JPH09254A - ノイラミニダーゼ２２０及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記の理化学的性質を有する新規なノイラミ
ニダーゼ２２０。 （１）作用および特異性：糖蛋白質、糖脂質、オリゴ糖
及び多糖類の糖鎖の非還元末端に存在するシアル酸残基
を遊離させる反応を触媒する。 （２）至適ｐＨ：５．０〜５．５ （３）至適温度：３５℃ （４）分子量：約９３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る測定） 【効果】 本発明により、ビブリオ・スピーシーズＪＴ
０２２０を好気的条件下で培養することによってノイラ
ミニダーゼ２２０を大量に、且つ夾雑蛋白質の少ない状
態で提供することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なノイラミニダーゼ
２２０、その製造方法ならびにノイラミニダーゼ２２０
生産能を有する微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】ノイラミニダーゼは、糖蛋白質、糖脂
質、オリゴ糖及び多糖類の糖鎖の非還元末端に存在する
シアル酸残基を遊離させる反応を触媒する酵素である。
ノイラミニダーゼは、血清等の生体液中のシアル酸含有
物質の定量に用いられることはよく知られ、ノイラミニ
ダーゼの供給源としては工業的規模で製造可能であり、
しかも活性の一定したものが得られること等の長所のた
め、微生物由来のものが大半を占めている。

【０００３】従来、微生物由来のノイラミニダーゼに関
しては、ビブリオ・コレラ（Vibriocholerae）、クロス
トリディウム・パーフリンゲン（Clostridium perfring
ens）、ストレプトコッカス・スピーシーズ（Streptoco
ccus sp.）、ストレプトマイセス・スピーシーズ（Stre
ptomyces sp.）等の微生物による培養液中への生産が知
られており、コリネバクテリウム・ディフテリア（Cory
nebacterium diphtheriae）、クレブシエラ・アエロゲ
ネス（Klebsiella aerogenes）等では大部分が膜結合型
として存在することが知られている。ノイラミニダーゼ
は、シアル酸含有物質中のシアル酸を定量するときに用
いられたり、シアル酸を除去したアシアロ体の調製に広
く用いられている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、新規
なノイラミニダーゼ２２０、その製造方法及び該製造方
法に用いる新規な微生物を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を鑑み鋭意ノイラミニダーゼ生産菌を探索した結果、ビ
ブリオ属に属する微生物が、新規ノイラミニダーゼ２２
０を産生し、且つ高い酵素生産能を有することを見出
し、本発明を完成した。

【０００６】即ち、本発明は、下記の理化学的性質を有
する新規なノイラミニダーゼ２２０である。 （１）作用及び特異性：糖蛋白質、糖脂質、オリゴ糖及
び多糖類の糖鎖の非還元末端に存在するシアル酸残基を
遊離させる反応を触媒する。 （２）至適ｐＨ：５〜５．５ （３）至適温度：３５℃ （４）分子量：約９３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る測定）

【０００７】さらに、本発明は、ビブリオ属に属し、ノ
イラミニダーゼ２２０生産能を有する微生物を培地に培
養し、培養物からノイラミニダーゼ２２０を採取するこ
とを特徴とするノイラミニダーゼ２２０の製造方法であ
る。

【０００８】さらにまた、本発明は、ノイラミニダーゼ
２２０生産能を有するビブリオ・スピーシーズＪＴ０２
２０である。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
新規なノイラミニダーゼ２２０は、ビブリオ・スピーシ
ーズＪＴ０２２０を培地に培養し、菌体外にノイラミニ
ダーゼ２２０を生産させ、これを採取することにより得
ることができる。

【００１０】本発明のノイラミニダーゼ２２０の一例で
ある後述の実施例１で得られるノイラミニダーゼ２２０
の酵素的諸性質を以下に述べる。 （１）作用 糖鎖の非還元末端にα配位ケトシド結合したシアル酸を
加水分解的に遊離する。

【００１１】（２）基質特異性 （試験方法）α２−３シアリルラクトース、α２−６シ
アリルラクトース、コロミン酸、糖脂質（ガングリオシ
ドＧＭ３、ＧＤ３）、糖蛋白質（ムチン、フェツイン）
を基質として用い、これらに含まれるシアル酸量を１０
０ｎｍｏｌに統一し、０．００１〜０．００５単位のノ
イラミニダーゼ２２０によって基質から遊離するシアル
酸量を測定することで各基質への作用の差を比較する。
具体的には、１００ｎｍｏｌのシアル酸を含む基質溶液
２５μｌと０．００３単位／５μｌの酵素液を５０ｍＭ
イミダゾール塩酸バッファー（ｐＨ７．５）＋２０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂中、３５℃、１０分間作用させた後、遊
離したシアル酸量をＴＢＡ法で定量し、各基質から遊離
されたシアル酸量を、α２−３シアリルラクトースを基
質とした場合を基準として比較する。

