JP2008507989A - 第一級アルコールを生成するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、全細胞触媒又は単離された酵素の助けを借りてアルデヒドから第一級アルコールを製造する方法に関する。
【解決手段】使用されるのは、アルコールデヒドロゲナーゼ及び補因子を再生することができる酵素であり、転換のためのアルデヒドは、１５０ｍＭを超える基質濃度を有することが好ましい。
【選択図】図３

Description

本発明は、アルデヒドから開始して第一級アルコールを生成するための方法に関する。還元は、補因子依存性オキシドレダクターゼによって行われ、次に補因子が第２の酵素系によって再生される。

第一級アルコールの生成は、これら生成物が直接の形態で、又は対応するエステル化合物に変換された後に香料として使用されるため、食品産業の興味の対象となっている。これらを生成する好ましい方法は、アルデヒドを還元させることによって第一級アルコールを得ることである。この還元は、原則として、文献における多数の既存のプロトコルに記載されているように、非天然の化学的な還元剤を使用することによって、たとえば金属水素化物を使用することによって行うことができる。しかし、このような経路では、「天然様である」が、「天然ではない」第一級アルコールを生じるだけである。しかし、食品産業において、正確に天然の第一級アルコールを得ることは非常に重要である。これらを生成する１つの経路は、アルデヒドの酵素的還元による。

原則として、アルデヒドの酵素的還元は、既に文献において広範に記述されてきた。特に、例としては、これらの物質の結果としてｔｒａｎｓ−３−ヘキセノール、ｔｒａｎｓ−２−ヘキセノール、ケイ皮アルコールおよび２‐フェニルエタノールの生成が公知であり、食品産業分野において、香料、又は香料のための中間体として使用される。しかし、反応は、非常にうすい溶媒中で行われ、技術的にいうと、これに伴い生成物濃度が低いという不利な点がある。

ボトリチス・シネレ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）株の存在下における反応体積１リットルあたり０．０５ｇの基質濃度でのケイ皮アルデヒドの還元が、Ｇ．Ｂｏｃｋら（Ｇ．Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｚ．Ｌｅｂｅｎｓｍ．Ｕｎｔｅｒｓ．Ｆｏｒｓｃｈ．１９８８，１８６，３３−３５）によって記述されている。最も高い収率は、反応体積１リットルあたり０．０１９〜０．０２５ｇであった。

還元反応による２‐フェニルエタノールの生成のためのアルコールデヒドロゲナーゼの利用も記述されている。概して、標準的バッチ条件下で得られる生成物濃度は、ほんの１ｇ／ｌ未満である（Ｍ．Ｗ．Ｔ．Ｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｄ．Ｓｅｌｌ，Ｊ．Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２００３，２５，５３１−５３６）。ｉｎ ｓｉｔｕでの生成物除去技術を使用することにより、さらなる第２相における補助合成物として必要とされるオレイルアルコールが２ｇ／ｌまで増加した（Ｍ．Ｗ．Ｔ．Ｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｄ．Ｓｅｌｌ，Ｊ．Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２００３，２５，５３１−５３６）。さらなる有機相としてオレイン酸を用いた抽出流加生体内変換を使用して、Ｓｔａｒｋらは、約１００ｍＭの量に相当する１２．６ｇ／ｌの生成物濃度で２−フェニルエタノールを得るために、このような特異的反応系をうまく使用した（Ｄ．Ｓｔａｒｋ，Ｔ．Ｍｕｎｃｈ，Ｂ．Ｓｏｎｎｌｅｉｔｎｅｒ，Ｉ．Ｗ．Ｍａｒｉｓｏｎ，Ｕ．ｖｏｎ Ｓｔｏｃｋａｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００２，１８，５１４−５２３）。

ｔｒａｎｓ−３−ヘキセノールおよびｔｒａｎｓ−２−ヘキセノールの生成については、最終的に重要な工程として、いずれの場合においても対応するアルデヒドの酵素的還元を含む一連の酵素法が記述されている（Ｓ．Ｋ．Ｇｏｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４８０６３７９号，１９８９；Ｂ．Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５４６４７６１号，１９９５；Ｐ．Ｂｒｕｎｅｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５６２０８７９号，１９９７；Ｍ．−Ｌ．Ｆａｕｃｏｎｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ．１９９９，２１，６２９−６３３；Ｒ．Ｂ．Ｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６２７４３５８号，２００１）。最も高い収率は、Ｍｕｌｌｅｒらによって報告されており（Ｂ．Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５４６４７６１号，１９９５；また、Ｊ．Ｓｃｈｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００４，２６，４６３−４７２も参照されたい）、ｔｒａｎｓ−３−ヘキセノールの場合１ｋｇあたり４．２ｇで、ｔｒａｎｓ−２−ヘキセノールの場合１ｋｇあたり１．５ｇであった。これらの方法の不利な点は、主に低い基質濃度が手順に使用されることと、反応溶液において１ｋｇあたり５ｇ未満である低い生成物濃度で得られるものを生じることである。

この不利な点を回避するために、ｔｒａｎｓ−２−ヘキセナールでの適切な酵素反応を１００ｍＭの基質濃度で行った（実施例４＝比較例）。ここで、使用した酵素としては、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼがｔｒａｎｓ−２−ヘキセナールに対する活性を有することが見いだされたので、これらの酵素を用いた。補因子の再生は、ギ酸デヒドロゲナーゼがケトンの酵素的還元における多くの場合にうまく使用された後は、この補因子生成酵素で行った（Ｍ．−Ｒ．Ｋｕｌａ，Ｕ．Ｋｒａｇｌ，Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｈｉｒａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ：Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ（Ｅｄ．：Ｒ．Ｎ．Ｐａｔｅｌ），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００，ｃｈａｐｔｅｒ ２８，ｐ．８３９以下参照）。しかし、２つの酵素成分の存在下では、おそらく、もとからｔｒａｎｓ−２−ヘキセナール濃度が低いことによる阻害効果および／又は不安定化効果の結果として、所望の反応は、わずかな程度で観察されるだけであり、７２時間後にわずか１６％の変換があった（実施例４）。

