MXPA06001718A - Procedimiento enzimatico para la produccion de derivados de acido 3-hidroxibutirico 4-sustituido y esteres de acido carboxilico sustituido con ciano e hidroxi vecinales. - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee metodos y composiciones para preparar derivados de acido 3-hidroxibutirico 4-sustituido por conversion catalizada por halohidrina deshalogenasa de derivados de acido 4-halo-3-hidroxibutirico; ademas, la presente invencion provee metodos y composiciones para preparar derivados de acido 4-halo-3hidroxibutirico mediante conversion catalizada por cetorreductasa de derivados de acido 4-halo-3-cetobutirico; la presente invencion tambien provee metodos y composiciones para preparar esteres de acidos carboxilicos sustituidos con ciano e hidroxilo vecinales.

Description

PROCEDIMIENTO ENZIMAT1CO PARA LA PRODUCCION DE DERIVADOS DE ACIDO 3-HIPROX1BUTIRICO 4-SUSTITUIDO Y ESTERES DE ACIDO CARBOXILICO SUSTITUIDO CON CIANO E HIDROXI VECINALES INTERREFERENCIA CON SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud es una continuación en parte de U. S. S. N. 10/639,159, presentada el 11 de agosto de 2003, que reclama el beneficio según 35 U. S. C. § 119(e) de U. S. S. N. 60/402,436, presentada el 9 de agosto de 2002, ambas incorporadas en la presente como referencia en su totalidad.

NOTIFICACION DE DERECHOS DE PROPIEDAD Una parte de la descripción de este documento de patente contiene material que está sujeto a protección de derechos de propiedad. El propietario de los derechos no tiene objeción en la reproducción facsimilar del documento de patente o la descripción de patente que aparece en el archivo o los registros de patente de la Oficina de Patentes y Marcas, pero por lo demás se reserva todos los derechos cualesquiera que estos sean.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a métodos y composiciones enzimáticas novedosas para preparar derivados de ácido 3-hidroxibutírico 4-sustituidos y ésteres de ácido carboxílico sustituidos con ciano e hidroxi vecinales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los derivados de ácido 3-hidroxibutírico 4-sustituido y los ésteres de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales son intermediarios comercialmente importantes en la síntesis de agentes farmacéuticos. Los ésteres quirales no racémicos de ácido 3-hidroxibutírico 4-sustituido se pueden utilizar en la síntesis de inhibidores de HMG-CoA reductasa, tales como atorvastatina, fluvastatina, rosuvastatina e itavastatina. Por ejemplo, un éster de ácido (R)-4-ciano-3-hidroxibutírico y un éster de ácido (3R,5R)-6-c¡ano-3,5-dihidroxihexanoico, son intermediarios clave para la producción del agente reductor de co!esterol atorvastatina. Se han descrito métodos para producir algunos ésteres de ácido 3-hidroxibutírico 4-sustituido. Isbell y otros, Carbohydrate Res., 72:301 (1979), reportan un método para sintetizar un éster de ácido (R)-4-ciano-3-hidroxibutír¡co, haciendo reaccionar la sal de calcio monohidratada de treonina con bromuro de hidrógeno, para producir un derivado dibromo de treonina, que después es convertido en una bromohidrina vecinal. El grupo hidroxilo de la bromohidrina se protege con cianuro de sodio antes de la reacción, id. En Acta Chem. Scand., B37, 341 (1983) se reporta un método para producir un 4-ciano-3-hidroxibutirato, partiendo de un 4-bromo-3-hidroxibutirato, que requiere proteger el grupo hidroxi con un grupo protector antes de la reacción con cianuro de sodio. Las rutas recientes para sintetizar ésteres de 4-ciano-3-hidroxibutirato incluyen la reacción química no catalizada de un éster de 4-bromo- o 4-cloro-3-hidroxibutirato, sin protección del grupo hidroxilo, con una sal de cianuro. Sin embargo, bajo las condiciones básicas creadas por el anión cianuro básico, se forman subproductos cuya remoción del producto es particularmente problemática. Los ésteres de 4-ciano-3-hidroxíbutirato son líquidos de alto punto de ebullición y se requiere destilación fraccionada al vacío para separar el éster de 4-ciano-3-hidroxibutirato de estos subproductos. Las condiciones de destilación son susceptibles de generar más subproductos y es problemático operar exitosamente la destilación. El uso de un éster de ácido 4-cloro-3-hidroxibutírico como material de partida en la síntesis de un éster de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico, es económicamente más atractivo que el uso de un éster de ácido 4-bromo-3-hidroxibutírico, pero requiere condiciones más forzadas en su reacción con las sales de cianuro, debido a la reactividad más baja del sustituyente cloro en comparación con el sustituyente bromo. Aunque la cianación de los ésteres de 4-cloro-3-hidroxibutirato procede con cianuro de álcali y a alta temperatura, estas condiciones forzadas resultan en la formación sustancial de subproductos, requiriéndose procedimientos de aislamiento y purificación extensivos que reducen más el rendimiento. La patente de E.U. No. 5,908,953 describe que, además de material de partida sin reaccionar, los ésteres crudos de alquilo inferior de ácido (R)-4-ciano-3-hidroxibutírico pueden contener hidroxiacrilato, cianoacrilato, 3-cianobutirolactona, 3-hidroxibutirolactona, ?-crotonolactona, éster de alquilo inferior de 3-ciano-4-hidroxibutirato, éster de alquilo inferior de 3,4--dicianobutirato y compuestos de alto punto de ebullición no caracterizados. La patente de E.U. No. 5,908,953 describe además un método de purificación para ésteres de alquilo inferior de ácido (R)-4-ciano-3-h¡drox¡butírico que incluye la destilación de una mezcla cruda en presencia de un solvente que tiene un punto de ebullición de 50 °C a 160 °C a 10 Torr. Se afirma que usando estos métodos de destilación se puede minimizar la descomposición de material de partida sin reaccionar, que de otra manera puede resultar en una considerable pérdida general de la producción del éster de alquilo inferior de ácido (R)-4-ciano-3-hidroxibutírico. La patente de E.U. No. 6,140,527 describe un enfoque alternativo para tratar los ésteres crudos de alquilo inferior de ácido (R)-4-ciano-3-hidroxibutírico, que incluye la remoción de los subproductos deshidratados, tales como ésteres de ácido 4-hidroxicrotónico, por reacción química, que hace estos componentes solubles en agua y extraíbles. De esta manera, aunque estos métodos utilizan un material de partida fácilmente disponible, una pérdida de rendimiento significativa y la necesidad de purificación del producto los hace comercialmente inconvenientes. Por consiguiente, serían muy deseables métodos más eficientes para producir ésteres quirales no racémicos de ácido 3-hidroxibutírico 4-sustituido. Las halohidrinas deshalogenasas, también referidas como haloalcohol deshalogenasas o halohidrina hidrógeno-haluro liasas, catalizan la eliminación de halogenuro de hidrógeno, como protón y ion halogenuro, de halohidrinas vecinales, para producir el epóxido correspondiente. Estas enzimas también catalizan la reacción inversa. Nagasawa y otros, Appl. Microbiol. Biotechnol. vol. 36 (1992) p. 478-482, describen la actividad de una halohidrina hidrógeno-halogenuro liasa sobre 4-cloro-3-hidrox¡butironitrilo entre otras halohidrinas vecinales. Nakamura y otros, Biochem. Biophys. Research Comm. vol. 180 (1991) p. 124-130, y Tetrahedron vol. 50 (1994) p. 11821-11826, describen la actividad de una halohidrina hidrógeno-halogenuro liasa para catalizar la reacción de algunos epóxidos con cianuro para formar los beta-hidroxinitrilos correspondientes. En estas referencias y la patente de E.U. No. 5,210,031 de Nakamura y otros, se describe una reacción de epihalohidrina con cianuro de álcali en presencia de una halohidrina hidrógeno-halogenuro liasa, para producir el 4-haIo-3-hidroxi-butironitrilo correspondiente. En la patente de E.U. No. 5,166,061 , Nakamura y otros describen una reacción de 1 ,3-dihalo-2-propanol con cianuro de álcali en presencia de unas enzimas deshalogenantes para producir el 4-halo-3-hidroxibutironitrilo correspondiente. En Tetrahedron, vol. 50(1994) p. 1821-11826, Nakamura y otros describen la reacción de 1 ,3-dicloro-2-propanol con cianuro, usando una halohidrina hidrógeno-halogenuro liasa, para producir 4-cloro-3-hidroxibutironitrilo. Lutje-Spelberg y otros, Org. Lett, vol. 2 (2001) p. 41-43, describen la actividad de una halohidrina deshalogenasa para catalizar la reacción de unos óxidos de estireno con azida para formar el 1-fenil-2-azido-etanol correspondiente.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la presente invención está dirigida a un método de producción de un éster o amida de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico a partir de un éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico, el método comprendiendo: (a) proveer un éster o amida del ácido 4-halo-3-hidroxibutírico, en donde el sustituyente halógeno se selecciona del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; y (b) poner en contacto el éster o amida del ácido 4-halo-3-hidroxibutírico con una halohidrina deshalogenasa y cianuro, bajo condiciones suficientes para formar una mezcla de reacción para convertir el éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico en un éster o amida de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico. En un aspecto adicional de la presente invención, el éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico del paso (a) se provee mediante un método que comprende: proveer un éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico, en donde el sustituyente halógeno se selecciona del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; y poner en contacto el éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico con una cetorreductasa, un cofactor y un sistema de regeneración de cofactor, bajo condiciones suficientes para formar una mezcla de reacción para convertir el éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico en el éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico. En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método de producción de un éster de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico a partir de un éster de ácido 4-halo-3-cetobutírico, el método comprendiendo: (a) proveer un éster de ácido 4-halo-3-cetobutírico, en donde el sustituyente halógeno se selecciona del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; y (b) poner en contacto el éster de ácido 4-halo-3-cetobutírico con una cetorreductasa, un cofactor, un sistema de regeneración de cofactor, cianuro, y una halohidrina deshalogenasa, para formar una mezcla de reacción para convertir el éster de ácido 4-halo-3-cetobutírico en un éster de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico. En otra modalidad, la presente invención está dirigida a un método de producción de un éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, a partir de un éster o amida de ácido 4-halo-3-h¡drox¡butír¡co, el método comprendiendo: (a) proveer un éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico, en donde el sustituyente halógeno se selecciona del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; y (b) poner en contacto el éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico con una haiohidrina deshalogenasa y un nucleófilo bajo condiciones adecuadas para formar una mezcla de reacción, para convertir el éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico en un éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4. En una modalidad adicional, la presente invención está dirigida a un método de producción de un éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, el método comprendiendo: (a) proveer un éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico, en donde el sustituyente halógeno se selecciona del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; y (b) poner en contacto el éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico con una cetorreductasa, un cofactor, un sistema de regeneración de cofactor, un nucleófilo, y una haiohidrina deshalogenasa, para formar una mezcla de reacción para convertir el éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico en un éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4. En otro aspecto, la presente invención está dirigida a una composición que comprende: (a) una halohidrina deshalogenasa; (b) un nucleófilo; y (c) un éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico. Además, la presente invención provee composiciones que son útiles en la producción de ásteres de ácido carboxilico sustituido con ciano e hidroxi vecinales, así como métodos relacionados adicionales para convertir ásteres de ácido carboxilico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales en ásteres de ácido carboxilico sustituido con ciano e hidroxi vecinales.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 representa la cantidad de 4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo (clorohidrina) y 4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo (cianohidrina), analizados en reacciones de prueba de 4-cIoro-3-hidroxibutirato de etilo con cianuro en soluciones acuosas a varios pHs, en presencia o ausencia de una halohidrina deshalogenasa (HHDH), como se describe en el ejemplo 21. La figura 2 representa un vector de expresión de 3944 p.b. (pCK110700) de la presente invención, que comprende un origen de duplicación de p 5A (p15 orí), un represor de lacl, un promotor T5, un sitio de unión ribosomal de T7 (T7g10), y un gen de resistencia al cloranfenicol (camR). La figura 3 representa un vector de expresión de 4036 p.b. (pCK110900) de la presente invención, que comprende un origen de duplicación de p15A (p15 ori), un represor de lacl, un sitio de unión de CAP, un promotor lac (lac), un sitio de unión ribosomal de T7 (T7g10 RBS), y un gen de resistencia al cloranfenicol (camR). La figura 4 representa el porcentaje de conversión con respecto al tiempo de la reacción de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo con ácido cianhídrico acuoso, en presencia de varias enzimas halohidrina deshalogenasa que se describen en los ejemplos 25 a 29.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee métodos y composiciones enzimáticas para producir varios ésteres y amidas de ácidos 3-hidroxibutíricos 4-sustituidos a partir de substratos de éster y amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico. La presente invención también provee métodos y composiciones para producir ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con ciano e hidroxi vecinales a partir de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales.

