JP2008507989A - 第一級アルコールを生成するための方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、全細胞触媒又は単離された酵素の助けを借りてアルデヒドから第一級アルコールを製造する方法に関する。
【解決手段】使用されるのは、アルコールデヒドロゲナーゼ及び補因子を再生することができる酵素であり、転換のためのアルデヒドは、150mMを超える基質濃度を有することが好ましい。
【選択図】図3
【解決手段】使用されるのは、アルコールデヒドロゲナーゼ及び補因子を再生することができる酵素であり、転換のためのアルデヒドは、150mMを超える基質濃度を有することが好ましい。
【選択図】図3
Description
本発明は、アルデヒドから開始して第一級アルコールを生成するための方法に関する。還元は、補因子依存性オキシドレダクターゼによって行われ、次に補因子が第2の酵素系によって再生される。
第一級アルコールの生成は、これら生成物が直接の形態で、又は対応するエステル化合物に変換された後に香料として使用されるため、食品産業の興味の対象となっている。これらを生成する好ましい方法は、アルデヒドを還元させることによって第一級アルコールを得ることである。この還元は、原則として、文献における多数の既存のプロトコルに記載されているように、非天然の化学的な還元剤を使用することによって、たとえば金属水素化物を使用することによって行うことができる。しかし、このような経路では、「天然様である」が、「天然ではない」第一級アルコールを生じるだけである。しかし、食品産業において、正確に天然の第一級アルコールを得ることは非常に重要である。これらを生成する1つの経路は、アルデヒドの酵素的還元による。
原則として、アルデヒドの酵素的還元は、既に文献において広範に記述されてきた。特に、例としては、これらの物質の結果としてtrans−3−ヘキセノール、trans−2−ヘキセノール、ケイ皮アルコールおよび2‐フェニルエタノールの生成が公知であり、食品産業分野において、香料、又は香料のための中間体として使用される。しかし、反応は、非常にうすい溶媒中で行われ、技術的にいうと、これに伴い生成物濃度が低いという不利な点がある。
ボトリチス・シネレ(Botrytis cinerea)株の存在下における反応体積1リットルあたり0.05gの基質濃度でのケイ皮アルデヒドの還元が、G.Bockら(G.Bock et al.,Z.Lebensm.Unters.Forsch.1988,186,33−35)によって記述されている。最も高い収率は、反応体積1リットルあたり0.019〜0.025gであった。
還元反応による2‐フェニルエタノールの生成のためのアルコールデヒドロゲナーゼの利用も記述されている。概して、標準的バッチ条件下で得られる生成物濃度は、ほんの1g/l未満である(M.W.T.Etschmann,D.Sell,J.Schrader,Biotechnol.Lett.2003,25,531−536)。in situでの生成物除去技術を使用することにより、さらなる第2相における補助合成物として必要とされるオレイルアルコールが2g/lまで増加した(M.W.T.Etschmann,D.Sell,J.Schrader,Biotechnol.Lett.2003,25,531−536)。さらなる有機相としてオレイン酸を用いた抽出流加生体内変換を使用して、Starkらは、約100mMの量に相当する12.6g/lの生成物濃度で2−フェニルエタノールを得るために、このような特異的反応系をうまく使用した(D.Stark,T.Munch,B.Sonnleitner,I.W.Marison,U.von Stockar,Biotechnol.Prog.2002,18,514−523)。
trans−3−ヘキセノールおよびtrans−2−ヘキセノールの生成については、最終的に重要な工程として、いずれの場合においても対応するアルデヒドの酵素的還元を含む一連の酵素法が記述されている(S.K.Goers et al.,米国特許第4806379号,1989;B.Muller et al.,米国特許第5464761号,1995;P.Brunerie et al.,米国特許第5620879号,1997;M.−L.Fauconnier et al.,Biotechnology Lett.1999,21,629−633;R.B.Holtz et al.,米国特許第6274358号,2001)。最も高い収率は、Mullerらによって報告されており(B.Muller et al.,米国特許第5464761号,1995;また、J.Schrader et al.,Biotechnology Letters 2004,26,463−472も参照されたい)、trans−3−ヘキセノールの場合1kgあたり4.2gで、trans−2−ヘキセノールの場合1kgあたり1.5gであった。これらの方法の不利な点は、主に低い基質濃度が手順に使用されることと、反応溶液において1kgあたり5g未満である低い生成物濃度で得られるものを生じることである。
この不利な点を回避するために、trans−2−ヘキセナールでの適切な酵素反応を100mMの基質濃度で行った(実施例4=比較例)。ここで、使用した酵素としては、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)由来のアルコールデヒドロゲナーゼがtrans−2−ヘキセナールに対する活性を有することが見いだされたので、これらの酵素を用いた。補因子の再生は、ギ酸デヒドロゲナーゼがケトンの酵素的還元における多くの場合にうまく使用された後は、この補因子生成酵素で行った(M.−R.Kula,U.Kragl,Dehydrogenases in the Synthesis of Chiral Compounds in:Stereoselective Biocatalysis(Ed.:R.N.Patel),Marcel Dekker,New York,2000,chapter 28,p.839以下参照)。しかし、2つの酵素成分の存在下では、おそらく、もとからtrans−2−ヘキセナール濃度が低いことによる阻害効果および/又は不安定化効果の結果として、所望の反応は、わずかな程度で観察されるだけであり、72時間後にわずか16%の変換があった(実施例4)。
また、M.−L.Fauconnierらは、アルコール−デヒドロゲナーゼ含有微生物を使用するときに、非常に低い基質濃度においてもtrans−3−ヘキセナールがアルコールデヒドロゲナーゼを阻害するという事実を報告している(M.−L.Fauconnier et al.,Biotechnology Lett.1999,21,629−633)。概して、反応は、0.066g/lに対応する0.67mMで行った。最大変換率は、82%であった。
手短に言えば、現在第一級アルコールを生成するためのアルデヒドのすべての酵素的還元法では、15g/l未満の低く技術的に魅力のない生成物濃度に至るだけである。対応して、せいぜい〜100mMの低い基質濃度でのみ、80%を超える技術的に意味のある変換速度を示すだけである。これについての根本的原因は、アルデヒド成分が阻害効果を有すること、および酵素が不活性化されることであると説明することができる。アルデヒドは、ケトンと比較すると、ずっと反応性のある成分であるので、これらの化合物は、実質的に酵素の官能基(特定のアミンのもの)と反応し(これは望まれない)、したがってこれらを不活性化させ得る。
したがって、アルデヒドからの第一級アルコールの生成のための、迅速で、簡単で、安価で、かつ有効な酵素法を開発することが本発明の目的であった。特に、公知の従来技術の方法を上回る空時収量を改善することが目的であった。これには、第1に、しっかりとした手順で、対応した優れた収率をもつ高基質濃度での方法を行うことが必要となる。特に、このような方法を、不飽和アルデヒドを還元させるために使用することができるはずである。
本目的は、請求項に従って解決された。請求項1は、rec全細胞触媒が使用される本発明に従った方法に関する。請求項2は、本方法の好ましい態様を含む。請求項3は、本発明に従った目的のための遊離酵素の使用に向けられる。請求項3〜9は、本発明による方法の好ましい態様を保護する。
