JP2008061547A - ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子、ニトリラーゼ遺伝子を含む形質転換体、並びにそれを用いたα−ヒドロキシカルボン酸の製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】カルボニル化合物とシアニドドナーからヒドロキシニトリルリアーゼおよびニトリラーゼを利用した、より簡便なα−ヒドロキシカルボン酸の製造方法を提供する。
【解決手段】ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、およびニトリラーゼをコードする遺伝子を導入して、形質転換体を製造し、この形質転換微生物を用いる反応により、カルボニル化合物とシアニドドナーからα−ヒドロキシカルボン酸を得る。
【選択図】図１Ａ
【解決手段】ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、およびニトリラーゼをコードする遺伝子を導入して、形質転換体を製造し、この形質転換微生物を用いる反応により、カルボニル化合物とシアニドドナーからα−ヒドロキシカルボン酸を得る。
【選択図】図１Ａ
Description
本発明は、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子、ニトリラーゼ遺伝子を含む発現ベクター、および形質転換体、並びにそれを用いたα−ヒドロキシカルボン酸の製造法に関する。
微生物を用いた酵素反応によるα−ヒドロキシカルボン酸の製造に関しては、α−ヒドロキシニトリルに、ニトリラーゼを作用させ、α―ヒドロキシカルボン酸を製造する方法が知られている。
例えば、コリネバクテリウム属細菌によるグリコール酸、乳酸およびα−ヒドロキシイソ酪酸等の製造方法（特許文献１）、バチルス属細菌、バクテリジウム属細菌、クロコッカス属細菌またはブレビバクテリウム属細菌による乳酸、グリコール酸等の製造方法（特許文献２）、シュードモナス属細菌、アースロバクター属細菌、アスペルギルス属細菌、ペニシリウム属細菌、コクリオボラス属細菌またはフザリウム属細菌による乳酸、α−ヒドロキシイソ酪酸、マンデル酸、α−ヒドロキシ酪酸、α−ヒドロキシ吉草酸、α−ヒドロキシ−α−フェニルプロピオン酸、α−ヒドロキシ−α−（ｐ−イソブチルフェニル）−プロピオン酸等の製造方法（特許文献３）等が挙げられる。
また、光学活性α―ヒドロキシカルボン酸を製造する方法としては、以下の方法がしられている。
（１）α−ヒドロキシニトリルに、光学選択性の高いニトリラーゼを作用させ、光学活性α―ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
（２）カルボニル化合物とシアニドドナーに、光学選択性の高いヒドロキシニトリルリアーゼを作用させ、光学活性α―ヒドロキシニトリルを合成した後、化学的加水分解によりα―ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
（３）カルボニル化合物とシアニドドナーに、光学選択性の高いヒドロキシニトリルリアーゼを作用させ、光学活性α―ヒドロキシニトリルを合成した後、ニトリラーゼを作用させ、光学活性α―ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
（２）カルボニル化合物とシアニドドナーに、光学選択性の高いヒドロキシニトリルリアーゼを作用させ、光学活性α―ヒドロキシニトリルを合成した後、化学的加水分解によりα―ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
（３）カルボニル化合物とシアニドドナーに、光学選択性の高いヒドロキシニトリルリアーゼを作用させ、光学活性α―ヒドロキシニトリルを合成した後、ニトリラーゼを作用させ、光学活性α―ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
上記（１）の方法としては、例えばラセミ体のマンデロニトリルから（Ｒ）−選択的ニトリラーゼの作用により、高収率で（Ｒ）−マンデル酸を製造する方法が提案されている（特許文献４，特許文献５，特許文献６）。（Ｒ）−選択的ニトリラーゼを与える微生物としてはシュードモナス属細菌、アルカリゲネス属細菌、アシネトバクター属細菌、カセオバクター属細菌、ノカルディア属細菌、バチルス属細菌、ブレビバクテリウム属細菌、オーロバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌またはゴルドナ属細菌（特許文献４，５，６，７および８）が知られている。一方、立体選択性の高い（Ｓ）−選択的ニトリラーゼは知られていない。よって、上記（１）の方法は、特定の光学活性体にのみ有効な製造方法で汎用性があるとは言えない。
上記（２）の方法は、非特許文献１、非特許文献２、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１で提案されている。
上記（３）の方法としては、固定化ヒロドキシニトリルリアーゼと固定化ニトリラーゼの混合物を使用し、ベンズアルデヒドとシアニドドナーからワンポットでＲ−マンデル酸を製造する方法が報告されている。（非特許文献３）、Manihot esculenta由来の（Ｓ）−選択的ヒドロキシニトリルリアーゼにより（Ｓ）−マンデロニトリルを製造後、Pseudomonas fluorescens EBC191由来のニトリラーゼを作用させることにより（Ｓ）−マンデル酸を製造する方法（非特許文献４）等がある。
しかしながら、非特許文献３の方法では、光学活性α―ヒドロキシニトリルは、水溶液中でラセミ化が起こり易いため、α−ヒドロキシニトリルを合成する反応は、有機溶剤中で行う必要がある。一般的に有機溶媒中での反応では、酵素を菌体に保持したまま反応に供すると、菌体内の酵素へ基質（反応原料化合物）が十分に接触せず、反応効率が低下することが知られている。よって、菌体から酵素を単離して反応に用いる必要がある。また単離した酵素は、適当な担体に固定する必要があるため、操作が煩雑となり、コスト高となる。さらには、酵素反応後、続く加水分解反応に際し、溶媒の置換、不純物の除去、光学活性の維持等の問題を回避する必要もあり、操作が煩雑となる。
また、非特許文献４記載のニトリラーゼは、ニトリルヒドラターゼ活性も示すため、マンデル酸アミドを副生する。
したがって、より簡便な反応で更には低コストで光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造する方法が求められていた。
したがって、より簡便な反応で更には低コストで光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造する方法が求められていた。
本発明の目的は、上述した従来技術における欠点を解消した光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法を提供することにある。
本発明者らは、鋭意研究の結果、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子、ニトリラーゼ遺伝子を含む発現ベクターを作製し、それを導入したヒドロキシニトリルリアーゼおよびニトリラーゼを有する形質転換体を得ることに成功した。
本発明者らは、上記形質転換体を利用して更に研究を進めた結果、酵素を菌体から単離することなく菌体自体を反応に用いることが可能であり、しかも、このような菌体自体を用いる反応によれば、立体選択的ヒドロキシニトリルリアーゼにより生成した光学活性シアンヒドリンは速やかにニトリラーゼにより光学活性α−ヒドロキシカルボン酸に変換され、アルデヒド化合物とシアニドドナーから高光学純度の光学活性α−ヒドロキシカルボン酸が高収率で製造できることを見いだした。
すなわち本発明は、下記の態様を含む。
〔１〕ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子、ニトリラーゼをコードする遺伝子が導入された形質転換微生物。
〔２〕立体選択的ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、および立体選択性の低いまたは該ヒドロキシニトリルリアーゼと同じ立体選択性を有するニトリラーゼをコードする遺伝子が導入された形質転換微生物。
〔３〕ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターと、ニトリラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターとから得られる〔１〕又は〔２〕記載の微生物。
〔４〕ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、およびニトリラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターから得られる請求項１又は２記載の微生物。
〔５〕ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子が、Manihot esculenta由来の遺伝子である、〔３〕又は〔４〕記載の発現ベクター。
〔１〕ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子、ニトリラーゼをコードする遺伝子が導入された形質転換微生物。
