JP4110243B2 - N‐アセチルグルコサミンの製造方法 - Google Patents
N‐アセチルグルコサミンの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4110243B2 JP4110243B2 JP2002200544A JP2002200544A JP4110243B2 JP 4110243 B2 JP4110243 B2 JP 4110243B2 JP 2002200544 A JP2002200544 A JP 2002200544A JP 2002200544 A JP2002200544 A JP 2002200544A JP 4110243 B2 JP4110243 B2 JP 4110243B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chitin
- acetylglucosamine
- raw material
- producing
- liter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を用いてβ‐キチン原料から直接N‐アセチルグルコサミンを製造する方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
キチンは、N‐アセチルグルコサミンを構成単位とする多糖であり、微生物界、植物界及び動物界にわたって広く存在しており、その年間生産量はセルロースに匹敵し、最も豊富なバイオマス資源の1つとして注目されている。
そして、このキチンを強酸によって加水分解して得られるグルコサミンは、変形性関節炎の症状を改善することが知られ、欧米では医薬品として、わが国では食品素材として、その需要が増加する傾向にある。
【0003】
ところで、最近に至り、N‐アセチルグルコサミンについては、これがグルコサミンと同様の作用を有することが判明し、しかもグルコサミンは苦味を呈するのに対し、N‐アセチルグルコサミンは爽やかな甘味を有するため摂取しやすいという利点があるため、グルコサミンに代わるものとしてN‐アセチルグルコサミンが注目されるようになってきた。
【0004】
このN‐アセチルグルコサミンは、これまで、カニ、エビなどの甲殻を水酸化ナトリウム水溶液内で熱処理し、タンパク質を除去したのち、塩酸で灰分を除いて得られるキチンを原料とし、これを塩酸加水分解してグルコサミンを生成させ、次いでこれを無水酢酸でアセチル化することにより製造されていた。
しかしながら、このようにして得たN‐アセチルグルコサミンは化学合成工程を含むという理由で食品素材として用いることはできなかった。
【0005】
他方、キチン分解酵素を生産する微生物の存在が知られている。一般に酵素は基質特異性を有し、特定の基質の特定の部位のみに作用して所定の物質を生成するので、副生物が少なく、所望の目的物が選択的に得られる上に、温和な反応条件を用いることができるため、工業的に実施する場合にコストを軽減しうるという利点があるにもかかわらず、これまで酵素を利用してキチン原料から直接N‐アセチルグルコサミンを製造する方法は知られていなかった。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、微生物を利用して、キチン原料特にβ‐キチン原料から直接にN‐アセチルグルコサミンを効率よく製造する新規な方法を提供することを目的としてなされたものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、キチンを原料として直接N‐アセチルグルコサミンを製造する方法について種々研究を重ねた結果、海洋では大量のキチンが生産されるが、これは微生物によって分解され、海洋の安定した生態系が保たれていること、したがってこの微生物すなわち海洋低温細菌ビブリオ(Vibrio)属に属する菌が生産する酵素のキチナーゼを利用すれば、β‐キチンから1段階でN‐アセチルグルコサミンを生成しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【0008】
すなわち、本発明は、基質としての役割を果すキチンの存在下で、海洋低温細菌ビブリオ(Vibrio)属に属するキチナーゼ生産菌を培養した培養液の上清に硫酸アンモニウムを80%飽和に達するまで加えて得た沈殿を再溶解して酵素液を調製し、この酵素液及びエチレンジアミンテトラ酢酸(以下EDTAと略す)をβ‐キチン原料に加えて反応させ、その反応液中よりN‐アセチルグルコサミンを回収することを特徴とするN‐アセチルグルコサミンの製造方法を提供するものである。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明方法においては、β‐キチンを原料として用いる。キチンには、カニやエビなどの甲殻を構成するα‐キチンとイカの甲殻を構成するβ‐キチンとが存在し、いずれもN‐アセチルグルコサミンのβ‐1,4結合重合体である。本発明方法においては、特に軟質結晶構造を有するβ‐キチンを用いる。
【0010】
次に、本発明方法においては、β‐キチン原料に、キチンを資化する海洋低温細菌ビブリオ属に属するキチナーゼ生産菌を含む酵素液を作用させて加水分解する。このキチナーゼ生産菌としては、海洋低温細菌ビブリオ属に属し、キチン資化能を有する微生物であれば、どのようなものでもよく、特に制限はない。このような微生物としては、例えば、房総沖日本海溝の深層水から分離された海洋低温細菌P2K−5菌株を挙げることができる。この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号FERM BP−5769として寄託されており、以下に示す菌学的性質を有している。