また、Ｍ．−Ｌ．Ｆａｕｃｏｎｎｉｅｒらは、アルコール−デヒドロゲナーゼ含有微生物を使用するときに、非常に低い基質濃度においてもｔｒａｎｓ−３−ヘキセナールがアルコールデヒドロゲナーゼを阻害するという事実を報告している（Ｍ．−Ｌ．Ｆａｕｃｏｎｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ．１９９９，２１，６２９−６３３）。概して、反応は、０．０６６ｇ／ｌに対応する０．６７ｍＭで行った。最大変換率は、８２％であった。

手短に言えば、現在第一級アルコールを生成するためのアルデヒドのすべての酵素的還元法では、１５ｇ／ｌ未満の低く技術的に魅力のない生成物濃度に至るだけである。対応して、せいぜい〜１００ｍＭの低い基質濃度でのみ、８０％を超える技術的に意味のある変換速度を示すだけである。これについての根本的原因は、アルデヒド成分が阻害効果を有すること、および酵素が不活性化されることであると説明することができる。アルデヒドは、ケトンと比較すると、ずっと反応性のある成分であるので、これらの化合物は、実質的に酵素の官能基（特定のアミンのもの）と反応し（これは望まれない）、したがってこれらを不活性化させ得る。

したがって、アルデヒドからの第一級アルコールの生成のための、迅速で、簡単で、安価で、かつ有効な酵素法を開発することが本発明の目的であった。特に、公知の従来技術の方法を上回る空時収量を改善することが目的であった。これには、第１に、しっかりとした手順で、対応した優れた収率をもつ高基質濃度での方法を行うことが必要となる。特に、このような方法を、不飽和アルデヒドを還元させるために使用することができるはずである。

本目的は、請求項に従って解決された。請求項１は、ｒｅｃ全細胞触媒が使用される本発明に従った方法に関する。請求項２は、本方法の好ましい態様を含む。請求項３は、本発明に従った目的のための遊離酵素の使用に向けられる。請求項３〜９は、本発明による方法の好ましい態様を保護する。

アルデヒドを還元させることによって第一級アルコールを生成するための方法において、この変換は、アルコールデヒドロゲナーゼおよび補因子を再生することができる酵素を含む組換え全細胞触媒の存在下において行われるという事実により、驚くべきことに、しかし実に好都合にも、提起された問題の解決に確実に達する。驚くべきことに、１５０ｍＭを超える、特に２５０ｍＭを超える、および非常に好ましくは５００ｍＭを超える高基質濃度にてこの方法を使用して、高〜非常に高い変換率が得られる。これらの変換率は、典型的には８０％以上、および特に９０〜９５％を上回る収率である。以前の方法での低い変換率に基づくと、低い基質濃度を使用するときでさえも、これを予想することはできなかったし、特に使用した基質がデヒドロゲナーゼに対して及ぼす重度の阻害又は不安定化効果（従来技術から公知の事実）の背景に対しては、極めて驚くべきである。

原則として、当業者が本出願を想定するかもしれないすべてのアルコールデヒドロゲナーゼは、ｒｅｃ全細胞触媒を確立するために適している。しかし、本発明に従った変換は、好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、およびグルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる酵素を含む組換え（ｒｅｃ）全細胞触媒の存在下において行われた。

上で提起された問題のさらなる解決は、単離されたアルコールデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる単離された酵素の存在下において、本発明に従った変換を行うことによって達成される。ここで、単離された形態で使用される酵素の形態のグルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる酵素と、アルコールデヒドロゲナーゼとの組み合わせの特異的な適合性は、特に、ギ酸デヒドロゲナーゼをこのように使用したときに、収率が満足できないことを考慮すると（また、実施例４ ＝比較例を参照されたい）、驚くべきものである。

グルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる酵素とアルコールデヒドロゲナーゼとの組み合わせにおける、ギ酸デヒドロゲナーゼとの類似の組み合わせを上回る著しく改善された性能は、たとえばｔｒａｎｓ−２−ヘキセナールの還元において得られた変換率を比較することによって例証される（実施例４（＝比較例）および実施例５〜７を参照されたい）。

変換は、好ましくは１５０ｍＭを超える、特に、２５０ｍＭを超える、および非常に好ましくは５００ｍＭを超える高い基質濃度のアルデヒドにて行われる。

本発明によれば、「１５０ｍＭを超える高い基質濃度にて」という用語は、記述された方法を使用すると、使用した水性溶媒（緩衝系を含む）の開始体積あたり１５０ｍＭを超える基質が変換されることを意味するものとして理解される。この状況において、反応混合物の濃度として１５０ｍＭを超える基質が実際に達成されるかどうか、又は水性溶媒の開始体積に基づいて１５０ｍＭを超える基質濃度が全体で変換されるかどうかは重要ではない。

しかし、特に好ましい変種は、１５０ｍＭを超える基質濃度等のアルデヒドが実際に変換のために提供されるものである。本明細書に詳述した濃度は、水性溶媒の開始体積に基づいて、実際に反応混合物で得られる基質（アルデヒド）濃度をいい、使用した全細胞触媒の、又は使用した単離された酵素（精製され、又は部分的に精製された形態で、又は粗製抽出物として）のインキュベーション期間の間に、この開始濃度が達成されるときには、重要ではない。これは、少なくとも一度達成されるだけである。