アルデヒドを還元させることによって第一級アルコールを生成するための方法において、この変換は、アルコールデヒドロゲナーゼおよび補因子を再生することができる酵素を含む組換え全細胞触媒の存在下において行われるという事実により、驚くべきことに、しかし実に好都合にも、提起された問題の解決に確実に達する。驚くべきことに、150mMを超える、特に250mMを超える、および非常に好ましくは500mMを超える高基質濃度にてこの方法を使用して、高〜非常に高い変換率が得られる。これらの変換率は、典型的には80%以上、および特に90〜95%を上回る収率である。以前の方法での低い変換率に基づくと、低い基質濃度を使用するときでさえも、これを予想することはできなかったし、特に使用した基質がデヒドロゲナーゼに対して及ぼす重度の阻害又は不安定化効果(従来技術から公知の事実)の背景に対しては、極めて驚くべきである。
原則として、当業者が本出願を想定するかもしれないすべてのアルコールデヒドロゲナーゼは、rec全細胞触媒を確立するために適している。しかし、本発明に従った変換は、好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、およびグルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる酵素を含む組換え(rec)全細胞触媒の存在下において行われた。
上で提起された問題のさらなる解決は、単離されたアルコールデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる単離された酵素の存在下において、本発明に従った変換を行うことによって達成される。ここで、単離された形態で使用される酵素の形態のグルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる酵素と、アルコールデヒドロゲナーゼとの組み合わせの特異的な適合性は、特に、ギ酸デヒドロゲナーゼをこのように使用したときに、収率が満足できないことを考慮すると(また、実施例4 =比較例を参照されたい)、驚くべきものである。
グルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる酵素とアルコールデヒドロゲナーゼとの組み合わせにおける、ギ酸デヒドロゲナーゼとの類似の組み合わせを上回る著しく改善された性能は、たとえばtrans−2−ヘキセナールの還元において得られた変換率を比較することによって例証される(実施例4(=比較例)および実施例5〜7を参照されたい)。
変換は、好ましくは150mMを超える、特に、250mMを超える、および非常に好ましくは500mMを超える高い基質濃度のアルデヒドにて行われる。
本発明によれば、「150mMを超える高い基質濃度にて」という用語は、記述された方法を使用すると、使用した水性溶媒(緩衝系を含む)の開始体積あたり150mMを超える基質が変換されることを意味するものとして理解される。この状況において、反応混合物の濃度として150mMを超える基質が実際に達成されるかどうか、又は水性溶媒の開始体積に基づいて150mMを超える基質濃度が全体で変換されるかどうかは重要ではない。
しかし、特に好ましい変種は、150mMを超える基質濃度等のアルデヒドが実際に変換のために提供されるものである。本明細書に詳述した濃度は、水性溶媒の開始体積に基づいて、実際に反応混合物で得られる基質(アルデヒド)濃度をいい、使用した全細胞触媒の、又は使用した単離された酵素(精製され、又は部分的に精製された形態で、又は粗製抽出物として)のインキュベーション期間の間に、この開始濃度が達成されるときには、重要ではない。これは、少なくとも一度達成されるだけである。
全細胞触媒を使用するときは、細胞全体反応の初めにこれらの濃度にてバッチ形態で直接アルデヒドを使用することができ、又はさもなければ、最初に、アルデヒドを添加する前に一定の光学濃度まで全細胞触媒を使用することができる。同様に、アルデヒドを最初により低い濃度で使用し、次いで指定したとおりの濃度まで細胞反応のインキュベーション期間の間に添加することができる。しかし、反応において、基質の所望のアルコールへの変換の間に少なくとも一回、150mMを超える基質濃度等を達成することができる場合は、それが好ましい。
すべてのアルデヒドは、アルデヒド成分として使用されることができる。好ましくは、使用されるアルデヒド成分は、以下の一般の構造式の下で包含されることができる
本方法は、特に、その一部分に少なくとも1つのC=C二重結合を含むアルデヒドを還元させるために使用される。本明細書において非常に好ましく使用される物質は、2−trans−ヘキセナール、2−cis−ヘキセナール、3−trans−ヘキセナール、3−cis−ヘキセナールおよび/又はケイ皮アルデヒドである。
本発明に関して、好ましくは、選択される酵素のうちの1つは、アルコールデヒドロゲナーゼである。当業者であれば、彼がアルコールデヒドロゲナーゼを選択するはずはない。好ましいことが判明したアルコールデヒドロゲナーゼは、たとえば乳酸桿菌属(Lactobacillus)株由来、特にラクトバシルス・ケフィール(Lactobacillus kefir)および乳酸短桿菌(Lactobacillus brevis)由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、又はロドコッカス属(Rhodococcus)株由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、特にロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)およびロドコッカス・ルバー(Rhodococcus ruber)由来、又はアルトロバクター属(Arthrobacter)株由来、特にアルトロバクター・パラフィネウス(Arthrobacter paraffineus)由来のアルコールデヒドロゲナーゼである。
補因子再生のための好ましいデヒドロゲナーゼは、グルコースデヒドロゲナーゼ、好ましくはバシラス属(Bacillus)、サーモプラズマ属(Thermoplasma)およびシュードモナス属(Pseudomonas)株由来のグルコースデヒドロゲナーゼであることが証明された。グルコースデヒドロゲナーゼは、たとえばA.Bommarius in:Enzyme Catalysis in Organic Synthesis(Ed.:K.Drauz,H.Waldmann),Volume III,Wiley−VCH,Weinheim,2002,chapter 15.3によって記述されている。
リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、当業者に公知である(S.−I.Suye,M.Kawagoe,S.Inuta,Can.J.Chem.Eng.1992,70,306−312;S.−I.Suye,Recent Res.Devei.Ferment.Bioeng.1998,1,55−64;PhD thesis S.Naamnieh,University of Dusseldorf;国際公開公報第2004/022764号)。また、当業者であれば、彼の目的のために最も効率的に使用することができるデヒドロゲナーゼを選択するであろう。原理的には、好ましいリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、使用されるその他の酵素の反応の経過に対して障害を生じない程度にNAD(P)Hを再生するものである。使用されるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(「リンゴ酸酵素」)は、好ましくはスルフォロブス属(Sulfolobus)、クロストリジウム属(Clostridium)、バシラス属(Bacillus)およびシュードモナス属(Pseudomonas)株、および大腸菌(E.coli)由来の「リンゴ酸酵素」である。大腸菌(E.coli)K12リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、この状況において非常に好ましく、これは公知である。遺伝子単離およびクローニングは、S.Naamnieh,PhD thesis,University of Dusseldorf,p.70以下参照に記述されている。