【0011】
1.形態的性質
(1)細胞形態:稈状(rod)
(2)鞭毛形態:極べん毛
(3)グラム染色:陰性
【0012】
2.生理的性質
(1)増殖温度:4℃+、25℃+、30℃+
(2)O−Fテスト:Fermentative
(3)塩類要求性:+
(4)色素生産:−
(5)オキシダーゼ:+
(6)カタラーゼ:+
【0013】
3.分離源
房総沖日本海溝の水深6000mの海水
【0014】
これらの菌学的性質は、1985年学会出版センター発行,駒形和男著,改訂版,長谷川武治編著,「微生物の分類と同定」下巻,第99〜161ページを参考にし、1990年,恒星社厚生閣発行,日本海洋学会編,絵面良男著,「沿岸環境調査マニュアルII(水質・微生物篇)」,第357〜364ページに記載された試験方法に従って行った。
【0015】
これらの菌学的性質を、上記の「沿岸環境調査マニュアルII(水質・微生物篇)」,第357〜364ページの記載に基づき、1984年,ボルチモア(Baltimor),ウイリアムス・アンド・ウィルキンス(Williams & Wilkins)社発行,ノエル・アール・クリーグ(Noel.R.Krieg)及びジョン・ジー・ホールト(John.G.Holt)編,「バージェイズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー(Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology)」,第1巻及び1994年同社発行,ジョン・ジー・ホールト(John.G.Holt)、ノエル・アール・クリーグ(Noel.R.Krieg)、ピーター・エイチ・スニース(Peter.H.A.Sneath)及びジェイムズ・ティー・スタレイ(James.T.Staley)編,「バージェイズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー(Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology)第9版」を参照して対比した結果、海洋低温細菌P2K−5菌株(FERM BP−5769)は、ビブリオ(Vibrio)属に属する細菌と同定された。
【0016】
本発明方法においては、先ず基質としての役割を果すキチンの存在下で海洋低温細菌P2K−5菌株(FERM BP−5769)を培養する。この際のキチンのα‐キチンやβ‐キチンのみでなく、その類似物質を用いてもよい。このようなキチンの類似物質としては、例えばコロイダルキチンのような再生キチン、キチン分解物又はグリコールキチンのようなキチン誘導体などがある。これらのキチン原料は単独で用いてもよいし、また2種以上の組合せでもよい。キチンにキチン類似物質を組み合わせて用いる場合には、後者を通常0.1g/リットル以上、好ましくは1〜50g/リットルの範囲の濃度で加える。
【0017】
この際、培養のための培地としては、一般に固体培地と称される寒天で固化させた固体状のものも用いることができるが、タンク培養が可能で、しかも生成物の分離が容易な液体培地を用いるのが好ましい。この培地は天然培地又は合成培地のいずれでもよく、特に制限はない。
【0018】
この培地の炭素源としては、例えば、グルコース、キシロース、スクロース、ペプトン又はこれらの誘導体などが、窒素源としては、例えばイーストエキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶液のような有機窒素源や、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムのような無機窒素源が、また、無機塩としては、例えば硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウムなどがそれぞれ用いられる。これらの栄養源は、それぞれ単独で組み合わせて用いることもできるが、通常は2種以上を組み合わせた、炭素原、窒素源、無機塩が用いられる。さらに、前記したキチンを炭素源、窒素源として利用することもできる。これらの栄養源を含む培地は、酸又は塩基を加えてpH6.5〜8.5に調整されたのち、例えばオートクレーブにより加熱加圧して殺菌後、使用される。
本発明方法における培養は、温度5〜35℃、好ましくは20〜28℃において、20〜72時間程度、静置又は振とう又は撹拌しながら行うことができる。
【0019】
次に、このようにして得られた培養液から、菌体を除去し、上清のみにキチンを加えて培養を継続するのが有利である。この菌体の除去は、常法に従い、遠心分離又はろ過によって行うことができる。また、このようにして得た上清から硫酸アンモニウム80%飽和の塩析により酵素を沈殿させ、このようにして得られた酵素沈殿を、水に再溶解し、所望に応じ、さらに透析して硫酸アンモニウムを除いて酵素液とする。
【0020】
本発明方法においては、β‐キチンと反応させる際、酵素を安定化するために、エチレンジアミンテトラ酢酸を添加することが必要である。この際のEDTAの濃度は0.5〜5mMの範囲で選ばれる。
本発明方法におけるキチンを分解する反応は、上記のようにして調製した酵素液にβ‐キチン原料を、好ましくは粉末として加え、5〜55℃、好ましくは30〜45℃、pH6〜9、好ましくは6.8〜8.5において、振とう又は撹拌することによって行われる。
このようにして、β‐キチンを原料として、1段階でN‐アセチルグルコサミンを効率よく製造することができる。