全細胞触媒を使用するときは、細胞全体反応の初めにこれらの濃度にてバッチ形態で直接アルデヒドを使用することができ、又はさもなければ、最初に、アルデヒドを添加する前に一定の光学濃度まで全細胞触媒を使用することができる。同様に、アルデヒドを最初により低い濃度で使用し、次いで指定したとおりの濃度まで細胞反応のインキュベーション期間の間に添加することができる。しかし、反応において、基質の所望のアルコールへの変換の間に少なくとも一回、１５０ｍＭを超える基質濃度等を達成することができる場合は、それが好ましい。

すべてのアルデヒドは、アルデヒド成分として使用されることができる。好ましくは、使用されるアルデヒド成分は、以下の一般の構造式の下で包含されることができる

ここで、Ｒは、（Ｃ_１−Ｃ_２０）−アルキル、（Ｃ_２−Ｃ_２０）−アルケニル、（Ｃ_２−Ｃ_２０）−アルキニル、（Ｃ_１−Ｃ_２０）−アルコキシ、ＨＯ−（Ｃ_１−Ｃ_２０）−アルキル、（Ｃ_２−Ｃ_２０）−アルコキシアルキル、（Ｃ_６−Ｃ_１８）−アリール、（Ｃ_７−Ｃ_１９）−アラルキル、（Ｃ_３−Ｃ_１８）−ヘテロアリール、（Ｃ_４−Ｃ_１９）−ヘテロアラルキル、（Ｃ_１−Ｃ_２０）−アルキル−（Ｃ_６−Ｃ_１８）−アリール、（Ｃ_１−Ｃ_２０）−アルキル−（Ｃ_３−Ｃ_１８）−ヘテロアリール、（Ｃ_３−Ｃ_８）−シクロアルキル、（Ｃ_１−Ｃ_２０）−アルキル−（Ｃ_３−Ｃ_８）−シクロアルキル、（Ｃ_３−Ｃ_８）−シクロアルキル−（Ｃ_１−Ｃ_２０）−アルキル、（Ｃ_６−Ｃ_１８）−アリール−（Ｃ_２−Ｃ_２０）−アルケニルである。

本方法は、特に、その一部分に少なくとも１つのＣ＝Ｃ二重結合を含むアルデヒドを還元させるために使用される。本明細書において非常に好ましく使用される物質は、２−ｔｒａｎｓ−ヘキセナール、２−ｃｉｓ−ヘキセナール、３−ｔｒａｎｓ−ヘキセナール、３−ｃｉｓ−ヘキセナールおよび／又はケイ皮アルデヒドである。

本発明に関して、好ましくは、選択される酵素のうちの１つは、アルコールデヒドロゲナーゼである。当業者であれば、彼がアルコールデヒドロゲナーゼを選択するはずはない。好ましいことが判明したアルコールデヒドロゲナーゼは、たとえば乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株由来、特にラクトバシルス・ケフィール（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ）および乳酸短桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、又はロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）株由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、特にロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）およびロドコッカス・ルバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ）由来、又はアルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）株由来、特にアルトロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼである。

補因子再生のための好ましいデヒドロゲナーゼは、グルコースデヒドロゲナーゼ、好ましくはバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株由来のグルコースデヒドロゲナーゼであることが証明された。グルコースデヒドロゲナーゼは、たとえばＡ．Ｂｏｍｍａｒｉｕｓ ｉｎ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｅｄ．：Ｋ．Ｄｒａｕｚ，Ｈ．Ｗａｌｄｍａｎｎ），Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩＩ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００２，ｃｈａｐｔｅｒ １５．３によって記述されている。

リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、当業者に公知である（Ｓ．−Ｉ．Ｓｕｙｅ，Ｍ．Ｋａｗａｇｏｅ，Ｓ．Ｉｎｕｔａ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．１９９２，７０，３０６−３１２；Ｓ．−Ｉ．Ｓｕｙｅ，Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｉ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．１９９８，１，５５−６４；ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ Ｓ．Ｎａａｍｎｉｅｈ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ；国際公開公報第２００４／０２２７６４号）。また、当業者であれば、彼の目的のために最も効率的に使用することができるデヒドロゲナーゼを選択するであろう。原理的には、好ましいリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、使用されるその他の酵素の反応の経過に対して障害を生じない程度にＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再生するものである。使用されるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（「リンゴ酸酵素」）は、好ましくはスルフォロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の「リンゴ酸酵素」である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、この状況において非常に好ましく、これは公知である。遺伝子単離およびクローニングは、Ｓ．Ｎａａｍｎｉｅｈ，ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，ｐ．７０以下参照に記述されている。

アルデヒドは、いずれの方法でも添加することができる。好ましくは、アルデヒドのすべてが、開始時に（バッチ反応）又は代わりに、メーターで測定して添加される。また、連続添加（連続送り込み法）を使用してもよい。これらの手順は、当業者に周知であり、この場合にも同様に使用される。

本発明によれば、「組換え全細胞触媒」は、少なくとも１つの組換遺伝子を発現しているか、又は発現された、すなわち本発明に従った変換（アルデヒドの還元および／又は補因子の再生）を触媒することができる、少なくとも１つの組換えタンパク質が存在する細胞を意味するものとして理解される。組換えタンパク質は、生存又は非生存全細胞触媒に存在することは限定されるわけではないが、どのような活性化型であってもよい。この状況において、「活性化型」は、組換えタンパク質が酵素反応を触媒する能力を意味するものとして理解される。本発明の好ましい態様において、組換えタンパク質は、もっぱら遊離型で細胞のサイトゾル全体に分布しており、封入体の形態では存在しない。本発明によれば、細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼおよび補因子を再生することができるデヒドロゲナーゼを発現することができ、又はできた。