アルデヒドは、いずれの方法でも添加することができる。好ましくは、アルデヒドのすべてが、開始時に(バッチ反応)又は代わりに、メーターで測定して添加される。また、連続添加(連続送り込み法)を使用してもよい。これらの手順は、当業者に周知であり、この場合にも同様に使用される。
本発明によれば、「組換え全細胞触媒」は、少なくとも1つの組換遺伝子を発現しているか、又は発現された、すなわち本発明に従った変換(アルデヒドの還元および/又は補因子の再生)を触媒することができる、少なくとも1つの組換えタンパク質が存在する細胞を意味するものとして理解される。組換えタンパク質は、生存又は非生存全細胞触媒に存在することは限定されるわけではないが、どのような活性化型であってもよい。この状況において、「活性化型」は、組換えタンパク質が酵素反応を触媒する能力を意味するものとして理解される。本発明の好ましい態様において、組換えタンパク質は、もっぱら遊離型で細胞のサイトゾル全体に分布しており、封入体の形態では存在しない。本発明によれば、細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼおよび補因子を再生することができるデヒドロゲナーゼを発現することができ、又はできた。
すべての周知の細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼおよび補因子を再生させることができる酵素を含む全細胞触媒として適切である。この状況において、言及される微生物は、例えば、Hansenula polymorpha、ピキアスピーシーズ(Picha sp.)、Saccharomyces cerevisiaeのような酵母、大腸菌(E.coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)のような原核生物、又は哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞のような真核生物といった有機体である。クローニング方法は、当業者に公知である(Sambrook,J.;Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)。大腸菌株は、この目的のために好ましく使用される。特に非常に好ましくは:E.coli XL1 Blue,NM 522,JM101,JM109,JM105,RR1,DH5α,TOP 10−,HB101,BL21 codon plus,BL21 (DE3)codon plus,BL21,BL21(DE3),MM294である。宿主生物体に好ましくクローン化される本発明による核酸を含む遺伝子構成物を有するプラスミドは当業者に公知である(PCT/EP03/07148参照、また、以下参照)。
適したプラスミド又はベクターは、原則として、この目的のために当業者が利用できる実施態様のすべてである。このようなプラスミドおよびベクターは例えばStudierおよび共同研究者(Studier,W.F.;Rosenberg A.H.;Dunn J.J.;Dubendroff J.W.;(1990),Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes,Methods Enzymol.185,61−89)又はNovagen、Promega、New England Biolabs、Clontech又はGibco−BRLのカタログで見つけることができる。さらに好ましいプラスミドおよびベクターは:Glover,D.M.(1985),DNA cloning:a practical approach,Vol.I−III,IRL Press Ltd.,Oxford;Rodriguez,R.L.and Denhardt,D.T.(eds)(1988),Vectors:a survey of molecular cloning vectors and their uses,179−204,Butterworth,Stoneham;Goeddel,D.V.(1990),Systems for heterologous gene expression,Methods Enzymol.185,3−7;Sambrook,J.;Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York、で見つけることができる。
検討された核酸配列を含む遺伝子構成物を、特に好ましい様式で宿主生物体にクローン化することができるプラスミドは、以下のものであるか、又は以下に基づく:pUC18/19(Roche Biochemicals社製),pKK−177−3H(Roche Biochemicals社製),pBTac2(Roche Biochemicals社製),pKK223−3(Amersham Pharmacia Biotech社製),pKK−233−3(Stratagene社製)又はpET(Novagen社製)。
本発明に従った方法のさらなる態様において、全細胞触媒は、好ましくは、使用される前に、基質および生成物についての細胞膜の透過性を無処置の系よりも増大させるような方法で前処理される。この状況においては、全細胞触媒が、たとえば凍結および/又は有機溶媒、特にトルエンでの処置によって前処理される方法が、特に好ましい。
R.エリスロポリス(R.erythropolis)又はラクトバシルス・ケフィール(Lactobacillus kefir)由来のアルコールデヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(リンゴ酸酵素として公知であるものを含む)を含む組換え全細胞触媒が、特にこの状況に適している。R.エリスロポリス(R.erythropolis)又はラクトバシルス・ケフィール(Lactobacillus kefir)由来のアルコールデヒドロゲナーゼおよびサーモプラズマ・アシドフィルム(Thermoplasma acidophilum)又は枯草菌(Bacillus subtilis)由来のグルコースデヒドロゲナーゼのすべての可能な組み合わせでの組換え全細胞触媒も同程度に適している。実施例の部分に記述した2つの組換え全細胞触媒は、特に適した組換え全細胞触媒として好ましい。
この組換え全細胞触媒の濃度は、好ましくは75g/l未満、より好ましい態様は50g/l以下、さらに好ましくは25g/l以下、もっとも好ましくは15g/l以下、gはウェットバイオマス(WBM)を参照とした。
本発明に従った方法は、いずれの反応温度でも、特に、使用する組換え全細胞触媒のために適したもので行うことができる。特に適していると考えられる反応温度は、10〜90℃、好ましくは15〜50℃および特に好ましくは20〜35℃の反応温度である。
反応のpHに関しては、再び当業者によって自由に選択され、固定したpH、又はさもなければpH間隔内でpHを変化させて反応を行うことができる。pHは、特に宿主生物の要求又は使用される単離された酵素を考慮にいれて選択される。好ましくは、反応は、5〜9のpH、好ましくはpH 6〜8で、および特に好ましくはpH 6.5〜7.5で行われる。
所望の生成物を得るために使用される基質の変換は、好ましくは、適切な組換え全細胞触媒を使用して細胞培養において行われる。使用される宿主生物に応じて、適切な栄養培地をこの目的に使用する。宿主細胞のために適した培地は、一般に公知であり、市販されている。さらに、たとえば、抗生物質、たとえば血清(ウシ胎児血清等)などの生育促進薬剤などの従来通りの添加物、並びに同様の公知の添加物を細胞培養に添加することができる。
好ましい態様において、所望の第一級アルコールを得るためのアルデヒドの変換は、有機溶媒を添加することなく行われる。これは、有機溶媒が生体触媒を含む反応混合物に添加されないことを意味する。しかし、あるいは、反応を行うために必要とされる添加された水に、さらなる有機溶媒、好ましくは水に可溶性である有機溶媒を添加することができる。これらは、特に、たとえばアルコール、特にメタノールもしくはエタノール、又はTHFもしくはジオキサンのようなエーテルなどの水溶性有機溶媒を意味する。
