CN115851778A - 一种来自黄曲霉的嗜热烯还原酶、表达载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶催化领域，涉及一种工程菌，特别是指一种来自黄曲霉的嗜热烯还原酶、表达载体及其应用。发明提供了一种来自黄曲霉的新型嗜热烯还原酶AfOYE1，并建立该酶的过表达体系，获得过表达AfOYE1的大肠杆菌细胞，构建了AfOYE1酶催化碳碳双键不对称还原制备手性烷烃的方法。将来自黄曲霉中被标注为AfvA的基因克隆至表达载体获得重组载体pETDuet‑gdh‑afoye1，并将所述重组载体转化大肠杆菌获得重组细胞，以所述重组细胞为催化介质，将烯烃催化还原为手性烷烃。
Description
技术领域
本发明属于酶催化领域，涉及一种工程菌，特别是指一种来自黄曲霉的嗜热烯还原酶、表达载体及其应用。
背景技术
不对称还原碳碳双键C=C反应生成手性烷烃是合成许多药物、农药和材料的关键步骤，该催化过程可以得到含有一个或者两个手性中心的化合物。目前使用的化学催化C=C不对称还原过程需要采用氢气和昂贵的手性配体及过渡金属催化剂，因此存在操作过程危险和成本高等不足(Dong Wang; Didier Astruc; The Golden Age of TransferHydrogenation. Chemical Reviews 2015, 115(13), 6621-6686.)。
酶催化碳碳双键不对称还原具有催化条件温和、专一性高、过程控制简单等优点，因而被广泛的应用于手性烷烃的制备。专利202010195210.6中公开了一种烯还原酶突变体该突变体对于特定的底物：
式中R为H、OH、COOH等基团，在60 ℃时的半衰期仅为4h。另外，已知的嗜热烯还原酶的催化活性较低，如自枯草芽孢杆菌的嗜热烯还原酶YqiG催化不同烯烃（5 mol/L）反应24小时后，其转化率低于60%（Christin Peters;David Frasson; Martin Sievers; Rebecca Buller; Novel Old Yellow EnzymeSubclasses.Chembiochem2019,20(12), 1569-1577.）。在实际工业生产应用中，较高的反应温度为工业应用过程所必须的，如通过提高温度以增加底物的溶解度及提高反应速率等，因此开发新型高活性的嗜热烯还原酶对于酶催化碳碳双键不对称还原制备手性烷烃的工业应用非常关键。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出一种来自黄曲霉的嗜热烯还原酶、表达载体及其应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种来自黄曲霉的嗜热烯还原酶（AfOYE1），其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
包含上述的嗜热烯还原酶的核苷酸序列的表达载体。
上述表达载体还含有编码葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列。
一种催化剂，含有上述的表达载体。
上述的催化剂在高温催化碳碳双键不对称还原制备手性烷烃中的应用，包括以下步骤：
1）合成AfOYE1基因，并将所述AfOYE1基因插入到含有葡萄糖脱氢酶的pETDuet-gdh载体的多克隆位点，获得表达载体pETDuet-gdh-afoye1；
2）将表达载体pETDuet-gdh-afoye1转入大肠杆菌，获得表达AfOYE1酶和葡萄糖脱氢酶的重组载体；
3）用磷酸盐缓冲液将所述重组载体配制成5-20 g/L的菌悬液；
4）将菌悬液、D-葡萄糖和底物混合获得反应体系，180-240 rpm震荡反应2-48 h，反应结束后，采用乙酸乙酯萃取（2×20 mL），收集有机相，经无水硫酸钠干燥、过滤、蒸出溶剂获得粗产物，再采用石油醚和乙酸乙酯的体积比为50:1的溶液为流动相，硅胶（200-300目）柱层析获得目标产物；其中D-葡萄糖为10 g/L；底物在反应体中的浓度为1-10 g/L。
进一步的，上述步骤4）中底物为：2-环戊烯-1-酮、2-环己烯-1-酮、2-甲基-2-环戊烯-1-酮、2-甲基-2-环己烯-1-酮、丙烯酰胺、反式-β-硝基苯乙烯、1-苯基-2-硝基丙烯、顺式-柠檬醛或马来酰亚胺等；
进一步的，上述目标产物：环戊酮、环己酮、(S)-2-甲基环戊酮、(S)-2-甲基环己酮、丙酰胺、β-硝基苯乙烷、2-硝基-1-苯基丙烷、香茅醛。