〔２〕立体選択的ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、および立体選択性の低いまたは該ヒドロキシニトリルリアーゼと同じ立体選択性を有するニトリラーゼをコードする遺伝子が導入された形質転換微生物。
〔３〕ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターと、ニトリラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターとから得られる〔１〕又は〔２〕記載の微生物。
〔４〕ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、およびニトリラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターから得られる請求項１又は２記載の微生物。
〔５〕ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子が、Manihot esculenta由来の遺伝子である、〔３〕又は〔４〕記載の発現ベクター。
〔６〕ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である、〔３〕又は〔４〕記載のベクター。
（ａ） 配列番号２で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号２で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔７〕ニトリラーゼをコードする遺伝子がBradyrhizobium japonicum由来の遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
〔８〕ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号３で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号３で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔９〕ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号４で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号４で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔１０〕ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号５で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号５で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ） 配列番号２で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号２で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔７〕ニトリラーゼをコードする遺伝子がBradyrhizobium japonicum由来の遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
〔８〕ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号３で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号３で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔９〕ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号４で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号４で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔１０〕ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号５で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号５で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔１１〕ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号６で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号６で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔１２〕ベクターが、プラスミドベクターである〔３〕〜〔１１〕のいずれかに記載のベクター。
〔１３〕プラスミドベクターが、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミド（ｐＯＸＮ１０３、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒ）、ニトリラーゼ発現プラスミド（ｐＮＬＡ００１、ｐＮＬＡ０１０、ｐＮＬＢ００１、ｐＮＬＢ００２、ｐＮＬＢ００４、ｐＮＬＢ０１０）、ニトリラーゼ遺伝子及びヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミド（ｐＮＬＡ２０１、ｐＮＬＡ２０３、ｐＮＬＡ２１１、ｐＮＬＡ２１３、ｐＮＬＢ２０１、ｐＮＬＢ２０３、ｐＮＬＢ２１１、ｐＮＬＢ２１３）のいずれかである〔１２〕記載のベクター。
〔１４〕請求項３〜１３のいずれかに記載のベクターが導入された形質転換体。
〔１５〕形質転換体の宿主が、大腸菌又はロドコッカス(Rhodococcus)属細菌である〔１４〕に記載の形質転換体。
（ａ） 配列番号６で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号６で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔１２〕ベクターが、プラスミドベクターである〔３〕〜〔１１〕のいずれかに記載のベクター。
〔１３〕プラスミドベクターが、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミド（ｐＯＸＮ１０３、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒ）、ニトリラーゼ発現プラスミド（ｐＮＬＡ００１、ｐＮＬＡ０１０、ｐＮＬＢ００１、ｐＮＬＢ００２、ｐＮＬＢ００４、ｐＮＬＢ０１０）、ニトリラーゼ遺伝子及びヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミド（ｐＮＬＡ２０１、ｐＮＬＡ２０３、ｐＮＬＡ２１１、ｐＮＬＡ２１３、ｐＮＬＢ２０１、ｐＮＬＢ２０３、ｐＮＬＢ２１１、ｐＮＬＢ２１３）のいずれかである〔１２〕記載のベクター。
〔１４〕請求項３〜１３のいずれかに記載のベクターが導入された形質転換体。
〔１５〕形質転換体の宿主が、大腸菌又はロドコッカス(Rhodococcus)属細菌である〔１４〕に記載の形質転換体。
〔１６〕形質転換体が、JM109/pNLA201、JM109/pNLA203、JM109/pNLA211、ATCC12674株/pOXN611、ATCC12674株/pOXN612のいずれかである請求項１５記載の形質転換体。
〔１７〕カルボニル化合物及びシアニドドナーに〔１〕，〔２〕，〔１４〕，〔１５〕，〔１６〕のいずれかの形質転換微生物を作用させることを含む、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
〔１７〕カルボニル化合物及びシアニドドナーに〔１〕，〔２〕，〔１４〕，〔１５〕，〔１６〕のいずれかの形質転換微生物を作用させることを含む、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
本発明によれば、カルボニル化合物とシアニドドナーからヒドロキシニトリルリアーゼおよびニトリラーゼを用いた、簡便なα−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法が提供される。
すなわち、本発明による形質転換体を用いることにより、酵素を菌体から単離することなくカルボニル化合物とシアニドドナーからα−ヒドロキシカルボン酸の製造が可能になる。
更に、本発明によれば、形質転換体内にヒドロキシニトリルリアーゼとニトリラーゼが高密度に存在することにより、ヒドロキシニトリルリアーゼにより生成したヒドロキシニトリル中間体が速やかにニトリラーゼによりヒドロキシカルボン酸に変換することが可能となり、α−ヒドロキシカルボン酸を高収率に製造することが可能となる。
本発明の形質転換体は、ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、およびニトリラーゼをコードする遺伝子が含むものである。好ましくは、立体選択的ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、および立体選択性の低い、あるいは該ヒドロキシニトリルリアーゼと同じ立体選択性を有するニトリラーゼをコードする遺伝子を含むものである。ここで、同じ立体選択性とは、ヒドロキシニトリルリアーゼが（Ｓ）選択的の場合は、（Ｓ）選択的ニトリラーゼ、（Ｒ）選択的の場合は、（Ｒ）選択的ニトリラーゼの組合せを言う。