さらに、適切な組換え全細胞触媒の細胞懸濁液中での変換を行うことが好ましく、また、細胞懸濁液中で使用されるアルデヒドが、懸濁液として存在するか、又は細胞懸濁液において乳剤もしくは溶液の形態で存在することができる。
単離された酵素を使用するときは(精製され、もしくは部分的に精製された形態で、又は粗製抽出物として、又は固定された形態で)、好ましい態様は、適切な量の対応する補因子を添加することを伴う。概して、添加される補因子の量は、0.00001〜0.1当量、好ましくは0.0001〜0.01当量、および特に0.0001〜0.001当量の範囲である。好ましい態様において、および全細胞触媒を使用するときに、「外部」補因子添加の使用は、省くことができ、又はこのような「外部」補因子は、0.0005当量未満の範囲で使用することができる。
本反応に関して、手順は、組換え全細胞触媒又は単離された酵素、および基質を最初に選択した溶媒系に導入するという好ましい態様に従う。次いで、必要に応じて、必要とされる一定量の対応する補因子(たとえば、NADHもしくはNADPH、又はこれらの酸化型NAD+およびNADP+)を反応混合物に添加することができる。しかし、添加の順位は変更することができる。反応混合物を当業者に公知の方法によって徐々に調整する。バッチ処理の場合、バイオマスは、濾過又は遠心分離によって容易に生成物から分離することができる。次いで、得られたアルコールを従来法(たとえば、抽出、蒸留、結晶化)によって単離することができる。
しかし、本方法は、連続的に行うこともできる。このためには、高分子重量物質(酵素又はバイオマス)が限外濾過膜の後ろに保持され、かつ低分子量物質(生成されたアミノ酸など)の膜を超えて通過することができる酵素膜反応器として公知のものの中で反応を行う。このような手順は、従来技術において既に繰り返し記述されてきた(Wandrey et al.in Jahrbuch 1998,Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen,VDI,p.151以下参照;Kragl et al.,Angew.Chem.1996,6,684)。
(C1−C20)−アルキルラジカルは、特に、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、セシル、アンデシル、ドデシル、およびすべてのこれらを結合している異性体である。同様に、(C1−C8)−アルキルラジカルは、鎖の中に1〜8個の炭素原子が存在するものである。
(C2−C20)−アルケニルラジカルは、少なくとも1つのC=C2重結合を有する上記のような(C1−C20)−アルキルラジカルを意味する。(C2−C20)−アルコキシラジカルは、少なくとも1つのC≡C3重結合を有する上記のような(C1−C20)−アルキルラジカルを意味する。(C1−C20)−アルコキシラジカルは、後者が酸素原子を経て分子に結合される条件をつければ、(C1−C20)―アルキルラジカルに対応する。同様のことは、同様に、(C1−C8)−アルコキシラジカルに適用される。
(C2−C20)−アルコキシアルキルは、アルキル鎖が少なくとも1つの酸素官能基によって中断されており、2つの酸素原子を互いに連結することができないラジカルを意味するものとして理解される。炭素原子数は、ラジカルに存在する総炭素原子数を示す。
上記のラジカルは、ハロゲンによって、および/又はN、O、P、S、Si原子を含むラジカルによって、一置換又は多置換されていることができる。これらは、特に、これらの鎖内にこれらのヘテロ原子の1つもしくは複数を含むか、又はこれらのヘテロ原子のうちの1つを経て分子に結合する、上述したタイプのアルキルラジカルである。
(C3−C8)−シクロアルキルはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル又はシクロヘプチル残基等を意味することが理解される。これらは、1つもしくは複数のハロゲンおよび/又はN、O、P、S、Si原子を含むラジカルによって置換することができ、および/又は、たとえば1−、2−、3−、4−ピペリジル、1−、2−、3−ピロリジニル、2−、3−テトラヒドロフリル、2−、3−、4−モルホリニルなど、環内にN、O、P、S原子を含むことができる。
(C3−C8)−シクロアルキル−(C1−C20)−アルキルラジカルは、上記したようなアルキルラジカルを経て分子に結合されている上記のようなシクロアルキルラジカルであることを示す。
本発明の目的のためには、(C1−C8)−アシロキシは、COO官能性を経て分子に結合されている8個以下の炭素原子をもつ上記のようなアルキルラジカルを意味する。
本発明の目的のためには、(C1−C8)−アシルは、CO官能性を経て分子に結合されている8個以下の炭素原子をもつ上記のようなアルキルラジカルを意味する。
(C6−C18)−アリールラジカルは、6〜18個のC原子をもつ芳香族ラジカルを意味するものとして理解される。これには、特に、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、ビフェニルラジカルなどの化合物、又は、たとえばインデニル系などの、主題とされている分子と縮合される前述したタイプの系を含み、これらは、(C1−C8)−アルキル、(C1−C8)−アルコキシ、NR1R2、(C1−C8)−アシル、(C1−C8)−アシロキシによって任意に置換することができる。
(C7−C26)−アラルキルラジカルは、(C1−C8)−アルキルラジカルを経て分子に結合されている(C6−C18)−アリールラジカルである。
本発明の目的のためには、(C3−C18)−ヘテロアリールラジカルは、例えば環の中に窒素、酸素、又は硫黄のようなヘテロ原子を有する3〜18個の炭素原子を持つ5−、6−、又は7員環の芳香族環系を意味する。このような複素芳香族化合物は、特に、1−、2−、3−フリル、1−、2−、3−ピロリル、1−、2−、3−チエニル、2−、3−、4−ピリジル、2−、3−、4−、5−、6−、7−インドリル、3−、4−、5−ピラゾリル、2−、4−、5−イミダゾイル、アクリジニル、キノリニル、フェナンスリジニル、2−、4−、5−、6−ピリミジニルのようなラジカルが考えられる。
(C4−C26)−ヘテロアラルキルは、(C7−C26)−アラルキルラジカルに対応する複素芳香族系を意味するものとして理解される。
適切なハロゲン(Hal)は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素である。
「単離された酵素」という用語は、本発明によれば、単離された酵素として(精製された、もしくは部分的に精製された形態で、又は粗製抽出物として、又は固定された形態で)の、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびグルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる酵素の使用を意味するものとして理解される。
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(MDH)は、「リンゴ酸酵素」と称され、リンゴ酸のピルビン酸への酸化的脱炭酸反応を触媒する。したがって、種々の生物体由来の、とりわけ高等動物、植物および微生物由来の多数のリンゴ酸デヒドロゲナーゼが公知である。4つのタイプのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ間に区別され、これは酵素分類E.C.1.1.1.37 〜EC 1.1.1.40に分類されている(http://www.genome.ad.jp)。リンゴ酸デヒドロゲナーゼのタイプに応じて、補因子としてNADおよび/又はNADP が必要とされる。
実施例において使用した大腸菌(E.coli)は、ブダペスト条約に従って番号DSM 14459の下で、08.24.01にDSMZ GmbH,Mascheroder Weg 1b,D−38124 Brunswickにて出願人によって寄託されている。
〔ラクトバシルス・ケフィール(Lactobacillus kefir)由来の(R)−アルコールデヒドロゲナーゼおよびサーモプラズマ・アシドフィルム(Thermoplasma acidophilum)由来のグルコースデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒の調製〕