【００１２】（結果）結果は表１の通りである。

【００１３】

【表１】 ─────────────────────────── 基質 相対反応速度（％） ─────────────────────────── α２−３シアリルラクトース 100 α２−６シアリルラクトース 53.6 コロミン酸 22.4 ガングリオシドＧＭ３ 70.5 ガングリオシドＧＤ３ 56.5 フェツイン 125 ムチン 56.8 ───────────────────────────

【００１４】表１から、本発明のノイラミニダーゼ２２
０は、α２−３，α２−６、α２−８結合したシアル酸
を含むシアリルラクトース、コロミン酸、糖脂質、糖蛋
白質によく作用し、これらのシアロ糖複合体の各種Ｎ−
アセチルノイラミン酸ケトシドを加水分解できる。

【００１５】（３）作用最適ｐＨ 最適ｐＨは、３５℃、１０分間の反応で、ｐＨ５．０〜
５．５の間にある（図１）。

【００１６】（４）安定ｐＨ範囲 ４℃、２４時間では、ｐＨ５〜１０においても活性の低
下はほとんど見られない。

【００１７】（５）力価の測定方法 ノイラミニダーゼの酵素活性は、反応液中に遊離される
シアル酸量をチオバルビツール酸（ＴＢＡ）法によって
求めた。すなわち、５０ｍＭ イミダゾール塩酸バッフ
ァー（ｐＨ７．５）中、１％濃度（ｗ／ｖ）にコロミン
酸を溶解した基質溶液２５μｌと５μｌの酵素液を加え
て３５℃、１０〜２０分間作用させる。この反応溶液に
２５ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを１２５μｌ加え
て３７℃、３０分間インキュベートした後、２％（ｗ／
ｖ）亜ヒ素酸ナトリウム溶液を１００μｌを添加、０．
１Ｍ チオバルビツール酸１ｍｌを加え、沸騰水浴中、
７分３０秒間加熱後、氷冷し、ｎ−ブタノール：塩酸
（９５：５）２ｍｌを加え、遠心分離後の紫紅色の上清
の５４９ｎｍにおける吸光度を測定する。上記測定条件
で、１分間に１μｍｏｌのシアル酸を遊離させる酵素量
を１単位とした。

【００１８】（６）作用最適温度 ｐＨ５．０、１０分間の反応で、３５℃に至適温度があ
る（図２）。

【００１９】（７）温度安定性 ｐＨ５．０、１０分間の反応で３５℃までは安定である
が４５℃以上では部分的に失活する。

【００２０】（８）分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で分子量は約９３，０００
である。

【００２１】上記のノイラミニダーゼ２２０の製造に用
いる微生物としては、例えばビブリオ・スピーシーズＪ
Ｔ０２２０が挙げられる。このビブリオ・スピーシーズ
ＪＴ０２２０は海洋性細菌であり、大分県北部の沿岸海
水から分離されたものである。この微生物、ＪＴ０２２
０の天然界からのスクリーニング方法を以下に示す。

【００２２】海水、海砂、もしくは海泥を微生物源とし
て、直接、コロミン酸、バクト イースト ニトロゲン
ベース W/O アミノアシッド、および海水からなる
滅菌培地に接種する。本培地で増殖した微生物は常法に
したがってシングルコロニーアイソレーションした後、
得られた微生物の培養液を酵素源として、常法によりノ
イラミニダーゼ２２０活性を測定し、本酵素活性を示す
菌株より本菌株を得ることができる。

【００２３】このようにして得られるＪＴ０２２０の菌
学的性質を以下に示す。 菌学的性質： １）形態 （１）細胞の形態は桿菌で、大きさは１×０．５〜２×１μｍ （２）運動性を示し、鞭毛を有する。 （３）グラム染色性は陰性 （４）胞子は形成しない。 ２）生理的性質 （１）生育温度 ４℃ 生育せず ３０℃ 生育する ３５℃ 生育する ４０℃ 生育せず （２）集落の色調 特徴的集落色素を産生せず。 （３）Ｏ−Ｆテスト Ｆ （４）カタラーゼテスト 陽性 （５）オキシダーゼテスト 陽性 （６）グルコースからガスの生成 無し （７）Ｖ−Ｐ反応 陰性 （８）ゼラチン分解能 有り （９）デンプン分解能 有り （１０）硝酸塩還元能 有り （１１）発光性 無し （１２）酸素に対する態度 通性嫌気性 （１３）ＰＨＢの蓄積 β−ヒドロキシ酪酸を基質 試験用培地に生育せず グルコースを基質 無し （１４）β−ヒドロキシ酪酸の利用能 無し （１５）ＮａＣｌ要求性 有り （１６）リパーゼ活性 有り （１７）マンニトールの資化性 有り （１８）プテリジン誘導体に対する感受性 １０μｇ 感受性 １５０μｇ 感受性 （１９）キノン系 Ｑ−８ （２０）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）^* ４４ （２１）アルギニンジヒドラーゼ活性 有り （２２）資化性 Ｄ−キシロース − シュークロース ＋ セロビオース ＋ Ｄ−グルコン酸塩 − γ−アミノ酪酸 − Ｌ−プロリン ＋ プトレスシン ＋ Ｄ−マンノース ＋ ガラクチュロン酸 − ヘプタン酸 − Ｄ−ソルビトール ＋ エタノール − 注）^* ：ＨＰＬＣ法によって行なった。

