アルテロモナス属に属し、ノイラミニダ
   ーゼ２１９生産能を有する微生物を培地に培養し、培養
   物から請求項１記載のノイラミニダーゼ２１９を採取す
   ることを特徴とするノイラミニダーゼ２１９の製造方
   法。
3. 【請求項３】 ノイラミニダーゼ２１９生産能を有する
   アルテロモナス・スピーシーズＪＴ０２１９。