进一步的，上述磷酸盐缓冲溶液为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05-0.15 mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH值为5.5-8.0。
进一步的，上述震荡反应的温度为25-80℃。
优选的，上述震荡反应的温度为45-80℃。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种来自黄曲霉的新型嗜热烯还原酶AfOYE1，并建立该酶的过表达体系，获得过表达AfOYE1的大肠杆菌细胞，构建了AfOYE1酶催化碳碳双键不对称还原制备手性烷烃的方法。将来自黄曲霉中被标注为AfvA的基因克隆至表达载体获得重组载体pETDuet-gdh-afoye1，并将所述重组载体转化大肠该菌获得重组细胞，以所述重组细胞为催化介质，将烯烃催化还原为手性烷烃。
2、本发明所述方法中使用的嗜热烯还原酶AfOYE1在80 ℃的条件下仍然具有催化活性，其最优的反应温度为45 ℃。与传统的烯还原酶相比，该酶具有优异的热稳定性，AfOYE1可以在45 ℃甚至更高的温度下催化碳碳双键还原，更高的反应温度可以有效提高反应速率及底物在催化体系中的溶解度。
3、嗜热烯还原酶AfOYE1能够高效催化邻位具有羰基、硝基、酰胺等吸电子基团的碳碳双键还原，0.1 g的重组细胞E. coli(pETDuet-gdh-afoye1)湿菌体10 h能够100 %转化10 mg烯烃生成羰基、硝基、酰胺取代的烷烃。与现有烯还原酶相比，本发明提供的烯还原酶AfOYE1化反应具有更高的催化反应活力。同时，嗜热烯还原酶AfOYE1催化潜手性烯烃还原具有高对映选择性，催化2-甲基-2-环己烯-1-酮和2-甲基-2-环戊烯-1-酮不对称还原制备相应的光学纯烷酮，0.1 g的重组细胞E. coli(pETDuet-gdh-afoye1)湿菌体10 h能够100 % 转化10 mg烯烃生成(S)-烷酮，获得的产物ee达99%以上，本发明提供的烯还原酶AfOYE1化反应具有优异的对映选择性和催化反应活力。
4、本发明采用表达嗜热烯还原酶AfOYE1的大肠杆菌全细胞作为催化剂，反应过程在水介质中实现，避免目前化学催化烯烃不对称还原中贵重金属催化剂和有毒有机溶剂的使用，相比传统烯还原酶具有更高的热稳定性，可以延长酶催化剂的使用时长。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为AfOYE1蛋白电泳图。
图2为AfOYE1催化 2-环戊烯-1-酮还原的产物环戊酮氢谱。
图3为AfOYE1催化 2-环己烯-1-酮还原的产物环己酮氢谱。
图4为AfOYE1催化 2-甲基-2-环戊烯-1-酮还原的产物(S)-2-甲基环戊酮氢谱。
图5为AfOYE1催化 2-甲基-2-环己烯-1-酮还原的产物(S)-2-甲基环己酮氢谱。
图6为AfOYE1催化产物(S)-2-甲基环己酮与消旋2-甲基环己酮的气相分析对照图。
图7为AfOYE1催化丙烯酰胺还原的产物丙酰胺氢谱。
图8为AfOYE1催化反式-β-硝基苯乙烯还原的产物β-硝基苯乙烷氢谱。
图9为AfOYE1催化1-苯基-2-硝基丙烯还原的产物2-硝基-1-苯基丙烷氢谱。
图10为AfOYE1催化顺式-柠檬醛还原的产物香茅醛氢谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
、烯还原酶AfOYE1基因合成及工程菌构建
通过PCR从巨大芽孢杆菌(Priestia megaterium)基因组中扩增葡萄糖脱氢酶基因片段（核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示）及pETDuet-1质粒片段，通过同源重组构建含有葡萄糖脱氢酶基因质粒pETDuet-gdh。依据大肠杆菌密码子偏爱性，将烯还原酶AfOYE1基因进行密码子优化并合成，并通过PCR扩增含有葡萄糖脱氢酶的pETDuet-gdh载体。采用同源重组的方法连接pETDuet-gdh载体片段和AfOYE1基因片段，将连接产物转入到E. coli（DH5α）菌株，挑取单克隆，提取质粒并测序确定正确序列，构建该酶表达载体pETDuet-gdh-afoye1。
、烯还原酶AfOYE1表达