（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子とは、アルデヒド化合物とシアニドドナーから（Ｓ）立体選択的にα−ヒドロキシ化合物を製造する能力を有する酵素蛋白をコードする遺伝子をいう。その遺伝子としては特に制限されないが、好ましくは、キャッサバ（Manihot esculenta）やパラゴム（Hevea brasiliensis）等由来のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子を挙げることができる。これらの遺伝子配列は文献等に公開されている（非特許文献Hughes Ｊ．ら、Arch. Biochem. Biopphys．311, 496-502 (1994)、非特許文献Hasslacher M．ら、J. Biol. Chem．271, 5884-5891 (1996)、GenBank accession number Ｚ２９０９１およびＵ４０４０２）。
（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子とは、アルデヒド化合物とシアニドドナーから（Ｒ）立体選択的にα−ヒドロキシ化合物を製造する能力を有する酵素蛋白をコードする遺伝子をいう。その遺伝子としては特に制限されないが、好ましくは、アーモンド（Prunus dulcis）やブラックチェリー（Prunus serotina）等由来のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子を挙げることができる。これらの遺伝子配列は文献等に公開されている（非特許文献Dreveny, I.，ら、Structure，９（９），８０３−８１５（２００１）、非特許文献 Cheng I.P．ら、Plant Cell Physiol，３４，１１３９−１１４３（１９９３）およびGenBank accession number ＡＦ４１２３２９）。
上述のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子は、植物から当該酵素遺伝子のｍＲＮＡを含む全ＲＮＡ又はｍＲＮＡ等を抽出し、定法に従ってｃＤＮＡを合成し、公知のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子配列情報をもとに設計したプライマ−を用いてＰＣＲ法で当該酵素をコ−ドする遺伝子を増幅することで得ることができる（このような方法に関しては、例えば、文献「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press (1989))等を参照することができる）。
また、ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子をいくつかの領域（例えば、５０塩基程度）に分割し、隣り合う領域とのオーバーラップ（例えば、２０塩基程度）を両端に有するような複数のオリゴヌクレオチドを設計および合成し、これらオリゴヌクレオチドを互いにアニールさせるＰＣＲによっても合成することができる。得られた増幅産物は、例えば、適切な制限酵素により切断し、同制限酵素切断末端と連結可能な切断末端を生じさせることができる制限酵素で処理したベクターＤＮＡと連結し、適切な微生物宿主の形質転換体または形質導入体を作製し、目的増幅産物がベクターＤＮＡ中に正しく組み込まれたクロ−ンを選択することにより、クロ−ニングすることができる（このような方法に関しては、例えば、文献 Xiong, A-S ら Nucleic Acids Res. 32(12), e98 (2004)等を参照することができる）。
上述のヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子は、その遺伝子がコードする酵素の立体選択性、酵素活性等が損失されない限り、塩基の欠失、付加、挿入又は置換等の変異が含まれていても構わない。例えば、配列番号１記載のヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列に対して、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加した配列であって、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。また、配列番号２記載のヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子に対して、相補な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ当該活性を有するＤＮＡであっても構わない。ここで「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション時の洗浄時に、塩濃度が300〜2000mM、温度が40〜75℃、好ましくは塩濃度が600〜900mM、温度が65℃の条件を意味する。
ニトリラーゼ遺伝子としては、ニトリラーゼの立体選択性が低いかまたは当該する生成物の選択性に偏っていれば特に制限はない。例えばBradyrhizobium japonicum ＵＳＤＡ１１０株由来のニトリラーゼ遺伝子や自然環境中のＤＮＡからクローニングされた２Ａ４と名付けられたニトリラーゼ遺伝子(図１Ｈ 配列番号６)等を挙げることができる。これらの遺伝子配列は文献等に公開されている（それぞれ、非特許文献DNA Res．９ ，１８９−１９７（２００２）、Robertson, D. E．ら、Appl.Environ.Microbiol．７０，２４２９−２４３６（２００４）およびGenBank accession number ＡＰ００５９５８およびＡＹ４８７４７３）。
ここで、「立体選択性の低いニトリラーゼ」とは、生成物の光学純度が±２０％ｅ．ｅ．以下のもの、好ましくは±１０％ｅ．ｅ．以下のものをいう。この場合に使用すべき生成物の光学純度を決定する方法に関しては、例えば、文献 日本化学会編“化学総説６，光学異性体の分離”、学会出版センター(1989)等を参照することができる。
Bradyrhizobium japonicum由来のニトリラーゼ遺伝子については、ニトリラーゼとしてアノテーションされていたものの、これまでニトリラーゼ活性は確認されておらず、本発明に於いて初めてニトリラーゼ活性を有することおよび基質特異性等が明らかとなった。
Bradyrhizobium japonicum由来のニトリラーゼ遺伝子は、常法により染色体ＤＮＡを抽出し、遺伝子配列情報をもとに設計したプライマ−を用いてＰＣＲ法で当該酵素をコ−ドする遺伝子を増幅することで得ることができる。また、上記のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の場合と同様に、遺伝子を人工合成することができる。自然環境中のＤＮＡからクローニングされたニトリラーゼ遺伝子についても、その配列情報を元に遺伝子を人工合成すればよい。
上述のニトリラーゼ遺伝子は、その遺伝子がコードする酵素の立体選択性、酵素活性等が損失されない限り、塩基の欠失、付加、挿入又は置換等の変異が含まれていても構わない。例えば、配列番号３記載のニトリラーゼのアミノ酸配列に対して、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加した配列であって、且つニトリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。また、配列番号４記載のニトリラーゼ遺伝子の配列に対して、相補な配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ当該活性を有する遺伝子であっても構わない。ここで「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション時の洗浄時に、塩濃度が300〜2000mM、温度が40〜75℃、好ましくは塩濃度が600〜900mM、温度が65℃の条件を意味する。
次に、上述のヒドロキシニトリルリア−ゼおよびニトリラーゼを発現させるための宿主―ベクター系の選択を行う。
次に、上述のヒドロキシニトリルリア−ゼおよびニトリラーゼを発現させるための宿主―ベクター系の選択を行う。
宿主に導入するベクターとしては、上記の酵素遺伝子を保持し、且つ複製可能であれば、特段の制約を受けるものではなく、それぞれの宿主に適したベクターを使用することができる。例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージ等が挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pBluescriptなどのColE系プラスミド等）、放線菌由来のプラスミド（pIJ486等）、酵母由来のプラスミド（YEp13、YEp 24、Ycp50等）が挙げられる。ファージＤＮＡとしては、λファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11等）、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡ等が挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pBluescriptなどのColE系プラスミド等）、放線菌由来のプラスミド（pIJ486等）、酵母由来のプラスミド（YEp13、YEp 24、Ycp50等）が挙げられる。ファージＤＮＡとしては、λファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11等）、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡ等が挙げられる。
宿主としては、上記の酵素遺伝子が発現するものであれば良い。例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌、枯草菌、酵母、カビ、植物等を挙げることができる。好ましくは、大腸菌及びロドコッカス属細菌である。
大腸菌宿主としては、例えば大腸菌Ｋ１２株やＢ株、あるいはそれら野生株由来の派生株であるJM109株、XL1-Blue株、C600株、W3110株等を挙げることができる。その他、これら菌株の変異体、組換え体および遺伝子工学的手法による誘導体等も用いられ得る。
大腸菌宿主としては、例えば大腸菌Ｋ１２株やＢ株、あるいはそれら野生株由来の派生株であるJM109株、XL1-Blue株、C600株、W3110株等を挙げることができる。その他、これら菌株の変異体、組換え体および遺伝子工学的手法による誘導体等も用いられ得る。
ロドコッカス属細菌としては、例えばロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC 12674株やロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J-1株(FERM BP-1478)等を挙げることができる。
以下、より詳細に形質転換（導入）体（以下、単に「形質転換体」と称す）の作成方法について説明する。
プラスミドＤＮＡは、宿主細胞中にてプラスミドが増殖するために必要なＤＮＡ配列、プロモ−タ−、リボソーム結合配列、転写タ−ミネ−タ−、更に好ましくは形質転換体の選択マ−カ−となる遺伝子を含む。
プラスミドＤＮＡは、宿主細胞中にてプラスミドが増殖するために必要なＤＮＡ配列、プロモ−タ−、リボソーム結合配列、転写タ−ミネ−タ−、更に好ましくは形質転換体の選択マ−カ−となる遺伝子を含む。
プロモーター配列としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター・ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター・ラムダファージ由来のＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）・アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）・中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）・α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等を挙げることができる。また、ｔａｃプロモーター・ｔｒｃプロモーターのように独自に改変・設計された配列も利用できる。
リボソーム結合配列としては、ＳＤ配列やKozak配列が知られており、これらの配列を変異遺伝子の上流に挿入することができる。原核生物を宿主に用いるときにはＳＤ配列を、真核細胞を宿主に用いるときにはＫｏｚａｋ配列をＰＣＲ法等により付加してもよい。ＳＤ配列としては、大腸菌由来、ロドコッカス属細菌または枯草菌由来の配列等を挙げることができるが、所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。例えば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。
転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター・ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。選択マ−カ−としては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。
大腸菌を宿主に用いた場合には、特に有用なベクターとしては、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２３３−２、ｐＦＹ５２９、ｐＥＴ−１２、ｐＥＴ−２６ｂ等が例示される。これらベクターにヒドロキシニトリルリア−ゼおよびニトリラーゼをコ−ドする遺伝子断片を組み込むには、これらを含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、必要であれば適当なリンカ−を付加した後、適当な制限酵素で切断したベクターと結合させることにより行うことができる。ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子およびニトリラーゼ遺伝子は、何れの順に結合させてもよい。また、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子発現プラスミドおよびニトリラーゼ遺伝子発現プラスミドとを別々に作成した後、これらを同じ宿主に導入して、ヒドロキシニトリルリアーゼおよびニトリラーゼを発現する組換え体を作成してもよい。この場合、両ベクターは不和合性を持たないように選択しなければならない。
かくして得られた発現プラスミドを宿主細胞に導入すれば、ヒドロキシニトリルリア−ゼおよびニトリラーゼを高度に発現する形質転換体が得られる。当該形質転換体を培養することにより、細胞内にこれらの酵素を発現・蓄積させることができる。
発現ベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレ−ション法等を挙げることができる。酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等を用いることができる。酵母への発現プラスミドの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレ−ション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
次に上記のごとく作成した形質転換体を培養する方法を説明する。培養に際し使用する培地には特に制限は無く、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。また培養条件に関しても、形質転換体が生育、増殖可能で且つ酵素産生が良好に行える条件を選択し、培養すればよい。
使用する培地として、炭素源としては、グルコ−ス、ガラクト−ス、フラクト−ス、スクロ−ス、ラフィノ−ス、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノ−ル、プロパノ−ル、グリセリン等のアルコ−ル類を挙げることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物を挙げることができる。その他、ペプトン、肉エキス、コ−ンスティ−プリカ−、酵母エキス、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を挙げることができる。その他、ビタミン等が必要に応じて適宜添加してもよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモ−タ−として誘導性のプロモ−タ−を用いた発現プラスミドで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデュ−サ−を培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモ−タ−を有する発現プラスミドで形質転換した微生物を培養するときには ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インド−ル酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモ−タ−を用いた発現プラスミドで形質転換した微生物を培養するときにはＩＡＡ等を培地に添加することができる。
大腸菌の培養に際し、通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養することが好ましい。培養に用いる培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ポリペプトン、コ−ンスティ−プリカ−、大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄若しくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものを用いることができる。なお、培地の初発ｐＨは７〜９に調整することが適当である。また、培養は、５℃〜４０℃、好ましくは１０℃〜３７℃で５〜１００時間行う。通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養、流加培養等により実施することが好ましい。
次に、上記のごとく調製した形質転換体をカルボニル化合物およびシアニドドナーに接触させることによる、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法を説明する。
本反応で使用するカルボニル化合物とは、下記式（１）で示すアルデヒド又はケトンをいう。
Ｒ1−ＣＯ−Ｒ2 （Ｉ）
で示される化合物をいう。
本反応で使用するカルボニル化合物とは、下記式（１）で示すアルデヒド又はケトンをいう。
Ｒ1−ＣＯ−Ｒ2 （Ｉ）
で示される化合物をいう。
式Iにおいて、Ｒ1及びＲ2は、互いに異なり、それぞれ水素原子又は炭素数１〜20（Ｃ1〜Ｃ20）の炭化水素基、置換基を有していてもよい炭素数１〜20（Ｃ1〜Ｃ20）のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数６〜20（Ｃ6〜Ｃ20）のアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数７〜20（Ｃ7〜Ｃ20）のアルキルアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数２〜20（Ｃ2〜Ｃ20）のアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよいシリル基又は水酸基である。但し、Ｒ1及びＲ2が同時に水素原子となることはない。また、置換基を有していてもよいアルキルチオ基、置換基を有していてもよいアリールチオ基、置換基を有していてもよいアルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアリールスルホニル基であってもよい。
前記炭化水素基中、−ＣＨ2−及び−ＣＨ3のＣＨ2はカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく、＝ＣＨ2は＝Ｏ又は＝Ｓで置き換えられていてもよく、また−ＣＨ2−のＣ−Ｈ、−ＣＨ3のＣ−Ｈ、＞ＣＨ−のＣ−Ｈ、＝ＣＨ−のＣ−Ｈ及び＝ＣＨ2のＣ−Ｈは、Ｎ又はＣ−ハロゲンで置き換えられていてもよく、また、Ｒ1及びＲ2は、共同して非対称の２価の基を表してもよい。ハロゲンとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式であっても飽和又は不飽和の環式であってもよい。炭化水素基が非環式の場合には、直鎖状でも分岐状でもよい。炭化水素基には、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基、Ｃ2〜Ｃ20アルキニル基、Ｃ4〜Ｃ20アルキルジエニル基、Ｃ6〜Ｃ18アリール基、Ｃ6〜Ｃ20アルキルアリール基、Ｃ6〜Ｃ20アリールアルキル基、Ｃ4〜Ｃ20シクロアルキル基、Ｃ4〜Ｃ20シクロアルケニル基、（Ｃ3〜Ｃ10シクロアルキル）Ｃ1〜Ｃ10アルキル基などが含まれる。
Ｃ1〜Ｃ20アルキル基は、Ｃ1〜Ｃ10アルキル基であることが好ましい。アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が挙げられる。
Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基は、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル基であることが好ましい。アルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、プロペニル基、イソプロペニル基、2-メチル-1-プロペニル基、2-メチルアリル基、2-ブテニル基等が挙げられる。
Ｃ2〜Ｃ20アルキニル基は、Ｃ2〜Ｃ10アルキニル基であることが好ましい。アルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられる。
Ｃ4〜Ｃ20アルキルジエニル基は、Ｃ4〜Ｃ10アルキルジエニル基であることが好ましい。アルキルジエニル基としては、例えば1,3-ブタジエニル基等が挙げられる。
Ｃ6〜Ｃ18アリール基は、Ｃ6〜Ｃ10アリール基であることが好ましい。アリール基としては、例えばフェニル基、1-ナフチル基、2-ナフチル基、インデニル基、ビフェニル基、アントリル基、フェナントリル基等が挙げられる。
Ｃ6〜Ｃ20アルキルアリール基は、Ｃ6〜Ｃ12アルキルアリール基であることが好ましい。アルキルアリール基としては、例えばo-トリル基、m-トリル基、p-トリル基、2,3-キシリル基、2,4-キシリル基、2,5-キシリル基、o-クメニル基、m-クメニル基、p-クメニル基、メシチル基等が挙げられる。
Ｃ6〜Ｃ20アリールアルキル基は、Ｃ6〜Ｃ12アリールアルキル基であることが好ましい。アリールアルキル基としては、例えばベンジル基、フェネチル基、1-ナフチルメチル基、2-ナフチルメチル基、1-フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基、ジエチルベンジル基等が挙げられる。
Ｃ4〜Ｃ20シクロアルキル基は、Ｃ4〜Ｃ10シクロアルキル基であることが好ましい。シクロアルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。
Ｃ4〜Ｃ20シクロアルケニル基は、Ｃ4〜Ｃ10シクロアルケニル基であることが好ましい。シクロアルケニル基としては、例えばシクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基等が挙げられる。
Ｃ1〜Ｃ20アルコキシ基は、Ｃ1〜Ｃ10アルコキシ基であることが好ましい。アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ6〜Ｃ20アリールオキシ基は、Ｃ6〜Ｃ10アリールオキシ基であることが好ましい。アリールオキシ基としては、例えばフェニルオキシ基、ナフチルオキシ基、ビフェニルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ7〜Ｃ20アルキルアリールオキシ基は、Ｃ7〜Ｃ12アルキルアリールオキシ基であることが好ましい。アルキルアリールオキシ基としては、例えばメチルフェニルオキシ基、エチルフェニルオキシ基、プロピルフェニルオキシ基、ブチルフェニルオキシ基、ジメチルフェニルオキシ基、ジエチルフェニルオキシ基、ジプロピルフェニルオキシ基、ジブチルフェニルオキシ基、メチルエチルフェニルオキシ基、メチルプロピルフェニルオキシ基、エチルプロピルフェニルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ2〜Ｃ20アルコキシカルボニル基は、Ｃ2〜Ｃ10アルコキシカルボニル基であることが好ましい。アルコキシカルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、2-メトキシエトキシカルボニル基、t-ブトキシカルボニル基等が挙げられる。
置換基を有していてもよいアミノ基としては、例えばアミノ基、ジメチルアミノ基、メチルアミノ基、メチルフェニルアミノ基、フェニルアミノ基等が挙げられる。
置換基を有していてもよいシリル基としては、例えばジメチルシリル基、ジエチルシリル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリメトキシシリル基、トリエトキシシリル基、ジフェニルメチルシリル基、トリフェニルシリル基、トリフェノキシシリル基、ジメチルメトキシシリル基、ジメチルフェノキシシリル基、メチルメトキシフェニル基等が挙げられる。
前記式Iで示されるカルボニル化合物としては、例えば、ベンズアルデヒド、ｍ−フェノキシベンズアルデヒド、ｐ−メチルベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−ニトロベンズアルデヒド、３，４−メチレンジオキシベンズアルデヒド、２，３−メチレンジオキシベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、フルフラール等の芳香族アルデヒド；アセトアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、シクロヘキサンアルデヒド等の脂肪族アルデヒド；エチルメチルケトン、ブチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、メチルペンチルケトン、メチル（２−メチルプロピル）ケトン、メチル（３−メチルブチル）ケトン等の飽和脂肪族ケトン；メチル（２−プロペニル）ケトン、（３−ブテニル）メチルケトン等の不飽和脂肪族ケトン；（３−クロロプロピル）メチルケトン等のアルキル（ハロアルキル）ケトン；２−（アルコキシカルボニルアミノ）−３−シクロヘキシルプロピオンアルデヒド等の２−（保護アミノ）アルデヒド；３−メチルチオプロピオンアルデヒド等のアルキルチオ脂肪族アルデヒドが挙げられる。
シアニドドナーとは、反応系へ添加することによって、シアニド、すなわちシアン化物イオン（ＣＮ−）を生じる物質を意味し、例えば、ＨＣＮ、シアン化ナトリウム（ＮａＣＮ）やシアン化カリウム（ＫＣＮ）等のシアン化水素の塩、又は、アセトンシアノヒドリン等のシアノヒドリン類を挙げることができる。特に、無機塩や副生物が生じないＨＣＮを用いることが好ましい。
形質転換体は、培養液、培養濃縮菌体、培養濃縮菌体洗浄物、培養濃縮菌体懸濁物、培養菌体を固定化したもの等の形態で使用される。操作の簡便性、容易性、反応効率の点から、培養濃縮菌体を緩衝液で洗浄後、同緩衝液で懸濁させたものを使用することが好ましい。
本反応において、ｐＨは、例えば、キャッサバ（Manihot esculenta）由来のヒドロキシニトリルリアーゼであれば、反応ｐＨ領域は、ｐＨ３．５〜ｐＨ７、至適ｐＨはｐＨ４．５〜ｐＨ６である。また、Bradyrhizobium japonicum由来のニトリラーゼ(配列番号３)および２Ａ４ニトリラーゼ（配列番号５）であれば、反応ｐＨ領域が少なくともｐＨ３．５以上である。よって、ｐＨ３．５〜ｐＨ７、更に好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６で反応を実施する。
反応温度は、使用するヒドロキシニトリルラーゼおよびニトリラーゼの至適反応温度や、製造するα−ヒドロキシカルボン酸、原料のカルボニル化合物、およびシアニドドナーの安定性を考慮して設定する。例えば、マンデル酸を製造する反応では、１０〜４５℃が好ましく、更に好ましくは１５〜４０℃である。
反応溶媒は、水系、有機溶媒系、水−有機溶媒二相系、いずれの条件でもヒドロキシニトリルリアーゼおよびニトリラーゼがともに作用する条件であれば限定されるものではない。形質転換体の培養菌体を固定化せずに用いる場合には、水系であることが好ましい。
カルボニル化合物、シアニドドナーの添加方法は、例えば、反応開始時にカルボニル化合物、シアニドドナー全量を添加する方法、予め反応溶媒にカルボニル化合物を全量添加し、シアニドドナーを連続、又は分割して添加する方法、あるいは、シアニドドナーを予め反応溶媒に添加し、カルボニル化合物を連続、又は分割して添加する方法などが挙げられる。
カルボニル化合物、シアニドドナーの添加方法は、例えば、反応開始時にカルボニル化合物、シアニドドナー全量を添加する方法、予め反応溶媒にカルボニル化合物を全量添加し、シアニドドナーを連続、又は分割して添加する方法、あるいは、シアニドドナーを予め反応溶媒に添加し、カルボニル化合物を連続、又は分割して添加する方法などが挙げられる。
反応終了液からのα―ヒドロオキシカルボン酸の回収方法については、特に限定されないが、例えば、反応溶液から有機溶媒を用いて抽出し、さらに必要に応じて水洗した後、溶媒を蒸発・乾固することにより、目的とするα−ヒドロキシカルボン酸を単離することができる。また、反応終了液から形質転換体をろ過、遠心などにより除去した後、水系、有機溶媒系あるいは水系―有機溶媒で晶析させる方法などが挙げられる。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
実施例１
（ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の取得）
（１）ＰＣＲによるヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の作製
非特許文献１およびGenBank accession number Z29091記載の塩基配列（配列番号２）を元に、キャッサバ（Manihot esculenta）のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子をＰＣＲ法により合成した。具体的には、２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０およびＲ０１〜Ｒ１０（配列番号７〜２６）を設計および合成した。
（１）ＰＣＲによるヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の作製
非特許文献１およびGenBank accession number Z29091記載の塩基配列（配列番号２）を元に、キャッサバ（Manihot esculenta）のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子をＰＣＲ法により合成した。具体的には、２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０およびＲ０１〜Ｒ１０（配列番号７〜２６）を設計および合成した。
オリゴヌクレオチドに相補的に設定された２０種のオリゴヌクレオチドは、それぞれ約２０塩基ずつ重なるように設計した（図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃ）。
凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを蒸留水で再懸濁し、100 pmol/μlとした。２０種のオリゴヌクレオチド溶液のそれぞれから１μｌずつ集めてミックスオリゴを作製した。この混合液をPCR-mix（Ｐｗｏ １０×緩衝液、ｄＮＴＰ ｍｉｘ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ（Boehringer Mannheim）に下記（表１）の用量で加えた。
（表１）ＰＣＲ反応液の組成
ＰＣＲは、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒のセットを５５サイクル行い、オリゴヌクレオチドを伸長させて、遺伝子を合成した（１ｓｔ ＰＣＲ）。
次に、上記のように作製した合成遺伝子の増幅を行った（２ｎｄ ＰＣＲ）。上記のＡ、Ｂ、Ｃの反応産物１．３μｌに、５μｌのＰｗｏ １０×緩衝液、５μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ、３６．２μｌの蒸留水および１μｌの外側プライマ−を添加した。外側プライマ−として、Ｆ０１（配列番号７）およびＲ０１（配列番号１７）のプライマ−を用いた。２ｎｄ ＰＣＲは、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で６０秒のセットを２３サイクル行い、遺伝子を増幅した。１．５％アガロ−スゲル電気泳動により、約１ｋｂの増幅産物を確認した。
（２）ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子のクロ−ニング
（１）で得られた約１ｋｂの増幅産物のバンドをＱＩＡquick Gel Extraction Kit（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製したＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ（オリゴヌクレオチドＦ０１中に切断認識部位が含まれる）およびＫｐｎＩ（オリゴヌクレオチドＲ０１中に切断認識部位が含まれる）で消化し、フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿により精製した。精製したＤＮＡ（５μｌ）、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで予め消化しておいたベクターｐＵＣ１９（タカラバイオ（株））（１μｌ）、蒸留水（４μｌ）およびsolution Ｉ（ＤＮＡ Ligation Kit ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を混合し１２時間、１６℃でインキュベ−トすることで増幅産物とベクターを結合した。
（１）で得られた約１ｋｂの増幅産物のバンドをＱＩＡquick Gel Extraction Kit（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製したＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ（オリゴヌクレオチドＦ０１中に切断認識部位が含まれる）およびＫｐｎＩ（オリゴヌクレオチドＲ０１中に切断認識部位が含まれる）で消化し、フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿により精製した。精製したＤＮＡ（５μｌ）、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで予め消化しておいたベクターｐＵＣ１９（タカラバイオ（株））（１μｌ）、蒸留水（４μｌ）およびsolution Ｉ（ＤＮＡ Ligation Kit ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を混合し１２時間、１６℃でインキュベ−トすることで増幅産物とベクターを結合した。
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１％ バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、０．５％ ＮａＣｌ）１ｍｌに接種し３７℃、５時間好気的に前培養し、この培養物 ０．４ｍｌをＳＯＢ培地 ４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。この培養物を遠心分離により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ ６．０）、２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置した。その後、再度遠心し、上澄を除いた後、沈殿した大腸菌を冷ＴＦ溶液 ３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルフォキシドを加え０℃で１０分間放置した。
こうして作製したコンピテントセル ２００μｌ に工程（１）で作製したクローニング産物を１０μｌ加え、０℃で３０分放置後、４２℃で３０秒間ヒ−トショックを与え、０℃で２分間冷却後、ＳＯＣ 培地（２０ｍＭ グルコ−ス、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）１ｍｌ を添加して３７℃にて１時間振盪培養した。
培養後、２００μｌずつＬＢＡｍｐ寒天培地（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ、１．５％寒天を含有するＬＢ培地）に塗布し、さらに３７℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニ−複数個を１．５ｍｌのＬＢＡｍｐ培地（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養し、集菌後、Flexi Prep（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。
得られた組換えプラスミドＤＮＡの塩基配列を、プライマ−としてオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０およびＲ０１〜Ｒ１０を用い、ＣＥＱ ＤＴＣＳ Quick Start Kitおよび蛍光シ−ケンサＣＥＱ ２０００ＸＬ ＤＮＡ Analysis system（いずれもＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ、米国）を用いて解析した。
解析したプラスミドＤＮＡの内、配列番号２のキャッサバ（Manihot esculenta）由来のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の塩基配列と同一の配列を有するプラスミドＤＮＡのひとつをｐＵＭＥと命名した。
実施例２
（ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミド、および該プラスミドを含むヒドロキシニトリルリア−ゼ発現大腸菌組換え体の作製）
（１）ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミドの作製
（ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミド、および該プラスミドを含むヒドロキシニトリルリア−ゼ発現大腸菌組換え体の作製）
（１）ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミドの作製
実施例１で得られたヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＤＮＡ断片を、pKK233-2（Centraalbureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）、オランダ；http://www.cbs.knaw.nl/）の誘導体であるpKK233-2(+Sse)のNcoI-Sse8387I部位に挿入し、pKK233-2をベースとしたヒドロキシニトリルリアーゼ発現ベクターpOXN103を以下のようにして作製した。
まず、ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位を両端に有する形となるよう、ＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌのＰｗｏ １０×バッファー、５μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、３６．２μｌの蒸留水、１μｌのセンスおよびアンチセンスプライマー、並びに鋳型としてプラスミドｐＵＭＥを１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で２分の変性を行った後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で２分を３０サイクル行った。センスプライマーＯＸＹＮ−０６（配列番号４８）は、２９ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を含む。また、アンチセンスプライマーＯＸＹＮ−０９（配列番号４９）は、３３ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位を含む。
まず、ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位を両端に有する形となるよう、ＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌのＰｗｏ １０×バッファー、５μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、３６．２μｌの蒸留水、１μｌのセンスおよびアンチセンスプライマー、並びに鋳型としてプラスミドｐＵＭＥを１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で２分の変性を行った後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で２分を３０サイクル行った。センスプライマーＯＸＹＮ−０６（配列番号４８）は、２９ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を含む。また、アンチセンスプライマーＯＸＹＮ−０９（配列番号４９）は、３３ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位を含む。
ＯＸＹＮ−０６：ccaccatggtaactgcacattttgttctg（配列番号４８；下線部は制限酵素ＮｃｏＩ認識部位を示す）
ＯＸＹＮ−０９：ggcctgcaggttaacttaataggagctaaaagc（配列番号４９；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
ＯＸＹＮ−０９：ggcctgcaggttaacttaataggagctaaaagc（配列番号４９；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
得られた増幅ＰＣＲ産物は、Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化後、ＮｃｏＩによって部分消化した。アガロースゲル電気泳動で分離し、植物コドン野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ全長を含むバンド（約０．８ｋｂ）のゲルを切り出した。該ゲル中の増幅産物をQIAquick Gel Extraction Kitで精製した。
次いで、発現用ベクターpKK233-2(+Sse)を以下のように調製した。pKK233-2 ５μｌをHindIII（１μｌ）で消化後、フェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿により精製した。次いで、DNA Blunting Kit（タカラバイオ（株））を用いて末端を平滑処理した。該処理液を再度フェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿により精製した。精製した発現ベクター（５μｌ）をShrimp Alkaline Phosphatase（タカラバイオ（株））を用いて脱リン酸化処理した。該処理液を再度エタノール沈殿により精製した。精製したベクターＤＮＡ（５μｌ）、アニーリング済みSse8387Iリン酸化リンカーpSse8387I（タカラバイオ（株））（５μｌ）およびsolution Ｉ（ＤＮＡ Ligation Kit ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を混合してライゲーション混合物を作った。該混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることでリンカーとベクターを結合した。実施例１（２）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。生育したコロニーより組換えベクターを回収した。回収した組換えベクターに対してSse8387I消化反応を行い、直鎖状に消化されることが確認されたものをpKK233-2(+Sse)とした。pKK233-2(+Sse)を制限酵素NcoIとSse8387Iで消化後、フェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿により精製した。
上述のヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＤＮＡ断片（５μｌ）と発現ベクターpKK233-2(+Sse)（５μｌ）を混合した。該混合液にsolution I（ＤＮＡ Ligation Kit ver.2（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を添加してライゲーション混合物を作った。この混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることでリンカーとベクターを結合した。実施例１（２）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、生育コロニーより組換えベクターを回収した。ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＤＮＡ断片が正しく発現ベクターに連結された組換えベクターを確認し、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドpOXN103と命名した。
（２）２番目のコドンが置換されたヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドの作製