I. Conversión de derivados de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico catalizada por halohidrina deshalogenasa La presente invención provee un método de producción de un éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, a partir de un éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico, el método comprendiendo: (a) proveer un éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico, en donde el sustiíuyente halógeno se selecciona del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; y (b) poner en contacto el éster o amida del ácido 4-halo-3-hidroxibutírico con una halohidrina deshalogenasa y un nucleófilo, bajo condiciones adecuadas para formar una mezcla de reacción para convertir el éster o amida de ácido 4-haIo-3-hidroxibutírico en un éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4. Significativamente, el método de la invención provee un procedimiento de fabricación de ésteres y amidas de ácidos 3-hidroxibutíricos 4-sustituidos, en el cual se minimiza la formación de subproductos. Los nucleófilos adecuados para usar en la práctica de la presente invención son aquellos capaces de desplazar el sustituyente halógeno del substrato de éster o amida de ácido 4-haIo-3-hidroxibutírico. Los nucleófilos típicos utilizados en la presente invención son los nucleófilos amónicos. Los nucleófilos ejemplares incluyen cianuro (CN"), azida (N3") y nitrito (ONO-). En una modalidad específica, la presente invención provee un método de producción de ésteres o amidas de ácidos 4-ciano-3-hidroxibutíricos a partir de ésteres o amidas de ácidos 4-halo-3-hidroxibutí ricos, por medio de una reacción catalizada por halohidrina deshalogenasa, el método comprendiendo: (a) proveer un éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico; en donde el sustituyente halógeno se selecciona del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; y (b) poner en contacto el éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico con una halohidrina deshalogenasa y cianuro, bajo condiciones adecuadas para formar una mezcla de reacción para convertir el éster o amida de ácido 4-haio-3-hidroxibutírico en un éster o amida de ácido 4-ciano-3-h¡droxibutírico. Como se usa aquí, el término "cianuro" se refiere al anión cianuro (CN"), ácido cianhídrico (HCN) y mezclas de los mismos. El cianuro se puede proveer en forma de una sal de cianuro, normalmente una sai de álcali (por ejemplo, NaCN, KCN y similares), en forma de ácido cianhídrico (gaseoso o en solución), o mezclas de los mismos. Los ésteres y amidas de ácidos 4-halo-3-hidroxibutíricos empleados en la práctica de la presente invención, se pueden preparar de acuerdo con los métodos que aquí se describen o alternativamente usando los métodos conocidos. Estos métodos se describen, por ejemplo, en la patente de E.U. No. 5,891 ,685; Hallinan y otros, Biocatalysis and Biotransformation, 12: 179-191 (1995); Russ. Chem. Rev., 41 : 740 (1972); Kataoka y otros, Appl. Microbio!. Biotechnol., 48: 699-703 (1997); y la patente de E.U. No. 5,430,171. Los substratos de éster y amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico empleados en la práctica de la presente invención, incluyen los que tienen la estructura IA y IB, respectivamente: IB en donde: X es un halógeno seleccionado del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; R , R2, R3, R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, flúor, un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilo sustituido opcionalmente, un alquenilo inferior sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente, un arilalquilo sustituido opcionalmente, amino, un alquilamino inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilamino sustituido opcionalmente, un alcoxi inferior sustituido opcionalmente, un cicloalcoxi sustituido opcionalmente, un ariioxi sustituido opcionalmente y un arilalcoxi sustituido opcionalmente; y R5 se selecciona del grupo que consiste de un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilo sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente y un arilalquilo sustituido opcionalmente; y R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilo sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente y un arilalquilo sustituido opcionalmente. "Sustituido opcionalmente" se refiere aquí al reemplazo de hidrógeno con un radical monovalente. Los grupos de sustitución adecuados incluyen, por ejemplo, hidroxilo, alquilo, alquilo inferior, alcoxi, alcoxi inferior, alquenilo, alquenilo inferior, nitro, amino, ciano, halógeno (esto es, halo), tio y similares. Otros grupos de sustitución adecuados incluyen carboxi (esto es, un grupo carboxilato o ácido carboxílico), carboalcoxi (esto es, un grupo éster), carbamida (esto es, un grupo amido), y acilo (esto es, que forma una cetona). El término "alquilo inferior" se usa aquí para hacer referencia a grupos alquilo de cadena recta o ramificada que tienen de uno a cerca de seis átomos de carbono que no están sustituidos o están sustituidos por ejemplo con uno o más grupos halógeno, hidroxilo u otros grupos, que incluyen por ejemplo metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, /-butilo, í-butilo, trifluorometilo y similares. El término "cicloalquilo" se refiere a porciones de alquilo carbocíclicas que tienen de 3 a cerca de 6 átomos de carbono, así como porciones alquilo heterocíclicas que tienen de 3 a cerca de 6 átomos, en donde por lo menos un átomo de anillo es un heteroátomo y los otros átomos son átomos de carbono. "Heteroátomo" se refiere aquí a oxígeno, nitrógeno o azufre. El término "alquenilo inferior" se usa aquí para referirse a un grupo de cadena recta o ramificada que tiene uno o más dobles enlaces y de 2 a cerca de 6 átomos de carbono. Los grupos alquenilo inferior empleados en la práctica de la presente invención pueden estar sustituidos opcionalmente con los grupos aquí descritos que incluyen por ejemplo halógeno, hidroxilo, alquilo inferior y similares. Como se usa aquí, el término "alcoxi inferior" se refiere a -OR, en donde R es un alquilo inferior o un alquenilo inferior. Los grupos alcoxi inferior adecuados empleados en la práctica de la presente invención incluyen metoxi, etoxi, f-butoxi, trifluorometoxi y similares. El término "ariloxi" se refiere aquí a RO-, en donde R es un arilo. Como se usa aquí, el término "arilo" se refiere a grupos aromáticos monocíclicos y policíclicos que tienen de 3 a cerca de 14 átomos de carbono o heteroátomos de esqueleto, e incluye grupos arilo carbocíclicos y grupos arilo heterocíclicos. Los grupos arilo carbocíclicos son grupos arilo en los que todos los átomos del anillo aromático son carbono. Los grupos arilo heterocíclicos son grupos arilo que tienen de 1 a cerca de 4 heteroátomos como átomos del anillo aromático, siendo el resto de los átomos del anillo átomos de carbono. Los grupos arilo ejemplares empleados como sustituyentes en la presente invención incluyen, por ejemplo, fenilo, piridilo, pirimidinilo, naftilo y similares. El término "arilalquilo" se refiere aquí a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo. Los grupos arilalquilo ejemplares incluyen bencilo, picolilo y similares. Los grupos arilalquilo sustituidos pueden estar sustituidos en la porción arilo, en la porción alquilo o en ambas porciones del grupo arilalquilo. Corno se usa aquí, el término "arilalcoxi" se refiere a RO-, en donde R es un arilalquilo. El término "cicloalcoxi" se refiere aquí a RO-, en donde R es un cicloalquilo de C3-C8 sustituido opcionalmente. El término "amino" se usa aquí para referirse al grupo -NH2. El término "alquiiamino inferior" se refiere aquí al grupo -NRR', en donde R es hidrógeno o un alquilo inferior, y R' es un alquilo inferior. El término "cicloalquilamino" se refiere aquí al grupo -NR, en donde R es un radical alifático divalente sustituido opcionalmente, que tiene de 3 a cerca de 8 átomos de carbono, de tal manera que N y R forman una estructura cíclica, por ejemplo pirrolidino, piperidino y similares. Los ésteres de ácidos 4-halo-3-hidroxibutíricos específicos del compuesto IA, que se pueden emplear en la práctica de la presente invención, incluyen el éster etílico del ácido 4-cloro-3-hidroxibutírico (esto es, en donde X es cloro, R1, R2, R3, R4 y R6 son hidrógeno y R5 es etilo), éster metílico del ácido 4-cloro-3-hidroxibutírico (esto es, en donde X es cloro, R , R2, R3, R4 y R6 son hidrógeno y R5 es metilo), éster etílico del ácido 4-bromo-3-hidroxibutírico (esto es, en donde X es bromo, R , R2, R3, R4 y R6 son hidrógeno y R5 es etilo), éster metílico del ácido 4-bromo-3-hidroxibutírico (esto es, en donde X es bromo, R1, R2, R3, R4 y R6 son hidrógeno y R5 es metilo), éster t-butílico del ácido 4-cloro-3-hidroxibutírico (esto es, en donde X es cloro, R1, R2, R3, R4 y R6 son hidrógeno y R5 es t-butilo), éster t-butílico del ácido 4-bromo-3-hidroxibutírico (esto es, en donde X es bromo, R , R2, R3, R4 y R6 son hidrógeno y R5 es t-butilo), y éster t-butílico del ácido 4-yodo-3-hidroxibutírico (esto es, en donde X es yodo, R , R2, R3, R4 y R6 son hidrógeno y R5 es t-butilo). En algunas modalidades, por lo menos uno de R , R2, R3, R4 y R5 es un alquilo inferior, tal como por ejemplo, metilo, etilo, o propilo. Las amidas de ácidos 4-halo-3-hidroxibutíricos adecuadas del compuesto IB, que se pueden emplear en la práctica de la presente invención, incluyen la amida de ácido 4-cloro-3-hidroxibutírico (esto es, en donde X es cloro, R , R2, R3, R4, R6, R7 y R8 son hidrógeno), amida del ácido 4-bromo-3- hidroxibutírico (esto es, en donde X es bromo y R1, R2, R3, R4, R6, R7 y R8 son hidrógeno), y amida del ácido 4-yodo-3-hidroxibutír¡co (esto es, en donde X es yodo, R1, R2, R3, R4, R6, R7 y R8 son hidrógeno). En algunas modalidades, por lo menos uno de R1, R2, R3, R4 y R6 es un alquilo inferior, tal como por ejemplo metilo, etilo o propilo. El sustituyente 4-halo de los substratos de éster y amida de ácido 4-haIo-3-hidroxibutírico se selecciona preferiblemente de cloro y bromo. Se prefieren particularmente los substratos de éster y amida de ácido 4-cloro- 3-hidroxibutírico. Los ésteres y amidas de ácidos 3-hidroxibutíricos 4-sust¡tuidos producidos por los métodos de la presente invención, incluyen los que tienen la estructura IIA y IIB, respectivamente: en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son como se define para las estructuras IA y IB; y Nu se selecciona del grupo que consiste de -CN, -N3 y -ONO. Cuando los substratos de éster de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico que tienen la estructura del compuesto IA se hacen reaccionar con cianuro y halohidrina deshalogenasa, se generan productos de éster de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico que tienen la estructura del compuesto III: ?? en donde R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son como se define para la estructura IA. Las halohidrina deshalogenasas se emplean en la práctica de la presente invención para catalizar la conversión de un éster o amida de ácido 4-ha!o-3-hidroxibutírico, en el éster o amida correspondiente de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, en presencia de un nucleófilo. Los términos "halohidrina deshalogenasa" y "HHDH" se usan aquí intercambiablemente para referirse a una enzima que, en el proceso de la presente invención, cataliza la conversión de un éster o amida carboxílica sustituida con halógeno e hidroxi vecinales en un éster o amida carboxílica sustituida con ciano e hidroxi vecinales, tal como por ejemplo el éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico en un éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, respectivamente, en presencia de un nucleófilo como cianuro. Las halohidrina deshalogenasas adecuadas incluyen las haiohidrina deshaiogenasas naturales (de tipo silvestre), así como haiohidrina deshaiogenasas no naturales generadas por manipulación humana. Las haiohidrina deshaiogenasas naturales y no naturales ejemplares y los polinucleótidos que codifican haiohidrina deshaiogenasas, incluyen los que se describen en la presente. Se han identificado genes que codifican haiohidrina deshaiogenasas naturales en Agrobacterium radiobacter AD1 (hheC), Agrobacterium tumefaciens (halB), Corynebacterium sp. (hheA que codifica la y hhB que codifica Ib), Arthrobacter sp. (hheAAD2), y Mycobacterium sp. GP1 (hheBepi). Véase: van Hylckama Vlieg, J. E. T., L. Tang, J. H. Lutje Spelberg, T. Smilda, G. J. Poelarends, T. Bosma, A. E. J. van Merode, . W. Fraaije y Dick B. Janssen, "Haiohydrin Dehalogenases are structurally and mechanistically related to short-chain dehydrogenases/reductases" (2001) Journal of Bacteriology, 183 : 5058-5066 (provee las secuencia de aminoácidos de estas haiohidrina deshaiogenasas en una alineación). Estas haiohidrina deshaiogenasas naturales se han caracterizado en cierto grado. La HHDH de Agrobacterium radiobacter AD1 es un homotetrámero de subunidades de 28 kD. Corynebacterium sp. N-1074 produce dos enzimas HHDH, una de las cuales está compuesta de subunidades de 28 kD (la), mientras que la otra está compuesta de subunidades relacionadas de 35 o 32 kD (Kb). La HHDH de algunas fuentes se inactiva fácilmente bajo condiciones oxidantes en un proceso que conduce a la disociación de las subunidades, tiene un pH óptimo amplio de 8 a 9 y una temperatura óptima de 50 °C (Tang, Enz. Microbiol. Technol. (2002) 30: 251-258; Swanson, Curr. Opinión Biotechnol. (1999) 10: 365-369). El pH óptimo para la formación de epóxído catalizada por HHDH, es de 8.0 a 9.0, y la temperatura óptima varía de 45 a 55 °C (Van Hyickama Vlieg y otros, J. Bacterio}. (2001 ) 183: 5058-5066; Nakamura y otros, Appl. Environ. Microbiol. (1994) 60: 1297-1301 ; Nagasawa y otros, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1992) 36: 478-482). Se ha reportado que el pH óptimo para la reacción inversa, apertura del anillo por cloro, para las dos enzimas de Corynebacterium sp. N-1074 es de 7.4 (la) o 5 (Ib). En la presente se proveen polinucleótidos que codifican la halohidrina deshalogenasa de Agrobacterium radiobacter AD1 como las SEQ ID NOs: 13, 15 y 17. Los polinucleótidos que corresponden a las SEQ ID NOs: 13, 15 y 17 son variantes que codifican la misma secuencia de aminoácidos (las secuencias traducidas se proveen como las SEQ ID NOs: 14, 16 y 18). Se pueden generar halohidrina deshalogenasas no naturales usando los métodos conocidos, por ejemplo, mutagénesis, evolución dirigida y similares. Más abajo se describen varios métodos ilustrativos. Se puede determinar fácilmente la actividad de las enzimas usando el método descrito en el ejemplo 4. Estos métodos de examen también se pueden aplicar fácilmente para identificar otras halohidrina deshalogenasas naturales. Las halohidrina deshalogenasas no naturales adecuadas incluyen las que corresponden a las SEQ ID NOs: 24 (HHDH B-03), 26 (HHDH C-04), 28 (HHDH E-01), 30 (S01056858), 32 (HHDH 2G5), 34 (HHDH z1.1A5), 36 (HHDH cys1.10), 38 (HHDH cys2.12), 74 (HHDH B-12), 76 (HHDH Mz1/4H6), 78 (HHDH F-04), 80 (HHDH A-08), 82 (HHDH G9), 84 (HHDH F9), 86 (HHDH H10), 88 (HHDH A1), 90 (HHDH A-03), 92 (HHDH E-03), 94 (HHDH S008278O1), 96 (HHDH S00890554), 98 (HHDH S00994580), 100 (HHDH S01018044), 102 (HHDH S01035939), 104 (HHDH S01009684), 106 (HHDH S00817219), 108 (HHDH S00708827), 110 (HHDH S00772501), 112 (HHDH S01035968) y 114 (HHDH S01040430). Las secuencias de polinucleótido ejemplares que codifican estas halohidrina deshalogenasas incluyen las que corresponden a las SEQ ID Nos: 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111 y 113, respectivamente. Halohidrina deshalogenasas no naturales adicionales que son adecuadas en la práctica de la presente invención, se proveen en la solicitud de patente titulada "Improved Halohydrin Dehalogenases and Related Polynucleotides", que corresponde al No. de Expediente del Abogado 0353.110US, presentada el 11 de agosto de 2003 y la solicitud asignada de E.U. No. de serie 60/494,382, y en la solicitud de patente titulada "Improved Halohydrin Dehalogenases and Related Polynucleotides" que corresponde al No. de Expediente del Abogado 0353.2 0US, presentada el 18 de febrero de 2004 y la solicitud asignada de E.U. No. de serie , ambas incorporadas en la presente como referencia en su totalidad. Las halohidrina deshalogenasas que son adecuadas para usar en la práctica de la presente invención, naturales o no naturales, pueden ser identificadas fácilmente por los expertos en la materia usando el método descrito en el ejemplo 4 y el substrato sustituido con halógeno e hidroxiio vecinales y el nucleófilo de interés. Las haiohidrina deshalogenasas empleadas en la práctica de la presente invención exhiben normalmente una actividad de por lo menos aproximadamente 1 µ????/min/mg en la prueba descrita en el ejemplo 4. Las haiohidrina deshalogenasas empleadas en la práctica de la presente invención pueden exhibir una actividad de por lo menos aproximadamente 10 pmol/min/mg, y algunas veces por lo menos aproximadamente 102 pmol/min/mg, y hasta aproximadamente 103 µ?t???/min/mg o más alta, en la prueba descrita en el ejemplo 4. La haiohidrina deshalogenasa se puede proveer a la mezcla de reacción en forma de enzima purificada, extracto celular, lisado celular o células completas transformadas con uno o más genes que codifican haiohidrina deshalogenasas. Las células completas transformadas con genes que codifican haiohidrina deshalogenasa, o extractos celulares o lisados celulares de las mismas, se pueden emplear en una variedad de formas diferentes, que incluyen sólida (por ejemplo, liofilizada, secada por aspersión y similares), o semisólida (por ejemplo una pasta cruda). Los extractos celulares o lisados celulares se pueden purificar parcialmente por precipitación (sulfato de amonio, polietilenimina, tratamiento con calor o similares), seguida por un proceso de desalación antes de la liofilización (por ejemplo ultrafiltración, diálisis y similares). Cualquiera de las preparaciones celulares se pueden estabilizar por entrecruzamiento usando agentes de entrecruzamiento conocidos, tales como por ejemplo glutaraldehído o inmovilización en una fase sólida (por ejemplo Eupergit C y similares). Los reactivos sólidos (por ejemplo enzimas, sales, etc.) se pueden proveer en una variedad de formas diferentes, que incluyen polvo (por ejemplo liofilizado, secado por aspersión y similares), solución, emulsión, suspensión y similares. Los reactivos se pueden liofilizar o secar por aspersión fácilmente usando los métodos y equipos que son conocidos para los expertos en la materia. Por ejemplo, la solución de proteína se puede congelar a -80 °C en alícuotas pequeñas y después añadirse a una cámara de liofilización previamente enfriada, seguido por la aplicación de vacío. Después de la remoción de agua de las muestras, la temperatura normalmente se eleva a 4 °C durante 2 horas antes de liberar el vacío y recuperación de las muestras liofilizadas. Para convertir el substrato de éster o amida de ácido 4-haIo-3-hidroxibutírico en el producto de éster o amida correspondiente de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, normalmente el substrato se pone en contacto con la halohidrina deshalogenasa y el nucleófilo en un solvente. Los solventes adecuados para efectuar la conversión del éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico en el éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, incluyen agua, solventes orgánicos (por ejemplo, acetato de etilo, acetato de butilo, 1 -octanol, heptano, octano, éter metil-t-butílico (MTBE), tolueno y similares), líquidos iónicos (por ejemplo, tetrafluoroborato de 1-etil-4-metilim¡dazolio, tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazolio, hexafluorofosfato de 1-butil-3- metilimidazolio, y similares), y sistemas de cosolventes que incluyen sistemas cosolventes acuosos y similares. Los solventes preferidos son los solventes acuosos, que incluyen agua y sistemas cosolventes acuosos. Los sistemas cosolventes acuosos ejemplares tienen agua y uno más solventes orgánicos. En general, un solvente orgánico componente de un sistema cosolvente acuoso se selecciona de tal manera que no inactive completamente los catalizadores de enzima empleados en el método de la invención. Se pueden identificar fácilmente sistemas de cosolvente apropiados midiendo la actividad de la enzima con el substrato de interés en el sistema solvente candidato, utilizando la prueba de enzima que se describe en el ejemplo 4. El solvente orgánico componente de un sistema cosolvente acuoso puede ser miscible con el componente acuoso, suministrando una sola fase líquida, o puede ser parcialmente miscible o inmiscible con el componente acuoso, suministrando dos fases líquidas. Normalmente cuando se emplea un sistema cosolvente acuoso, se selecciona bifásico, con agua dispersa en un solvente orgánico o viceversa. En general, cuando se utiliza un sistema cosolvente acuoso, es deseable seleccionar un solvente orgánico que pueda separarse fácilmente de la fase acuosa. Generalmente, la relación de agua a solvente orgánico en el sistema cosolvente está en la escala de aproximadamente 90:10 a aproximadamente 10:90 (v/v) de solvente orgánico a agua, y entre 80:20 y 20:80 (v/v ) de solvente orgánico a agua. El sistema cosolvente se puede preformar antes de su adición a la mezcla de reacción, o se puede formar in situ en el recipiente de reacción. El solvente acuoso (agua o sistema cosolvente acuoso) puede ser o no amortiguador de pH. La conversión del éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico en el éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, se puede efectuar a un pH de aproximadamente de 5 o mayor. Generalmente la conversión se efectúa a un pH de aproximadamente 10 o menor, usualmente en la escala de aproximadamente 5 a aproximadamente 10. Normalmente, la conversión se efectúa a un pH de aproximadamente 9 o menor, mas usualmente en la escala de aproximadamente 5 a aproximadamente 9. De preferencia, la conversión se efectúa a un pH de aproximadamente de 8 o menor, usualmente en la escala de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, y muy de preferencia en la escala de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. Esta conversión también se puede efectuar a un pH de aproximadamente 7.8 o menor, o 7.5 o menor. Alternativamente, la conversión se puede efectuar a un pH neutro, es decir, de aproximadamente 7. Durante la conversión, el pH de la mezcla de reacción puede cambiar. El pH de la mezcla de reacción se puede mantener a un nivel deseado o dentro de una escala de pH deseada agregando un ácido o una base durante la conversión. Alternativamente, el cambio de pH se puede controlar usando un solvente acuoso que comprenda un amortiguador. Los amortiguadores adecuados para mantener la escala de pH deseada son conocidos e incluyen por ejemplo los amortiguadores de fosfato, trietanolamina, y similares. También se pueden usar combinaciones de amortiguadores y la adición de ácido o base. Como se describió arriba, cuando se desea la conversión a un derivado de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico, el cianuro se puede proveer en forma de una sal de cianuro, normalmente una sal de álcali (por ejemplo, NaCN, KCN y similares), en forma de ácido cianhídrico (gaseoso o en solución), o mezclas de los mismos. El ácido cianhídrico es un ácido débil. En soluciones acuosas, dentro de varias unidades de pH de su pKa (pKa= 9.1 en agua), el cianuro está presente como CN" y HCN en concentraciones en equilibrio. A valores de pH por abajo de 9 aproximadamente, el cianuro está presente predominantemente como HCN. Cuando el cianuro es provisto por una sal de cianuro, normalmente la mezcla de reacción se hace amortiguadora o se acidifica o ambas cosas, para proveer el pH deseado. Los ácidos adecuados para acidificar soluciones básicas de sales de cianuro incluyen ácidos orgánicos, por ejemplo ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos, ácidos fosfónicos y similares; ácidos minerales, por ejemplo ácidos halohídricos (tales como ácido clorhídrico), ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares; sales ácidas, por ejemplo sales de fosfato diácido (por ejemplo, KH2P04), sales de bisulfato (por ejemplo, NaHS04) y similares; así como también ácido cianhídrico. Los ácidos o sales ácidas usadas para acidificar la sal de cianuro se pueden seleccionar para proveer también un amortiguador en la solución resultante. Por ejemplo, se puede usar la acidificación con ácido fosfórico o una sal de fosfato diácido para proveer una solución amortiguadora de fosfato de HCN en la escala amortiguadora de fosfato (pH 6-8). Cuando el cianuro es provisto por ácido cianhídrico y se desea un pH más alto que el originado, normalmente la mezcla de reacción se hace amortiguadora o se hace menos acida agregando una base para proveer el pH deseado. Las bases adecuadas para la neutralización de ácido cianhídrico son las bases orgánicas, por ejemplo aminas, alcóxidos y similares, y bases inorgánicas, por ejemplo, sales de hidróxido (por ejemplo, NaOH), sales de carbonato (por ejemplo, NaHC03), sales de bicarbonato (por ejemplo, K2CO3), sales de fosfato básico (por ejemplo, K2HP04, Na3P04), y similares, así como también sales de cianuro. Para valores de pH menores de 9 aproximadamente, a los que el cianuro está presente predominantemente como HCN, la ecuación (1) describe la reacción catalizada por halohidrina deshalogenasa de un éster de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico con el HCN, en mezclas de reacción acuosas no amortiguadoras.

El consumo del ácido cianhídrico, un ácido débil (pKa -9) y la liberación del ácido halohídrico, un ácido fuerte (pKa <0), ocasiona que el pH de la mezcla de reacción caiga si no se neutraliza de alguna manera el ácido halohídrico acuoso (H+ + X"). El pH de la mezcla de reacción se puede mantener en el valor deseado mediante técnicas de amortiguamiento estándares en donde el amortiguador neutraliza el ácido haiohídrico hasta la capacidad amortiguadora provista, o mediante la adición de una base concurrentemente con el curso de la conversión. Dicha adición se puede hacer manualmente mientras se monitorea el pH de la mezcla de reacción o, más convenientemente, usando un titulador automático como un regulador del pH. También se puede usar una combinación de capacidad amortiguadora parcial y adición de base para el control de proceso. Cuando el pH se mantiene por amortiguamiento o por adición de una base durante la conversión, el producto del proceso general es una sal de halogenuro acuosa en lugar del ácido haiohídrico acuoso. Por ejemplo, la ecuación (2) representa el proceso general cuando se agrega hidróxido de sodio acuoso (Na+ + OH") durante la reacción para mantener un pH inicial por abajo de 9 aproximadamente.

+ (NA+ **7 + ¾0 En la modalidad en donde se agrega una sal de cianuro como la base para neutralizar el ácido haiohídrico conforme este es producido, la neutralización regenera HCN y mantiene la concentración total de cianuro (HCN + CN") y también el pH de la mezcla de reacción. Esto puede ser ventajoso porque de otra manera la velocidad de conversión disminuye conforme disminuye la concentración de cianuro. Por ejemplo, la ecuación (3) representa el proceso general cuando se agrega cianuro de sodio acuoso (Na+ + CN") durante la reacción para mantener un pH inicial. Aunque el cianuro está presente predominantemente como HCN en la mezcla de reacción, la concentración de HCN se mantiene, mientras la conversión en general consume la sal de cianuro básico agregada.