〔菌の生産〕
大腸菌(E. coli)DSM14459(特許国際公開公報第03/042412号に記述してある)の化学処理によるコンピテントセルをプラスミドpNO5cで形質転換させた(Sambrook et al.1989,Molecular cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。このプラスミドは、ラクトバシルス・ケフィール(Lactobacillus kefir)由来のアルコールデヒドロゲナーゼをコードする(Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenase:a useful catalyst for synthesis.Bradshaw et al.JOC 1992,57 1532−6,Reduction of acetophenone to R(+)−phenylethanol by a new alcohol dehydrogenase from Lactobacillus kefir.Hummel W.Ap Microbiol Biotech 1990,34,15−19)。組換え大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO5c−図1)で化学処理によるコンピテントセルを作製して、サーモプラズマ・アシドフィルム(Thermoplasma acidophilum)由来のコドンを最適化したグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子をコードするプラスミドpNO8c(図2)で形質転換した(Bright, J.R. et al.,1993 Eur.J.Biochem.211:549−554)。両遺伝子は、ラムノースプロモーター(Stumpp,Tina;Wilms,Burkhard;Altenbuchner,Josef.A new,L−rhamnose−inducible expression system for Escherichia coli.BlOspektrum(2000),6(1),33−36)の制御下にある。pNO5cおよびpNO8cの配列並びにプラスミドマップを以下に詳述してある。
大腸菌(E. coli)DSM14459(特許国際公開公報第03/042412号に記述してある)の化学処理によるコンピテントセルをプラスミドpNO5cで形質転換させた(Sambrook et al.1989,Molecular cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。このプラスミドは、ラクトバシルス・ケフィール(Lactobacillus kefir)由来のアルコールデヒドロゲナーゼをコードする(Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenase:a useful catalyst for synthesis.Bradshaw et al.JOC 1992,57 1532−6,Reduction of acetophenone to R(+)−phenylethanol by a new alcohol dehydrogenase from Lactobacillus kefir.Hummel W.Ap Microbiol Biotech 1990,34,15−19)。組換え大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO5c−図1)で化学処理によるコンピテントセルを作製して、サーモプラズマ・アシドフィルム(Thermoplasma acidophilum)由来のコドンを最適化したグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子をコードするプラスミドpNO8c(図2)で形質転換した(Bright, J.R. et al.,1993 Eur.J.Biochem.211:549−554)。両遺伝子は、ラムノースプロモーター(Stumpp,Tina;Wilms,Burkhard;Altenbuchner,Josef.A new,L−rhamnose−inducible expression system for Escherichia coli.BlOspektrum(2000),6(1),33−36)の制御下にある。pNO5cおよびpNO8cの配列並びにプラスミドマップを以下に詳述してある。
〔活性細胞の調製〕
大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO5c、pNO8c)の単一コロニーを、添加した抗生物質(50μg/lアンピシリンおよび20μg/mlクロラムフェニコール)を含む2mlのLB培地中で、振とう(250rpm)しながら37℃にて18時間インキュベートした。この培養液を誘導因子としてのラムノース(2g/l)、添加した抗生物質(50μg/lアンピシリンおよび20μg/mlクロラムフェニコール)および1mMZnCl2を含む新鮮なLB培地中に1:100希釈して、振とう(250rpm)しながら30℃にて18時間インキュベートした。細胞を遠心し(10000g、10分、4℃)、上清を廃棄して、細胞ペレットを直接又は20℃に貯蔵後のいずれかに、生体内変換実験において使用した。
大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO5c、pNO8c)の単一コロニーを、添加した抗生物質(50μg/lアンピシリンおよび20μg/mlクロラムフェニコール)を含む2mlのLB培地中で、振とう(250rpm)しながら37℃にて18時間インキュベートした。この培養液を誘導因子としてのラムノース(2g/l)、添加した抗生物質(50μg/lアンピシリンおよび20μg/mlクロラムフェニコール)および1mMZnCl2を含む新鮮なLB培地中に1:100希釈して、振とう(250rpm)しながら30℃にて18時間インキュベートした。細胞を遠心し(10000g、10分、4℃)、上清を廃棄して、細胞ペレットを直接又は20℃に貯蔵後のいずれかに、生体内変換実験において使用した。
ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)由来の(S)−アルコールデヒドロゲナーゼおよび枯草菌(Bacillus subtilis)由来のグルコースデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒の調製
〔菌の生産〕
大腸菌(E.coli)DSM14459(特許国際公開公報第03/042412号に記述してある)の化学処理によるコンピテントセルをプラスミドpNO14cで形質転換させた(Sambrook et al.1989,Molecular cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。このプラスミドは、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)由来のアルコールデヒドロゲナーゼ(Cloning,sequence analysis and heterologous expression of the gene encoding a (S)−specific alcohol dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis DSM 43297.Abokitse,K.;Hummel,W.Applied Microbiology and Biotechnology 2003,62 380−386)および枯草菌(Bacillus subtilis)由来のグルコースデヒドロゲナーゼ(Glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis expressed in Escherichia coli.I:Purification,characterization and comparison with glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium.Hilt W;Pfleiderer G;Fortnagel P Biochimica et biophysica acta (1991 Jan 29),1076(2),298−304)をコードする。アルコールデヒドロゲナーゼは、ラムノースプロモーター(Stumpp,Tina;Wilms,Burkhard;Altenbuchner,Josef. A new,L−rhamnose−inducible expression system for Escherichia coli.BIOspektrum(2000),6(1),33−36)の制御下にある。pNO14cの配列およびプラスミドマップは、以下に詳述してある。