【0021】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
なお、各例中のN‐アセチルグルコサミンの定量は、モルガン−エルソン法(1968年,共立出版株式会社発行,「生物化学実験 第11巻,糖質実験法」,第22〜23ページ)による比色定量で行った。
【0022】
また、キチナーゼ生産菌培養用培地としては、以下の組成の1/2TZ培地を用いた。
ポリペプトン[ダイゴ(Daigo)社製] 2.5g/リットル
イーストエキス[ディフコ(Difco)社製] 0.5g/リットル
N‐2‐水酸化エチルピペラジン‐N´‐エタン スルホン酸[ドジン(Dojin)社製] 4.77g/リットル
塩化ナトリウム 21.533g/リットル
硫酸ナトリウム 3.607g/リットル
塩化カリウム 0.609g/リットル
炭酸水素ナトリウム 0.176g/リットル
臭化カリウム 0.088g/リットル
ホウ酸 0.023g/リットル
フッ化ナトリウム 0.003g/リットル
塩化マグネシウム・六水塩 9.747g/リットル
塩化カルシウム・二水塩 1.368g/リットル
塩化ストロンチウム・六水塩 0.022g/リットル
【0023】
実施例1
栓付き試験管に1/2TZ培地5mlを採り、冷蔵保存されたキチナーゼ生産菌(FERM BP−5769)200μlを植菌し、25℃において1晩振とう培養した。
次に、このようにして得た培養液1mlをマリン・ブロス[ディフコ(Difco)社製]100mlに加え、さらに24時間振とう培養したのち、その25mlを分取し、キチン粉末20gを含む1/2TZ培地1リットルに添加し、25℃において48時間、好気的に振とう培養した。次いで、これを20分間遠心分離(8000×g)し、上清を回収した。この上清に硫酸アンモニウムを80%飽和に達するまで加え、生じた沈殿を遠心分離により捕集した。このようにして得た沈殿を10mMリン酸緩衝液(pH7.4)8mlに溶解したのち、同じ緩衝液3リットルを用いて1晩透析を行うことにより、酵素液20mlを調製した。
次に、サンプル管に、上記酵素液1mlを分取し、EDTA1mMを添加し、イカキチン粉末20mgを加え、37℃で所定時間振とう培養したのち、遠心分離し、その上清中に含まれるN‐アセチルグルコサミンを定量したところ、2時間後は0.01mg/ml、4日後は0.2mg/mlであった。
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【発明の効果】
本発明方法によると、酸を使用することなく、キチン原料から1段階で有用なN‐アセチルグルコサミンを、酸の中和などの付加的な処理を必要とせずに、しかもきょう雑物としてグルコサミンを含まない純粋な状態で効率よく製造することができる。
Claims (3)
- 基質としての役割を果すキチンの存在下で、海洋低温細菌ビブリオ(Vibrio)属に属するキチナーゼ生産菌を培養した培養液の上清に硫酸アンモニウムを80%飽和に達するまで加えて得た沈殿を再溶解して酵素液を調製し、この酵素液及びエチレンジアミンテトラ酢酸をβ‐キチン原料に加えて反応させ、その反応液中よりN‐アセチルグルコサミンを回収することを特徴とするN‐アセチルグルコサミンの製造方法。
- 基質としての役割を果すキチンがキチン、再生キチン、キチン分解物及びキチン誘導体の中から選ばれた少なくとも1種である請求項1記載のN‐アセチルグルコサミンの製造方法。
- β‐キチン原料として、イカの甲殻を用いる請求項1記載のN‐アセチルグルコサミンの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002200544A JP4110243B2 (ja) | 2002-07-09 | 2002-07-09 | N‐アセチルグルコサミンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002200544A JP4110243B2 (ja) | 2002-07-09 | 2002-07-09 | N‐アセチルグルコサミンの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004041035A JP2004041035A (ja) | 2004-02-12 |
JP4110243B2 true JP4110243B2 (ja) | 2008-07-02 |
Family
ID=31707375
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002200544A Expired - Fee Related JP4110243B2 (ja) | 2002-07-09 | 2002-07-09 | N‐アセチルグルコサミンの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4110243B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101348124B1 (ko) | 2005-07-19 | 2014-01-07 | 혹꼬우 가가꾸 고오교오 가부시끼가이샤 | 미생물에 의한 n-아세틸-d-글루코사민의 발효 생산방법 |
JP2010088301A (ja) | 2007-02-01 | 2010-04-22 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