すべての周知の細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼおよび補因子を再生させることができる酵素を含む全細胞触媒として適切である。この状況において、言及される微生物は、例えば、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、ピキアスピーシーズ（Ｐｉｃｈａ ｓｐ．）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような原核生物、又は哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞のような真核生物といった有機体である。クローニング方法は、当業者に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．；Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。大腸菌株は、この目的のために好ましく使用される。特に非常に好ましくは：Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ，ＮＭ ５２２，ＪＭ１０１，ＪＭ１０９，ＪＭ１０５，ＲＲ１，ＤＨ５α，ＴＯＰ １０−，ＨＢ１０１，ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ，ＢＬ２１ （ＤＥ３）ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ，ＢＬ２１，ＢＬ２１（ＤＥ３），ＭＭ２９４である。宿主生物体に好ましくクローン化される本発明による核酸を含む遺伝子構成物を有するプラスミドは当業者に公知である（ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７１４８参照、また、以下参照）。

適したプラスミド又はベクターは、原則として、この目的のために当業者が利用できる実施態様のすべてである。このようなプラスミドおよびベクターは例えばＳｔｕｄｉｅｒおよび共同研究者（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｗ．Ｆ．；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ａ．Ｈ．；Ｄｕｎｎ Ｊ．Ｊ．；Ｄｕｂｅｎｄｒｏｆｆ Ｊ．Ｗ．；（１９９０），Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，６１−８９）又はＮｏｖａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ又はＧｉｂｃｏ−ＢＲＬのカタログで見つけることができる。さらに好ましいプラスミドおよびベクターは：Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（１９８５），ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｄ．Ｔ．（ｅｄｓ）（１９８８），Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，１７９−２０４，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．（１９９０），Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，３−７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．；Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、で見つけることができる。

検討された核酸配列を含む遺伝子構成物を、特に好ましい様式で宿主生物体にクローン化することができるプラスミドは、以下のものであるか、又は以下に基づく：ｐＵＣ１８／１９（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製），ｐＫＫ−１７７−３Ｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製），ｐＢＴａｃ２（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製），ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製），ｐＫＫ−２３３−３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）又はｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）。

本発明に従った方法のさらなる態様において、全細胞触媒は、好ましくは、使用される前に、基質および生成物についての細胞膜の透過性を無処置の系よりも増大させるような方法で前処理される。この状況においては、全細胞触媒が、たとえば凍結および／又は有機溶媒、特にトルエンでの処置によって前処理される方法が、特に好ましい。

Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）又はラクトバシルス・ケフィール（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（リンゴ酸酵素として公知であるものを含む）を含む組換え全細胞触媒が、特にこの状況に適している。Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）又はラクトバシルス・ケフィール（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼおよびサーモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のグルコースデヒドロゲナーゼのすべての可能な組み合わせでの組換え全細胞触媒も同程度に適している。実施例の部分に記述した２つの組換え全細胞触媒は、特に適した組換え全細胞触媒として好ましい。

この組換え全細胞触媒の濃度は、好ましくは７５ｇ／ｌ未満、より好ましい態様は５０ｇ／ｌ以下、さらに好ましくは２５ｇ／ｌ以下、もっとも好ましくは１５ｇ／ｌ以下、ｇはウェットバイオマス（ＷＢＭ）を参照とした。

本発明に従った方法は、いずれの反応温度でも、特に、使用する組換え全細胞触媒のために適したもので行うことができる。特に適していると考えられる反応温度は、１０〜９０℃、好ましくは１５〜５０℃および特に好ましくは２０〜３５℃の反応温度である。

反応のｐＨに関しては、再び当業者によって自由に選択され、固定したｐＨ、又はさもなければｐＨ間隔内でｐＨを変化させて反応を行うことができる。ｐＨは、特に宿主生物の要求又は使用される単離された酵素を考慮にいれて選択される。好ましくは、反応は、５〜９のｐＨ、好ましくはｐＨ ６〜８で、および特に好ましくはｐＨ ６．５〜７．５で行われる。

所望の生成物を得るために使用される基質の変換は、好ましくは、適切な組換え全細胞触媒を使用して細胞培養において行われる。使用される宿主生物に応じて、適切な栄養培地をこの目的に使用する。宿主細胞のために適した培地は、一般に公知であり、市販されている。さらに、たとえば、抗生物質、たとえば血清（ウシ胎児血清等）などの生育促進薬剤などの従来通りの添加物、並びに同様の公知の添加物を細胞培養に添加することができる。

好ましい態様において、所望の第一級アルコールを得るためのアルデヒドの変換は、有機溶媒を添加することなく行われる。これは、有機溶媒が生体触媒を含む反応混合物に添加されないことを意味する。しかし、あるいは、反応を行うために必要とされる添加された水に、さらなる有機溶媒、好ましくは水に可溶性である有機溶媒を添加することができる。これらは、特に、たとえばアルコール、特にメタノールもしくはエタノール、又はＴＨＦもしくはジオキサンのようなエーテルなどの水溶性有機溶媒を意味する。

さらに、適切な組換え全細胞触媒の細胞懸濁液中での変換を行うことが好ましく、また、細胞懸濁液中で使用されるアルデヒドが、懸濁液として存在するか、又は細胞懸濁液において乳剤もしくは溶液の形態で存在することができる。

単離された酵素を使用するときは（精製され、もしくは部分的に精製された形態で、又は粗製抽出物として、又は固定された形態で）、好ましい態様は、適切な量の対応する補因子を添加することを伴う。概して、添加される補因子の量は、０．００００１〜０．１当量、好ましくは０．０００１〜０．０１当量、および特に０．０００１〜０．００１当量の範囲である。好ましい態様において、および全細胞触媒を使用するときに、「外部」補因子添加の使用は、省くことができ、又はこのような「外部」補因子は、０．０００５当量未満の範囲で使用することができる。