【００２４】このＪＴ０２２０菌株の上記の菌学的性質
について、バージーズ マニュアルオブ デタミネイテ
ィブ バクテリオロジー第９改正（１９９４）を用いて
検討した結果、ＪＴ０２２０菌株はビブリオ属に属する
微生物であると同定された。

【００２５】次いでこのＪＴ０２２０菌株の菌株的性質
をビブリオ属に属する類縁の公知種々と比較検討したと
ころ、表２に示す通り、ＪＴ０２２０の菌株的性質はそ
の全項目において一致するものはなかった。その中でも
近種であると考えられる４種と比較したところ、ビブリ
オ・ツビアッシー（Vibrio tubiashii）とはキシロー
ス、グルコン酸塩、ストレプトマイシンの資化性におい
て、ビブリオ・スプレンディダス（Vibrio splendidus)
とは発光性、キシロース、ソルビトール、ストレプト
マイシンの資化性において、ビブリオ・メディテラーネ
(Vibrio mediterranei) とはアルギニンジヒドロラーゼ
の有無、ゼラチンの分解において、ビブリオ・オリエン
タリス（Vibrio orientalis ）とは発光性、生育温度、
グルコン酸の資化性においてそれぞれ異なる。したがっ
て、ＪＴ０２２０菌株は、ビブリオ属に属する公知種と
は明らかに区別され、新菌種であると認定し、ビブリオ
・スピーシーズＪＴ０２２０と同定した。このビブリオ
・スピーシーズＪＴ０２２０は、工業技術院生命工学工
業技術研究所に平成７年５月３０日に寄託し、その寄託
番号はＦＥＲＭ ＢＰ−５１１９である。

【００２６】

【表２】

【００２７】本発明においてビブリオ・スピーシーズＪ
Ｔ０２２０を培養するには、通常のこの分野の微生物の
一般的な栄養培地を使用できるが、ＮａＣｌ要求性の細
菌であるため、０．５％以上、好ましくは３％程度のＮ
ａＣｌを培地に加える必要があり、天然海水や人工海水
に栄養源として０．２〜２%程度のコロミン酸あるいは
Ｎ−アセチルマンノサミンと０．１〜１％程度の酵母エ
キスを添加した培地を使用することができる。

【００２８】培養は、２０〜３０℃で２０〜４８時間好
気的に行なわれ、これにより培養液中にノイラミニダー
ゼ２２０が生成、蓄積される。培養液からのノイラミニ
ダーゼ２２０の採取時期は、ノイラミニダーゼ２２０の
産生量が菌の増殖とともに増加するので適宜、設定すれ
ば良い。

【００２９】培養物中に産生されるノイラミニダーゼ２
２０は、培養終了後の培養物をそのまま遠心分離して菌
体を除去し、得られる上清を粗酵素液として採取するこ
ともできる。この粗酵素液はさらに酵素の分野で通常用
いられている方法で精製することができる。この精製方
法としては、例えば、硫安分画法や限外濾過膜を用いて
酵素を濃縮した後、イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー等で行なえば良
い。

【００３０】本発明のビブリオ・スピーシーズＪＴ０２
２０よりノイラミニダーゼ２２０を生産する具体的方法
は、該微生物を天然海水中に１％Ｎ-アセチルマンノサ
ミン、０．６７％ バクト イースト ニトロゲン ベ
ース ｗ／ｏ アミノ アシッド（Ｄｉｆｃｏ社製）を
加えた培地中で培養温度１５〜３５℃、好ましくは２０
〜３０℃、ｐＨ６．８〜８．８、好ましくは７．２〜
８．２、培養時間、１０〜４８時間、好ましくは１６〜
３６時間培養することにより行われる。