将pETDuet-gdh-afoye1转入E. coli（BL21），获得表达菌株E. coliBL21(pETDuet-gdh-afoye1)。挑取E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)单克隆，在含卡那霉素（50 μg / mL）的LB培养基中于37 ℃，220 rpm培养13 h作为种子液。按1:100的比例将种子液接种到250 mL的LB培养基中，37 ℃，220 rpm振荡培养，当OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG（终浓度为0.5 mM），在16 ℃下低温诱导重组蛋白表达16小时，4 ℃冷冻离心，收获菌体。经细胞破碎并纯化后，得到纯AfOYE1蛋白（图1）。
应用例1
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原2-环戊烯-1-酮，技术路线如下：
取新鲜培养的E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1) 湿菌体0.4 g，重悬于20 mL磷酸钾缓冲液 (磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，0.1 M, pH 7.0 )中，加入D-葡萄糖0.2 g和2-环戊烯-1-酮40 mg （24 mmol/L），于摇床 (45 ℃, 220 rpm) 震荡反应24 h。反应结束后，向反应液加入20 mL乙酸乙酯萃取2次，合并收集乙醚溶液，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂得到粗产物。经硅胶柱层析分离，得到环戊酮。该转化过程可将2-环戊烯-1-酮40 mg全部转化生成环戊酮，效率为100 %。
产物为无色液体；如图2所示，1HNMR (CDCl3): δ = 2.13-2.17 (m, 4H), 1.93-1.97 (m, 4H)ppm.
应用例2
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原2-环戊烯-1-酮，操作步骤如应用例1，不同的是缓冲液为磷酸钠缓冲液（磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，0.1M,pH 7.0），仍可将2-环戊烯-1-酮20 mg全部转化生成环戊酮。
产物为无色液体；1HNMR (CDCl3): δ = 2.13-2.17 (m, 4H), 1.93-1.97 (m, 4H)ppm。
应用例3
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原2-环戊烯-1-酮，操作步骤如应用例1，不同的是缓冲液为磷酸钾缓冲液（磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，0.1M,pH5.5），仍可将2-环戊烯-1-酮20 mg全部转化生成环戊酮。
产物为无色液体；1HNMR (CDCl3): δ = 2.13-2.17 (m, 4H), 1.93-1.97 (m, 4H)ppm。
应用例4
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原2-环戊烯-1-酮，操作步骤如应用例1，不同的是缓冲液为磷酸钾缓冲液 (磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，0.1M, pH 8.0 )，底物为20 mg，可将2-环戊烯-1-酮20 mg全部转化生成环戊酮。
产物为无色液体；1HNMR (CDCl3): δ = 2.13-2.17 (m, 4H), 1.93-1.97 (m, 4H)ppm。
应用例5
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原2-环戊烯-1-酮，操作步骤如应用例1，不同的是反应温度为25 ℃，底物为15 mg，可将2-环戊烯-1-酮15 mg全部转化生成环戊酮。
产物为无色液体；1HNMR (CDCl3): δ = 2.13-2.17 (m, 4H), 1.93-1.97 (m, 4H)ppm。
应用例6
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原2-环戊烯-1-酮，操作步骤如应用例1，不同的是反应温度为40 ℃，底物为30 mg，可将2-环戊烯-1-酮30 mg全部转化生成环戊酮。