本反応に関して、手順は、組換え全細胞触媒又は単離された酵素、および基質を最初に選択した溶媒系に導入するという好ましい態様に従う。次いで、必要に応じて、必要とされる一定量の対応する補因子（たとえば、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ、又はこれらの酸化型ＮＡＤ^＋およびＮＡＤＰ^＋）を反応混合物に添加することができる。しかし、添加の順位は変更することができる。反応混合物を当業者に公知の方法によって徐々に調整する。バッチ処理の場合、バイオマスは、濾過又は遠心分離によって容易に生成物から分離することができる。次いで、得られたアルコールを従来法（たとえば、抽出、蒸留、結晶化）によって単離することができる。

しかし、本方法は、連続的に行うこともできる。このためには、高分子重量物質（酵素又はバイオマス）が限外濾過膜の後ろに保持され、かつ低分子量物質（生成されたアミノ酸など）の膜を超えて通過することができる酵素膜反応器として公知のものの中で反応を行う。このような手順は、従来技術において既に繰り返し記述されてきた（Ｗａｎｄｒｅｙ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｊａｈｒｂｕｃｈ １９９８，Ｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ ｕｎｄ Ｃｈｅｍｉｅｉｎｇｅｎｉｅｕｒｗｅｓｅｎ，ＶＤＩ，ｐ．１５１以下参照；Ｋｒａｇｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６，６８４）。

（Ｃ_１−Ｃ_２０）−アルキルラジカルは、特に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、セシル、アンデシル、ドデシル、およびすべてのこれらを結合している異性体である。同様に、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アルキルラジカルは、鎖の中に１〜８個の炭素原子が存在するものである。

（Ｃ_２−Ｃ_２０）−アルケニルラジカルは、少なくとも１つのＣ＝Ｃ２重結合を有する上記のような（Ｃ_１−Ｃ_２０）−アルキルラジカルを意味する。（Ｃ_２−Ｃ_２０）−アルコキシラジカルは、少なくとも１つのＣ≡Ｃ３重結合を有する上記のような（Ｃ_１−Ｃ_２０）−アルキルラジカルを意味する。（Ｃ_１−Ｃ_２０）−アルコキシラジカルは、後者が酸素原子を経て分子に結合される条件をつければ、（Ｃ_１−Ｃ_２０）―アルキルラジカルに対応する。同様のことは、同様に、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アルコキシラジカルに適用される。

（Ｃ_２−Ｃ_２０）−アルコキシアルキルは、アルキル鎖が少なくとも１つの酸素官能基によって中断されており、２つの酸素原子を互いに連結することができないラジカルを意味するものとして理解される。炭素原子数は、ラジカルに存在する総炭素原子数を示す。

上記のラジカルは、ハロゲンによって、および／又はＮ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ原子を含むラジカルによって、一置換又は多置換されていることができる。これらは、特に、これらの鎖内にこれらのヘテロ原子の１つもしくは複数を含むか、又はこれらのヘテロ原子のうちの１つを経て分子に結合する、上述したタイプのアルキルラジカルである。

（Ｃ_３−Ｃ_８）−シクロアルキルはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル又はシクロヘプチル残基等を意味することが理解される。これらは、１つもしくは複数のハロゲンおよび／又はＮ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ原子を含むラジカルによって置換することができ、および／又は、たとえば１−、２−、３−、４−ピペリジル、１−、２−、３−ピロリジニル、２−、３−テトラヒドロフリル、２−、３−、４−モルホリニルなど、環内にＮ、Ｏ、Ｐ、Ｓ原子を含むことができる。

（Ｃ_３−Ｃ_８）−シクロアルキル−（Ｃ_１−Ｃ_２０）−アルキルラジカルは、上記したようなアルキルラジカルを経て分子に結合されている上記のようなシクロアルキルラジカルであることを示す。

本発明の目的のためには、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アシロキシは、ＣＯＯ官能性を経て分子に結合されている８個以下の炭素原子をもつ上記のようなアルキルラジカルを意味する。

本発明の目的のためには、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アシルは、ＣＯ官能性を経て分子に結合されている８個以下の炭素原子をもつ上記のようなアルキルラジカルを意味する。

（Ｃ_６−Ｃ_１８）−アリールラジカルは、６〜１８個のＣ原子をもつ芳香族ラジカルを意味するものとして理解される。これには、特に、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、ビフェニルラジカルなどの化合物、又は、たとえばインデニル系などの、主題とされている分子と縮合される前述したタイプの系を含み、これらは、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アルコキシ、ＮＲ^１Ｒ^２、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アシル、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アシロキシによって任意に置換することができる。

（Ｃ_７−Ｃ_２６）−アラルキルラジカルは、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アルキルラジカルを経て分子に結合されている（Ｃ_６−Ｃ_１８）−アリールラジカルである。

本発明の目的のためには、（Ｃ_３−Ｃ_１８）−ヘテロアリールラジカルは、例えば環の中に窒素、酸素、又は硫黄のようなヘテロ原子を有する３〜１８個の炭素原子を持つ５−、６−、又は７員環の芳香族環系を意味する。このような複素芳香族化合物は、特に、１−、２−、３−フリル、１−、２−、３−ピロリル、１−、２−、３−チエニル、２−、３−、４−ピリジル、２−、３−、４−、５−、６−、７−インドリル、３−、４−、５−ピラゾリル、２−、４−、５−イミダゾイル、アクリジニル、キノリニル、フェナンスリジニル、２−、４−、５−、６−ピリミジニルのようなラジカルが考えられる。