【００３１】目的とする酵素は主に菌体外に分泌される
ため、培養液を遠心分離して菌体を除去すれば、高いノ
イラミニダーゼ活性（約０．５単位／ｍｌ）を有する粗
酵素液が得られる。さらに、この時点での酵素の比活性
は約２０単位／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであり、この値は
現在市販されているノイラミニダーゼの中でも高品質の
ものに相当する。さらに、研究や検査に使用する際に問
題となるプロテアーゼや各種グリコシダーゼ活性をほと
んど含まないことが確認された。すなわち本発明のビブ
リオ・スピーシーズＪＴ０２２０を用いれば、培養液上
清を直接、酵素液として用いることができることから、
ノイラミニダーゼを安価でしかも簡便に製造することが
できるという優れた利点を有している。

【００３２】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明
する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 〔実施例１〕 本発明のノイラミニダーゼ２２０の製造 (1) 酵素の採取 天然海水１００ｍｌを１２１℃で１５分間滅菌した後、
蒸留水で１ｇのＮ−アセチルマンノサミンと０．６７ｇ
のバクト イースト ニトロゲン ベース ｗ／ｏ ア
ミノ アシッドを溶解して、滅菌フィルターを用いて無
菌的に添加した。これに、ビブリオ・スピーシーズＪＴ
０２２０の前培養液１ｍｌを接種し、好気的培養条件下
で２７℃で４８時間培養した。培養終了後、培地を８，
０００ｘｇで１５分間遠心し、菌体を除去して上清液９
０ｍｌを得た。この上清を粗酵素液とした。この粗酵素
液の活性と比活性はそれぞれ、０．５２単位／ｍｌ、２
５単位／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。

【００３３】(2) 酵素の精製 上記(1) より得られた粗酵素液を以下の操作で精製し
た。粗酵素液９０ｍｌを充分量の２５ｍＭ イミダゾー
ル塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に対して透析した後、
同じバッファーで平衡化した４０ｍｌのＱＡＥ−トヨパ
ールを加えて穏やかに撹拌しながら酵素を吸着させた。
これを空カラムに移して担体と上澄みを分けた。担体は
１００ｍｌの２５ｍＭ イミダゾール塩酸バッファー
（ｐＨ７．５）で洗浄後、２５ｍＭ イミダゾール塩酸
バッファー＋０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で担体
に吸着している酵素を溶出させた。活性画分はまとめて
透析後、２５ｍＭ イミダゾール塩酸バッファー（ｐＨ
７．５）で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑ（ファルマシア製）
に付加し、吸着させ、０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出した。
溶出された活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥしたところ、電
気泳動的に単一のバンドの精製ノイラミニダーゼ２２０
０．７２ｍｇを取得した。この精製酵素の比活性は５
５単位／ｍｇ proteinであり、出発粗酵素液に比べて
２．２倍に上昇し、全活性は４０単位、活性収率は８５
％であった。

【００３４】〔試験例１〕５０ｍＭ 酢酸バッファー
（ｐＨ５．０）１００μｌでガングリオシドＧＭ３を５
００μｇ溶解した基質溶液に０．３単位の酵素液１０μ
ｌ加えて３５℃、６０分間反応させた。反応終了後、生
じた沈澱を分別後、上清は水で置換したセップパックＣ
１８に付した。これを５ｍｌの水で洗浄、引き続き、２
ｍｌのメタノールで吸着物を溶出した。この画分と先に
得られた沈澱物を乾燥する事により白色粉末を得た。５
００μｇのガングリオシドＧＭ３から３７０μｇのラク
トシルセラミドが得られた。

【００３５】

【発明の効果】本発明により、ビブリオ・スピーシーズ
ＪＴ０２２０を好気的条件下で培養することによってノ
イラミニダーゼ２２０を大量に、且つ夾雑蛋白質の少な
い状態で提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のノイラミニダーゼ２２０の各ｐＨに
よる作用性を示す。

【図２】 本発明のノイラミニダーゼ２２０の各温度に
よる作用性を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する新規なノイ
   ラミニダーゼ２２０。 （１）作用および特異性：糖蛋白質、糖脂質、オリゴ糖
   及び多糖類の糖鎖の非還元末端に存在するシアル酸残基
   を遊離させる反応を触媒する。 （２）至適ｐＨ：５〜５．５ （３）至適温度：３５℃ （４）分子量：約９３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
   る測定）
2. 【請求項２】 ビブリオ属に属し、ノイラミニダーゼ２
   ２０生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物から
   請求項１記載のノイラミニダーゼ２２０を採取すること
   を特徴とするノイラミニダーゼ２２０の製造方法。
3. 【請求項３】 ノイラミニダーゼ２２０生産能を有する
   ビブリオ・スピーシーズＪＴ０２２０。