大腸菌(E.coli)DSM14459(特許国際公開公報第03/042412号に記述してある)の化学処理によるコンピテントセルをプラスミドpNO14cで形質転換させた(Sambrook et al.1989,Molecular cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。このプラスミドは、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)由来のアルコールデヒドロゲナーゼ(Cloning,sequence analysis and heterologous expression of the gene encoding a (S)−specific alcohol dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis DSM 43297.Abokitse,K.;Hummel,W.Applied Microbiology and Biotechnology 2003,62 380−386)および枯草菌(Bacillus subtilis)由来のグルコースデヒドロゲナーゼ(Glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis expressed in Escherichia coli.I:Purification,characterization and comparison with glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium.Hilt W;Pfleiderer G;Fortnagel P Biochimica et biophysica acta (1991 Jan 29),1076(2),298−304)をコードする。アルコールデヒドロゲナーゼは、ラムノースプロモーター(Stumpp,Tina;Wilms,Burkhard;Altenbuchner,Josef. A new,L−rhamnose−inducible expression system for Escherichia coli.BIOspektrum(2000),6(1),33−36)の制御下にある。pNO14cの配列およびプラスミドマップは、以下に詳述してある。
〔活性細胞の調製〕
大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO14c−図3)の単一コロニーを、添加した抗生物質(50μg/lアンピシリンおよび20μg/mlクロラムフェニコール)を含む2mlのLB培地中で、振とう(250rpm)しながら37℃にて18時間インキュベートした。この培養液を誘導因子としてのラムノース(2g/l)、添加した抗生物質(50μg/lアンピシリンおよび20μg/mlクロラムフェニコール)および1mMZnCl2を含む新鮮なLB培地中に1:100希釈して、振とう(250rpm)しながら30℃にて18時間インキュベートした。細胞を遠心し(10000g、10分、4℃)、上清を廃棄して、細胞ペレットを直接又は20℃に貯蔵後のいずれかに、生体内変換実験において使用した。
大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO14c−図3)の単一コロニーを、添加した抗生物質(50μg/lアンピシリンおよび20μg/mlクロラムフェニコール)を含む2mlのLB培地中で、振とう(250rpm)しながら37℃にて18時間インキュベートした。この培養液を誘導因子としてのラムノース(2g/l)、添加した抗生物質(50μg/lアンピシリンおよび20μg/mlクロラムフェニコール)および1mMZnCl2を含む新鮮なLB培地中に1:100希釈して、振とう(250rpm)しながら30℃にて18時間インキュベートした。細胞を遠心し(10000g、10分、4℃)、上清を廃棄して、細胞ペレットを直接又は20℃に貯蔵後のいずれかに、生体内変換実験において使用した。
〔ケイ皮アルコールおよびtrans−2−ヘキセン−1−オールの製造の実施例〕
〔実施例1〕
アルコールデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒を使用する0.2Mの溶液におけるケイ皮アルデヒドの還元
Titrino反応器において、40mlのリン酸緩衝液(pH7.0にさせた)を室温で、OD=24の光学濃度が得られるような細胞濃度の上記のアルコールデヒドロゲナーゼをもつ全細胞触媒大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO14c)(大腸菌(E.coli)、R.エリスロポリス(R.erythropolis)由来の(S)−アルコールデヒドロゲナーゼ、枯草菌(B.subtilis)由来のグルコースデヒドロゲナーゼ)、1.05当量のグルコース(使用されるケイ皮アルデヒドの量に基づいた当量)および8mmolのケイ皮アルデヒド(0.2Mの基質濃度に対応、使用されたリン酸緩衝液に基づく)にて処置した。反応混合物を室温で撹拌し、水酸化ナトリウム溶液(2MNaOH)を添加することによってpHを一定に(pH6.5に)保持した。試料は、規則的な間隔で採取し、ケイ皮アルデヒドのケイ皮アルコールへの変換をHPLCによって決定した。1時間後に、変換率は、93%に達し、2時間後に100%に達した。
アルコールデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒を使用する0.2Mの溶液におけるケイ皮アルデヒドの還元
Titrino反応器において、40mlのリン酸緩衝液(pH7.0にさせた)を室温で、OD=24の光学濃度が得られるような細胞濃度の上記のアルコールデヒドロゲナーゼをもつ全細胞触媒大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO14c)(大腸菌(E.coli)、R.エリスロポリス(R.erythropolis)由来の(S)−アルコールデヒドロゲナーゼ、枯草菌(B.subtilis)由来のグルコースデヒドロゲナーゼ)、1.05当量のグルコース(使用されるケイ皮アルデヒドの量に基づいた当量)および8mmolのケイ皮アルデヒド(0.2Mの基質濃度に対応、使用されたリン酸緩衝液に基づく)にて処置した。反応混合物を室温で撹拌し、水酸化ナトリウム溶液(2MNaOH)を添加することによってpHを一定に(pH6.5に)保持した。試料は、規則的な間隔で採取し、ケイ皮アルデヒドのケイ皮アルコールへの変換をHPLCによって決定した。1時間後に、変換率は、93%に達し、2時間後に100%に達した。
〔実施例2〕
〔アルコールデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒を使用する0.5Mの溶液におけるケイ皮アルデヒドの還元〕