（Ｃ_４−Ｃ_２６）−ヘテロアラルキルは、（Ｃ_７−Ｃ_２６）−アラルキルラジカルに対応する複素芳香族系を意味するものとして理解される。

適切なハロゲン（Ｈａｌ）は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素である。

「単離された酵素」という用語は、本発明によれば、単離された酵素として（精製された、もしくは部分的に精製された形態で、又は粗製抽出物として、又は固定された形態で）の、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびグルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる酵素の使用を意味するものとして理解される。

リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）は、「リンゴ酸酵素」と称され、リンゴ酸のピルビン酸への酸化的脱炭酸反応を触媒する。したがって、種々の生物体由来の、とりわけ高等動物、植物および微生物由来の多数のリンゴ酸デヒドロゲナーゼが公知である。４つのタイプのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ間に区別され、これは酵素分類Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７ 〜ＥＣ １．１．１．４０に分類されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ）。リンゴ酸デヒドロゲナーゼのタイプに応じて、補因子としてＮＡＤおよび／又はＮＡＤＰ が必要とされる。

実施例において使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ブダペスト条約に従って番号ＤＳＭ １４４５９の下で、０８．２４．０１にＤＳＭＺ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋにて出願人によって寄託されている。

〔ラクトバシルス・ケフィール（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ）由来の（Ｒ）−アルコールデヒドロゲナーゼおよびサーモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）由来のグルコースデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒の調製〕

〔菌の生産〕
大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１４４５９（特許国際公開公報第０３／０４２４１２号に記述してある）の化学処理によるコンピテントセルをプラスミドｐＮＯ５ｃで形質転換させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。このプラスミドは、ラクトバシルス・ケフィール（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼをコードする（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ａ ｕｓｅｆｕｌ ｃａｔａｌｙｓｔ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｒａｄｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．ＪＯＣ １９９２，５７ １５３２−６，Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ ｔｏ Ｒ（＋）−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌ ｂｙ ａ ｎｅｗ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ．Ｈｕｍｍｅｌ Ｗ．Ａｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ １９９０，３４，１５−１９）。組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１４４５９（ｐＮＯ５ｃ−図１）で化学処理によるコンピテントセルを作製して、サーモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）由来のコドンを最適化したグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子をコードするプラスミドｐＮＯ８ｃ（図２）で形質転換した（Ｂｒｉｇｈｔ， Ｊ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：５４９−５５４）。両遺伝子は、ラムノースプロモーター（Ｓｔｕｍｐｐ，Ｔｉｎａ；Ｗｉｌｍｓ，Ｂｕｒｋｈａｒｄ；Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊｏｓｅｆ．Ａ ｎｅｗ，Ｌ−ｒｈａｍｎｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．ＢｌＯｓｐｅｋｔｒｕｍ（２０００），６（１），３３−３６）の制御下にある。ｐＮＯ５ｃおよびｐＮＯ８ｃの配列並びにプラスミドマップを以下に詳述してある。

〔活性細胞の調製〕
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１４４５９（ｐＮＯ５ｃ、ｐＮＯ８ｃ）の単一コロニーを、添加した抗生物質（５０μｇ／ｌアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を含む２ｍｌのＬＢ培地中で、振とう（２５０ｒｐｍ）しながら３７℃にて１８時間インキュベートした。この培養液を誘導因子としてのラムノース（２ｇ／ｌ）、添加した抗生物質（５０μｇ／ｌアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）および１ｍＭＺｎＣｌ_２を含む新鮮なＬＢ培地中に１：１００希釈して、振とう（２５０ｒｐｍ）しながら３０℃にて１８時間インキュベートした。細胞を遠心し（１００００ｇ、１０分、４℃）、上清を廃棄して、細胞ペレットを直接又は２０℃に貯蔵後のいずれかに、生体内変換実験において使用した。

ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）由来の（Ｓ）−アルコールデヒドロゲナーゼおよび枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のグルコースデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒の調製

〔菌の生産〕
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１４４５９（特許国際公開公報第０３／０４２４１２号に記述してある）の化学処理によるコンピテントセルをプラスミドｐＮＯ１４ｃで形質転換させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。このプラスミドは、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ （Ｓ）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＤＳＭ ４３２９７．Ａｂｏｋｉｔｓｅ，Ｋ．；Ｈｕｍｍｅｌ，Ｗ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００３，６２ ３８０−３８６）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ．Ｈｉｌｔ Ｗ；Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ Ｇ；Ｆｏｒｔｎａｇｅｌ Ｐ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ （１９９１ Ｊａｎ ２９），１０７６（２），２９８−３０４）をコードする。アルコールデヒドロゲナーゼは、ラムノースプロモーター（Ｓｔｕｍｐｐ，Ｔｉｎａ；Ｗｉｌｍｓ，Ｂｕｒｋｈａｒｄ；Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊｏｓｅｆ． Ａ ｎｅｗ，Ｌ−ｒｈａｍｎｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．ＢＩＯｓｐｅｋｔｒｕｍ（２０００），６（１），３３−３６）の制御下にある。ｐＮＯ１４ｃの配列およびプラスミドマップは、以下に詳述してある。

〔活性細胞の調製〕
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１４４５９（ｐＮＯ１４ｃ−図３）の単一コロニーを、添加した抗生物質（５０μｇ／ｌアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を含む２ｍｌのＬＢ培地中で、振とう（２５０ｒｐｍ）しながら３７℃にて１８時間インキュベートした。この培養液を誘導因子としてのラムノース（２ｇ／ｌ）、添加した抗生物質（５０μｇ／ｌアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）および１ｍＭＺｎＣｌ_２を含む新鮮なＬＢ培地中に１：１００希釈して、振とう（２５０ｒｐｍ）しながら３０℃にて１８時間インキュベートした。細胞を遠心し（１００００ｇ、１０分、４℃）、上清を廃棄して、細胞ペレットを直接又は２０℃に貯蔵後のいずれかに、生体内変換実験において使用した。