Cuando se emplea la adición de base para neutralizar el ácido halohídrico liberado durante la reacción catalizada por halohidrina deshalogenasa de un éster o amida 4-halo-3-hidroxibutírica a un éster o amida de ácido 4-ciano-3-h¡droxibutírico, el avance de la conversión se puede monitorear por la cantidad de base agregada para mantener el pH. Normalmente las bases agregadas a las mezclas de reacción no amortiguadoras o parcialmente amortiguadoras durante la conversión, se agregan en soluciones acuosas. Cuando el nucleófilo es el anión conjugado de un ácido más fuerte que tiene un pKa significativamente menor al pH inicial de la solución de reacción, el nucleófilo está presente predominantemente en su forma aniónica, de modo que a diferencia del HCN, no es liberado un protón en su reacción. Por consiguiente, en reacciones de tales nucleófilos, el pH de la mezcla de reacción se puede mantener sin amortiguamiento estequiométrico ni adición de base. Por ejemplo, el ácido conjugado de azida, ácido hidrazoico, tiene un pKa de 4.7 y el ácido conjugado de nitrito, ácido nitroso, tiene un pKa de 3.3. Por consiguiente, a pH neutro, estos nucleófilos están presentes predominantemente en su forma aniónica, N3" y ONO", respectivamente. Esto es, la mezcla de reacción neutra comprende la azida acuosa y la sal de nitrito, respectivamente. Su reacción en dichas mezclas libera el anión halogenuro para formar la sal de halogenuro acuosa, no el ácido halohídrico acuoso. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente las cantidades a usar de HHDH, substrato de éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico y nucleófilo, en base por ejemplo a la actividad de HHDH determinada por medio del método del ejemplo 4, la cantidad del producto deseado y similares. Para ilustrarlo, la cantidad de éster o amida de ácido 4-haIo-3-hidroxibutírico puede estar en la escala de 10 g/L a 500 g/L, aproximadamente, usando aproximadamente de 10 mg a 30 g de halohidrina deshalogenasa. La cantidad estequiométrica de nucleófilo puede ser determinada fácilmente. Se proveen ejemplos ilustrativos adicionales en la presente. Las condiciones adecuadas para efectuar la conversión catalizada por HHDH de la presente invención, incluyen una amplia variedad de condiciones que pueden ser optimizadas fácilmente por experimentación de rutina, que incluye poner en contacto la HHDH, el substrato de éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico, y el nucleófilo a un pH y temperatura experimentales y detectar el producto, por ejemplo usando los métodos que se proveen en los ejemplos de la presente. La conversión catalizada por HHDH de éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico en éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, normalmente se efectúa a una temperatura en la escala de 15° a 75°C, aproximadamente. Mas típicamente, la reacción se efectúa a una temperatura en la escala de 20°C a 55°C, aproximadamente, y normalmente de 20°C a 45°C, aproximadamente. La reacción también se puede realizar a condiciones ambientales. La conversión catalizada por HHDH de éster o amida de ácido 4-haIo-3-hidroxibutírico, en éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, generalmente se deja proceder hasta una conversión casi completa o esencialmente completa del substrato. La conversión de substrato a producto se puede monitorear usando los métodos conocidos, detectando substrato o producto. Los métodos adecuados incluyen cromatografía de gases, HPLC, y similares. Los rendimientos del éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, generado en la mezcla de reacción, por lo general son mayores de 50% aproximadamente; también pueden ser mayores de 60%, aproximadamente; también pueden ser mayores de 70% aproximadamente; también pueden ser mayores de 80% aproximadamente; y frecuentemente son mayores de 90% aproximadamente. El éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4 se puede recoger de la mezcla de reacción y opcionalmente se puede purificar usando métodos que son conocidos para el experto en la materia, así como los que se describen en los ejemplos. Los substratos preferidos de éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico de la presente invención, son quirales, siendo estereogénicos en la posición 3, y pueden ser racémicos o no racémicos. Algunas enzimas halohidrina deshalogenasas usadas en el proceso de la presente invención, convierten el substrato quiral en el éster o amida de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico con retención de la estereoquímica absoluta en la posición 3 estereogénica. Los substratos quirales no racémicos de éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico se pueden convertir en productos sustancial e igualmente no racémicos de éster o amida de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico, con poca o ninguna pérdida de pureza estereoquímica. Los ejemplos muestran modalidades de la invención que proveen alta retención de pureza enantiomérica (debido a las convenciones para designar la estereoquímica, el enantiómero de 4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo designado como (S) y el enantiómero de 4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo designado como (R), tienen la estereoconfiguración idéntica en la posición 3). En otras modalidades de la presente invención, algunas enzimas halohidrina deshalogenasas pueden ser estereoespecíficas para un estereoisómero del substrato quiral de éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico. El proceso de la presente invención que utiliza tales enzimas estereoespecíficas se puede usar para hacer reaccionar un estereoisómero de una mezcla estereoisomérica de un éster o amida de ácido 4-halo-3- hidroxibutírico, por ejemplo una mezcla racémica, dejando el otro estereoisómero sustancíalmente sin reaccionar, suministrando así una resolución cinética de la mezcla. Una característica significativa adicional de la presente invención es que la pureza de los productos generados de éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, es muy alta, sin la necesidad de procedimientos de purificación extensos tales como destilación al vacío. Normalmente la pureza de los productos generados de éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, de acuerdo con los métodos de la presente invención, es de por lo menos 80% aproximadamente, usualmente por lo menos 90% aproximadamente, y normalmente por lo menos 95% aproximadamente. La pureza del producto se puede determinar mediante métodos convencionales, tales como HPLC o cromatografía de gases.

II. Producción de halohidrinas catalizada por cetorreductasa La presente invención también provee un método enzimático para generar un éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico: a) suministrando un éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico, en donde el sustituyente halógeno se selecciona del grupo que consiste en cloro, bromo y yodo; y b) poniendo en contacto el éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico con una cetorreductasa, un cofactor, y un sistema de regeneración de cofactor, bajo condiciones adecuadas para formar una mezcla de reacción para convertir el éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico en el éster o amida de ácido 4-haio-3-hidroxibutírico. Los términos "cetorreductasa" y "KRED" se usan intercambiablemente en la presente para referirse a una enzima que, en el proceso de la presente invención, cataliza la reducción de un éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico en el éster o amida correspondiente de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico. Tal actividad catalítica se puede detectar con una prueba como la que se describe más adelante en el ejemplo 4. Como se usa aquí, el término "cofactor" se refiere a un compuesto no proteico que opera en combinación con una enzima que cataliza la reacción de interés. Los cofactores adecuados empleados en la práctica de la presente invención incluyen NADP+ (fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina), NADPH (esto es, la forma reducida del fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina), NAD+ (esto es, dinucleótido de nicotinamida y adenina) y NADH (esto es, la forma reducida de NAD+), y similares. La forma reducida del cofactor es regenerada reduciendo el cofactor oxidado con un sistema de regeneración de cofactor. En el presente proceso, la cetorreductasa cataliza la reducción del éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico realizada por la forma reducida del cofactor. La ecuación (4) describe la reducción catalizada por cetorreductasa de un éster de ácido 4-halo-3-cetobutírico realizada por NADH o NADPH, que son representados como alternativas por la designación NAD(P)H. O OH O * LAOR * NAD(P)H + H* NAA0R ÷ AD(P Las cetorreductasas que son adecuadas para reducir el éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico al éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico, incluyen tanto cetorreductasas naturales como cetorreductasas no naturales generadas por la manipulación humana. Las cetorreductasas naturales y no naturales ejemplares y los poiinucleótidos que codifican las cetorreductasas, incluyen las que se describen en la presente. Las enzimas KRED naturales se pueden encontrar en una amplia gama de bacterias y levaduras. Se han reportado en la literatura varias secuencias de genes y enzimas KRED naturales, tales como Candida magnoliae (Genbank No. JC7338; Gl:11360538), Candida parapsilosis (Genbank No. BAA24528.1 ; Gl:2815409), Sporobolomyces salmicolor (Genbank No. AF160799; Gl 6539734). Secuencias de polinucleótido que codifican la cetorreductasa de Candida magnoliae son provistas como las SEQ ID Nos:1 (CR2-5), 3 (CR1 -2), 5 (CR1-3) y 7 (CR2-4). Las SEQ ID Nos: 1 (CR2-5), 5 (CR1-3) y 7 (CR2-4) son variantes que codifican la proteína de C. magnoliae (SEQ ID Nos: 2, 6 y 8). La SEQ ID NO: 3 (CR1-2) codifica una variante que difiere de la proteína de C. magnoliae en un cambio de aminoácido (SEQ ID NO: 4). Se ha reportado la reducción enzimática de ß-ceto-ésteres para una carbonil reductasa de Rhodococcus erythropolis (Peters, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1992) 38: 334-340; Zelinskí, J.

Biotechnol. (1994) 33:283-292), una aldehido reductasa de Sporoboromyces salmonicolor AKU 4429 (Shimizu, Biotechnol. Lett. (1990) 12:593-596; Appl. Environ. Microbio!. (1990) 56: 2374-2377). Para la reducción de 4-cloro-3-acetoaceíaío de etilo (ECAA) se han usado enzimas como las derivadas de S. cerevisiae (J. Org. Chem. (1991) 56: 4778; Biosci. Biotech. Biochem. (1994) 58 :2236), Sporobolomyces salmonicolor (Biochim. Biophys. Acta (1992) 1122: 57), Sporobolomyces sp. (Biosci. Biotech. Biochem. (1993) 57: 303; publicación de patente Japonesa JP2566960), Candida albicans (Biosci. Biotech. Biochem. (1993) 57: 303), Candida macedoniensis (Arch. Biochem. Biophys. (1992) 294-469), Geotrichium candidum (Enzyme Microbio!. Technol. (1992) 14: 731). La patente de E.U. No. 6,168,935 describe el uso de glicerol deshidrogenasa (Tetrahedron Lett. (1988) 29: 2453), alcohol deshidrogenasa (ADH) de Thermoanaerobium brockii (JACS (1985) 107: 4028), o Sulfolobus solfatarícus (Biotechnol. Lett. (1991) 13: 31) o Pseudomonas sp. (patente de E.U. No. 5,385,833; J. Org. Chem. (1992) 57: 1526). Las cetorreductasas no naturales adecuadas se pueden identificar fácilmente aplicando los métodos conocidos, que incluyen mutagénesis, evolución dirigida y similares, seguido por examen de la actividad usando el método descrito en el ejemplo 4. Por ejemplo, estos métodos se pueden aplicar fácilmente a cetorreductasas naturales que incluyen las que se describen en la presente. Se proveen aquí cetorreductasas no naturales ejemplares como las SEQ ID Nos: 40 (KRED krh133c), 42 (KRED krh215), 44 (KRED krh267), 46 (KRED krh287), 48 (KRED krh320), 50 (KRED krh326), 52 (KRED krh408), 54 (KRED krh417), 56 (KRED krh483), 58 (KRED krh476), 60 (KRED krh495), 114 (KRED S01040430), 116 (KRED S01091361), 118 (KRED S01091625) y 120 (KRED S01094648). Las secuencias de polinucleótido que las codifican se proveen en la presente como las SEQ ID Nos: 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 113, 115, 117 y 119, respectivamente. Cetorreductasas no naturales adicionales que son adecuadas para usar en la práctica de la presente invención, se proveen en la solicitud de patente titulada "Improved Ketoreductase Polypeptides and Related Polynucleotides" que corresponde al No. de Expediente del Abogado 0 90.110US/15077US01 , presentada el 11 de agosto de 2003, y la solicitud asignada de E.U. No. de serie 60/494,195, y en la solicitud de patente titulada "Improved Ketoreductase Polypeptides and Related Polynucleotides", que corresponde al No. de Expediente del Abogado 0190.210US/1577US02, incorporadas en la presente como referencia en su totalidad. Las cetorreductasas empleadas en la práctica de la presente invención exhiben normalmente una actividad de por lo menos aproximadamente 1 pmol/min/mg en la prueba descrita en el ejemplo 4, usando el substrato de éster o amida de ácido 4-haIo-3-cetobutírico de interés. Las cetorreductasas empleadas en la práctica de la presente invención pueden exhibir una actividad de por lo menos 1 mol/min/mg a cerca de 10 µ????/min/mg, y algunas veces por lo menos aproximadamente 102 pmol/min/mg, hasta aproximadamente 103 prnol/min/mg, o más alta.

Los esteres y amidas de ácido 4-halo-3-cetobutírico empleados en la práctica de la presente invención se pueden comprar o se pueden sintetizar usando los métodos conocidos. Los substratos de éster de ácido 4-halo-3-cetobutínco ejemplares incluyen los que tienen la estructura IV: en donde: X es un halógeno seleccionado del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; y R , R2, R3, R4 y R5 se seleccionan como se describe para la estructura 1A. Los ésteres de ácidos 4-halo-3-cetobutíricos específicos que se pueden emplear en la práctica de la presente invención, incluyen éster etílico del ácido 4-cloro-3-cetobutírico (esto es, en donde X es cloro, R1, R2, R3 y R4 son hidrógeno y R5 es etilo), éster metílico del ácido 4-cloro-3-cetobutírico (esto es, en donde X es cloro, R1, R2, R3 y R4 son hidrógeno y R5 es metilo), éster etílico del ácido 4-bromo-3-cetobutírico (esto es, en donde X es bromo, R , R2, R3 y R4 son hidrógeno y R5 es etilo), éster etílico del ácido 4-yodo-3-cetobutírico (esto es, en donde X es yodo, R1, R2, R3 y R4 son hidrógeno y R5 es etilo), éster metílico del ácido 4-bromo-3-cetobutírico (esto es, en donde X es bromo, R1, R2, R3 y R4 son hidrógeno y R5 es metilo), éster metílico del ácido 4-yodo-3-cetobutírico (esto es, en donde X es yodo, R1, R2, R3 y R4 son hidrógeno y R5 es metilo), éster t-butílico del ácido 4-cloro-3-cetobutírico (esto es, en donde X es cloro, R , R2, R3 y R4 son hidrógeno y R5 es t-butilo), éster t-butílico del ácido 4-bromo-3-cetobutírico (esto es, en donde X es bromo, R1 , R2, R3 y R4 son hidrógeno y R5 es t-butilo), y éster t-butílico del ácido 4-yodo- 3-cetobutírico (esto es, en donde X es yodo, R , R2, R3 y R4 son hidrógeno y R5 es t-butilo). En algunas modalidades, por lo menos uno de R1, R2, R3 y R4 es un alquilo inferior, tal como por ejemplo, metilo, etilo o propilo.

Cuando los substratos de éster de ácido 4-halo-3-cetobutírico que tienen la estructura del compuesto IV son reducidos durante la conversión catalizada por KRED de la presente invención, se generan ésteres de ácido 4- halo-3-hidroxibutírico que tienen la estructura V: V en donde X, R1, R¿, Ra, R4 y Rs son como se describe para la estructura IV.

Los ésteres o amidas de ácidos 4-halo-3-hidroxibutíricos producidos por el método de reducción catalizada por cetorreductasa de la presente invención, se pueden usar entonces fácilmente en las conversiones catalizadas halohidrina deshalogenasa de la presente invención. Por ejemplo, se pueden usar los ésteres de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico que corresponden a la estructura V, como substrato para la conversión por HHDH en presencia de cianuro, para generar ésteres de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico que tienen la estructura VI: VI en donde R1, R2, R3, R4 y R5 son como se describe para el compuesto V. El término "sistema de regeneración de cofactor" se refiere a aquí a un grupo de reactivos que participan en una reacción que reduce la forma oxidada del cofactor (por ejemplo, NADP a NADPH). Los cofactores oxidados por la reducción catalizada por cetorreductasa del éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico, son regenerados en forma reducida por el sistema de regeneración de cofactor. Los sistemas de regeneración de cofactor comprenden un reductor estequiométrico que es una fuente de equivalentes de hidrógeno reductor, y es capaz de reducir la forma oxidada del cofactor. El sistema de regeneración de cofactor puede comprender además un catalizador, por ejemplo un catalizador de enzima, que cataliza la reducción de la forma oxidada del cofactor por el reductor. Los sistemas de regeneración de cofactor para regenerar NADH o NADPH a partir de NAD o NADP, respectivamente, son conocidos, y se pueden usar en la presente invención.

Los sistemas de regeneración de cofactor adecuados empleados en la práctica de la presente invención, incluyen glucosa y glucosa deshidrogenasa, formiato y formiato deshidrogenasa, glucosa-6-fosfato y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, alcohol isopropílico y alcohol secundario deshidrogenasa, fosfito y fosfito deshidrogenasa, hidrógeno molecular e hidrogenasa, y similares, y se pueden usar en combinación con NADP/NADPH o NAD/NADH como el cofactor. También se puede usar como sistema de regeneración de cofactor la regeneración electroquímica usando hidrogenasa. Véase por ejemplo las patentes de E.U. Nos. 5,538,867 y 6,495,023, que se incorporan aquí como referencia. También son adecuados los sistemas de regeneración de cofactor que comprenden un catalizador de metal y un agente reductor (por ejemplo, hidrógeno molecular o formiato). Véase por ejemplo la publicación de PCT WO 2000053731 , que se incorpora en la presente como referencia. Los términos "glucosa deshidrogenasa" y "GDH" se usan aquí intercambiablemente para referirse a una enzima dependiente de NAD o NADP, que cataliza la conversión de D-glucosa y NAD o NADP en ácido glucónico y NADH o NADPH, respectivamente. La ecuación (5) describe la reducción de NAD o NADP catalizada por glucosa deshidrogenasa con glucosa. glucosa ÷ NAD(P)+ + H2Q ácido glucónico + NAD{P)H * H* ^ Las deshidrogenasas de glucosa que son adecuadas para usar en la práctica de la presente invención incluyen glucosa deshidrogenasas tanto naturales como no naturales. Se han reportado en la literatura genes que codifican glucosa deshidrogenasa natural. Por ejemplo, el gen GDH de Bacillus subtilis 61297 fue expresado en E. coli y se informó que exhibía las mismas propiedades fisicoquímicas que la enzima producida en su hospedero nativo (Vasantha y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1983) 80:785). La secuencia genética del gen GDH de B. subtilis, que corresponde a Genbank No. M12276, fue reportada por Lampel y otros (J. Bacteriol. (1986) 166:238-243), y en forma corregida por Yamane y otros (Microbiology (1996) 142:3047-3056) como Genbank No. D50453. Los genes GDH naturales también incluyen los que codifican la GDH de B. cereus ATCC 14579 (Nature (2003) 423;87-91; Genbank No. AE0 7013) y B. megaterium {Eur. J. Biochem. (1988) 174:485-490; Genbank No. X12370; J. Ferment. Bioeng. (1990) 70:363-369, Genbank No. GI216270). Aquí se provee glucosa deshidrogenasa de Bacillus sp, como las SEQ ID Nos: 10 y 12 (codificadas por las secuencias de polinucleótido que corresponden a las SEQ ID Nos: 9 y 1 1 , respectivamente). Las glucosa deshidrogenasas no naturales se pueden generar usando los métodos conocidos, tales como por ejemplo mutagénesis, evolución dirigida y similares. Las enzimas GDH que tienen actividad adecuada, ya sean naturales o no naturales, se pueden identificar fácilmente usando la prueba descrita en el ejemplo 4. Se proveen aquí halohidrina deshalogenasas no naturales ejemplares como SEQ ID Nos: 62 (GDH 2313), 64 (GDH 2331), 66 (GDH2279), 68 (GDH 2379), 122 (GDH S0 024744), 124 (GDH S01052992) y 126 (GDH S01063714). Las secuencias de polinucleótido que las codifican se proveen aquí como SEQ ID Nos: 61 , 63, 65, 67, 121 , 123, y 125, respectivamente. Glucosa deshidrogenasas no naturales adicionales que son adecuadas para usar en la práctica de la presente invención, se proveen en la solicitud de patente titulada "Improved Glucose Dehydrogenase Polypeptides and Related Polynucleotides" que corresponde al No. de Expediente del Abogado 0352.110US/15076US01, presentada el 11 de agosto de 2003, y la solicitud asignada de E.U. No. de serie 60/494,300, y en la solicitud de patente titulada "Improved Glucose Dehydrogenase Polypeptides and Related Polynucleotides", que corresponde al No. de Expediente del Abogado 0352.2 0US/15076US02, presentada el 18 de febrero de 2004, y la solicitud asignada de E.U. No. de Serie , incorporadas en la presente como referencia en su totalidad. Las glucosas deshidrogenasas empleadas en la práctica de la presente invención pueden exhibir una actividad de por lo menos aproximadamente 10 pmol/min/mg, y algunas veces por lo menos aproximadamente 102 pmol/min/mg, o aproximadamente 103 pmol/min/mg, hasta aproximadamente 104 mol/min/mg, o mayor, en la prueba descrita en el ejemplo 4. Cuando se emplean glucosa y glucosa deshidrogenasa como el sistema de regeneración de cofactor, conforme el éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico es reducido por la cetorreductasa y NADH o NADPH, el NAD o NADP resultante es reducido por la oxidación acoplada de glucosa a ácido glucónico con la glucosa deshidrogenasa. La reacción neta es. descrita por la ecuación (6), que es la suma de las ecuaciones (4) y (5): ? 9 KRED 0H X--^-^OR + alucosa -^ x^J^^OR ÷ ácido glucónico NAD(P)H (6) La reducción catalizada por cetorreductasa del éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico generalmente se efectúa en un solvente. El solvente puede ser un sistema cosolvente, tal como por ejemplo un sistema cosolvente acuoso. Los solventes adecuados (incluyendo los sistemas cosolventes) para efectuar esta conversión son los mismos que se describen arriba para la conversión catalizada por HHDH de ésteres y amidas de ácidos 4-halo-3-hidroxibutíricos, a ésteres y amidas de ácidos 4-ciano-3-hidroxibutíricos. El solvente acuoso (agua o sistema cosolvente acuoso) puede ser o no amortiguador de pH. La conversión del éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico en el éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico, se puede efectuar a un pH de aproximadamente de 5 o mayor. Generalmente la conversión se efectúa a un pH de aproximadamente 10 o menor, usualmente en la escala de aproximadamente 5 a aproximadamente 10. Normalmente, la conversión se efectúa a un pH de aproximadamente 9 o menor, mas usualmente en la escala de aproximadamente 5 a aproximadamente 9. De preferencia, la conversión se efectúa a un pH de aproximadamente de 8 o menor, usualmente en la escala de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, y muy de preferencia en la escala de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. De forma alternativa, la conversión se puede efectuar a un pH neutro, es decir, de aproximadamente 7. Cuando se emplea el sistema de regeneración de cofactor de glucosa /glucosa deshidrogenasa, la coproducción de ácido glucónico (pKa = 3.6), representada en la ecuación (6), ocasiona que el pH de la mezcla de reacción caiga si el ácido glucónico acuoso resultante no es neutralizado de alguna manera. El pH de la mezcla de reacción se puede mantener a un valor deseado mediante técnicas de amortiguamiento estándares, en donde el amortiguador neutraliza el ácido glucónico hasta la capacidad amortiguadora provista, o mediante la adición de una base, concurrente con el curso de la conversión. Los amortiguadores y procedimientos adecuados para amortiguamiento, y las bases y procedimientos adecuados para la adición de base durante la conversión, son los mismos descritos anteriormente para la conversión catalizada por HHDH de ásteres y amidas de 4-halo-3-hidroxibutirato en ásteres y amidas de 4-ciano-3-hidroxibutirato. En la reducción catalizada por cetorreductasa del éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico usando glucosa /glucosa deshidrogenasa como regeneración de cofactor, cuando el pH se mantiene por amortiguamiento o por adición de una base durante la conversión, el producto del proceso general es una sal de gluconato acuosa en lugar de ácido glucónico acuoso. Por ejemplo, la ecuación (7) representa el proceso general cuando se agrega hidróxido de sodio (Na+ + OH") durante la reacción para mantener el pH: ÷ glucosa + (Na*+ OH") X.JklX-OR + (Na++ gluconato ~) NAD(P)H ^ Cuando se emplea adición de base para neutralizar el ácido glucónico liberado durante la reducción catalizada por cetorreductasa de un éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico, usando el sistema de regeneración de cofactor de glucosa /glucosa deshidrogenasa, el avance de la conversión se puede monitorear por la cantidad de base agregada para mantener el pH. Normalmente las bases agregadas a las mezclas de reacción no amortiguadoras o parcialmente amortiguadoras durante la conversión, se agregan en soluciones acuosas. Los términos "formiato deshidrogenasa" y "FDH" se usan aquí intercambiablemente para referirse a una enzima dependiente de NAD o NADP que cataliza la conversión de formiato y NAD o NADP en dióxido de carbono y NADH o NADPH, respectivamente. Las formiato deshidrogenasas que son adecuadas para usar en la práctica de la presente invención, incluyen formiato deshidrogenasas naturales y también formiato deshidrogenasas no naturales. Las formiato deshidrogenasas incluyen las que corresponden a las SEQ ID Nos: 70 (Pseudomonas sp.) y 72 (Candida boidinii), que son codificadas por las secuencias de polinucleotido que corresponden a las SEQ ID Nos: 69 y 71 , respectivamente. Las formiato deshidrogenasas empleadas en la práctica de la presente invención, ya sean naturales o no naturales, pueden exhibir una actividad de por lo menos aproximadamente 1 µ????/min/mg, algunas veces por lo menos aproximadamente 10 µ????/min/mg, o por lo menos aproximadamente 102 mol/min/mg, hasta aproximadamente 103 pmol/min/mg, o mayor, y se pueden examinar fácilmente para determinar su actividad en la prueba descrita en el ejemplo 4. Como se usa aquí, el término "formiato" se refiere al anión formiato (HC02"), ácido fórmico (HC02H), y mezclas de los mismos. El formiato se puede proveer en forma de una sal, normalmente una sal de álcali o de amonio (por ejemplo, HC02Na, KHC02NH4) y similares), en forma de ácido fórmico, normalmente ácido fórmico acuoso, o mezclas de los mismos. El ácido fórmico es un ácido moderado. En soluciones acuosas, en varias unidades de pH de su pKa (pKa =3.7 en agua), el formiato está presente como HC02" y como HC02H en concentraciones en equilibrio. A valores de pH por arriba de 4 aproximadamente, el formiato está presente predominantemente como HC02". Cuando el formiato es provisto como ácido fórmico, normalmente la mezcla de reacción se hace amortiguadora o se hace menos ácida agregando una base para proveer el pH deseado, normalmente cerca de 5 o mayor. Las bases adecuadas para neutralizar el ácido fórmico son las que se describe arriba para la neutralización de ácido cianhídrico. Para valores de pH por arriba de 5 aproximadamente, a los cuales el formiato está presente predominantemente como HC02", la ecuación (8) describe la reducción catalizada por formiato deshidrogenasa de NAD o NADP con formiato.

HC02- + NAD(P)+ —???-·? C02 + NADP(H} Cuando se emplea formiato y formiato deshidrogenasa como el sistema de regeneración de cofactor, conforme el éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico es reducido por la cetorreductasa y NADH o NADPH, el NAD o NADP resultante es reducido por la oxidación acoplada de formiato a dióxido de carbono con la formiato deshidrogenasa. La reacción neta es descrita por la ecuación (9), que es la suma de las ecuaciones (4) y (8): AnR +. HCO2- + H+ NAD{P)H (9) La ecuación (9) muestra que cuando se emplea el sistema de regeneración de cofactor de formiato /formiato deshidrogenasa para la reducción del éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico en solución acuosa con un pH por arriba de 5 aproximadamente, los protones en la solución son consumidos y la reacción ocasiona que el pH de la mezcla de reacción se eleve si no es amortiguado o reacidificado de alguna manera. El pH de la mezcla de reacción se puede mantener en el valor deseado mediante técnicas de amortiguamiento estándares, en donde el amortiguador libera protones hasta la capacidad amortiguadora provista, o mediante la adición de un ácido concurrente con el curso de la conversión. Los ácidos adecuados para agregar durante la reacción para mantener el pH, incluyen ácidos orgánicos, por ejemplo ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos, ácidos fosfóricos y similares; ácidos minerales, por ejemplo ácidos halohídricos (tales como ácido clorhídrico), ácido sulfúrico, ácido fosfórico, y similares; sales ácidas, por ejemplo sales de fosfato diácido (por ejemplo, KH2P04), sales de bisulfato (por ejemplo, NaHS04) y similares. Se prefiere particularmente el ácido fórmico, con lo cual se mantiene tanto la concentración de formiato como el pH de la solución. Por ejemplo, la ecuación (10) representa el proceso general cuando se agrega ácido fórmico (HC02H) durante la reacción para mantener un pH inicial por arriba de 5 aproximadamente. Aunque el formiato está presente predominantemente como HCO2" en la mezcla de reacción, la concentración de HCO2" es mantenida mientras que la conversión en forma neta consume el ácido fórmico agregado. x ÍOR .

Cuando se emplea la adición de ácido para mantener el pH durante la reducción catalizada por cetorreductasa de un éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico, usando el sistema de regeneración de cofactor de formiato /formiato deshidrogenasa, el avance de la conversión se puede monitorear por la cantidad de ácido agregada para mantener el pH. Normalmente, los ácidos agregados durante la conversión a las mezclas de reacción no amortiguadoras o parcialmente amortiguadoras, se agregan en soluciones acuosas. Para realizar los métodos de la presente invención se puede proveer inicialmente la forma oxidada o reducida del cofactor. Como se describió arriba, el sistema de regeneración de cofactor convierte el cofactor oxidado a su forma reducida, que es utilizada entonces en la reducción del substrato de cetorreductasa (esto es, el éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico) a la halohidrina correspondiente. Como con las halohidrina deshalogenasas, la cetorreductasa y las enzimas del sistema de regeneración de cofactor se pueden proveer a la mezcla de reacción de conversión del éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico, en forma de enzima purificada, extracto celular, Osado celular, o células completas transformadas con uno o más genes que codifican la cetorreductasa y las enzimas del sistema de regeneración de cofactor. Los genes que codifican las enzimas pueden ser transformados en células hospederas, separadamente o juntos en la misma célula hospedera. Por ejemplo, en una modalidad, un grupo de células hospederas puede ser transformado con genes que codifican cetorreductasa, y otro grupo puede ser transformado con genes que codifican la enzima del sistema de regeneración de cofactor (por ejemplo, GDH, FDH, y similares). Ambos grupos de células transformadas pueden ser utilizadas juntas en la mezcla de reacción en forma de células completas o lisados celulares o extractos celulares derivados de los mismos. Alternativamente, una célula hospedera puede ser transformada con genes que codifican tanto la cetorreductasa como una enzima del sistema de regeneración de cofactor, de tal manera que cada célula exprese tanto la cetorreductasa como la enzima del sistema de regeneración de cofactor. En una modalidad adicional, la célula hospedera puede ser transformada con genes que codifican cetorreductasa, una enzima del sistema de regeneración de cofactor, y una halohidrina deshalogenasa. Estas células pueden ser utilizadas en los métodos de la presente invención para proveer las enzimas en forma de células completas, lisado celular o extracto celular. Como se describe para la mezcla de reacción del método con catálisis de HHDH, los reactivos sólidos (esto es, enzimas, sales, sistema de regeneración de cofactor, cofactor, y similares) pueden ser provistos en una variedad de formas, que incluyen polvo (por ejemplo, liofilizado, secado por aspersión y similares), solución, emulsión, suspensión y similares. Las cantidades de reactivos usadas en el paso de reducción generalmente varían dependiendo de las cantidades deseadas de éster o amida de ácido 4~halo-3-hidroxibutírico, y concomitantemente la cantidad de substrato de cetorreductasa empleado. La siguiente guía se puede usar para determinar las cantidades a usar de cetorreductasa, cofactor y sistema de regeneración de cofactor. Generalmente, los ésteres y amidas de ácidos 4-halo-3-cetobutírico se emplean a una concentración de aproximadamente 10 a 500 gramos/litro, usando aproximadamente de 10 mg a 5 g de cetorreductasa y aproximadamente de 25 mg a 5 g de cofactor. Los expertos en la materia entenderán fácilmente como variar estas cantidades para ajustarías al grado deseado de productividad y escala de producción. Las cantidades apropiadas de sistema de regeneración de cofactor pueden ser determinadas fácilmente por experimentación de rutina, en base a la cantidad utilizada de cofactor o cetorreductasa. En general, el reductor (por ejemplo, glucosa, formiato) se utiliza en cantidades por arriba de la equimolar del substrato de cetorreductasa, para obtener una conversión esencialmente completa o casi completa del substrato de cetorreductasa. El orden de adición no es critico. Los reactivos se pueden agregar juntos al mismo tiempo a un solvente (por ejemplo un solvente monofásico, un sistema cosolvente acuoso bifásico, y similares), o alternativamente, algunos de los reactivos se pueden agregar separadamente, y algunos juntos en diferentes puntos de tiempo. Por ejemplo, se pueden agregar primero al solvente, el sistema de regeneración de cofactor, el cofactor, la cetorreductasa y el substrato de cetorreductasa. Para mejorar la eficiencia del mezclado cuando se usa un sistema cosolvente acuoso, usualmente primero se agregan y mezclan en la fase acuosa el sistema de regeneración de cofactor, la cetorreductasa y el cofactor. Entonces se puede añadir y mezclar la fase orgánica, seguido por la adición del substrato de cetorreductasa. Alternativamente, el substrato de cetorreductasa se puede premezclar en la fase orgánica entes de la adición a la fase acuosa. En cuanto a la conversión de ésteres y amidas de ácidos 4-halo-3-hidroxibutíricos catalizada por halohidrina deshalogenasa, las condiciones adecuadas para efectuar la reducción catalizada por cetorreductasa de los ésteres y amidas de ácidos 4-halo-3-cetobutíricos de la presente invención, incluyen una amplia variedad de condiciones que pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en la materia. Las temperaturas adecuadas para efectuar el paso de reducción catalizada por cetorreductasa están normalmente en la escala de 15 °C a 75 °C, aproximadamente. Usualmente, las reacciones se efectúan a una temperatura en la escala de 20 °C a 55 °C, aproximadamente, y de preferencia de 20 °C a 45 °C, aproximadamente. La reacción también se puede efectuar a condiciones ambientales. Como en la reacción catalizada por halohidrina deshalogenasa, la reacción catalizada por cetorreductasa se deja proceder hasta observar la conversión casi completa o esencialmente completa del substrato usando los métodos conocidos. Como en la reacción catalizada por halohidrina deshalogenasa, el avance de la reacción catalizada por cetorreductasa se puede monitorear por la cantidad de base o ácido agregado para contrarrestar el cambio de pH que de otra manera puede ocurrir con el sistema de regeneración de cofactor particular usado, como se describe arriba. La reducción catalizada por cetorreductasa del éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico genera un carbón estereogénico nuevo en la posición 3 del producto éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico. Normalmente, el éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico es generado con una estereoselectividad en la posición 3 relativamente alta. De esta manera, los ásteres y amidas de ácidos 4-halo-3-hidroxibutíricos generados por la reducción catalizada por cetorreductasa de ésteres y amidas de ácidos 4-halo-3-cetobutíricos, normalmente son quirales y no racémicos. Las reacciones de cetorreductasa usadas en la presente invención normalmente generan los ésteres preferidos no racémicos quirales de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico que tienen un e.e. de por lo menos aproximadamente 90%, usualmente de por lo menos aproximadamente 95%, y normalmente de por lo menos aproximadamente 99%. Los ejemplos ¡lustran modalidades que proveen (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo con más de 99% de e.e. Como se usa aquí, el término "exceso enantiomérico" o "e.e.", se refiere a la diferencia absoluta entre las fracciones molares o de peso de los enantiómeros mayor (F(+)) y menor (F(.)) (esto es, |F(+) - F(.)|), en donde F(+) + F(.) = 1. El porcentaje de e.e. es 100 X |F(+) - F(.)|. La composición enantiomérica se puede caracterizar fácilmente usando el método de cromatografía de gases descrito más abajo en el ejemplo 6, y usando métodos que son conocidos. Como se describe arriba, cuando estos ésteres o amidas de ácidos 4-halo-3-h¡drox¡butír¡cos no racémicos quirales se usan como substratos en las reacciones catalizadas por halohidrina deshalogenasa de la presente invención, los ésteres o amidas de ácidos 4-hidroxibutíricos 4-sustituidos resultantes son sustancial e igualmente no racémicos, con poca o ninguna pérdida de pureza estereoquímica. La combinación de alta estereoselectividad de la producción catalizada por cetorreductasa de los ésteres y amidas de ácidos 4-halo-3-hidroxibutíricos no racémicos, y la alta fidelidad estereoquímica de la conversión catalizada por halohidrina deshalogenasa de ellos, en los ésteres o amidas de ácidos 4-ciano-3-hidroxibutíricos no racémicos correspondientes, proveen un procedimiento de la invención particularmente atractivo en la producción general de ésteres o amidas de ácidos 4-ciano-3-hidroxibutíricos no racémicos de alto e.e., a partir de ésteres o amidas de ácidos 4-halo-3-cetobutíricos. Una característica significativa adicional de la presente invención es que el rendimiento de los productos quirales generados es muy alto. Normalmente, los rendimientos de éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico y productos de éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, generados de acuerdo con los métodos de la presente invención, son de por lo menos aproximadamente 70%, usualmente por lo menos aproximadamente 80%, normalmente por lo menos aproximadamente 90%, y pueden ser de por lo menos aproximadamente 95%. El cálculo del rendimiento de producto se basa en la cantidad inicial de substrato provista y la cantidad de producto formado en la mezcla de reacción. El éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico producto se puede purificar opcionalmente antes de ponerlo en contacto con la halohidrina deshalogenasa. Como se usa aquí, el término "purificado" se refiere a un procedimiento en el que se aplica un proceso de separación a una mezcla, produciendo aumento de la concentración de un componente con respecto a los otros componentes de la mezcla. Los procedimientos de purificación adecuados empleados en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, filtración, extracción en fase sólida o líquida, destilación, y similares. Si el éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico se purifica de la mezcla de reacción de cetorreductasa, se agrega subsiguientemente a un solvente (por ejemplo un solvente monofásico, un sistema cosolvente acuoso bifásico) con la halohidrina deshalogenasa y el nucieófilo.

III. Conversión enzimática de éster/arnida de ácido 4-halo-3-cetobutíríco en éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucieófilo en la posición 4, en un solo recipiente de reacción La presente invención provee un método para convertir esteres y amidas de ácidos 4-halo-3-hidroxibutíricos en los esteres y amidas correspondientes de ácidos 3-hidroxibutíricos sustituidos con nucieófilo en la posición 4, el método comprendiendo poner en contacto el éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico con una cetorreductasa, un cofactor, un sistema de regeneración de cofactor, un nucieófilo y una halohidrina deshalogenasa, para formar una mezcla de reacción para convertir el éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico en un éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido en la posición 4. Mecanísticamente, este método de un solo recipiente procede mediante la conversión catalizada por cetorreductasa del éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico para proveer el éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico in situ, y la consecuente conversión catalizada por halohidrina deshalogenasa del éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico en el éster o amida correspondiente de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucieófilo en la posición 4. Significativamente, el éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico producido por la reacción catalizada por cetorreductasa, no se separa ni recupera antes de ponerlo en contacto con la halohidrina deshalogenasa y el nucleófilo (por ejemplo cianuro y similares) para su conversión en éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4. Los reactivos adecuados (substratos, enzimas, cofactores), solventes, pH, temperatura y otras condiciones de reacción y procedimientos, para la conversión en un solo recipiente del éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico en éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4, son los mismos descritos arriba para efectuar la conversión catalizada por halohidrina deshalogenasa de ésteres y amidas de ácidos 4-halo-3-hidroxibutíricos en los ésteres y amidas correspondientes de ácidos 3-hidroxibutíricos sustituidos con nucleófilo en la posición 4. Cuando se usa glucosa y glucosa deshidrogenasa como el sistema de regeneración de cofactor, y se agregan dos equivalentes de base durante la reacción para neutralizar tanto el ácido glucónico como el ácido halohídrico producidos y mantener el pH inicial de la mezcla de reacción (para pH's iniciales en la escala de 5 a 9, aproximadamente), el proceso general en una reacción en un solo recipiente es descrito por la ecuación (11), que es la suma de las ecuaciones (2) y (7), en donde se ilustra como base hidróxido de sodio acuoso. (11) Pueden resultar otras ecuaciones de proceso general de un recipiente, de la suma de ecuaciones que describen otras opciones para realizar la reacción catalizada por halohidrina deshalogenasa (por ejemplo usando una sal de cianuro como la base), o la reacción de cetorred uctasa (por ejemplo usando formiato y formiato deshidrogenasa como sistema de regeneración de cof actor), como se describe arriba para las reacciones realizadas separadamente. También se entenderá que se puede obtener el mismo resultado de un solo recipiente realizando primero la reacción de cetorreductasa separadamente como se describe arriba, y después agregando halohidrina deshalogenasa y cianuro a la mezcla de reacción de cetorreductasa, y realizando la reacción de halohidrina deshalogenasa en presencia de los componentes de reacción de cetorreductasa. En el ejemplo 24 se ¡lustra una modalidad de un proceso de un solo recipiente para convertir un éster de ácido 4-halo-3-cetobutírico en un éster de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico.

IV. Conversión catalizada por halohidrina deshalogenasa de ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales, en ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con ciano e hidroxi vecinales Además de los substratos de éster de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico, se ha descubierto que se pueden usar halohidrina deshalogenasas para catalizar la conversión de otros substratos de éster de ácido carboxilico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en sus ésteres correspondientes de ácido carboxilico sustituido con ciano e hidroxi vecinales, usando las mismas condiciones descritas en la parte I. De esta manera, la presente invención también provee un método de producción de un éster de ácido carboxilico sustituido con ciano e hidroxi vecinales a partir de un éster de ácido carboxilico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, el método comprendiendo: (a) proveer un éster de ácido carboxilico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en donde el sustituyente halógeno se selecciona del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; y (b) poner en contacto el éster de ácido carboxilico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, con una halohidrina deshalogenasa y cianuro, bajo condiciones adecuadas para formar una mezcla de reacción para convertir el éster de ácido carboxilico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en un éster de ácido carboxilico sustituido con ciano e hidroxi vecinales. Como se usa aquí, el término "sustituido con halógeno e hidroxi vecinales" se refiere a sustituciones de los grupos halógeno e hidroxilo en carbonos adyacentes. El término "sustituido con ciano e hidroxi vecinales" se usa aquí para referirse a sustituciones de los grupos ciano (C=N) e hidroxilo en carbonos adyacentes. Los ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxilo vecinales que son adecuados para usar en la práctica de la presente invención, incluyen los que no son éster de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico. Concomitantemente, el producto de éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e idroxi vecinales, generado por estos métodos, incluye los que no son éster de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico. Los substratos de éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales preferidos de la presente invención, son quirales, siendo estereogénicos en el carbono sustituido con hidroxi, y pueden ser racémicos o no racémicos. En estas modalidades, algunas enzimas halohidrina deshalogenasas usadas en el proceso de la presente invención, convierten el substrato quiral de éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxilo vecinales, en el éster correspondiente de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales, con retención de la estereoquímica absoluta en el carbono estereogénico sustituido con hidroxi. Los substratos no racémicos de éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, se pueden convertir en productos de éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales, sustancial e igualmente no racémicos, con poca o ninguna pérdida de la pureza estereoquímica. Los ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales que son adecuados en la práctica de la presente invención, incluyen los que tienen la estructura VII, que proveen ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con ciano e hidroxi vecinales que tienen la estructura correspondiente VIH. en donde: X, R , R2, R5 y R6 son como se define para la estructura IA, y n es cero o de 1 a 9, inclusive, y cada Mn se selecciona independientemente de -C(=0)- (esto es, carbonilo) o -CRn R" , en donde Rn' y Rn' se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, flúor, un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilo sustituido opcionalmente, un alquenilo inferior sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente, un arilalquilo sustituido opcionalmente, amino, un alquilamino inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilamino sustituido opcionalmente, un alcoxi inferior sustituido opcionalmente, un cicloalcoxi sustituido opcionalmente, un ariloxi sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente, hidroxilo, nitro, amino, ciano, carboxi (esto es, un grupo carboxilato o ácido carboxílico), carboalcoxi (esto es, un grupo éster), carbamida (esto es, un grupo amido) y acilo (esto es, que forma una cetona). Los ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales adecuados tienen la estructura VII con n=1, e incluyen los ésteres de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico previamente descritos. Otros ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales adecuados, tienen la estructura Vil en donde n=0, teniendo así la estructura IX, que proveen ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con ciano e hidroxi vecinales que tienen la estructura correspondiente X. en donde: X, R1, R2, R5 y R6 son como se define para la estructura VII. Los ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales adecuados, que tienen la estructura IX, incluyen los ésteres de ácidos 4-halo-2-hidroxipropiónicos. Con respecto a las estructuras VII y IX, X es normalmente cloro o bromo, de preferencia cloro. Con respecto a las estructuras VII a X, R1, R2, R5 y R6 son de preferencia, cada uno independientemente, hidrógeno o alquilo inferior. Otros ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales adecuados tienen la estructura VII, en donde n es de 2 a 9, inclusive. Normalmente, n es de 2 a 8, inclusive, más normalmente de 2 a 7, inclusive, usualmente de 2 a 6, inclusive. Los ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales adecuados que tienen n=2, incluyen los ésteres de ácidos 5-halo-4-hidroxipentanoicos. Los ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales adecuados que tienen n=3, incluyen los ésteres de ácidos 6-halo-5-hidroxihexanoicos. Los ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales adecuados que tienen n=4, incluyen los ésteres de ácidos 7-halo-6-hidroxiheptanoicos. Los ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales adecuados que tienen n=5, incluyen los ésteres de ácidos 8-ha!o-7-hidroxioctanoicos. Los ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales adecuados que tienen n=6, incluyen los ésteres de ácidos 9-halo-8-hidroxinonanoicos. Los ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales adecuados que tienen n=8, incluyen los ésteres de ácidos -halo-10-hidroxiundecanoicos. Los ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales adecuados que tienen n=9, incluyen los ésteres de ácidos 12-halo-11-hidroxidodecanoicos. Los ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno e hidroxi vecinales preferidos, son los ésteres de ácidos 6-haIo-5-hidroxi-3-oxohexanoicos que tienen la estructura XI, y los ésteres de ácidos 6-halo-3,5-dihidroxi-hexanoicos que tienen la estructura XIII, que proveen ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con ciano e hidroxi vecinales que tienen las estructuras XII y XIV, respectivamente. en donde, para XI, XII, XIII y XIV: X, R , R2, R5 y R6 son como se define para la estructura Vil. R1 , R1", R2 , R2", R3' y R3" son como se define para Rn' y Rn" en la estructura VII. Preferiblemente, R\ R2, R6, R1', R ", R2", R3' y R3" son, cada uno independientemente, hidrógeno o alquilo inferior. Normalmente, X es cloro o bromo. Los ésteres de ácidos 6-halo-5-h¡droxi-hexanoicos preferidos de la estructura XI o XIII, tienen X = Cl. Los ésteres de ácido 6-halo-5-hidrox¡-3-oxohexanoicos de la estructura XI que se pueden emplear en la práctica de la presente invención, incluyen el éster t-butílico del ácido 6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoico (esto es, en donde X es cloro, R1, R2, R6, R1', R1", R2", R3' y R3" son hidrógeno y R5 es t-butilo) y éster t-butílico del ácido 6-bromo-5-hidroxi-3-oxohexanoico (esto es, en donde X es bromo, R1, R2, R6, R1', R1", R2", R3' y R3" son hidrógeno y R5 es t-butilo). Cuando se emplean en el método de la presente invención, estos substratos producen el producto correspondiente sustituido con ciano e hidroxilo vecinales, que tiene la estructura XII, en donde R , R2, R6, R1', R1", R2", R3' y R3" son hidrógeno y R5 es t-butilo. Los ésteres de ácidos 6-ha!o-3,5-dihidrox¡hexanoicos específicos que tienen la estructura XIII, que se pueden emplear en la práctica de la presente invención, incluyen el éster t-butílico del ácido 6-cloro-3,5-dihidroxi-hexanoico (esto es, en donde X es cloro, R1, R2, R6, R1', R1", R2", R3' y R3" son hidrógeno y R5 es t-butilo) y el éster t-butílico del ácido 6-bromo-3,5-dihidroxihexanoico (esto es, en donde X es bromo, R1, R2, R6, R1', R ", R2 ", R3' y R3 son hidrógeno y R5 es t-butilo). Cuando se emplean en el método de la presente invención, estos substratos de éster de ácido 6-halo-3,5-dihidroxihexanoico producen un producto sustituido con ciano e hidroxilo vecinales, que tiene la estructura XIV, en donde R , R2, R6, R1', R1 ', R2", R3' y R3" son hidrógeno y R5 es t-butilo. Las halohidrina deshalogenasas adecuadas para catalizar la conversión de substrato de éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en producto de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxilo vecinales, incluyen halohidrina deshalogenasas tanto naturales como no naturales, como se describió anteriormente en la parte I. Las halohidrina deshalogenasas se pueden identificar fácilmente usando la prueba descrita en el ejemplo 4 (parte (3)) y sustituyendo con (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo el substrato de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxilo vecinales de interés. Las condiciones que son adecuadas para formar una mezcla de reacción para convertir el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en un éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales, son las mismas descritas para convertir ésteres de ácidos 4-halo-3-hidroxibutíricos en sus correspondientes ésteres de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico (véase la parte I anterior), por ejemplo fuentes de cianuro, métodos para controlar el pH, temperaturas, solventes y sistemas cosolventes, y similares. En los ejemplos 32-41 más abajo se proveen métodos ejemplares para convertir ésteres de ácidos 6-haIo-5-hidroxi-3-oxohexanoicos (estructura XI) y ésteres de ácidos 6-halo-3,5-dihidroxihexanoicos (estructura XIII), en sus correspondientes ésteres de ácidos carboxílicos sustituidos con ciano e hidroxi vecinales (esto es, las estructuras XII y XIV, respectivamente).

V. Composiciones La presente invención también provee composiciones que son útiles para la conversión enzimática de éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico en éster o amida de ácido 3-hidroxibutírico sustituido con nucleófilo en la posición 4. Estas composiciones comprenden una halohidrina deshalogenasa, un éster o amida de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico, y un nucleófilo. En una composición preferida, el nucleófilo es cianuro. En una modalidad adicional, la presente invención provee composiciones útiles para preparar ésteres y amidas de ácidos 3- hidroxibutíricos sustituidos con nucleófilo en la posición 4 que tienen una cetorreductasa, un sistema de regeneración de cofactor, un cofactor y una halohidrina deshalogenasa. Estas composiciones pueden incluir también un éster o amida de ácido 4-halo-3-cetobutírico. En estas composiciones se puede emplear cualquiera de las cetorreductasas, componentes de un sistema de regeneración de cofactor, cofactores, halohidrina deshalogenasas, ésteres o amidas de ácido 4-halo-3-cetobutírico, ésteres o amidas de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico y nucleofilos previamente descritos. La presente invención también provee composiciones que son útiles para efectuar la conversión de un éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales en un éster o amida de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales. Estas composiciones comprenden una halohidrina deshalogenasa, un cianuro, y un éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxilo vecinales. Las composiciones de la presente invención pueden estar en forma sólida (por ejemplo un polvo) o líquida (por ejemplo solución, emulsión, suspensión y similares). Por ejemplo, la composición puede estar en forma de un polvo liofilizado o secado por aspersión. Alternativamente, la composición también puede comprender un solvente. Las composiciones pueden incluir, además, componentes para el control del pH o para hacerlas procesables, que incluyen por ejemplo una sal, un ácido, una base, un amortiguador, un agente solubilizante, etc.

VI. Halohidrina deshalogenasas, cetorreductasas v enzimas del sistema de regeneración de cofactor, y sus polinucleótidos correspondientes Además de las enzimas y polinucleótidos específicos que se describen en la presente, los expertos en la materia reconocerán que se pueden aplicar fácilmente técnicas conocidas para descubrir polinucleótidos, tanto naturales como no naturales, que codifiquen enzimas adecuadas para usar en la práctica de la presente invención. Véase, por ejemplo, Ling y otros, "Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal. Biochem., 254 (2): 157-78 (1997); Dale y otros, "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method", Methods Mol. Biol., 57: 369-74(1996); Smith, "In vitro mutagenesis", Ann. Rev. Genel, 19: 423-462 (1985); Botstein y otros, "Strategies and applications of in vitro mutagenesis", Science, 229: 1193-1201 (1985); Cárter, "Site-directed mutagenesis", Biochem. J., 237: 1-7 (1986); Kramer y otros, "Point Mismatc Repair", Cell, 38 :879-887 (1984); Wells y otros, "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of múltiple mutations at defined sites", Gene, 34: 315-323 (1985); Minshull y otros, "Protein evolution by molecular breeding", Current Opinión in Chemical Biology, 3: 284-290 (1999); Christians y otros, "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorilation using DNA family shuffiing", Nature Biotechnology, 17: 259-264 (1999); Crameri y otros, "DNA shuffiing of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution", Nature, 391 : 288-291 ; Crameri y otros, "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffiing", Nature Biotechnology, 15: 436-438 (1997); Zhang y otros, "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening", Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 94: 45-4-4509; Crameri y otros, "Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling", Nature Biotechnology, 14: 315-319 (1996); Stemmer, "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling", Nature, 370: 389-391 (1994); Stemmer, "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution", Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 91 :10747-10751 (1994); WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651 ; y WO 01/75767. Estos y otros métodos conocidos se pueden aplicar fácilmente, por ejemplo junto con la prueba que se describe en la presente, para identificar otras cetorreductasas, halohidrina deshalogenasas y enzimas del sistema de regeneración de cofactor, que tengan las actividades aquí descritas, así como otras propiedades deseables, por ejemplo temperatura alterada o pH óptimo, resistencia a solvente y similares. Por ejemplo, una cetorreductasa se puede mutar o evolucionar para generar colecciones que se puedan examinar para identificar una cetorreductasa que tenga preferencia por un tipo de cofactor sobre otro, por ejemplo, NAD sobre NADP o viceversa. Se puede optimizar el codón de las secuencias de ácido polinucleico que codifican las enzimas empleadas en la presente invención, para optimizar la expresión del organismo hospedero seleccionado. Los expertos en la materia reconocerán que están fácilmente disponibles tablas y otras referencias que proveen información de preferencia de codón para una amplia gama de organismos. Véase, por ejemplo, Henaut y Danchin, "Escherichia coli and Salmonella", Neidhardt y otros, eds., ASM Press, Washington, D. C. (1996) p. 2047-2066. Las enzimas empleadas en la práctica de la presente invención se pueden producir transformando un vector que contenga un polinucleótido que codifica haloh^idrina deshalogenasa, cetorreductasa o una enzima del sistema de regeneración de cofactor, en una célula hospedera, usando técnicas de biología molecular muy conocidas. Véase, por ejemplo, Berger y Kimmel, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Methods in Enzymology, Volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, California; Sambrook y otros, "Molecular Cloning- A Laboratory Manual", 2a. ed., Vol. -3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989; y "Current Protocols in Molecular Biology", F.M. Ausubel y otros, eds., "Current Protocols", una operación arriesgada entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. (complementada hasta 1999). En los ejemplos 1 y 2 se ilustran métodos para preparar las enzimas. Los aspectos anteriores de la invención y otros más se pueden entender mejor con respecto a los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación de construcciones de expresión para halohidrina deshaloqenasa, cetorreductasa y glucosa deshidrogenasa (1) Halohidrina deshaloqenasa (HHDH) El codón del gen de halohidrina deshalogenasa se optimizó para su expresión en E. coli en base a la secuencia de aminoácidos de la halohidrina deshalogenasa de Agrobacterium sp. El gen se sintetizó usando oligómeros de 60 monómeros y se clonó en el vector de expresión pCK1 0700 (representado en la figura 2) bajo el control de un promotor T5. Los vectores se transformaron en E. coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, California) de la cual se preparó ADN plasmídico usando métodos estándares. Después, el ADN plasmídico se transformó en E. coli BL21 (Stratagene, La Jolla, California), el hospedero de expresión, usando métodos estándares. Se encontraron varias clonas en la colección de expresión que expresaron la HHDH activa. Se determinaron las secuencias de los genes de estas clonas (véanse las SEQ ID Nos: 13 (HHDH.1), 15 (HHDH.2) y 17 (HHDH.16), que codifican las secuencias de polipéptido SEQ ID Nos. 14, 16, y 18, respectivamente). (2) Cetorreductasa (KRED) El codón del gen de cetorreductasa se optimizó para su expresión en E. coli en base a la secuencia de aminoácidos de la cetorreductasa de Candida magnoíiae. El gen se sintetizó usando oligómeros de 60 monómeros y se clonó en los sitios de clonación Sfi\ del vector de expresión pCK110900 (representado en la figura 3), bajo el control de un promotor lac y un gen represor lacl. El vector de expresión contiene el origen de duplicación p15A y el gen de resistencia al cloranfenico!. Los plásmidos se transformaron en un hospedero de expresión E. coli usando métodos estándares. Se encontraron varias clonas que expresaron la cetorreductasa activa y se determinó la secuencia de sus genes para confirmar las secuencias de ADN (véanse las SEQ ID Nos: 1 (cetorreductasa 1), 3 (cetorreductasa 2), 5 (cetorreductasa 3) y 7 (cetorreductasa 4), que codifican las secuencias de polipéptido SEQ ID Nos. 2, 4, 6 y 8, respectivamente). (3) Glucosa deshidrogenasa (GDH) Los genes de glucosa deshidrogenasa se amplificaron usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) de preparaciones de ADN genómico de Bacillus subtilis y Bacillus megaterium. Los iniciadores de las reacciones de amplificación se diseñaron usando las secuencias publicadas del gen de glucosa deshidrogenasa de B. subtilis y B. megaterim, y fueron los siguientes: Iniciador delantero de B. subtilis (SEQ ID NO: 19): 5'-GAATTCGCCCATATGTATCCGGATTTAAAAGG-3' Iniciador inverso de B. subtiüs (SEQ ID NO: 20): 5'-TGGCCGGATCCTCATTAACCGCGGCCTGCCTGGA-3' Iniciador delantero de B. megateríum (SEQ ID NO: 21): 5'-GAATTCGCCCATATGTATAAAGATTTAGAAGG-3' Iniciador inverso de B. megateríum (SEQ ID NO: 22): 5'-GGCCGGATCCTCATTATCCGCGTCCTGCTTGGA-3' Los productos de PCR se clonaron en los sitios de clonación Sf/'l de! vector de expresión pCK1 10900 (representado en la figura 3), bajo el control de un promotor lac y el gen represor lacl. El vector de expresión contiene el origen de duplicación p15A y el gen de resistencia al cloranfenicol. Los plásmidos se transformaron en un hospedero de expresión E.coli usando métodos estándares. Se encontraron varias clonas que expresan la GDH activa y se determinó la secuencia de los genes para confirmar las secuencias (véanse las SEQ ID Nos: 9 (glucosa deshidrogenasa S06-3) y 11. (glucosa deshidrogenasa 02-6), que codifican las secuencias de polipéptido SEQ ID Nos. 10 y 12, respectivamente). (4) Formiato deshidrogenasa (FDH) El codón de los genes de formiato deshidrogenasa se optimizó para su expresión en E. coli en base a las secuencias de aminoácidos de la formiato deshidrogenasa de especies de Pseudomonas cepa 101 (Registro de la Protein Datábase ID 2NAD_A) y Candida boidinii (Registro de Genbank No. CAA09466). Los genes se sintetizaron usando oligómeros de 60 monómeros y se clonaron en los sitios de clonación Sf/'l del vector de expresión pCK110900 (representado en la figura 3), bajo el control de un promotor lac y un gen represor lacl. El vector de expresión contiene el origen de duplicación p15A y el gen de resistencia al cloranfenicol. Los plásmidos se transformaron en un hospedero de expresión E. coli usando métodos estándares. Se encontraron clonas que expresaron la formiato deshidrogenasa activa y se determinó la secuencia de sus genes para confirmar las secuencias de ADN (véanse las SEQ ID Nos: 69 y 71 , que codifican las secuencias de polipéptido SEQ ID Nos. 70 y 72, respectivamente).

EJEMPLO 2 Producción de la enzima m Enzima HHDH En un fermentador aireado agitado se pusieron 10.0 L de medio de crecimiento que contenía 0.528 g/L de sulfato de amonio; 7.5 g/L de fosfato ácido de dipotasio trihidratado; 3.7 g/L de fosfato diácido de potasio; 2 g/L de extracto de levadura Tastone-154; 0.05 g/L de sulfato ferroso; y 3 ml/L de una solución de oligoelementos que contenía 2 g/L de cloruro de calcio dihidratado, 2.2 g/L de sulfato de zinc heptahidratado, 0.5 g/L de sulfato de manganeso monohidratado, 1 g/L de sulfato cuproso heptahidratado; 0.1 g/L de borato de sodio decahidratado y 0.5 g/L de EDTA, a una temperatura de 30 °C. El fermentador se inoculó con un cultivo exponencial tardío de Escheríchia coli BL21 (Stratagene, La Jolla, California) equipado con plásmido que contiene polinucleótidos de HHDH como se describe en el ejemplo 1 , después se desarrolló en un matraz agitado que contenía LB, 1 % de glucosa (Sigma Chemical Co., San Luis Missouri) y 30 pg/ml de cloranfenicol (Sigma Chemical Co., San Luis Missouri) a una densidad óptica inicial a 600 nm (D060o) de 0.5 a 2.0. El fermentador se agitó a 500-1500 rpm y se suministró aire al recipiente de fermentación a 1.0-15.0 L/min, para mantener una concentración de oxígeno disuelto de 30% de saturación o mayor. El pH del cultivo se controló en 7.0 agregando hidróxido de amonio al 20% v/v. Después que el cultivo alcanzó una D06oo de 40, la temperatura se redujo a 25 °C y se indujo la expresión de halohidrina deshalogenasa mediante la adición de isopropil-P-D-tiogalactosidasa (IPTG) (Sigma Chemical Corp., San Luis Missouri) hasta una concentración final de 1 mM. El cultivo se desarrolló otras 15 horas. Después de la inducción, las células se cosecharon por centrifugación y se lavaron con amortiguador de fosfato de potasio 10 mM, pH 7.0. La pasta celular se usó directamente en el proceso de recuperación posterior o se guardó a -80 °C hasta usarse. (2) Enzima cetorreductasa En un fermentador aireado agitado se pusieron 10.0 L de medio de crecimiento que contenía 0.528 g/L de sulfato de amonio; 7.5 g/L de fosfato ácido de dipotasio trihidratado; 3.7 g/L de fosfato diácido de potasio; 2 g/L de extracto de levadura Tastone-154; 0.05 g/L de sulfato ferroso; y 3 ml/L de una solución de oligoelementos que contenía 2 g/L de cloruro de calcio dihidratado, 2.2 g/L de sulfato de zinc heptahidratado, 0.5 g/L de sulfato de manganeso monohidratado, 1 g/L de sulfato cuproso heptahidratado; 0.1 g/L de borato de sodio decahidratado y 0.5 g/L de EDTA, a una temperatura de 30 °C. El fermentador se inoculó con un cultivo exponencial tardío de Escherichia coli W3110 (pCR2-5) desarrollado en un matraz agitado que contenía LB, 1 % de glucosa (Sigma Chemical Co., San Luis Missouri) y 30 g/ml de cloranfenicol (Sigma Chemical Co., San Luis Missouri) a una densidad óptica inicial de 600 nm (D06oo) de 0.5 a 2.0. El fermentador se agitó a 500-1500 rpm y se suministró aire al recipiente de fermentación a 1.0-15.0 L/min; el pH del cultivo se controló en 7.0 agregando hidróxido de amonio al 20% v/v. Después que el cultivo alcanzó una D06oo de 40, la temperatura se redujo a 25 °C y se indujo la expresión de glucosa deshidrogenasa mediante la adición de isopropil^-D-tiogalactósido (IPTG) (Sigma Chemical Corp., San Luis Missouri), hasta una concentración final de 1 mM. El cultivo se desarrolló otras 15 horas. Después de la inducción, las células se cosecharon por centrifugación y se lavaron con amortiguador de fosfato de potasio 10 mM, pH 7.0. La pasta celular se usó directamente en el proceso de recuperación posterior o se guardó a -80 °C hasta usarse. (3) Enzima glucosa deshidroqenasa En un fermentador aireado agitado se pusieron 10.0 L de medio de crecimiento que contenía 0.528 g/L de sulfato de amonio; 7.5 g/L de fosfato ácido de dipotasio trihidratado; 3.7 g/L de fosfato diácido de potasio; 2 g/L de extracto de levadura Tastone-154; 0.05 g/L de sulfato ferroso; y 3 ml/L de una solución de oligoelementos que contenía 2 g/L de cloruro de calcio dihidratado, 2.2 g/L de sulfato de zinc heptahidratado, 0.5 g/L de sulfato de manganeso monohidratado, 1 g/L de sulfato cuproso heptahidratado; 0.1 g/L de borato de sodio decahidratado y 0.5 g/L de EDTA, a una temperatura de 30 °C. El fermentador se inoculó con un cultivo exponencial tardío de (pGDHS06 o pGDHM02) desarrollado en un matraz agitado que contenía LB, 1% de glucosa (Sigma Chemical Co., San Luis Missouri) y 30 g/ml de cloranfenicol (Sigma Chemical Co., San Luis Missouri) a una densidad óptica inicial a 600 nm (D06oo) de 0.5 a 2.0. El fermentador se agitó a 500-1500 rpm y se suministró aire al recipiente de fermentación a 1.0-15.0 L/min; el pH del cultivo se controló en 7.0 agregando hidróxido de amonio al 20% v/v. Después que el cultivo alcanzó una D06oo de 40, la temperatura se redujo a 25 °C y se indujo la expresión de glucosa deshidrogenasa mediante la adición de ¡sopropil-P-D-tiogalactósido (IPTG) (Sigma Chemical Corp., San Luis Missouri) hasta una concentración final de 1 mM. El cultivo se desarrolló otras 15 horas. Después de la inducción, las células se cosecharon por centrifugación y se lavaron con amortiguador de fosfato de potasio 0 mM, pH 7.0. La pasta celular se usó directamente en el proceso de recuperación posterior o se guardó a -80 °C hasta usarse. (4) Formiato deshidrogenasa En un termentador aireado agitado se pusieron 10.0 L de medio mínimo esterizado en autoclave que contenía 3.5g/L de NaNH4HP04 4H20, 7.5g/L de K2HP04 3H20 y 3.7g/L de KH2P04 (véase Lageveen y otros, 1988, Appl. Environ. Microbiol. 54:2924.(1988)), 2g/L de NH4CI, 0.528g/L de (NH4)2S04, pH 7.0, 5 ml/L de oligoelementos R2 (véase Reisenberg y otros, Appl. Microbiol. Biotechnol, 1990, 34: 77), 20m!/L de solución de extracto de levadura al 10% en agua, 5 ml/L de MgS04 1 M, 40 ml/L de glucosa al 50% en agua. La temperatura del medio se llevó a 30 °C. Se agregó cloranfenicol tomada de una solución concentrada de abastecimiento, a una concentración final de 30 pg/ml. El fermentador se inoculó con un cultivo nocturno de Escheríchia coli W3110 (pFDHPs3 o pFDHCb13) desarrollado en un matraz agitado que contenía el medio mínimo anterior con solución de oligoelementos R2, pH 7.0, 0.2% de extracto de levadura, 1% de glucosa y 30 g/ml de cloranfenicol, a una densidad óptica inicial a 600 nm (??ß??) de 0.04-0.1. El aire se suministró al recipiente de fermentación a 5.0 L/min y el pH del cultivo se mantuvo en 7.0 usando una solución concentrada de hidróxido de potasio en agua. El cultivo se desarrolló hasta una DOeoo de 12-15, y entonces se empezó a agregar una solución de alimentación de 50% de glucosa, 6% de cloruro de amonio y 0.5% de sulfato de magnesio, a una velocidad que resultó en una concentración final de oxígeno disuelto de 30-40% de saturación. La velocidad de alimentación de la bomba se controló de tal manera que el oxígeno disuelto en el fermentador se mantuvo cerca de 30% a una velocidad de flujo de aire de 10 IJmin, y una velocidad de agitación de 600 rpm. Después que el cultivo alcanzó una DC>6oo de 15 y se había expuesto al régimen de alimentación durante algunas horas, se indujo la expresión de formiato deshidrogenase mediante la adición de 1 mM de IPTG. El cultivo se desarrolló otras 8-18 horas antes de ser cosechado por centrifugación.

EJEMPLO 3 Preparación de la enzima (1) Cetorreductasa La pasta celular se lavó suspendiendo 1 volumen en peso húmedo de pasta celular en 3 volúmenes de Tris/sulfato 100 mM (pH 7.2), seguido por centrifugación a 5000 g durante 40 minutos en un Sorval 12BP. La pasta celular lavada se suspendió en 2 volúmenes de Tris/sulfato 00 mM (pH 7.2). La KRED intracelular fue liberada de las células pasando la suspensión a través de un homogeneizador en dos pases, usando una presión de 980 kg/cm2 en el primer pase y 560 kg/cm2 en el segundo pase. El lisado se calentó a temperatura ambiente y después se agregó al lisado una solución al 10% p/v de polietilenimina (PEI), pH 7.2, a una concentración final de PEI de 0.75% p/v, y se agitó 30 minutos. El homogenado tratado se centrifugó a 10,000 rpm en una centrífuga de laboratorio Beckman durante 60 minutos. El sobrenadante se decantó y se dispensó en recipientes poco profundos, se congeló a -20 °C y se liofilizó. (2) Glucosa deshidrogenasa La pasta celular se lavó suspendiendo 1 volumen en peso húmedo de pasta celular en 3 volúmenes de Tris/sulfato 100 mM (pH 7.2), seguido por centrifugación a 5000 g durante 40 minutos en un Sorval 12BP. La pasta celular lavada se suspendió en 2 volúmenes de Tris/sulfato 100 mM (pH 7.2). La HHDH intracelular fue liberada de las células pasando la suspensión a través de un homogeneizador en dos pases, usando una presión de 980 kg/cm2 en el primer pase y 560 kg/cm2 en el segundo pase. El homogenado se centrifugó a 10,000 rpm en una centrífuga de laboratorio Beckman durante 60 minutos. El sobrenadante se decantó y se dispensó en recipientes poco profundos, se congeló a -20 °C y se liofilizó. (3) Halohidrina deshaloqenasa La pasta celular se lavó suspendiendo 1 volumen en peso húmedo de pasta celular en 3 volúmenes de Tris/sulfato 100 mM (pH 7.2), seguido por centrifugación a 5000 g durante 40 minutos en un Sorval 12BP. La pasta celular lavada se suspendió en 2 volúmenes de Tris/sulfato 100 mM (pH 7.2). La HHDH intracelular fue liberada de las células pasando la suspensión a través de un homogeneízador en dos pases, usando una presión de 980 kg/cm2 en el primer pase y 560 kg/cm2 en el segundo pase. El lisado celular se dejó enfriar a 4°C entre los pases a través del homogeneízador. El homogenado se centrifugó a 10,000 rpm en una centrífuga de laboratorio Beckman durante 60 minutos. El sobrenadante se decantó y se dispensó en recipientes poco profundos, se congeló a -20 °C y se liofilizó, hasta quedar un polvo que se guardó a -80 °C. Para determinar la calidad de la preparación después de la fermentación, se analizó el lisado celular que contenía la enzima haiohidrina deshalogenasa expresada, de acuerdo con el siguiente protocolo. Aproximadamente 50 µ? de lisado celular clarificado en Tns-SC»4 100 mM, NaCN 100 mM, pH 8.0, se mezclaron con 10 mM de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo (Sigma Aidrich, San Luis Missouri, o se prepara de acuerdo con los métodos de catálisis con cetorreductasa aquí descritos). El volumen total de reacción era de 0.2 mi. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 30 min a 1 h. La reacción se extrajo con 7 volúmenes de acetato de etilo y la capa orgánica se retiró a un frasco de GC de 1.8 mi. La capa orgánica se analizó mediante GC para examinar la presencia del producto (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo. La cantidad de producto producido se determinó por comparación con una curva patrón preparada y analizada bajo las mismas condiciones. (4) Formiato deshidroqenasa Se preparó un lisado celular que contenía formiato deshidrogenasa expresada, mediante homogenización de la pasta celular en 1 volumen de trietanolamina 100 mM (pH 7.0) a 4 °C. El lisado celular se dejó enfriar a 4 °C entre los pases a través del homogeneizador. El lisado celular se clarificó por centrifugación a 4 °C. El lisado clarificado se analizó como se describe en el ejemplo 4.

EJEMPLO 4 Caracterización de la actividad de la enzima (1) Cetorreductasa (KRED) A una solución de éster etílico del ácido 4-cloro-3-cetobutírico (10 nM) en amortiguador de fosfato de potasio 100 mM (pH 7.0), se le agregó la enzima cetorreductasa como una solución previamente disuelta en el mismo amortiguador. La reacción se inició agregando NADPH (1 mM final) y el curso de la reacción se monitoreó midiendo la reducción de absorbancia a 340 nm. Esta absorbancia corresponde a la concentración de NADPH. Los resultados se graficaron como unidades de absorbancia (NADPH) contra el tiempo y se determinó la pendiente de la gráfica (unidades de absorbancia /min). La pendiente de la gráfica de absorbancia contra tiempo se convirtió en unidades de concentración usando el coeficiente de extinción de NADPH, y la actividad de la cetorreductasa se determinó en unidades de µ???? (NADPH consumido) /min /mg (catalizador de cetorreductasa total). La medición también se puede hacer usando detección fluorescente, utilizando una excitación de 340 nm para NADPH con emisión medida a 455 nm. Se puede sustituir el éster etílico del ácido 4-cloro-3-ceto-butírico con otros substratos de interés para evaluar la actividad de cetorreductasa con respecto a otros substratos. (2) Glucosa deshidrogenasa (GDH) A una solución de glucosa 50 nM en amortiguador de fosfato de potasio 100 m (pH 7.0), se le agregó la enzima glucosa deshidrogenasa como una solución previamente disuelta en el mismo amortiguador. La reacción se inició agregando NADP (1 mM final) y el curso de la reacción se monitoreó midiendo el aumento de absorbancia a 340 nm o de la fluorescencia (excitación 340 nm, emisión 455 nm). Los resultados se graficaron como unidades de absorbancia (NADPH) contra el tiempo y se determinó la pendiente de la gráfica (unidades de absorbancia /min). La pendiente de la gráfica de absorbancia contra tiempo se convirtió en unidades de concentración usando el coeficiente de extinción de NADPH (véase (1) arriba), y la actividad de la glucosa deshidrogenasa se determinó en unidades de pmol (NADPH creado) /min /mg (catalizador de glucosa deshidrogenasa total). (3) Halohidrina deshalogenasa (HHDH) A una solución de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo (10 mM) en amortiguador de fosfato de potasio 300 mM, NaCN 300 mM (pH 8.0), se le agregó la enzima halohidrina deshalogenasa como una solución previamente disuelta en el mismo amortiguador. Se retiraron alícuotas de la mezcla a diferentes tiempos y se extrajeron con tres volúmenes de acetato de etilo. Después se analizó la capa orgánica por cromatografía de gases (GC) como se describe más abajo en el ejemplo 6. Se tomaron muestras en varios puntos de tiempo y se gráfico el área pico del producto cianohidrina, (R)-4-ciano-3-hidroxibuturato de etilo, en función del tiempo. Las áreas pico se convirtieron en unidades de concentración usando una curva patrón que se preparó para el (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo. La actividad de la halohidrina deshalogenasa se determinó en unidades de pmol (cianohidrina producida) /min /mg (catalizador de halohidrina deshalogenasa total). Se pueden usar otros nucleófilos o substratos de interés para evaluar la actividad de halohidrina deshalogenasa con respecto a los otros nucleófilos o substratos. (4) Formiato deshidrogenasa A una solución de 150 mM de formiato en amortiguador de trietanolamina 100 mM (pH 7.0) se le agregó la enzima formiato deshidrogenasa como una solución previamente disuelta en el mismo amortiguador. La reacción se inició agregando NAD (2 mM final) y el curso de la reacción se monitoreó midiendo el aumento de absorbancia a 340 nm o de la fluorescencia (excitación 340 nm, emisión 455 nm). Los resultados se graficaron como unidades de absorbancia (NADH) contra el tiempo y se determinó la pendiente de la gráfica (unidades de absorbancia /min). La pendiente de la gráfica de absorbancia contra tiempo se convirtió en unidades de concentración usando el coeficiente de extinción de NADH, y la actividad de la formiato deshidrogenasa se determinó en unidades de pmol (NADH creado) /min /mg (catalizador de formiato deshidrogenasa total).

EJEMPLO 5 Preparación de (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo a partir de 4- cloroacetato de etilo (por medio de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo) A una solución bien agitada de amortiguador de fosfato de potasio 100 m , NaCI 500 mM, pH 7 (1 L), a temperatura ambiente, se le agregó glucosa (160 g, 830 mmol, 1.1 eq). A esto se le agregó la cetorreductasa de SEQ ID NO: 2 (0.9g), glucosa deshidrogenasa S06 de SEQ ID NO: 10 (0.5 g) y NADP (0.5g) como polvos liofilizados. Una vez disueltos, se agregó acetato de butilo (500 mL) para formar una emulsión. A esta emulsión se le agregó una solución de 4-cloroacetoacetato de etilo (100g, 608 mmol) en acetato de butilo (500 mL), gota a gota durante 3 horas. El pH se mantuvo entre 6.8 y 7 mediante un titulador automático que dispensa Na2CO3 (2M en agua, aproximadamente 160 mL en total). Después de 40 horas, la adición automática de la base había terminado y no había material de partida residual según una cromatografía de gases. Las capas se separaron y la fase acuosa se lavó con acetato de etilo (500 mL). La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó en un evaporador rotativo, para dar (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo esencialmente puro (-97%). A una solución bien agitada de (S)-4-cloro3-hidroxibutirato de etilo (8.25 g, 50 mmol) en amortiguador de fosfato de potasio 300 mM, NaCN 300 mM, pH 8.0 (1 L), a 30 °C, se le agregó la halohidrina deshalogenasa de SEQ ID NO: 14 (9 g) como un polvo liofilizado. Después de 57 horas, la mezcla se lavó con acetato de etilo (2 x 250 mL) y la fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La mezcla se filtró y se evaporó en un evaporador rotativo para dar (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo esencialmente puro, según se determinó usando el método de cromatografía de gases y los datos de tiempo de elución descritos más abajo en el ejemplo 6. Este ejemplo muestra el proceso de la invención en donde es provisto un éster de ácido 4-ciano-3-hidroxibutír¡co ((R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo) poniendo en contacto un éster de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico ((S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo) con una halohidrina deshalogenasa y cianuro (provisto como una sal de cianuro, NaCN). Además, muestra el proceso de la invención en donde es provisto el éster de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico poniendo en contacto un éster de ácido 4-halo-3- cetobutírico (4-cIoroacetoacetato de etilo) con una cetorreductasa, un cofactor (NADPH, provisto como NADP), y un sistema de regeneración de cofactor (glucosa y glucosa deshidrogenase). También muestra la producción general de (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo no racémico quiral a partir de 4-cloroacetoacetato de etilo aquiral, con alto e.e. y con alta pureza, sin procedimientos de purificación extensivos.

EJEMPLO 6 Caracterización de (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo El 4-ciano-3-(R)-hídroxibutirato de etilo producido en el ejemplo 5 se analizó usando cromatografía de gases con detección de ionización de llama (FID), usando una columna Agilent HP-5, de 30 cm de longitud, 0.25 pm de diámetro interno, usando el siguiente programa: 1 minuto a 100 °C, 5 °C/ minuto durante 10 minutos; 25 °C /minuto durante 2 minutos; después 2 minutos a 200 °C. Las temperaturas de entrada y salida fueron ambas de 300 °C y la velocidad de flujo fue de 2 ml/minuto. Bajo estas condiciones, el (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo eluye a los 6.25 minutos, el (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo eluye a los 4.5 minutos, y el 4-cloroacetoacetato de etilo eluye a los 4.1 minutos. La pureza química de las especies se midió usando las áreas de pico integradas de los resultados de la cromatografía de gases. La enantioselectividad de la halohidrina deshalogenasa (HHDH) con respecto a (R)-4-ciano-3-hidrox¡but¡rato de etilo se midió por cromatografía de gases y detección FID usando una columna Restek gammaDEX SA (30 m de largo, 0.32 pm de diámetro interno), usando el siguiente programa: 25 minutos a 165 °C y velocidad de flujo de 2 ml/minuto. Las temperaturas de entrada y salida fueron ambas de 230 °C. Bajo estas condiciones, el (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo eluye a los 19.6 minutos y el (S)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo eluye a los 19.2 minutos.