Titrino反応器において、40mlのリン酸緩衝液(pH 7.0にさせた)を室温で、OD=16の光学濃度が得られるような細胞濃度の、上記のアルコールデヒドロゲナーゼをもつ全細胞触媒大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO14c)(大腸菌(E.coli)、R.エリスロポリス(R.erythropolis)由来の(S)−アルコールデヒドロゲナーゼ、枯草菌(B.subtilis)由来のグルコースデヒドロゲナーゼ)、1.05当量のグルコース(使用されるケイ皮アルデヒドの量に基づいた当量)および20mmolのケイ皮アルデヒド(0.5Mの基質濃度に対応、使用されたリン酸緩衝液に基づく)にて処置した。反応混合物を室温で撹拌し、水酸化ナトリウム溶液(2MNaOH)を添加することによってpHを一定に(pH6.5に)保持した。試料は、規則的な間隔で採取し、ケイ皮アルデヒドのケイ皮アルコールへの変換をHPLCによって決定した。1時間後に、変換率は、44%に達し、5時間後に91%に達し、25時間後に93%に達した。
〔アルコールデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒を使用する0.5Mの溶液におけるケイ皮アルデヒドの還元〕
Titrino反応器において、40mlのリン酸緩衝液(pH 7.0にさせた)を室温で、OD=16の光学濃度が得られるような細胞濃度の、上記のアルコールデヒドロゲナーゼをもつ全細胞触媒大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO14c)(大腸菌(E.coli)、R.エリスロポリス(R.erythropolis)由来の(S)−アルコールデヒドロゲナーゼ、枯草菌(B.subtilis)由来のグルコースデヒドロゲナーゼ)、1.05当量のグルコース(使用されるケイ皮アルデヒドの量に基づいた当量)および20mmolのケイ皮アルデヒド(0.5Mの基質濃度に対応、使用されたリン酸緩衝液に基づく)にて処置した。反応混合物を室温で撹拌し、水酸化ナトリウム溶液(2MNaOH)を添加することによってpHを一定に(pH6.5に)保持した。試料は、規則的な間隔で採取し、ケイ皮アルデヒドのケイ皮アルコールへの変換をHPLCによって決定した。1時間後に、変換率は、44%に達し、5時間後に91%に達し、25時間後に93%に達した。
〔実施例3〕
〔(R)−選択的アルコールデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒を使用する1.5Mの溶液におけるケイ皮アルデヒドの還元〕
Titrino反応器において、40mlのリン酸緩衝液(pH7.0にさせた)を室温で、OD=30の光学濃度が得られるような細胞濃度の、上記の(R)−選択的アルコールデヒドロゲナーゼをもつ全細胞触媒大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO5c、pNO8c)(大腸菌(E.coli)、L.ケフィール(L.kefir)由来の(R)−アルコールデヒドロゲナーゼ、T.アシドフィルム(T.acidophilum)由来のグルコースデヒドロゲナーゼ)、1.05当量のグルコース(使用されるケイ皮アルデヒドの量に基づいた当量)および60mmolのケイ皮アルデヒド(1.5Mの基質濃度に対応する、使用されたリン酸緩衝液に基づく)にて処置した。反応混合物を室温で25時間撹拌し、水酸化ナトリウム溶液(5MNaOH)を添加することによってpHを一定に保持した。試料は、規則的な間隔で採取し、ケイ皮アルデヒドのケイ皮アルコールへの変換をHPLCによって決定した。1時間後に、変換率は、15%に達し、5時間後に58%に達し、23.5時間後に98%に達した。
〔(R)−選択的アルコールデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒を使用する1.5Mの溶液におけるケイ皮アルデヒドの還元〕
Titrino反応器において、40mlのリン酸緩衝液(pH7.0にさせた)を室温で、OD=30の光学濃度が得られるような細胞濃度の、上記の(R)−選択的アルコールデヒドロゲナーゼをもつ全細胞触媒大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO5c、pNO8c)(大腸菌(E.coli)、L.ケフィール(L.kefir)由来の(R)−アルコールデヒドロゲナーゼ、T.アシドフィルム(T.acidophilum)由来のグルコースデヒドロゲナーゼ)、1.05当量のグルコース(使用されるケイ皮アルデヒドの量に基づいた当量)および60mmolのケイ皮アルデヒド(1.5Mの基質濃度に対応する、使用されたリン酸緩衝液に基づく)にて処置した。反応混合物を室温で25時間撹拌し、水酸化ナトリウム溶液(5MNaOH)を添加することによってpHを一定に保持した。試料は、規則的な間隔で採取し、ケイ皮アルデヒドのケイ皮アルコールへの変換をHPLCによって決定した。1時間後に、変換率は、15%に達し、5時間後に58%に達し、23.5時間後に98%に達した。
〔実施例4(比較例)〕
〔補因子再生のためにギ酸デヒドロゲナーゼを使用する100mMのtrans−2−ヘキセナールの変換〕
trans−2−ヘキセナール(100mM)およびNADH(3.5mM、アルデヒドに基づいて0.035当量に対応する)、ギ酸ナトリウム(455mM、アルデヒドに基づいて4.55当量に対応)からなる反応混合物を、20U/mmolの酵素量の、R.エリスロポリス(R.erythropolis)由来の(S)−ADH(大腸菌で発現)および20U/mmolのカンジダ・ボイジニイ(Candida boidinii)由来のギ酸デヒドロゲナーゼと共に、1mlのリン酸緩衝液(100mM;pH7.0)中で、30℃の反応温度で、72時間の期間にわたって撹拌した。この期間内に、試料を採取し、それぞれの変換率を、HPLCを経て決定した。変換率は、5時間後に7%であり、72時間後に16%であった。
〔補因子再生のためにギ酸デヒドロゲナーゼを使用する100mMのtrans−2−ヘキセナールの変換〕
trans−2−ヘキセナール(100mM)およびNADH(3.5mM、アルデヒドに基づいて0.035当量に対応する)、ギ酸ナトリウム(455mM、アルデヒドに基づいて4.55当量に対応)からなる反応混合物を、20U/mmolの酵素量の、R.エリスロポリス(R.erythropolis)由来の(S)−ADH(大腸菌で発現)および20U/mmolのカンジダ・ボイジニイ(Candida boidinii)由来のギ酸デヒドロゲナーゼと共に、1mlのリン酸緩衝液(100mM;pH7.0)中で、30℃の反応温度で、72時間の期間にわたって撹拌した。この期間内に、試料を採取し、それぞれの変換率を、HPLCを経て決定した。変換率は、5時間後に7%であり、72時間後に16%であった。
〔実施例5〕
〔補因子再生のためにグルコースデヒドロゲナーゼを使用する100mMのtrans−2−ヘキセナールの変換〕
trans−2−ヘキセナール(100mM)およびNADH(1.4mM、アルデヒドに基づいて0.014当量に対応する)、グルコース(300mM、アルデヒドに基づいて3当量に対応)からなる反応混合物を、20U/mmolの酵素量の、R.エリスロポリス(R.erythropolis)由来の(S)−ADH(大腸菌で発現)および150U/mmolのバシラス(Bacillus)属由来のグルコースデヒドロゲナーゼと共に、1mlのリン酸緩衝液(100mM;pH7.0)中で、30℃の反応温度で、72時間の期間にわたって撹拌した。この期間内に、試料を採取し、それぞれの変換率を、HPLCを経て決定した。変換率は、5時間後に64%であり、72時間後に72%であった。
〔補因子再生のためにグルコースデヒドロゲナーゼを使用する100mMのtrans−2−ヘキセナールの変換〕
trans−2−ヘキセナール(100mM)およびNADH(1.4mM、アルデヒドに基づいて0.014当量に対応する)、グルコース(300mM、アルデヒドに基づいて3当量に対応)からなる反応混合物を、20U/mmolの酵素量の、R.エリスロポリス(R.erythropolis)由来の(S)−ADH(大腸菌で発現)および150U/mmolのバシラス(Bacillus)属由来のグルコースデヒドロゲナーゼと共に、1mlのリン酸緩衝液(100mM;pH7.0)中で、30℃の反応温度で、72時間の期間にわたって撹拌した。この期間内に、試料を採取し、それぞれの変換率を、HPLCを経て決定した。変換率は、5時間後に64%であり、72時間後に72%であった。
〔実施例6〕