〔ケイ皮アルコールおよびｔｒａｎｓ−２−ヘキセン−１−オールの製造の実施例〕

〔実施例１〕
アルコールデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒を使用する０．２Ｍの溶液におけるケイ皮アルデヒドの還元
Ｔｉｔｒｉｎｏ反応器において、４０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０にさせた）を室温で、ＯＤ＝２４の光学濃度が得られるような細胞濃度の上記のアルコールデヒドロゲナーゼをもつ全細胞触媒大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１４４５９（ｐＮＯ１４ｃ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）由来の（Ｓ）−アルコールデヒドロゲナーゼ、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のグルコースデヒドロゲナーゼ）、１．０５当量のグルコース（使用されるケイ皮アルデヒドの量に基づいた当量）および８ｍｍｏｌのケイ皮アルデヒド（０．２Ｍの基質濃度に対応、使用されたリン酸緩衝液に基づく）にて処置した。反応混合物を室温で撹拌し、水酸化ナトリウム溶液（２ＭＮａＯＨ）を添加することによってｐＨを一定に（ｐＨ６．５に）保持した。試料は、規則的な間隔で採取し、ケイ皮アルデヒドのケイ皮アルコールへの変換をＨＰＬＣによって決定した。１時間後に、変換率は、９３％に達し、２時間後に１００％に達した。

〔実施例２〕
〔アルコールデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒を使用する０．５Ｍの溶液におけるケイ皮アルデヒドの還元〕
Ｔｉｔｒｉｎｏ反応器において、４０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０にさせた）を室温で、ＯＤ＝１６の光学濃度が得られるような細胞濃度の、上記のアルコールデヒドロゲナーゼをもつ全細胞触媒大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１４４５９（ｐＮＯ１４ｃ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）由来の（Ｓ）−アルコールデヒドロゲナーゼ、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のグルコースデヒドロゲナーゼ）、１．０５当量のグルコース（使用されるケイ皮アルデヒドの量に基づいた当量）および２０ｍｍｏｌのケイ皮アルデヒド（０．５Ｍの基質濃度に対応、使用されたリン酸緩衝液に基づく）にて処置した。反応混合物を室温で撹拌し、水酸化ナトリウム溶液（２ＭＮａＯＨ）を添加することによってｐＨを一定に（ｐＨ６．５に）保持した。試料は、規則的な間隔で採取し、ケイ皮アルデヒドのケイ皮アルコールへの変換をＨＰＬＣによって決定した。１時間後に、変換率は、４４％に達し、５時間後に９１％に達し、２５時間後に９３％に達した。

〔実施例３〕
〔（Ｒ）−選択的アルコールデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒を使用する１．５Ｍの溶液におけるケイ皮アルデヒドの還元〕
Ｔｉｔｒｉｎｏ反応器において、４０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０にさせた）を室温で、ＯＤ＝３０の光学濃度が得られるような細胞濃度の、上記の（Ｒ）−選択的アルコールデヒドロゲナーゼをもつ全細胞触媒大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１４４５９（ｐＮＯ５ｃ、ｐＮＯ８ｃ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｌ．ケフィール（Ｌ．ｋｅｆｉｒ）由来の（Ｒ）−アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｔ．アシドフィルム（Ｔ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）由来のグルコースデヒドロゲナーゼ）、１．０５当量のグルコース（使用されるケイ皮アルデヒドの量に基づいた当量）および６０ｍｍｏｌのケイ皮アルデヒド（１．５Ｍの基質濃度に対応する、使用されたリン酸緩衝液に基づく）にて処置した。反応混合物を室温で２５時間撹拌し、水酸化ナトリウム溶液（５ＭＮａＯＨ）を添加することによってｐＨを一定に保持した。試料は、規則的な間隔で採取し、ケイ皮アルデヒドのケイ皮アルコールへの変換をＨＰＬＣによって決定した。１時間後に、変換率は、１５％に達し、５時間後に５８％に達し、２３．５時間後に９８％に達した。

〔実施例４（比較例）〕
〔補因子再生のためにギ酸デヒドロゲナーゼを使用する１００ｍＭのｔｒａｎｓ−２−ヘキセナールの変換〕
ｔｒａｎｓ−２−ヘキセナール（１００ｍＭ）およびＮＡＤＨ（３．５ｍＭ、アルデヒドに基づいて０．０３５当量に対応する）、ギ酸ナトリウム（４５５ｍＭ、アルデヒドに基づいて４．５５当量に対応）からなる反応混合物を、２０Ｕ／ｍｍｏｌの酵素量の、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）由来の（Ｓ）−ＡＤＨ（大腸菌で発現）および２０Ｕ／ｍｍｏｌのカンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）由来のギ酸デヒドロゲナーゼと共に、１ｍｌのリン酸緩衝液（１００ｍＭ；ｐＨ７．０）中で、３０℃の反応温度で、７２時間の期間にわたって撹拌した。この期間内に、試料を採取し、それぞれの変換率を、ＨＰＬＣを経て決定した。変換率は、５時間後に７％であり、７２時間後に１６％であった。