产物为无色液体；1HNMR (CDCl3): δ = 2.13-2.17 (m, 4H), 1.93-1.97 (m, 4H)ppm。
应用例7
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原2-环戊烯-1-酮，操作步骤如应用例1，不同的是反应温度为80 ℃，底物为15 mg，可将2-环戊烯-1-酮15 mg全部转化生成环戊酮。
产物为无色液体；1HNMR (CDCl3): δ = 2.13-2.17 (m, 4H), 1.93-1.97 (m, 4H)ppm。
应用例8
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原2-环戊烯-1-酮，操作步骤如应用例1，不同的是反应温度为45 ℃，底物为10 mg，反应时间为2 h，可将2-环戊烯-1-酮10 mg （6 mmol/L）全部转化生成环戊酮。
环戊酮数据如下：
无色液体；1HNMR (CDCl3): δ = 2.13-2.17 (m, 4H), 1.93-1.97 (m, 4H)ppm。
应用例9
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原2-环戊烯-1-酮，操作步骤如应用例1，不同的是反应温度为45 ℃，底物为50 mg，反应时间为36 h，可将2-环戊烯-1-酮50 mg全部转化生成环戊酮。
产物为无色液体；1HNMR (CDCl3): δ = 2.13-2.17 (m, 4H), 1.93-1.97 (m, 4H)ppm。
应用例10
本应用例为E. coliBL21 ( pETDuet-gdh-afoye1)催化还原2-环己烯-1-酮，技术路线如下：
操作步骤同应用例1，反应24 h后，转化率为100%，得到环己酮。
环己酮数据如下：
无色液体；如图3所示，1HNMR (CDCl3): δ = 2.31-2.34 (m, 4H), 1.82-1.88 (m,4H), 1.69-1.74 (m, 2H) ppm.
应用例11
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原2-甲基-2-环戊烯-1-酮，技术路线如下：
操作步骤如应用例1，反应24 h后，转化率为100%，得到(S)-2-甲基环戊酮。
(S)-2-甲基环戊酮数据如下：
无色液体；如图3所示，1HNMR (CDCl3): δ = 2.19-2.33 (m, 2H), 2.05-2.15 (m,2H), 1.95-2.03 (m, 1H), 1.74-1.82 (m, 1H), 1.42-1.53 (m,1H), 1.08 (d, J =6.96 Hz, 3H) ppm.
应用例12
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原2-甲基-2-环己烯-1-酮，技术路线如下：
操作步骤如应用例1，反应24 h后，转化率为100%，得到ee值为>99%的(S)-2-甲基环己酮。
(S)-2-甲基环己酮数据如下：
无色液体；如图5所示，1HNMR (CDCl3): δ = 2.29-2.35 (m, 2H), 2.18-2.26 (m,1H), 1.98-2.04 (m, 2H), 1.76-1.80 (m, 1H), 1.55-1.64 (m,2H), 1.29-1.35 (m,1H), 0.96 (d, J = 6.60 Hz, 3H) ppm.
应用例13
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原丙烯酰胺，技术路线如下：
操作步骤如应用例1，反应24 h，转化率为30%，得到丙烯酰胺。
丙烯酰胺数据如下：
无色液体；如图7所示，1HNMR (CDCl3): δ = 2.26 (q, J = 7.86 Hz, 2H), 0.96(t, J= 7.86 Hz, 3H) ppm.
应用例14
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原反式-β-硝基苯乙烯，技术路线如下：
操作步骤如应用例1，反应24 h，转化率为100%，得到β-硝基苯乙烷。
β-硝基苯乙烷数据如下：
无色液体；如图8所示，1HNMR (CDCl3): δ = 7.30-7.37 (m, 3H), 7.22-7.24 (m,2H), 4.64 (t, J = 7.34 Hz, 2H), 3.35 (t, J = 7.34 Hz, 2H)ppm.
应用例15
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原1-苯基-2-硝基丙烯，技术路线如下：
操作步骤如应用例1，反应24 h，转化率为100%，得到2-硝基-1-苯基丙烷。
2-硝基-1-苯基丙烷数据如下：
无色液体；如图9所示，1HNMR (CDCl3): δ = 7.29-7.36 (m, 3H), 7.18-7.20 (m,2H), 4.78-4.83 (m, 1H), 3.36 (dd, J = 7.52 Hz, J = 14.00 Hz,1H), 3.04 (dd, J= 6.80 Hz, J = 14.00 Hz, 1H), 1.57 (d, J = 6.66 Hz, 3H) ppm.
应用例16
本应用例为E. coliBL21 (pETDuet-gdh-afoye1)催化还原顺式-柠檬醛，技术路线如下：
操作步骤如应用例1，反应24 h，转化率为82%，得到香茅醛。
香茅醛数据如下：
无色液体；如图10所示，1HNMR (CDCl3): δ = 5.06-5.10 (m, 1H), 2.37-2.43(m, 1H), 2.19-2.26 (m, 1H), 1.96-2.09 (m, 3H), 1.68 (s, 3H),1.60 (s, 3H),1.24-1.39 (m, 2H), 0.97 (d, J = 6.66 Hz, 3H) ppm.
实施效果分析
嗜热烯还原酶AfOYE1能够高效催化邻位具有羰基、硝基、酰胺等吸电子基团的碳碳双键还原，与现有典型的嗜热烯还原酶YqiG相比，AfOYE1在2 h能催化6 mmol/L烯烃全部转化为烷烃产物，而YqiG在24h之后仅催化低于60%的5 mol/L烯烃转化为烷烃产物，因此本发明提供的烯还原酶AfOYE1化反应具有更高的催化反应活力。同时，嗜热烯还原酶AfOYE1催化潜手性烯烃还原具有高对映选择性，催化2-甲基-2-环己烯-1-酮和2-甲基-2-环戊烯-1-酮不对称还原制备相应的光学纯烷酮，0.4 g的重组细胞E. coli(pETDuet-gdh-afoye1)湿菌体2 h能够100 % 转化10 mg烯烃（6 mmol/L）生成(S)-烷酮，获得的产物ee达99%以上，本发明提供的烯还原酶AfOYE1化反应具有优异的对映选择性和催化反应活力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种来自黄曲霉的嗜热烯还原酶，其特征在于：所述嗜热烯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.包含权利要求1所述的嗜热烯还原酶的核苷酸序列的表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体还含有编码葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列。
4.一种催化剂，其特征在于：含有权利要求2或3所述的表达载体。
5.权利要求4所述的催化剂在高温催化碳碳双键不对称还原制备手性烷烃中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤如下：将催化剂重悬于磷酸盐缓冲液中，再加入底物和D-葡萄糖，震荡反应至完全，经萃取、干燥、过滤、除溶剂、萃取获得目标产物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述催化剂为含有权利要求1所述的嗜热烯还原酶的核苷酸序列的表达载体，表达载体的浓度为5-20g/L。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述底物为2-环戊烯-1-酮、2-环己烯-1-酮、2-甲基-2-环戊烯-1-酮、2-甲基-2-环己烯-1-酮、丙烯酰胺、反式-β-硝基苯乙烯、1-苯基-2-硝基丙烯、顺式-柠檬醛和马来酰亚胺中的任意一种；底物的终浓度为1-10 g/L，D-葡萄糖的终浓度为10g/L。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述磷酸钾缓冲液为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，磷酸钠缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；磷酸盐缓冲液的浓度为0.05-0.15 mol/L、pH值为5.5-8.0。
10.根据权利要求5-9任一项所述的应用，其特征在于，所述震荡反应的条件为：温度25-80℃、180-240 rpm、时间2-48 h。
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