CN109071683A (zh) | 2016-04-27 | 2018-12-21 | 昭和电工株式会社 | 几丁质低聚物、n-乙酰葡糖胺和1-o-烷基-n-乙酰葡糖胺的制造方法 |
KR102027295B1 (ko) * | 2017-08-08 | 2019-11-04 | 전남대학교산학협력단 | 키티나아제를 생산할 수 있는 신규한 살리니비브리오 속 균주 및 이의 용도 |
-
2002
- 2002-07-09 JP JP2002200544A patent/JP4110243B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2004041035A (ja) | 2004-02-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5447761B2 (ja) | キチン・キトサンを分解する新種の微生物及びその利用方法 | |
CN101608166A (zh) | 一株黄杆菌菌株及其在产生琼胶酶中的应用 | |
JP4110243B2 (ja) | N‐アセチルグルコサミンの製造方法 | |
JPH0691819B2 (ja) | デアセチラーゼの製造方法 | |
JP3586684B1 (ja) | バリダマイシンをバリエナミンおよびバリダミンに変換する新規微生物 | |
JP3118573B1 (ja) | キチナーゼ及びその製造法 | |
JP2615443B2 (ja) | N−アセチル−d−グルコサミンデアセチラーゼの製造方法 | |
JP3076856B2 (ja) | 細菌によるアルギン酸の分解法 | |
JP3820418B2 (ja) | 新規キチナーゼ及びその製造方法 | |
JPH0313878B2 (ja) | ||
JP3026312B2 (ja) | キチン分解物の製造法 | |
JP3003009B2 (ja) | マンノースイソメラーゼ及びそれを用いたマンノースの製造法 | |
CN113151060B (zh) | 一种延长赖氨酸芽孢杆菌zcgt05及其应用 | |
JPH02138965A (ja) | クレブシェラ属の菌株の培養物を用いてラムノース含有量の高い単糖類混合物を生産する方法 | |
JPH01228465A (ja) | 新規なβ−アガラーゼ及びその製造法 | |
KR20090112382A (ko) | 한천 분해능을 갖는 사카로파거스 속 균주 | |
JP3621985B2 (ja) | 新規β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ及びその製造方法 | |
JP2707093B2 (ja) | 新規微生物 | |
KR0140430B1 (ko) | 아스퍼질러스 푸미가투스 돌연변이 균주와 생산효고 및 이를 이용한 키토산-올리고당의 제조방법 | |
JP3797851B2 (ja) | バクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法 | |
JPS61280277A (ja) | キトサナ−ゼの製造法 | |
JP3858065B2 (ja) | 新規n−アセチルキトオリゴ糖デアセチラーゼ及びその製造法 | |
JPH07106148B2 (ja) | アガラ−ゼ活性を有する新規酵素、その製造方法および前記酵素を産生する新規微生物 | |
JPH1175827A (ja) | 新規なキトサナーゼ生産菌とキトサナーゼの製造方法 | |
JPS58164561A (ja) | 新生理活性ペンタペプチド及びその製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050525 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070914 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071113 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071213 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080212 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080313 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080313 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4110243 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110418 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110418 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120418 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130418 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130418 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140418 Year of fee payment: 6 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |