CN115997026A - 通过拜尔-维利格单加氧酶将法呢基丙酮转化成乙酸高法呢基酯 - Google Patents

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Abstract

生产乙酸高法呢基酯的方法，其包括在辅因子存在下使法呢基丙酮与拜尔‑维利格单加氧酶(BVMO)接触。所述方法可进一步包括将乙酸高法呢基酯水解成高法呢基醇。

Description

通过拜尔-维利格单加氧酶将法呢基丙酮转化成乙酸高法呢基酯
技术领域
本发明涉及制备高法呢醇，特别是(3E,7E)-高法呢醇及其乙基衍生物的新方法。
背景
高法呢醇是用于生产广受欢迎的香料成分(-)-降龙涎香醚(Ambrox)(3a,6,6,9a-四甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃)的重要中间体。文献描述了用于制备高法呢醇的各种方法。例如，以冗长的步骤从橙花叔醇(3,7,11-三甲基十二碳-1,6,10-三烯-3-醇)开始，经高法呢酰胺合成高法呢醇(A.F.Barrero等人,J.Org.Chem.1996,61,2215)。可替代地，高法呢醇可以在极性溶剂和卤化钯催化剂存在下通过橙花叔醇的脱羰作用来制备(WO92/06063)。P.Kociensiki等人已经描述了用于生产高法呢醇的另一种方法(J.Org.Chem.1989,54,1215)，所述方法从二氢呋喃开始通过五个阶段经高香叶醇进行。最近，文献(WO2013/156398)中已经描述了从香叶基丙酮开始经维蒂希(Wittig)烯化、随后环丙烷开环和甲酰氧基化合成高法呢醇。
所有迄今已知的方法都有缺点，例如，使用的试剂昂贵，工艺条件没有经济吸引力(例如，温度低于0℃，使用的试剂有毒，和/或使用的溶剂易燃。
因此，需要提供用于制造高法呢醇和乙基高法呢醇和/或其前体的新的或改善的方法。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了一种从式(II)的酮生产式(I)的乙酸酯的方法，
Figure BDA0004018959130000021
其中R为甲基或乙基，
Figure BDA0004018959130000022
其中R具有以上给出的含义，
所述方法包括在辅因子存在下使式(II)的化合物与拜尔-维利格(Baeyer-Villiger)单加氧酶(BVMO)接触。
根据本发明的第二个方面，提供了一种从通过本发明的第一个方面的方法获得的式(I)的乙酸酯通过水解生产式(III)的醇的方法，
Figure BDA0004018959130000023
其中R为甲基或乙基。
根据本发明的第三方面，提供了通过本发明的第一方面的方法获得和/或可获得的式(I)的乙酸酯作为用于生成式(III)的醇的前体的用途，所述式(III)的醇任选地用作酶介导的香料成分生产的底物。
本发明的任何方面的某些实施方案可以提供以下优点中的一个或多个：
·至高法呢醇/乙基高法呢醇的前体的不寻常且新颖的生物途径，
·用于实施绿色化学和环境友好型合成工艺的酶技术的用途。
本文将进一步描述提供的与本发明的任何特定一个或多个所述方面相关的细节、实施例和优选方案，并且同样地适用于本发明的所有方面。除非本文另有表明或上下文另有明显矛盾，本文描述的实施方案、实施例和优选方案的任何组合以其所有可能的变型包含于本发明中。
附图的简要说明
图1显示了在NAD或NADP与葡萄糖脱氢酶的组合存在下，法呢基丙酮随时间的转化率。
图2显示了在不同浓度的丙酮或异丙醇存在下，法呢基丙酮随时间的转化率。
详细说明
本发明基于以下令人惊讶的发现：具有直链烯烃链的式(II)的酮在拜尔-维利格单加氧酶(BVMO)存在下进行氧化，得到乙酸酯，其可以用作用于制备醇例如高法呢醇或乙基高法呢醇的前体。
已知BVMO酶可以催化酮向酯的转化。然而，所报道的那些酶仅被描述在生物系统中作用于环状底物(包括萜烯酮和苯并稠合酮)、脂族酮和脂族羟基酮。令人惊讶地，目前发现通过BVMO酶还催化了由式(II)定义的多不饱和支链酮向式(I)的乙酸酯的转化。文献中没有报道BVMO酶可以作用于多不饱和支链酮。
因此，本文提供了一种从式(II)的酮生产式(I)的乙酸酯的方法，
Figure BDA0004018959130000031
其中R为甲基或乙基，
Figure BDA0004018959130000032
其中R具有以上给出的含义，
所述方法包括在辅因子存在下使式(II)的化合物与拜尔-维利格单加氧酶(BVMO)接触。
式(II)的化合物以四种不同立体异构体的形式存在，例如，作为具有5E,9E-或5Z,9E-构型的式(II)的化合物。
在某些实施方案中，所述方法包括在不存在式(II)的任何其他立体异构体下，使式(II)的5E,9E-化合物与BVMO酶接触。
在其他实施方案中，式(II)的化合物可以例如为立体异构体的混合物。在某些实施方案中，所述混合物包含式(II)的5E,9E-化合物和一种或多种式(II)的其他立体异构体。
在某些实施方案中，所述混合物包含式(II)的5E,9E-化合物和式(II)的5E,9Z-化合物。
在某些实施方案中，所述混合物包含作为主要成分的式(II)的5E,9E-化合物。主要成分意指混合物中存在的5E,9E-化合物的重量％大于式(II)的5Z,9E-化合物的重量％。
当R为甲基时，所述式(II)的化合物可以称为法呢基丙酮，包含E,E-法呢基丙酮、E,Z-法呢基丙酮、Z,E-法呢基丙酮、Z,Z-法呢基丙酮和其混合物。
当R为乙基时，所述式(II)的化合物可以称为乙基法呢基丙酮，包含E,E-乙基法呢基丙酮、E,Z-乙基法呢基丙酮、Z,E-乙基法呢基丙酮、Z,Z-乙基法呢基丙酮和其混合物。
其中R为甲基的式(II)的化合物是商业可获得的。其中R为乙基的式(II)的化合物就其自身而言是新颖的。它可以按照实施例11中描述的方法从5,9-二甲基癸-4,8-二烯醛合成。
如本文所用，术语“BVMO(拜尔-维利格单加氧酶)”指可以催化各种氧化反应的单加氧酶，所述氧化反应包括用于通过氧化式(II)的酮生产式(I)的酯化合物的拜尔-维利格氧化。
BVMO酶可以是野生型酶或修饰酶。如本文所用，术语“野生型”无论是在关于多肽例如酶，多核苷酸例如基因，生物体，细胞，还是在关于任何其他物质时，其均指所述物质的天然存在形式。如本文所用，术语“修饰的”在关于多肽例如酶，多核苷酸例如基因，生物体，细胞或任何其他物质时，其均指与野生型不同的这种物质。可以产生修饰物质的对野生型物质的适当改变包括对遗传物质的改变、对蛋白质物质的改变。对遗传物质的改变可以包括本领域已知的任何遗传修饰，其将使该物质与野生型不同。这种遗传修饰的实例包括但不限于：缺失、插入、取代、融合等，其可以在含有待修饰的相关一个基因或多个基因的多核苷酸序列上进行。
关于本发明的目的，只要BVMO酶在宿主细胞中产生，并且能够催化从式(II)的酮产生具有引入至其链中的酯基的式(I)的乙酸酯的反应(例如，来自法呢基丙酮的乙酸高法呢基酯)，所述BVMO可以为但不特别限于源自以下微生物的BVMO：例如假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、红球菌属(Rhodococcus sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、丛毛单胞菌属(Comanonas)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、短枝单胞菌属(Brachymonas sp.)、喜热裂孢菌属(Themobifida sp.)