EJEMPLO 7 Preparación de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo a partir de 4-cloro- acetoacetato de etilo Un matraz encamisado de 3L, de 3 cuellos, equipado con un agitador mecánico y conectado a un titulador automático mediante un electrodo de pH y un tubo de alimentación para la adición de base, se cargó con trietanolamina (6.6 ml_) y H2O (492 ml_) para hacer una solución de trietanolamina 100 mM. El pH se ajustó a 7 con HCI al 37%. Después se le agregó D-glucosa (125 g). El agua que circulaba en la camisa del matraz se puso a 30 °C. Después de 10 minutos se le agregó la cetorreductasa de SEQ ID NO: 2 (5.7 g) y la glucosa deshidrogenasa S06 de SEQ ID NO: 10 (3.1 g) en polvo. Después de 10 minutos se le agregó ß-NAD (125 mg) y la mezcla resultante se dejó agitando 5 minutos. Después se cargó acetato de butilo (250 ml_). Usando un embudo de adición, se le agregó lentamente 4- cloroacetoacetato de etilo 2.4 M (250 ml_, 100 g en 167 mL de acetato de butilo) durante 3 horas. El pH fue mantenido en 7 por el titulador automático mediante la adición de Na2C03 2 M (152 mL) durante 15 horas. Subsiguientemente, la cromatografía de gases de una muestra de reacción mostró la conversión completa a producto. Se le agregó celite (16 g) y la mezcla de reacción se dejó agitando 10 minutos. La solución se filtró a través de una almohadilla de celite y la capa orgánica se separó. La capa acuosa se extrajo con acetato de butilo (2 x 200 mL). Las capas orgánicas se combinaron y el solvente de la capa combinada se removió al vacío por evaporación rotativa,' ara obtener 87 g del (S)-4-cloro-3-hidroxlbutirato de etilo. El exceso enantiomérico fue de >99%, determinado después de su conversión en (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo en el ejemplo 8.

EJEMPLO 8 Preparación de (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo a partir de (S)- cloro-3-hidroxibutirato de etilo Un matraz encamisado de 3L, de 3 cuellos, equipado con un agitador mecánico y conectado a un titulador automático mediante un electrodo de pH y un tubo de alimentación para la adición de base, se cargó con H20 ( 200 mL), NaCN (37.25 g) y NaH2P04 ( 25 g) para llevar el pH de la solución a 7. El reciclador de agua se puso a 40 °C. Después de 10 minutos se le agregó la halohidrina deshalogenasa de SEQ ID NO: 32 como lisado celular (250 mL). La mezcla de reacción se dejó agitando 5 minutos. Usando un embudo de adición, se le agregó lentamente (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo (45 g del material del ejemplo 7) durante 1 hora. El pH fue mantenido en 7 por el titulador automático mediante la adición de NaOH 10 M (27 mL) durante 17 horas. Subsiguientemente, la cromatografía de gases de una muestra de reacción mostró la conversión completa a producto. Se agregó celite (16 g) al matraz, que después se conectó a un diafragma, cuyo material de escape se burbujeó en NaOH 5M (200 mL) para remover el HCN. La mezcla se calentó a 60 °C bajo 100 mm de Hg de presión. Después de 1 hora se agregó a la solución un burbujeador de aire sumergido para ayudar a la remoción del HCN. Después de 3 horas, un detector de HCN indicó menos de 5 ppm de HCN en el gas de escape. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente; después se filtró a través de una almohadilla de celite. El filtrado se extrajo con acetato de butilo (3 x 800 mL) y la capa orgánica combinada se filtró a través de una almohadilla de carbón activado. El solvente se removió al vacío por evaporación rotativa, para proveer 28.5 g de (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo. La pureza fue de 98% (p/p) según HPLC y el exceso enantiomérico fue de >99% (según la GC quiral, el enantiómero S no fue detectable).

EJEMPLO 9 Preparación de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo a partir de 4-cloro acetoacetato de etilo Un recipiente de 100 mL conectado a un titulador automático mediante un electrodo de pH y un tubo de alimentación para la adición de base, se cargó con una solución de glucosa (7.5 g) en amortiguador de trietanolamina 100 m , pH 7 (25 mL). A esta solución se le agregó la cetorreductasa de SEQ ID NO: 42 (100 mg), 50 mg de GDH de SEQ ID NO: 66 y NADP (6.25 mg). Después se cargó acetato de butilo (10 mL). Posteriormente se cargó 4-cloroacetoacetato de etilo (6 g) en acetato de butilo (10 mL). El pH fue mantenido en 7 por el titulador automático mediante la adición de NaOH 4 M (7.5 mL) durante 7 horas. Se extrajo una muestra de la mezcla de reacción con un volumen igual de acetato de butilo, y la capa orgánica se analizó mediante GC. El análisis mostró 99% de conversión del 4-cloroacetóacetato de etilo en (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo.

EJEMPLO 10 Preparación de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo a partir de 4-cloro- acetoacetato de etilo El procedimiento fue idéntico al ejemplo 9, excepto que se usaron 400 mg de la cetorreductasa de SEQ ID NO: 42, y NAD+ (12.5 mg) en lugar del NADP. La adición de la solución de NaOH con el titulador automático se completó en 11 horas y el análisis de GC mostró 99% de conversión del 4-cloroacetoacetato de etilo en (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo.

EJEMPLO 11 Preparación de (S)-4-cloro-3-hidroxíbutirato de etilo a partir de 4-cloroacetoacetato de etilo Un recipiente de 100 ml_ conectado a un titulador automático mediante un electrodo de pH y un tubo de alimentación para la adición de base, se cargó con una solución de glucosa (12 g) en agua (30 mL). A esta solución se le agregó la cetorreductasa de SEQ ID NO: 42 (100 mg), 50 mg de GDH de SEQ ID NO: 66 y NADP (6.25 mg). Después se cargó acetato de butilo (10 mL). Posteriormente se cargó 4-cloroacetoacetato de etilo (10 g) por medio de una bomba de jeringa, de la siguiente manera: se cargó rápidamente 1 mL y después se cargó el resto a una velocidad de 1 mL/h. El pH fue mantenido en 7 por el titulador automático mediante la adición de NaOH 4 M durante 18 horas. La agitación se detuvo y las fases se dejaron separar. La capa orgánica incluía algo de emulsión. La capa orgánica, incluyendo la poca emulsión, se separó y se lavó con 10 mL de agua. La capa acuosa combinada se extrajo dos veces con 20 mL de acetato de butilo. Los extractos orgánicos se combinaron y el producto se evaporó rotativamente al vacío para remover agua. Se le agregó más acetato de butilo durante la evaporación para ayudar a remover el agua. Cuando el agua se removió, la solución de acetato de butilo se decantó de los sólidos en el matraz. La evaporación del solvente al vacío dio 8.85 g de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo (87.4% de rendimiento) con pureza muy buena.

EJEMPLO 12 Preparación de (R)-4-c¡ano-3-hidroxibutirato de etilo a partir de (S)-4- cIoro-3-hidroxibutirato de etilo Un recipiente de 170 mL conectado a un titulador automático mediante un electrodo de pH y un tubo de alimentación para la adición de base, se cargó con NaCN (1.5 g, 31 mmol) y agua (50 mL). El recipiente se selló y el aire del espacio superior se removió con nitrógeno. El pH fue ajustado a 7 mediante la adición de H2SO4 concentrado (0.9 mL). La mezcla de reacción se calentó a 40 °C y se trató con una solución de la halohidrina deshaiogenasa de SEQ ID NO: 32 (1.2 g en 10 mL de agua que contenía 42 L de ß-mercaptoetanol 14 ). Después se le agregó (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo (1.8 g, 10.8 mmol) por medio de una jeringa. El titulador automático mantuvo el pH en 7 mediante la adición de NaOH 2M. La reacción terminó después de 15 h y se habían agregado un total de 4.6 mL de NaOH 2M. Se extrajo una muestra de la mezcla de reacción con un volumen igual de acetato de butilo. Un análisis de GC del extracto orgánico mostró que la conversión del (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo en (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo fue >99%.

EJEMPLO 13 Preparación de (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo a partir de (S)-4- cloro-3-hidroxibutirato de etilo El procedimiento fue idéntico al ejemplo 12, excepto que se usó NaCN 4 como la base en lugar de NaOH 2M. La reacción terminó después de 8 horas y se habían agregado un total de 2.3 mL de NaCN 4M. Según el análisis de GC, la conversión del (S)-4-cloro-3-hidroxibutírato de etilo en (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo fue >99%. Este ejemplo muestra el proceso de la invención usando como base un cianuro de álcali para mantener constante tanto el pH como la concentración de cianuro en la mezcla de reacción.

EJEMPLO 14 Preparación de (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo a partir de (S)-4- cloro-3-hidroxibutirato de etilo Un recipiente de 250 mL conectado a un titulador automático mediante un electrodo de pH y un tubo de alimentación para la adición de base (NaOH 7.5M), se cargó con agua (83.5 mL) y 0.7 g de la haiohidrina deshalogenasa de la SEQ ID NO: 24. La mezcla se agitó 30 minutos. El titulador se activó y se ajustó para mantener un pH de 7. Después se cargó HCN acuoso al 25% (9.26 mi, 8.6 g) durante 20 minutos para hacer una solución de HCN al 2.3%. La mezcla se calentó a 40 °C durante 10 minutos y después se cargó (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo (5 g) durante 1 hora. El titulador automático mantuvo el pH a 7 mediante la adición de NaOH 2M. Después de 20 horas, un análisis de GC de un extracto en acetato de butilo de una muestra de reacción, mostró que la conversión del (S)-4-cIoro-3-hidroxibutirato de etilo en (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo fue de 95%. Este ejemplo muestra el proceso de la invención usando como la fuente de cianuro ácido cianhídrico acuoso.

EJEMPLO 15 Preparación de (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo a partir de (S)-4- cloro-3-hidroxibutirato de etilo A un frasco de 20 mL con tapa de rosca se le agregó NaCN (250 mg) y NaH2PO4 (830 mg). Se le agregó agua (10 mL), seguida por la halohidrina deshalogenasa de la SEQ ID NO: 32 como un polvo liofilizado (200 mg). Después se le agregó (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo (300 mg). El frasco se tapó y se calentó en un baño de aceite a 40 °C. Después de 4 horas un análisis de GC de un extracto en acetato de butilo de la muestra de reacción, mostró 54% de conversión del (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo en (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo. Después de 72 horas, el análisis de GC mostró conversión completa.

EJEMPLO 16 Preparación de (S -ciano-3-hidroxibutirato de etilo a partir de ( )-4- cloro-3-hidroxibutirato de etilo El procedimiento fue idéntico al ejemplo 15, excepto que se hizo reaccionar el enantiómero (R) del 4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo en lugar del enantiómero (S), y las cantidades de todos los componentes de la reacción se dividieron a la mitad. Después de 1 hora de tiempo de reacción, el análisis de GC mostró 55% de conversión del (R)-4-cloro-3-h¡droxibutirato de etilo en (S)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo. Este ejemplo en combinación con los ejemplos precedentes muestran que el proceso de la invención se puede usar para convertir cualquier enantiómero de éster de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico en el enantiómero correspondiente de éster de ácido 4-c¡ano-3-hidroxibutírico.

EJEMPLO 17 Preparación de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de metilo a partir de 4-cloro- acetoacetato de metilo El procedimiento fue idéntico al ejemplo 9, excepto que se hizo reaccionar una cantidad equimolar de 4-cloroacetoacetato de metilo en lugar del 4-cloroacetoacetato de etilo, y las enzimas fueron la cetorreductasa de la SEQ ID NO: 50 y la glucosa deshidrogenasa de la SEQ ID NO: 62. La reacción se terminó en 11 horas y el análisis de CG mostró >99% de (S)-4-cloro-3-hidroxibutlrato de metilo. El producto se aisló por extracción en acetato de butilo y evaporación del solvente, y su identidad se confirmó mediante RMN de 1H y 3C.

EJEMPLO 18 Preparación de (R)-4-ciano-3-hídroxibut¡rato de metilo a partir de (S)-4- cloro-3-hidroxibutirato de metilo El procedimiento fue idéntico al ejemplo 16, excepto que se hizo reaccionar una cantidad equimolar de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de metilo (preparado en el ejemplo 17), en lugar del (R)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo. Después de 1 hora de tiempo de reacción, el análisis de GC mostró 38% de conversión del (R)-4-cloro-3-hidroxibutirato de metilo en (S)-4-ciano-3-hidroxibutirato de metilo. El producto se caracterizó mediante RMN de H y 13C EJEMPLO 19 Preparación de (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo a partir de (S)-4- bromo-3-h¡droxibutirato de etilo El procedimiento fue idéntico al ejemplo 16, excepto que se hizo reaccionar una cantidad equimolar de (S)-4-bromo-3- idroxibutirato de etilo en lugar del (R)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo. Después de 1 hora de tiempo de reacción, el análisis de GC mostró 90% de conversión del (S)-4-bromo-3-hidroxibutirato de etilo en (S)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo. El producto se caracterizó mediante RMN de 1H y 13C. Este ejemplo muestra el proceso de la invención en donde el sustituyente halógeno del éster de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico es el bromo.

EJEMPLO 20 Preparación de 3-hidroxibutirato de etilo a partir de acetoacetato de etilo El procedimiento fue idéntico al ejemplo 7, excepto que se hizo reaccionar una cantidad equimolar de acetoacetato de etilo en lugar del 4-cloroacetoacetato de metilo, y se usaron 200 mg de la cetorreductasa de la SEQ ID NO: 50 y 100 mg de la glucosa deshidrogenase de la SEQ ID NO: 62. La reacción se completó en 6 horas. El producto se aisló por extracción en acetato de butilo y evaporación del solvente, y se caracterizó mediante RMN de 1H 13C. En combinación con los ejemplos precedentes, este ejemplo demuestra que las enzimas cetorreductasas que tienen actividad para reducir acetoacetato de etilo a 3-hidroxibutirato de etilo, son útiles para reducir ásteres de ácidos 4-haIo-3-cetobutíricos a ásteres de ácidos 4-haIo-3-hidroxibutíricos en las modalidades de esta invención.

EJEMPLO 21 Perfiles de pH de reacciones de prueba enzimática y no enzimática de 4- cloro-3-hidroxibutirato de etilo con cianuro Soluciones acuosas que contenían 25 mg/mL de cianuro de sodio se prepararon a pH 5.0, 6.0, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 y 9.0, mediante la adición de ácido fosfórico al 85%, monitoreando con un medidor de pH. Se cargaron 5 ml_ de cada solución en frascos separados de 20 ml_ con tapa de rosca. A cada frasco se le agregó la halohidrina deshalogenasa de la SEQ ID NO: 38 (20 mg), seguido por (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo (50 mg, 0.30 mmol). Para experimentos de reacciones no enzimáticas, el procedimiento fue idéntico, excepto que la enzima se omitió. Los frascos se taparon y se calentaron en un baño de aceite a 55 °C durante 3 horas, después se removieron y se enfriaron a temperatura ambiente. De cada mezcla de reacción se extrajo una muestra de 0.4 mL con 1 mL de acetato de butilo, y los extractos se analizaron por cromatografía de gases. En el cuadro I se dan las cantidades analizadas de substrato y productos en cada frasco, y en la figura 1 se grafican contra el pH. Tanto en el cuadro como en dicha figura, clorohidrina significa (S)-4-cloro-3- hidroxibutirato, cianohidrina significa (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato, y crotonato significa 4-hidroxicrotonato de etilo. En el cuadro, ND significa no detectado.

CUADRO I Milimoles de clorohidrina, cianohidrina y subproducto de crotonato, analizados en reacciones de prueba con y sin halohidrina deshalogenasa (véase el ejemplo 21) Los pH's finales de las mezclas de reacción de prueba se volvieron a medir. Para las mezclas que incluían halohidrina deshalogenasa con pH's iniciales de 7 o más (siendo las mezclas en las cuales ocurrió la conversión casi completa de la clorohidrina en la cianohidrina), los pH's finales de la mezcla fueron de 0.4 a 0.6 unidades de pH más bajos que los pH's iniciales. Las otras mezclas mostraron cambios de pH mucho menores con respecto a sus valores iniciales. Estos datos muestran que bajo estas condiciones y tiempos de reacción, no ocurrió reacción no enzimática medible del 4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo con el cianuro, a ningún pH probado menor de 8. A pH 8 y mayor, ocurrió una reacción no enzimática creciente con cianuro para formar el 4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo con pH creciente, y fue acompañada de una formación creciente de subproducto de 4-hidroxicrotonato de etilo. En contraste, la reacción enzimática con halohidrina deshalogenasa ocurrió a todos los pH's probados mayores de 5 y sin formación detectable de 4-hidroxicrotonato de etilo a ningún pH probado. Adicionalmente, para las reacciones de prueba tanto enzimáticas como no enzimáticas, a pH mayor de 8, el total de moles de los productos analizados por GC disminuyó de los 0.30 mmoles iniciales provistos (como 4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo reactivo), indicando la formación creciente de subproductos no analizables a medida que el pH se eleva a más de 8. Se estableció separadamente que los grupos éster del reactivo y el producto son hidrolizados crecientemente a grupos de ácido carboxílico a pH's mayores de 8, y que los ácidos carboxílicos resultantes no son extraídos en los extractos de las muestras de la mezcla de reacción que se analizan por GC; véase el ejemplo 22.

EJEMPLO 22 Hidrólisis no enzimátíca de 4-cíano-3-hidroxibutirato de etilo Se prepararon soluciones acuosas de fosfato a pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 y 9.0, disolviendo 0.48 g de NaH2P04 en 40 mL de agua, y ajusfando el pH con la adición de NaOH 2M, mientras se monitoreaba con un medidor de pH. Se cargaron 5 mL de cada solución en frascos separados de 20 mL con tapa de rosca. Después se les agregó (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo (46 mg, 0.29 mmol). Los frascos se taparon y se calentaron en un baño de aceite a 55 °C y después se enfriaron a temperatura ambiente. De cada mezcla de reacción se extrajeron 0.4 mL con 1 mL de acetato de butilo y los extractos se analizaron por GC. Para un estándar externo se preparó nuevamente un duplicado de la mezcla de pH 7.0 e inmediatamente se extrajo. En el cuadro II se dan las cantidades analizadas de 4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo de cada frasco. No se detectó producto de su hidrólisis en los extractos de las muestras de reacción. Se estableció separadamente que el ácido carboxílico producto de la hidrólisis del éster no es extraído en los extractos de las muestras de reacción que son analizadas por GC.

CUADRO II Milimoles de clorohidrina y cianohidrina analizadas en las reacciones de hidrólisis de prueba (véase el ejemplo 22) Los pH's finales de las mezclas de prueba se volvieron a medir. Las mezclas con pH's iniciales de 8.0, 8.5 y 9.0 tuvieron un pH final de 7.4. La mezcla con un pH inicial de 7.5 tuvo un pH final de 7.3, y la mezcla con un pH inicial de 7 no cambió. Esto pone en evidencia la producción de ácido carboxílico en las muestras con pH más alto, causando la neutralización de las soluciones en la escala de amortiguamiento del fosfato. Este ejemplo, en combinación con el ejemplo 21 , muestra que el 4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo es hidrolizado crecientemente al aumentar el pH a los pH's mayores de 8, en donde puede ser producido por la reacción no enzimática del 4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo con el cianuro.