〔補因子再生のためにグルコースデヒドロゲナーゼを使用する100mMのtrans−2−ヘキセナールの変換〕
trans−2−ヘキセナール(100mM)およびNADPH(1mM、アルデヒドに基づいて0.01当量に対応する)、塩化マグネシウム(5mM)、グルコース(300mM、アルデヒドに基づいて3当量に対応)からなる反応混合物を、13U/mmolの酵素量の、L.ケフィール(L.kefir)由来の(R)−ADHおよび60U/mmolのサーモプラズマ・アシドフィルム(Thermoplasma acidophilum)由来のグルコースデヒドロゲナーゼと共に、1mlのリン酸緩衝液(100mM;pH7.0)中で、30℃の反応温度で、72時間の期間にわたって撹拌した。この期間内に、試料を採取し、それぞれの変換率を、HPLCを経て決定した。変換率は、1時間後に40%であり、5時間後に79%であり、72時間後に86%であった。
〔補因子再生のためにグルコースデヒドロゲナーゼを使用する100mMのtrans−2−ヘキセナールの変換〕
trans−2−ヘキセナール(100mM)およびNADPH(1mM、アルデヒドに基づいて0.01当量に対応する)、塩化マグネシウム(5mM)、グルコース(300mM、アルデヒドに基づいて3当量に対応)からなる反応混合物を、13U/mmolの酵素量の、L.ケフィール(L.kefir)由来の(R)−ADHおよび60U/mmolのサーモプラズマ・アシドフィルム(Thermoplasma acidophilum)由来のグルコースデヒドロゲナーゼと共に、1mlのリン酸緩衝液(100mM;pH7.0)中で、30℃の反応温度で、72時間の期間にわたって撹拌した。この期間内に、試料を採取し、それぞれの変換率を、HPLCを経て決定した。変換率は、1時間後に40%であり、5時間後に79%であり、72時間後に86%であった。
〔実施例7〕
〔アルコールデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒を使用する0.5Mの溶液におけるtrans−2−ヘキセナールの還元〕
Titrino反応器において、40mlのリン酸緩衝液(pH7.0にさせた)を室温で、OD=27の光学濃度が得られるような細胞濃度の、上記の(R)−選択的アルコールデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO5c、pNO8c)(大腸菌(E.coli)、L.ケフィール(L.kefir)由来の(R)−アルコールデヒドロゲナーゼ、T.アシドフィルム(T.acidophilum)由来のグルコースデヒドロゲナーゼ)、6当量のグルコース(使用されるケイ皮アルデヒドの量に基づいた当量)および20mmolのtrans−2−ヘキセナール(0.5Mの基質濃度に対応する、使用されたリン酸緩衝液に基づく)にて処置した。反応混合物を室温で24時間撹拌し、水酸化ナトリウム溶液(2MNaOH)を添加することによってpHを一定に保持した。試料は、規則的な間隔で採取し、trans−2−ヘキセナールのtrans−2−ヘキセン−1−オールへの変換率を、HPLCによって決定した。変換率は、1時間後に、24%であり、5時間後に61%であり、24時間後に>99%であった。
〔アルコールデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒を使用する0.5Mの溶液におけるtrans−2−ヘキセナールの還元〕
Titrino反応器において、40mlのリン酸緩衝液(pH7.0にさせた)を室温で、OD=27の光学濃度が得られるような細胞濃度の、上記の(R)−選択的アルコールデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒大腸菌(E.coli)DSM14459(pNO5c、pNO8c)(大腸菌(E.coli)、L.ケフィール(L.kefir)由来の(R)−アルコールデヒドロゲナーゼ、T.アシドフィルム(T.acidophilum)由来のグルコースデヒドロゲナーゼ)、6当量のグルコース(使用されるケイ皮アルデヒドの量に基づいた当量)および20mmolのtrans−2−ヘキセナール(0.5Mの基質濃度に対応する、使用されたリン酸緩衝液に基づく)にて処置した。反応混合物を室温で24時間撹拌し、水酸化ナトリウム溶液(2MNaOH)を添加することによってpHを一定に保持した。試料は、規則的な間隔で採取し、trans−2−ヘキセナールのtrans−2−ヘキセン−1−オールへの変換率を、HPLCによって決定した。変換率は、1時間後に、24%であり、5時間後に61%であり、24時間後に>99%であった。
Claims (8)
- アルデヒドを還元して第一級アルコールを製造するための方法であって、
変換は、アルコールデヒドロゲナーゼと、補因子を再生することができる酵素とを含む組換え全細胞触媒の存在下で行われることを特徴とする第一級アルコールを製造する方法。 - 請求項1記載の第一級アルコールを製造する方法であって、
前記変換は、アルコールデヒドロゲナーゼと、グルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる酵素とを含む組換え全細胞触媒の存在下で行われることを特徴とする第一級アルコールを製造する方法。 - アルデヒドを還元して第一級アルコールを製造するための方法であって、
前記変換は単離されたアルコールデヒドロゲナーゼと、単離されたグルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる酵素との存在下で行われることを特徴とする第一級アルコールを製造するための方法。 - 請求項1、2又は3のいずれかに記載の第一級アルコールを製造するための方法であって、
2−trans−ヘキセナール、2−cis−ヘキセナール、3−trans−ヘキセナール、3−cis−ヘキセナール及び/又はケイ皮アルデヒドがアルデヒド成分として使用されることを特徴とする第一級アルコールを製造するための方法。 - 請求項1〜4のいずれかに記載の第一級アルコールを製造するための方法であって、
前記アルコールデヒドロゲナーゼとして、乳酸桿菌属(Lactbacillus)株由来、特にラクトバシルス・ケフィール(Lactbacillus kefir)及びラクトバシルス・ブレビス(Lactbacillus brevis)由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、又はロドコッカス属(Rhodococcus)株由来、特にロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)由来のアルコールデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒が使用されることを特徴とする第一級アルコールを製造するための方法。 - 請求項1〜5のいずれかに記載の第一級アルコールを製造するための方法であって、
前記補因子を再生することができる酵素が、好ましくはバシラス属(Bacillus)、サーモプラズマ属(Thermoplasma)及びシュードモナス属(Pseudomonas)株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ、又は好ましくはカンジダ属(Candida)及びシュードモナス属(Pseudomonas)株由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする第一級アルコールを製造するための方法。 - 請求項1〜6のいずれかに記載の第一級アルコールを製造するための方法であって、
前記補因子を再生することができる酵素がリンゴ酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする第一級アルコールを製造するための方法。 - 請求項1〜7のいずれかに記載の第一級アルコールを製造する方法であって、
前記請求項が全細胞触媒の使用に関連する限りにおいて、大腸菌(E.coli)が宿主生物体として用いられることを特徴とする第一級アルコールを製造する方法。
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