、戈登氏菌属(Gordonia sp.)、假栖大洋菌属(Pseudooceanicola sp.)等，更优选地，源自以下微生物的BVMO：假单胞菌属、短枝单胞菌属、假栖大洋菌属或不动杆菌属，和最优选地，源自以下微生物的BVMO：不动杆菌属、假单胞菌属(例如韦龙氏假单胞菌(Pseudomonas veronii))、短枝单胞菌属(例如Brachymonas petroleovorans)或假栖大洋菌属(例如巴兹假栖大洋菌(Pseudooceanicola batsensis))。在一个特别的实施方案中，所述BVMO源自不动杆菌属或假单胞菌属(例如韦龙氏假单胞菌)。BVMO编码基因的核苷酸序列可以从已知的数据库例如NCBI的GenBank中获得。
酶也可以根据EC分类通过它们的功能来定义。酶学委员会编号(EC编号)是酶的数字分类方案，基于它们催化的化学反应。适合于进行本文所述转化的BVMO可以例如属于EC1.4.13类(作用于成对供体的氧化还原酶，以NADH或NADPH作为一个供体掺入或还原分子氧，并将一个氧原子掺入另一个供体)。
所述BVMO可以例如为以下实施例中使用的BVMO酶的一种或多种，例如从EnzymeWorks,Inc.,San Diego(USA)获得的EW-103(其为野生型不动杆菌属BVMO酶的变体)，或者从Gecco Biotech B.V.获得的MekA。
拜尔-维利格单加氧酶辅因子(BVMO-辅因子)是在催化反应期间辅助BVMO酶的辅因子。在本文提供的方法中使用的BVMO-辅因子可以是适合于辅助将式(II)的酮转化成式(I)的乙酸酯的任何类型。所述辅因子可以例如为无机分子或有机分子。所述BVMO-辅因子可以例如选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，或其组合。
优选地，所述BVMO-辅因子以相对于BVMO的起始摩尔浓度存在于反应混合物中，例如BVMO酶被NAD(P)H饱和。因此，优选地，所述NAD(P)H以至少等于BVMO酶浓度的浓度存在于反应混合物中。
在本发明的一个实施方案中，所述NAD(P)H以约1至10mg/ml，例如1至5mg/ml，或1至4mg/ml的起始浓度存在于反应混合物中。
通常，辅因子太昂贵而不能以化学计量量使用，并且期望它们再生。此外，通过再生辅因子，有可能提高期望的转化的效率或促进产物分离，从而进一步降低工艺成本。为此，经常使用辅因子再生系统。
葡萄糖脱氢酶(GDH)通常用于NAD(P)H的再生。例如，GDH酶可从Codexis Inc.(GDH-105、GDH-901、CDX-019)、Johnson Matthey(GDH-101)或EnzymeWorks(GDH-EW)购得。另外的GDH酶可以根据文献获得，例如来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶：(UniProtKB登录号：P12310,E.C.1.1.1.47,(1986)J.Bacteriol.1986,166,238-43)。GDH酶通常与例如用于辅因子再生的葡萄糖组合使用。可替代地，当与例如异丙醇组合时，如果不干扰由特别的BVMO酶催化的反应，醇脱氢酶(ADH)酶可以用于辅因子再生。
可以用于辅因子再生的其他酶是例如与例如亚磷酸钠组合的亚磷酸脱氢酶(PTDH)。
拜尔-维利格单加氧酶可以以本领域已知的任何合适的形式存在于反应混合物中，例如但不限于：无细胞提取物，或含于宿主生物体细胞内，并且这些可以以本领域已知的任何合适方式位于反应混合物中，例如但不限于：以溶液/悬浮液中的游离形式，或以纯化的和/或固定化的形式(保持在膜上，或结合到柱上/柱内)。优选地，BVMO以生产所需量的式(I)的乙酸酯必需的浓度存在于反应混合物中，所述式(I)的乙酸酯能够在溶解氧的相对水平下被生产。
在一个实施方案中，所述拜尔-维利格单加氧酶作为从产生它的细胞制备的细胞提取物存在于反应混合物中，其中所述细胞优选是用于产生所述MO酶的细菌宿主细胞。所述细胞提取物可以通过能够裂解宿主细胞的任何合适的方法获得，包括但不限于：超声处理、RNA酶/溶菌酶处理、冻融处理或碱处理。
优选地，然后处理细胞提取物以去除细胞碎片，之后在本文所述的方法中用作拜尔-维利格单加氧酶的来源。所述细胞裂解物可以通过本领域已知的任何合适的方法处理，包括但不限于：过滤、离心或用盐纯化以获得澄清的细胞提取物。
在BVMO-辅因子已经被用于辅助式(II)的酮为转化成式(I)的乙酸酯之后，辅因子再生系统用于再生BVMO-辅因子。辅因子再生系统可以例如再生还原形式的辅因子，例如NADH和/或NADPH。在本文提供的方法中使用的辅因子再生系统可以是适合于再生BVMO-辅因子的任何类型，所述BVMO-辅因子可用于通过BVMO酶将式(II)的酮转化成式(I)的乙酸酯(例如法呢基丙酮至乙酸高法呢基酯)。
因此，另一方面提供了从式(II)的酮生产式(I)的乙酸酯的方法，所述方法包括在辅因子和辅因子再生系统存在下使式(II)的酮与BVMO酶接触。
在一个特定的实施方案中，所述辅因子再生系统为ADH/异丙醇辅因子再生系统。
在另一个特定的实施方案中，所述辅因子再生系统为GDH/葡萄糖辅因子再生系统。
在另一个特定的实施方案中，所述辅因子再生系统为亚磷酸脱氢酶/亚磷酸辅因子再生系统。
与GDH/葡萄糖系统相比，使用ADH/异丙醇辅因子再生系统具有反应介质不会酸化的优点。
从式(II)的酮生产式(I)的乙酸酯的方法是在允许式(II)的酮转化成式(I)的乙酸酯的时间、温度、pH和增溶剂的条件下进行。
反应混合物的pH可以在4至9，优选地在7至9的范围内(其包括约8.5的pH)，并且可以通过向反应混合物中添加缓冲液或pH校正剂来维持。用于此目的的示例性缓冲液为Tris-HCl缓冲液或甘氨酸/NaOH缓冲液。
对于所考虑的BVMO酶，温度为约15℃至约60℃，例如约15℃至约50℃、或约15℃至约45℃、或约30℃至约60℃或约35℃至约55℃。在生物转化过程中，温度可以保持恒定或者可以被改变。
本文提供的方法可以进一步包括将式(I)的化合物纯化和/或与任何未反应的式(II)的化合物分离。例如可以将式(I)的化合物通过溶剂萃取(例如使用甲苯、己烷、叔丁基甲基醚(tBME))和/或蒸馏纯化。
在本发明的另一方面，可以使式(I)的化合物进一步反应。例如，式(I)的化合物可以被水解成式(III)的化合物
Figure BDA0004018959130000081
其中R是甲基或乙基。
在某些实施方案中，水解可以是生物催化的，并且任选地发生于相同的反应发酵液(broth)中。
可替代地，式(I)的化合物可以被化学水解，优选地在纯化之后，例如在碳酸钾存在下在甲醇溶液中。
由此获得的醇可以用作例如用于生物催化转化的底物。
在某些实施方案中，其中R为甲基的式(III)的化合物可以在SHC(角鲨烯何帕烯(Hopene)环化酶)酶存在下被转化成(-)-降龙涎香醚。
在某些实施方案中，其中R为乙基的式(III)的化合物可以被转化成乙基龙涎呋喃(Ethylambrofix)(其在WO2021/110858中有更详细的描述)。
本文描述的实施例是对本公开的说明并且不旨在对其进行限制。根据本公开，已经描述了本公开的不同实施方案。在不脱离本公开的精神和范围下，可以对本文描述和说明的技术进行许多修饰和变化。因此，应当理解，实施例仅是说明性的并且不限制本发明的范围。
实施例
实施例1：气相色谱(GC)分析，转化率的计算
将1μl溶剂相(溶剂萃取的样品)注射(分流比3)至30m x 0.32mm x 0.25μmZebron ZB-5柱中。该柱在恒定的流量(4ml/min H2)下展开，温度梯度为：100℃、15℃/min至200℃、120℃/min至240℃、在240℃下4分钟。入口温度：250℃，检测器温度：250℃(Thermo Trace 1310GC设备)。
如下，由记录的底物和产物峰面积计算法呢基丙酮转化率：
转化率(％)：100x(产物峰面积/(产物峰面积+底物峰面积)
实施例2：法呢基丙酮与乙硫异烟胺单加氧酶(EthA)的BVMO反应
用于EthA生产的用质粒转化的大肠杆菌TOP10(GenBank:AAK48336.1,UniProtKBP9WNF8,Fraaije等人2004,J.Biol.Chem.279(5),3354)在补充有100μg/ml氨苄西林和200μg/ml FAD的200ml LB培养基中生长至OD650nm为0.75(37℃，200rpm)。然后通过添加0.2％阿拉伯糖诱导酶生产的诱导。将法呢基丙酮(0.1％)添加至培养物，随后在30℃下进一步培育23h。对培养物取样并用甲基叔丁基醚(MTBE)提取，用于底物和产物含量的GC分析。通过GC-MS分析确认反应产物的同一性。在两组独立的实验中，法呢基丙酮向乙酸高法呢基酯的转化率为2-5％。
实施例3：法呢基丙酮与环十五烷酮单加氧酶(CPDMO)的BVMO反应
从大肠杆菌BL21(DE3)细胞生产CPDMO，该大肠杆菌BL21(DE3)细胞用pJ401衍生的质粒转化用于CPDMO生产(GenBank AB232538.1，UniProtKB Q1T7B5)。
将200ml LB培养基培养物(50μg/ml卡那霉素)从过夜的接种培养物接种，在28℃、160rpm下培育约3.5h至OD650nm为0.500-0.600。将IPTG添加至0.8mM用于诱导酶生产。将培养物在28℃、160rpm下进一步培育3-4h。通过离心收获细胞并洗涤。将回收的细胞沉淀悬浮于2.5ml反应缓冲液(50mM Tris-Cl pH 9.0)中，通过超声处理使细胞破裂。最后向经超声处理的物质添加16.5ml 50mM Tris-HCl pH 9.0，得到CPDMO粗制酶制剂。为了分析酶活性，向950μl粗制CPDMO酶制剂添加10μl法呢基丙酮和40μl 50mM NADH。将反应在30℃下培育3h，用MTBE提取并进行GC分析。法呢基丙酮向乙酸高法呢基酯的转化率为约7％。
实施例4：法呢基丙酮与EnzymeWorks BVMO酶的BVMO反应
试验了从酶供应商EnzymeWorks,Inc,(http://www.enzymeworking.com)可获得的八种拜尔-维利格单加氧酶将法呢基丙酮转化成乙酸高法呢基酯的能力。在100mM甘氨酸/NaOH缓冲液pH 9.0中，反应含有2g/l法呢基丙酮、25mM葡萄糖、1mM NADP、2g/l BVMO酶、2g/l葡萄糖脱氢酶(GDH)。将反应在30℃下温和摇动(70rmp)培育24。用1.5ml MTBE提取0.5ml反应用于GC分析。使用EW-103BVMO，在24h内法呢基丙酮转化率为约50％。
实施例5：法呢基丙酮与Gecco-Biotech BVMO酶的BVMO反应
由Gecco Biotech(http://www.gecco-biotech.com/)供应的BVMO酶(野生型酶或变体酶)被应用于将法呢基丙酮转化成乙酸高法呢基酯。BVMO酶作为具有亚磷酸脱氢酶(PTDH)的纯化的融合蛋白提供。在50mM Tris HCl(pH 7.5)缓冲液(1ml反应体积)中，在20μM BVMO、1mM NADP和100mM Na2HPO3.5H2O存在下，20mM法呢基丙酮(约5g/l)在24℃下反应20小时。
下表中总结的结果表明法呢基丙酮转化率在3％和52％之间，其取决于使用的BVMO酶。
表中使用的缩写为：“n.a.”：不适用。“STMO”：类固醇单加氧酶。“PAMO”：苯丙酮单加氧酶。“HAPMO”：4-羟基苯乙酮单加氧酶。“ACMO”：丙酮单加氧酶。“CPDMO”：环十五烷酮1,2-单加氧酶。
Figure BDA0004018959130000101
Figure BDA0004018959130000111
实施例6：BVMO酶EW-103的辅因子需求
使用EW-103BVMO研究了是否NADPH和NADH两者都可以在法呢基丙酮转化中作为辅因子起作用。
在50mM Tris-HCl缓冲液pH 8.5与7.6mM法呢基丙酮、1mM辅因子、2mg/ml BVMOEW-103、2mg/ml GDH和25mM葡萄糖(5ml体积，Heidolph Synthesis 1，30℃，900rmp)中进行反应。在一个反应中，由NAD替代NADP。NADH作为辅因子支持法呢基丙酮转化，但令人惊讶地，在培育两小时后，法呢基丙酮转化突然停止在约20％转化率。以大约相同的时间，当使用NADPH作为辅因子时，获得了法呢基丙酮的完全转化。
重复反应，使用两种不同的葡萄糖脱氢酶(GDH)以及增加的NAD浓度(1、2和5mM)。独立于应用的NAD浓度和使用的GDH酶，法呢基丙酮转化停止在约20％，而当NADPH为辅因子时再次实现完全转化(见图1)。
实施例7：辅因子再生系统
可以设想在使用葡萄糖或异丙醇时使用葡萄糖脱氢酶(GDH)或醇脱氢酶(ADH)用于辅因子再生。研究了使用ADH/异丙醇代替GDH/葡萄糖的可能性，试验了EW-103对异丙醇和丙酮的敏感性。
在50mM Tris-HCl缓冲液pH 8.5与7.6mM法呢基丙酮(2g/l)、1mM NADP、2g/l BVMOEW-103、2g/l GDH和25mM葡萄糖(5ml，Heidolph Synthesis 1，30℃，900rpm)中进行的反应中，将异丙醇或丙酮添加至5％和10％(v/v)。
向反应添加5％异丙醇或丙酮对法呢基丙酮转化率没有影响。当异丙醇或丙酮添加至10％时，法呢基丙酮转化率降低。当反应含有10％异丙醇时，24h内法呢基丙酮转化率仅为64％左右。EW-103BVMO对丙酮添加不太敏感：在含有10％丙酮的反应中，24h内法呢基丙酮转化率为80％(见图2)。
这个结果表明了使用醇脱氢酶(ADH)/异丙醇辅因子再生系统的可能性。ADH酶可从许多酶制造商和供应商处获得(例如来自Codexis Inc.的KRED-P2-H07)。
在1mM NADPH、1g/L BVMO EW-103、0.5g/L ADH(Codexis KRED-P2-H07)、35mM异丙醇(150mL总体积)存在下，在50mM Tris-Cl缓冲液pH 8.5与8g/l法呢基丙酮(30.5mM)中进行的反应中确认了ADH/异丙醇辅因子再生系统的用途。24小时内法呢基丙酮转化率为约75％。在这个反应设置中，用1g EW-103BVMO酶将约6g法呢基丙酮转化成乙酸高法呢基酯。此转化收率高于在类似实验中使用GDH/葡萄糖辅因子再生系统进行的转化收率，并且在GDH/葡萄糖辅因子再生系统中1g BVMO EW-103酶仅能转化3.6g法呢基丙酮。
实施例8：BVMO法呢基丙酮转化的反应产物
通过GC-MS分析鉴定乙酸高法呢基酯为使用BVMO酶的法呢基丙酮转化的产物。
在一些反应中，有趣地且令人惊讶地观察到乙酸高法呢基酯和高法呢醇两者作为反应产物产生。预料这是由于BVMO非依赖性的反应催化乙酸高法呢基酯水解的结果，例如通过脂肪酶(存在于使用的酶冻干物或细胞提取物中)。这没有进一步研究，但可以预料法呢基丙酮向乙酸高法呢基酯的氧化步骤和随后的乙酸高法呢基酯向高法呢醇的水解可以在一锅反应中被催化，该一锅反应将BVMO催化的反应与例如适当的脂肪酶催化水解乙酸高法呢基酯和应用适当的反应条件组合。
实施例9：工艺相关的反应条件和转化收率
在27g/l异丙醇(0.44M)与9g/l BVMO EW-103、3.2g/l ADH KRED-P2-H07和1.5g/lNADPH(2mM)存在下，以106g/l底物(0.4M)使用EW-103BVMO进行法呢基丙酮转化。在30℃下，在50mM Tris-Cl缓冲液pH 8.5中进行反应，并且持续搅拌。用MTBE提取反应样品用于GC分析。48小时的反应后，法呢基丙酮转化率为约70％，对应于每克BVMO酶8克法呢基丙酮的转化收率。
在27g/l异丙醇(0.44M)存在下，以106g/l底物(0.4M)进行进一步反应，改变其他反应参数：BVMO、ADH和NADPH浓度设置如下：
(1)45g/l、10g/l、5mM，或
(2)5g/l、10g/l、0.5mM
大约24小时的反应后，根据用MTBE提取的反应样品判断，(1)中法呢基丙酮的转化率为86.2％，表示每克BVMO酶2g法呢基丙酮的转化收率。根据用MTBE提取的反应样品判断，(2)中法呢基丙酮的转化率为59％，对应于每克BVMO酶转化约12.5g法呢基丙酮的转化收率。
这个结果证明用BVMO酶(例如BVMO EW-103)在大约24小时内完全转化法呢基丙酮的可能性是高的，并且仔细设置酶与底物的比率将提高转化收率(定义为每克BVMO酶转化的g底物)和生产率(根据每克BVMO酶的法呢基丙酮转化率和反应的小时定义)。
实施例10：用BVMO酶转化乙基法呢基丙酮
用EnzymeWorks BVMO EW-103对乙基法呢基丙酮(四种异构体的混合物)进行BVMO氧化。在50mM甘氨酸/NaOH缓冲液pH 9.0中，反应(5ml体积)含有2g/l底物、2g/l BVMO酶、0.5g/l NADP、4.5g/l葡萄糖、2g/l GDH。在30℃、650rpm(Heidolph Synthesis 1设备)下培育反应。开始后5、12.5和48h对反应取样，提取(0.6ml反应至0.7ml MTBE)并通过GC-FID分析底物/产物含量。从四个异构体底物峰中鉴定出四种反应产物。GC-MS分析鉴定乙基法呢基丙酮被转化成乙酸高乙基法呢基酯。观察到总体转化率为25-30％。
例如使用例如脂肪酶进一步水解反应产物乙酸高乙基法呢基酯将产生乙基高法呢醇，其为用角鲨烯何帕烯环化酶(SHC)环化成乙基龙涎呋喃的底物。
实施例11：乙基法呢基丙酮
在-50℃下，在30分钟期间，将乙基溴化镁在乙醚中的溶液(3M，175mL，525mmol，1.2当量)滴加至5,9-二甲基癸-4,8-二烯醛(E/Z-混合物，78.8g，437mmol)在乙醚(200mL)中的溶液中。添加完成后去除冷却浴，并搅拌混合物1小时。然后将其倒入2M HCl水溶液(200mL)中，并用甲基叔丁基醚(MTBE，150mL)萃取混合物。有机层用水和稀释的NaCl水溶液洗涤至pH中性并经MgSO4干燥。过滤并在旋转蒸发器中去除溶剂后，获得澄清无色液体(79.2g，86％)，将其溶解于丙酮(200mL)中。冷却至0℃后，滴加琼斯试剂(4M CrO3于H2SO4水溶液中，94.1mL)，在此期间温度升至43℃，并且混合物变成绿棕色。添加完后，在室温下搅拌混合物1h，然后添加附加量的琼斯试剂(30mL)并继续搅拌20分钟，然后加入2-丙醇(20mL)。如上进行后处理和萃取，得到澄清的黄色液体(74.8g)，将其在91-95℃(0.09mbar)下经10cm维格罗分馏柱(Vigreux column)蒸馏，得到7,11-二甲基十二碳-6,10-二烯-3-酮(50.1g，64％，E/Z-混合物)，为淡黄色澄清油。
在-5℃下，在30分钟期间，将7,11-二甲基十二碳-6,10-二烯-3-酮(34.0g，163mmol)在THF(100mL)中的溶液添加至新鲜制备的乙烯基溴化镁在THF中的溶液(0.9M，228mmol，1.4当量)中。在室温下搅拌所得的混合物20分钟，然后通过添加饱和NH4Cl水溶液(150mL)水解。如上进行进一步后处理，得到澄清的黄色液体(37.5g)，将其经10cm维格罗分馏柱通过蒸馏纯化，得到在90℃/0.07mbar下蒸馏的3-乙基-7,11-二甲基十二碳-1,6,10-三烯-3-醇(12.0g，31％，澄清无色液体，根据GC E/Z比为5:4)。
向该产物(12.0g，50.8mmol)中添加2-甲氧基丙烯(7.33g，102mmol，2当量)和磷酸(10mg)。将混合物放置于高压釜容器中并在170℃下搅拌3h。冷却至室温后，加入如上所述相同量的2-甲氧基丙烯和磷酸，并在170℃下搅拌混合物18h。冷却至室温后，将混合物在旋转蒸发器中浓缩，得到棕色液体(14.91g)，将其在库格尔若炉(Kugelrohr oven)中在150℃/0.05mbar下蒸馏，得到澄清的黄色液体(12.66g)，其通过快速色谱用庚烷/MTBE 95:5在硅胶上进一步纯化，得到6-乙基-10,14-二甲基十五碳-5,9,13-三烯-2-酮(6.51g,46％)，为无色液体(根据GC，E/Z异构体31/26/25/18％的混合物)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz):4.88-5.37(m,3H),2.46(d,J＝7.8Hz,2H),2.29(br d,J＝7.8Hz,2H),2.15(s,3H),1.96-2.11(m,10H),1.67-1.73(m,5H),1.60-1.65(m,4H),0.94-1.03(m,3H)。13C-NMR(CDCl3,101MHz):208.8(s),208.7(s),142.3(s),142.2(s),142.1(s),135.3(s),135.2(s),135.1(s),135.0(s),131.5(s),131.3(s),131.3(s),124.7(d),124.3(d),124.2(d),124.0(d),122.0(d),121.6(d),121.5(d),44.1(t),39.7(t),39.7(t),36.8(t),36.5(t),32.0(t),32.0(t),31.9(t),30.6(t),30.3(t),30.0(q),29.9(q),29.5(t),26.9(t),26.8(t),26.7(t),26.7(t),26.6(t),26.6(t),25.7(q),25.7(q),23.4(q),23.4(q),23.1(t),23.1(t),22.7(t),22.2(t),22.1(t),17.7(q),17.6(q),16.0(q),16.0(q),14.1(q),13.2(q),13.2(q),12.8(q)。MS(EI,70eV):276(M+,<1),218(<1),207(<1),149(10),136(15),121(28),107(10),95(16),81(36),69(89),55(15),43(100)。

Claims (5)

1.从式(II)的酮生产式(I)的乙酸酯的方法，
Figure FDA0004018959120000011
其中R为甲基或乙基，
Figure FDA0004018959120000012
其中R具有以上给出的含义，
所述方法包括在辅因子存在下使式(II)的化合物与拜尔-维利格单加氧酶(BVMO)接触。
2.权利要求1的方法，其中所述辅因子选自NADH和NADPH或其组合。
3.权利要求1至2的方法，其进一步包括辅因子再生系统的存在。
4.权利要求3的方法，其中所述辅因子再生系统为醇脱氢酶与异丙醇的组合。
5.权利要求1至4的方法，其中所述方法进一步包括将式(I)的乙酸酯水解成式(III)的醇，
Figure FDA0004018959120000013
其中R为甲基或乙基。
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