EJEMPLO 23 Preparación de (RH-ciano-3-hidroxibutirato de etilo a partir de 4- cloroacetoacetato de etilo (por medio de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo) Un recipiente de 100 ml_ conectado a un titulador automático mediante un electrodo de pH y un tubo de alimentación para la adición de base (NaOH 4M), se cargó con una solución (25 ml_) de glucosa (7.5 g) en amortiguador de trietanolamina 100 mM, pH 7. A esta solución se le agregó la cetorreductasa de la SEQ ID NO: 50 (50 mg), la glucosa deshidrogenasa de la SEQ ID NO: 62 (20 mg) y NADP (1.5 mg). Entonces se cargó acetato de butilo (10 mL) y 4-cloroacetoacetato de etilo (6 g) en más acetato de butilo (10 mL). El titulador automático mantuvo el pH a 7 mediante la adición a la mezcla en agitación de NaOH 4M durante 13 horas. Después las fases se dejaron separar durante 30 minutos y la capa orgánica (25 mL), que contenía el intermediario de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo, se removió. Un recipiente de 170 mL conectado a un titulador automático mediante un electrodo de pH y un tubo de alimentación para la adición de base (NaOH 2M), se cargó con cianuro de sodio (1.5 g), seguido por agua (50 mL). El recipiente se selló y el aire del espacio superior se removió con nitrógeno. El pH se ajustó a 7 usando ácido sulfúrico concentrado (0.9 mL). La mezcla se calentó a 40 °C y se trató con una solución de la halohidrina deshalogenasa de la SEQ ID NO: 32 (1.2 g) en 10 mL de agua que contenía 42 µ!_ de ß-mercaptoetanol 14?. Después se le agregó la capa orgánica (25 mL) que contenía el (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo del primer paso por medio de una jeringa. El titulador automático mantuvo el pH en 7 mediante la adición de NaOH 2M a la mezcla en agitación. Después de 15 h, la conversión de (S)-4-cloro-3- idroxibutirato de etilo en (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo fue de 33%, indicada por la adición acumulativa de 5 mL de la base (se esperan 15 mL para la conversión completa).

EJEMPLO 24 Preparación de (R)-4-ciano-3- idroxibutirato de etilo a partir de 4- cloroacetoacetato de etilo (por medio de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo) A un frasco de 20 mL con tapa de rosca se le agregó NaCN (125 mg, 2.55 mmol), NaH2P04 (415 mg, 3.46 mmol) y glucosa (750 mg, 3.8 mmol). Se le agregó agua (5 mL), seguida por NADP (2 mg), la cetorreductasa de la SEQ ID NO: 56 (50 mg), la glucosa deshidrogenasa de la SEQ ID NO: 62 (50 mg), y la haiohidrina deshalogenasa de la SEQ ID NO: 32 (100 mg). Después se le agregó 4-cloro-acetoacetato de etilo (24 mg, 0.15 mmol) en 0.5 mL de acetato de butilo. El frasco se tapó y se calentó en un baño de aceite a 30 °C. Después de 1 hora, un análisis de GC de un extracto en acetato de butilo de una muestra de reacción, mostró 100% de conversión del 4-cloro- acetoacetato de etilo en (S)-4-cIoro-3-hidroxibutirato de etilo, a 96% de selectividad, y (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo a 4% de selectividad. Después, el frasco de reacción se calentó a 40 °C durante 15 horas. Un análisis de GC de un extracto en acetato de butilo mostró entonces 2% del (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo remanente, con un rendimiento general de 98% de (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo en base al 4-cloroacetato de etilo de partida. Este ejemplo muestra el proceso de la invención en donde un éster de ácido 4-ciano-3-hidroxibutírico (4-ciano-3-(R)-hidroxibutirato de etilo) es producido por medio de un éster de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico intermediario (4-cloro-3-(S)-hidroxibutirato de etilo), poniendo en contacto un éster de ácido 4-halo-3-cetobutírico (4-cloroacetoacetato de tilo) con una cetorreductasa, un cofactor (NADPH, provisto como NADP), un sistema de regeneración de cofactor (glucosa y glucosa deshidrogenase), una halohidrina deshalogenasa, y cianuro (provisto por una sal de cianuro, NaCN), con todos los reactivos presentes simultáneamente en la mezcla de reacción.

EJEMPLOS 25-29 Preparaciones de (R)-4-cíano-3hidroxibutirato de etilo a partir de (S)-4- cloro-3-hidroxibutirato de etilo Para cada uno de los ejemplos 25-29, un recipiente de 170 ml_ conectado a un titulador automático mediante un electrodo de pH y un tubo de alimentación para la adición de base, se cargó con NaCN (1.5 g, 31 mmol) y agua (50 mL). El recipiente se selló y el pH se ajustó a 7 agregando H2S04 concentrado (0.9 mL). La mezcla de reacción se calentó a 40 °C y se trató con una solución de halohidrina deshalogenasa (0.4 g en 10 mL de agua). La halohidrina deshalogenasa usada en estos ejemplos tenía las secuencias de polipéptido que se dan para las siguientes SEQ ID Nos: Ejemplo 25, SEQ ID NO: 32 Ejemplo 26, SEQ ID NO: 94 Ejemplo 27, SEQ ID NO: 96 Ejemplo 28, SEQ ID NO: 98 Ejemplo 29, SEQ ID NO: 100 Después se agregó por medio de una jeringa (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo (5.00 g, 30.1 mmol). El titulador automático mantuvo el pH a 7 mediante la adición de NaCN 4M. El avance de las reacciones se monitoreó registrando el volumen acumulado de solución de NaCN agregada contra el tiempo. La figura 4 muestra el porcentaje de conversión de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo (calculado de los equivalentes acumulados de NaCN agregado) contra el tiempo para todos estos ejemplos. En el ejemplo 25 se usó una halohidrina deshalogenasa que tenía la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 32, que es la secuencia de aminoácidos de la halohidrina deshalogenasa nativa de Agrobacterium radiobacter AD1 (hheC), expresada del ácido nucleico novedoso que corresponde a la SEQ ID NO: 31. La comparación del porcentaje de conversión contra el tiempo entre los ejemplos 26 a 29 y el ejemplo 25, muestra que las halohidrina deshalogenasas novedosas de la presente invención tienen mayor actividad que la halohidrina deshalogenasa nativa de Agrobacterium radiobacter AD1 (hheC).

EJEMPLO 30 Preparación de (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo a partir de (S)-4- cloro-3-hidroxibutirato de etilo El procedimiento fue idéntico al de los ejemplos 25-29, excepto que se usó la halohidrina deshalogenasa de la SEQ ID NO: 104. Después de 12 horas, la reacción se completó en base a la adición de solución de NaCN, y el análisis de GC mostró que la conversión del (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo en (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo fue >99%. La mezcla de reacción se enfrió y se combinó con otras cinco soluciones finales de reacción producidas similarmente en un matraz de tres cuellos de 500 mL. El matraz se equipó con un condensador y tubo de inmersión de nitrógeno que se extendía al líquido, y se conectó a una bomba de diafragma para aplicar vacío (500 mm Hg). Se usó una trampa cáustica para atrapar el HCN del gas de escape. La mezcla de reacción se calentó a 50 °C y se usó una purga de nitrógeno para facilitar la remoción del HCN. Después de tres horas se completó la remoción del HCN. La mezcla se enfrió y se dividió en recipientes de centrífuga. Se dividieron 300 mL de acetato de butilo entre los recipientes, que se taparon y agitaron para la extracción. Las mezclas se centrifugaron a 8000 rpm durante 30 minutos. Las capas se separaron y ia fase acuosa se extrajo similarmente dos veces más con 300 mL de acetato de butilo. Los extractos combinados de acetato de butilo se evaporaron al vacío, para dar 19.6 g de (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo como un líquido amarillo pálido (83% de rendimiento).

EJEMPLO 31 Preparación de (RH-ciano-3-hidroxibutirato de etilo a partir de (S)-4- cloro-3-hidroxibutirato de etilo Un recipiente de 170 mL conectado a un titulador automático mediante un electrodo de pH y un tubo de alimentación para la adición de base, se cargó con NaCN (1.5 g, 31 mmol), y agua (50 mL). El recipiente se selló y el pH se ajustó a 7 agregando H2S04 concentrado (0.9 mL). La mezcla se calentó a 40 °C y se trató con una solución de la halohidrina deshalogenasa de la SEQ ID NO: 100 (0.4 g en 10 mL de agua). Después se le agregó (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo (10.0 g, 60.2 mmol) por medio de una jeringa. El titulador automático mantuvo el pH en 7 mediante la adición de NaCN 4M. Después de 18 h, la reacción estaba completa en base a la adición de la solución de NaCN (no agregándose más base, 14.6 mL agregados acumulados), y el análisis de GC mostró que la conversión del (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo en (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo fue >99%. La mezcla de reacción se enfrió y se transfirió a un matraz de tres cuellos de 250 mL El matraz se equipó con un condensador y tubo de inmersión de nitrógeno que se extendía al líquido, y se conectó a una bomba de diafragma para aplicar vacío (500 mm Hg). Se usó una trampa cáustica para atrapar el HCN del gas de escape. La mezcla de reacción se calentó a 50 °C y se usó una purga de nitrógeno para facilitar la remoción del HCN. Después de tres horas se completó la remoción del HCN. La mezcla se enfrió y se transfirió a un recipiente de centrífuga. Se agregaron 60 mL de acetato de butilo al recipiente, que se tapó y se agitó para la extracción. La mezcla se centrifugó a 10,000 rpm durante 30 minutos. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo similarmente dos veces más con 60 mL de acetato de butilo. Los extractos combinados de acetato de butilo se evaporaron al vacío, para dar 7.7 g de (R)-4-ciano-3-hidroxibutirato de etilo (81 % de rendimiento).

EJEMPLOS 32-36 Preparaciones de (R)-6-ciano-5-h¡droxi-3-oxohexanoato de t-butilo a partir de (R)-6-cloro-5-hidrox¡-3-oxohexanoato de t-butilo Se preparó una solución acuosa que contenía 25 mg/mL de cianuro de sodio a pH 7.2, disolviendo 1.25 g de NaCN y 4.2 g de NaH2P04 en 50 mL de agua. Para cada uno de los ejemplos 32-36, se cargó 1 mL de la solución en un frasco de tapa de rosca de 5 mL. Se agregó al frasco halohidrina deshalogenasa en polvo (20 mg), seguido por 10 mg de (S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxo-hexanoato de fer-butilo (Julich Fine Chemicals). El frasco se tapó y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. Después se extrajo la mezcla de reacción con 1 mL de MTBE y la capa orgánica se analizó por HPLC. En cada ejemplo, el (R)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxo-hexanoato de íer-butilo reaccionó completamente. La secuencia de polipéptido de la halohidrina deshalogenasa usada en cada ejemplo y el rendimiento de reacción analizado de (R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxo-hexanoato de ter-butilo, fueron como sigue: Ejemplo 32, SEQ ID NO: 106, 25% Ejemplo 33, SEQ ID NO: 108, 15% Ejemplo 34, SEQ ID NO: 32, 15% Ejemplo 35, SEQ ID NO: 74, 10% Ejemplo 36, SEQ ID NO: 110, 10% EJEMPLOS 37-41 Preparaciones de (3R,5R)-6-ciano-3.5-dihidroxi-hexanoato de t-butilo a partir de (3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxi-3-hexanoato de t-butilo Se preparó una solución acuosa que contenía 28 mg/mL de cianuro de sodio a pH 6.7, disolviendo 1.4 g de NaCN y 6 g de NaH2PO4 en 50 mL de agua. Para cada uno de los ejemplos 37-41 , se cargó 1 mL de la solución en un frasco de tapa de rosca de 5 mL. Se agregó al frasco halohidrina deshalogenasa en polvo (20 mg), seguido por 20 mg de (3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato de íer-butilo (Chemistry - A European Journal (2001), 7 (21), 4562-4571). El frasco se tapó y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas. Después se extrajo la mezcla de reacción con 1 ml_ de acetato de etilo y la capa orgánica se analizó por HPLC. En cada ejemplo solo se detectó el (3R,5S)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de íer-butilo y (3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxi-3-hexanoato de fer-butilo sin reaccionar. La secuencia de polipéptido de la halohidrina deshalogenasa usada en cada ejemplo y el rendimiento de reacción analizado de (3R,5R)-6-ciano-3,5-d¡hidroxihexanoato de t-butilo, fueron como sigue: Ejemplo 37, SEQ ID NO: 100, 83% Ejemplo 38, SEQ ID NO: 108, 65% Ejemplo 39, SEQ ID NO: 32, 64% Ejemplo 40, SEQ ID NO: 74, 63% Ejemplo 41 , SEQ ID NO: 102, 81% En una reacción de control, omitiendo la halohidrina deshalogenasa, la conversión fue del 4%. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y otros documentos citados en esta solicitud, se incorporan en la presente como referencia en su totalidad para todos los fines, como si se indicara individualmente que cada publicación, patente, solicitud de patente u otro documento individual se incorporara como referencia para todos los fines. Aunque se han ilustrado y descrito las modalidades preferidas de la invención, se apreciará que se le pueden hacer varios cambios sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir un éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales a partir de un éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, el método comprendiendo: (a) proveer un éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en donde el sustituyente halógeno se selecciona del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo, y en donde el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales no es un éster de ácido 4-halo-3-hidroxibutírico; y (b) poner en contacto el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, con una halohidrina deshalogenasa y cianuro, bajo condiciones adecuadas para formar una mezcla de reacción para convertir el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en un éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales, es un éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales no racémico.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el cianuro es provisto por ácido cianhídrico.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el cianuro es provisto por una sal de cianuro. 5 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el sustituyente halógeno del éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, se selecciona de cloro y bromo. 6 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales es un éster de ácido carboxílico sustituido con cloro e hidroxi vecinales. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales es un éster de alquilo inferior. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque: (1) el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales tiene la estructura: y (2) el éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales tiene la estructura: en donde: X es un halógeno seleccionado del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; R1, R2 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, flúor, un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilo sustituido opcionalmente, un alquenilo inferior sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente, un arilalquilo sustituido opcionalmente, amino, un alquilamino inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilamino sustituido opcionalmente, un alcoxi inferior sustituido opcionalmente, un cicloalcoxi sustituido opcionalmente, un ariloxi sustituido opcionalmente y un arilalcoxi sustituido opcionalmente; y R5 se selecciona del grupo que consiste de un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilo sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente y un arilalquilo sustituido opcionalmente; y cada Mn se selecciona independientemente de -C(=0)- (esto es, carbonilo) o -CRn Rn ', en donde Rn' y Rn se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, flúor, un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilo sustituido opcionalmente, un alquenilo inferior sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente, un arilalquilo sustituido opcionalmente, amino, un alquilamino inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilamino sustituido opcionalmente, un alcoxi inferior sustituido opcionalmente, un cicloalcoxi sustituido opcionalmente, un ariloxi sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente, hidroxilo, nitro, amino, ciano, carboxi (esto es, un grupo carboxilato o ácido carboxílico), carboalcoxl (esto es, un grupo éster), carbamida (esto es, un grupo amido) y acilo (esto es, que forma una cetona); y n es cero o un entero de 2 a 9, inclusive. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque n es un entero de 2 a 8, inclusive. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque n es 3. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales, es un éster de ácido 6-halo-5-hidroxihexanoico. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque: (1) el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales tiene la estructura: y (2) el éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales tiene la estructura: en donde: X es un halógeno seleccionado del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; R1, R2, R3, R4, R6, Rr, R1 ', R3' y R3" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, flúor, un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilo sustituido opcionalmente, un alquenilo inferior sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente, un arilalquilo sustituido opcionalmente, amino, un alquilamino inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilamino sustituido opcionalmente, un alcoxi inferior sustituido opcionalmente, un cicloalcoxi sustituido opcionalmente, un ariloxi sustituido opcionalmente y un arilalcoxi sustituido opcionalmente; y R5 se selecciona del grupo que consiste de un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilo sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente y un arilalquilo sustituido opcionalmente. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque: (1) el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales tiene la estructura: y (2) el éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales tiene la estructura: en donde: X es un halógeno seleccionado del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; R1, R2, R3, R4, R5, R1', R1", R2", R3' y R3" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, flúor, un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilo sustituido opcionalmente, un alquenilo inferior sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente, un ariialquilo sustituido opcionalmente, amino, un alquilamino inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilamino sustituido opcionalmente, un alcoxi inferior sustituido opcionalmente, un cicloalcoxi sustituido opcionalmente, un ariloxi sustituido opcionalmente y un arilalcoxi sustituido opcionalmente; y R5 se selecciona del grupo que consiste de un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilo sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente y un ariialquilo sustituido opcionalmente. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque: (1) el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales tiene la estructura: y (2) el éster de ácido carboxilico sustituido con ciano e hidroxi vecinales tiene la estructura: en donde: X es un halógeno seleccionado del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; R1, R2 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, flúor, un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicioalquilo sustituido opcionalmente, un alquenilo inferior sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente, un arilalquilo sustituido opcionalmente, amino, un alquilamino inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilamino sustituido opcionalmente, un alcoxi inferior sustituido opcionalmente, un cicloalcoxi sustituido opcionalmente, un ariloxí sustituido opcionalmente y un arilalcoxi sustituido opcionalmente; y R5 se selecciona del grupo que consiste de un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicioalquilo sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente y un arilalquilo sustituido opcionalmente. 1

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado además porque la halohidrina deshalogenasa es una halohidrina deshalogenasa natural. 1

6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la halohidrina deshalogenasa es una halohidrina deshalogenasa no natural 1

7. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la mezcla de reacción para convertir el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en un éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales, se mantiene a un pH en la escala de aproximadamente 5 a aproximadamente 9. 1

8. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la mezcla de reacción para convertir el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en un éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales, se mantiene a un pH en la escala de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. 1

9. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la mezcla de reacción para convertir el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en un éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales, se mantiene a un pH de aproximadamente 8 o menor. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la mezcla de reacción para convertir el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en un éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales, comprende adicionalmente un amortiguador de pH. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende: (c) agregar una base suficiente para mantener la mezcla de reacción para convertir el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en un éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales, a un pH de aproximadamente 5 o mayor. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la base se selecciona de sales de hidróxido, sales de carbonato y sales de bicarbonato. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la base se selecciona de una sal de cianuro. 24. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende recuperar el éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales, de la mezcla de reacción para convertir el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en un éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque comprende purificar el éster de ácido carboxílico sustituido con ciano e hidroxi vecinales. 26.- Una composición que comprende: (a) una halohidrina deshalogenasa; (b) cianuro; y (c) un éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales, en donde el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales no es un éster de ácido 4-halo-3- hidroxibutírico. 27.- La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque el éster de ácido carboxílico sustituido con halógeno e hidroxi vecinales tiene la estructura: en donde: X es un halógeno seleccionado del grupo que consiste de cloro, bromo y yodo; R1, R2 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, flúor, un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilo sustituido opcionalmente, un alquenilo inferior sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente, un arilalquilo sustituido opcionalmente, amino, un alquilamino inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilamino sustituido opcionalmente, un alcoxi inferior sustituido opcionalmente, un cicloalcoxi sustituido opcionalmente, un ariloxi sustituido opcionalmente y un arilalcoxi sustituido opcionalmente; y R5 se selecciona del grupo que consiste de un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilo sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente y un arilalquilo sustituido opcionalmente; y cada Mn se selecciona independientemente de -C(=0)- (esto es, carbonita) o -CRnRn", en donde Rn' y Rn se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, flúor, un alquilo inferior sustituido opcionalmente, un cicloaiquilo sustituido opcionalmente, un alquenilo inferior sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente, un arilalquilo sustituido opcionalmente, amino, un alquilamino inferior sustituido opcionalmente, un cicloalquilamino sustituido opcionalmente, un alcoxi inferior sustituido opcionalmente, un cicloalcoxi sustituido opcionalmente, un ariloxi sustituido opcionalmente, un arilo sustituido opcionalmente, hidroxilo, nitro, amino, ciano, carboxi (esto es, un grupo carboxilato o ácido carboxílico), carboalcoxi (esto es, un grupo éster), carbamida (esto es, un grupo amido) y acilo (esto es, que forma una cetona); y n es cero o un entero de 2 a 9, inclusive.