〔実施例５〕
〔補因子再生のためにグルコースデヒドロゲナーゼを使用する１００ｍＭのｔｒａｎｓ−２−ヘキセナールの変換〕
ｔｒａｎｓ−２−ヘキセナール（１００ｍＭ）およびＮＡＤＨ（１．４ｍＭ、アルデヒドに基づいて０．０１４当量に対応する）、グルコース（３００ｍＭ、アルデヒドに基づいて３当量に対応）からなる反応混合物を、２０Ｕ／ｍｍｏｌの酵素量の、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）由来の（Ｓ）−ＡＤＨ（大腸菌で発現）および１５０Ｕ／ｍｍｏｌのバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のグルコースデヒドロゲナーゼと共に、１ｍｌのリン酸緩衝液（１００ｍＭ；ｐＨ７．０）中で、３０℃の反応温度で、７２時間の期間にわたって撹拌した。この期間内に、試料を採取し、それぞれの変換率を、ＨＰＬＣを経て決定した。変換率は、５時間後に６４％であり、７２時間後に７２％であった。

〔実施例６〕
〔補因子再生のためにグルコースデヒドロゲナーゼを使用する１００ｍＭのｔｒａｎｓ−２−ヘキセナールの変換〕
ｔｒａｎｓ−２−ヘキセナール（１００ｍＭ）およびＮＡＤＰＨ（１ｍＭ、アルデヒドに基づいて０．０１当量に対応する）、塩化マグネシウム（５ｍＭ）、グルコース（３００ｍＭ、アルデヒドに基づいて３当量に対応）からなる反応混合物を、１３Ｕ／ｍｍｏｌの酵素量の、Ｌ．ケフィール（Ｌ．ｋｅｆｉｒ）由来の（Ｒ）−ＡＤＨおよび６０Ｕ／ｍｍｏｌのサーモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）由来のグルコースデヒドロゲナーゼと共に、１ｍｌのリン酸緩衝液（１００ｍＭ；ｐＨ７．０）中で、３０℃の反応温度で、７２時間の期間にわたって撹拌した。この期間内に、試料を採取し、それぞれの変換率を、ＨＰＬＣを経て決定した。変換率は、１時間後に４０％であり、５時間後に７９％であり、７２時間後に８６％であった。

〔実施例７〕
〔アルコールデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒を使用する０．５Ｍの溶液におけるｔｒａｎｓ−２−ヘキセナールの還元〕
Ｔｉｔｒｉｎｏ反応器において、４０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０にさせた）を室温で、ＯＤ＝２７の光学濃度が得られるような細胞濃度の、上記の（Ｒ）−選択的アルコールデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１４４５９（ｐＮＯ５ｃ、ｐＮＯ８ｃ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｌ．ケフィール（Ｌ．ｋｅｆｉｒ）由来の（Ｒ）−アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｔ．アシドフィルム（Ｔ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）由来のグルコースデヒドロゲナーゼ）、６当量のグルコース（使用されるケイ皮アルデヒドの量に基づいた当量）および２０ｍｍｏｌのｔｒａｎｓ−２−ヘキセナール（０．５Ｍの基質濃度に対応する、使用されたリン酸緩衝液に基づく）にて処置した。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、水酸化ナトリウム溶液（２ＭＮａＯＨ）を添加することによってｐＨを一定に保持した。試料は、規則的な間隔で採取し、ｔｒａｎｓ−２−ヘキセナールのｔｒａｎｓ−２−ヘキセン−１−オールへの変換率を、ＨＰＬＣによって決定した。変換率は、１時間後に、２４％であり、５時間後に６１％であり、２４時間後に＞９９％であった。

ｐＮＯ５ｃプラスミドのプラスミドマップを示す。 ｐＮＯ８ｃプラスミドのプラスミドマップを示す。 ｐＮＯ１４ｃプラスミドのプラスミドマップを示す。

Claims (8)

1. アルデヒドを還元して第一級アルコールを製造するための方法であって、
   変換は、アルコールデヒドロゲナーゼと、補因子を再生することができる酵素とを含む組換え全細胞触媒の存在下で行われることを特徴とする第一級アルコールを製造する方法。
2. 請求項１記載の第一級アルコールを製造する方法であって、
   前記変換は、アルコールデヒドロゲナーゼと、グルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる酵素とを含む組換え全細胞触媒の存在下で行われることを特徴とする第一級アルコールを製造する方法。
3. アルデヒドを還元して第一級アルコールを製造するための方法であって、
   前記変換は単離されたアルコールデヒドロゲナーゼと、単離されたグルコースデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの群から補因子を再生することができる酵素との存在下で行われることを特徴とする第一級アルコールを製造するための方法。
4. 請求項１、２又は３のいずれかに記載の第一級アルコールを製造するための方法であって、
   ２−ｔｒａｎｓ−ヘキセナール、２−ｃｉｓ−ヘキセナール、３−ｔｒａｎｓ−ヘキセナール、３−ｃｉｓ−ヘキセナール及び／又はケイ皮アルデヒドがアルデヒド成分として使用されることを特徴とする第一級アルコールを製造するための方法。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載の第一級アルコールを製造するための方法であって、
   前記アルコールデヒドロゲナーゼとして、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ）株由来、特にラクトバシルス・ケフィール（Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ）及びラクトバシルス・ブレビス（Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、又はロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）株由来、特にロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼを含む全細胞触媒が使用されることを特徴とする第一級アルコールを製造するための方法。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の第一級アルコールを製造するための方法であって、
   前記補因子を再生することができる酵素が、好ましくはバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ、又は好ましくはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする第一級アルコールを製造するための方法。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載の第一級アルコールを製造するための方法であって、
   前記補因子を再生することができる酵素がリンゴ酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする第一級アルコールを製造するための方法。
8. 請求項１〜７のいずれかに記載の第一級アルコールを製造する方法であって、
   前記請求項が全細胞触媒の使用に関連する限りにおいて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が宿主生物体として用いられることを特徴とする第一級アルコールを製造する方法。

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