ヒドロキシニトリルリア−ゼの２番目のアミノ酸であるバリンをイソロイシンに置換したヒドロキシニトリルリア−ゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲは（１）と同様の条件にて行った。センスプライマ−は、OXYN-10（配列番号５０；３３ヌクレオチドからなり、その配列中にBspHI認識部位およびヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＴＣでイソロイシンをコ−ドする）である。また、アンチセンスプライマ−は、OXYN-09（配列番号４９、３４ヌクレオチドからなり、その配列中にSse8387I認識部位およびヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
ヒドロキシニトリルリア−ゼの２番目のアミノ酸であるバリンをイソロイシンに置換したヒドロキシニトリルリア−ゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲは（１）と同様の条件にて行った。センスプライマ−は、OXYN-10（配列番号５０；３３ヌクレオチドからなり、その配列中にBspHI認識部位およびヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＴＣでイソロイシンをコ−ドする）である。また、アンチセンスプライマ−は、OXYN-09（配列番号４９、３４ヌクレオチドからなり、その配列中にSse8387I認識部位およびヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
センスプライマ−ＯＸＹＮ−１０：
ATTTCCATCATGATCACTGCACATTTTGTTCTG（配列番号５０；下線部は制限酵素ＢｓｐＨＩ認識部位を示す）
ATTTCCATCATGATCACTGCACATTTTGTTCTG（配列番号５０；下線部は制限酵素ＢｓｐＨＩ認識部位を示す）
アンチセンスプライマ−ＯＸＹＮ−０９：
GGCCTGCAGGTTAACTTAATAGGAGCTAAAAGC（配列番号４９；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
GGCCTGCAGGTTAACTTAATAGGAGCTAAAAGC（配列番号４９；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、BspHIおよびSse8387Iによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。
本ＤＮＡ断片を（１）と同様の方法により、pKK233-2(+Sse)のNcoIおよびSse8387I認識部位に挿入して、プラスミドpOXN103V2Iを得た。
（３）第２番目のアミノ酸バリンがアルギニンに置換されたヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドの作製
ヒドロキシニトリルリアーゼの第２番目のアミノ酸であるバリンがアルギニンに置換されたヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドpOXN103V2Rを、（１）で作製したプラスミドpOXN103を鋳型とし、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）による部位特異的変異導入法により作製した。変異導入用プライマーには以下を用いた。
ヒドロキシニトリルリアーゼの第２番目のアミノ酸であるバリンがアルギニンに置換されたヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドpOXN103V2Rを、（１）で作製したプラスミドpOXN103を鋳型とし、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）による部位特異的変異導入法により作製した。変異導入用プライマーには以下を用いた。
センスプライマーＯＸＹＮ−４５：
aaacagacca tgcgtactgc acattttg（配列番号５１：２８ヌクレオチド、ＯＸＹＮ−４６と相補的な配列を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＣＧＴでアルギニンをコードする）
aaacagacca tgcgtactgc acattttg（配列番号５１：２８ヌクレオチド、ＯＸＹＮ−４６と相補的な配列を有し、第２番目のアミノ酸に対応するコドンはＣＧＴでアルギニンをコードする）
アンチセンスプライマーＯＸＹＮ−４６：
caaaatgtgc agtacgcatg gtctgttt（配列番号５２：２８ヌクレオチド、ＯＸＹＮ−４５と相補的な配列を有する）
caaaatgtgc agtacgcatg gtctgttt（配列番号５２：２８ヌクレオチド、ＯＸＹＮ−４５と相補的な配列を有する）
実施例３
（ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現形質転換体の活性評価）
（１）細胞抽出液の調製
実施例２で作製したヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミドにより大腸菌JM109株を形質転換し、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体JM109/pOXN103、JM109/pOXN103V2IおよびJM109/pOXN103V2Rを得た。これらを、以下に示すＬＢ培地（５００ｍｌ容三角フラスコ中の１００ｍｌ）で３０℃で２４時間培養した。
（ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現形質転換体の活性評価）
（１）細胞抽出液の調製
実施例２で作製したヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミドにより大腸菌JM109株を形質転換し、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現形質転換体JM109/pOXN103、JM109/pOXN103V2IおよびJM109/pOXN103V2Rを得た。これらを、以下に示すＬＢ培地（５００ｍｌ容三角フラスコ中の１００ｍｌ）で３０℃で２４時間培養した。
培地組成
トリプトン １０ｇ／Ｌ
酵母エキス ５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ
アンピシリン ５０ｍｇ／Ｌ
ＩＰＴＧ １ｍＭ（終濃度）
トリプトン １０ｇ／Ｌ
酵母エキス ５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ
アンピシリン ５０ｍｇ／Ｌ
ＩＰＴＧ １ｍＭ（終濃度）
得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭ リン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液を、超音波破砕機ＶＰ−１５Ｓ（タイテック、日本）を用いて、出力コントロ−ル４、DUTY CYCLE ４０％、PULS、TIMER＝Ｂモ−ド１０ｓの条件で氷冷紙ながら３分間破砕した。破砕した菌体懸濁液を細胞抽出液全画分として採取した。次に遠心分離を行い（１０，０００×ｇ、５分間、４℃）、得られた上清を細胞抽出液可溶性画分として採取した。得られた細胞抽出液可溶性画分を用い、特許文献１記載の方法によりヒドロキシニトリルリア−ゼ活性を測定した。すなわち、２５℃およびｐＨ５．０の条件下、ラセミ体マンデロニトリルからベンズアルデヒドの生成を経て追跡した。酵素溶液５０μｌを、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）９００μｌと混合し、基質溶液１００μｌ（毎回新たに調製される１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）中で３７．５ｍＭラセミ体マンデロニトリル）を添加して活性測定を開始した。２８０ｎｍでの吸光の増加（対照として酵素非含有基質溶液で測定）を５分間追跡した。１Ｕは上記条件下でラセミマンデロニトリルから１分間あたりベンズアルデヒド１μｍｏｌの変換を触媒する酵素量に相当する。
その結果、JM109/pOXN103、JM109/pOXN103V2IおよびJM109/pOXN103V2Rの細胞抽出液化可溶性画分のタンパク質ｍｇあたり比活性（ユニット（Ｕ）／ｍｇタンパク質）はそれぞれ ２．７２、３．９９、１６．６であった。
（２）ポリアクリルアミドゲル電気泳動による発現量の解析
（１）で得られた細胞抽出液全画分を、それぞれ菌濃度換算でＯＤ６３０＝１２．５となるよう、１０ｍＭ リン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した。希釈した各株由来の細胞抽出液全画分を等量のポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファ−（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ｗ／ｖ ＳＤＳ、１２％ｖ／ｖβメルカプトエタノ−ル、２０％ｖ／ｖグリセロ−ル、微量ブロモフェノ−ルブル−）と混合し、５分間煮沸し変性処理を行った。１０％ポリアクリルアミドゲルを作製し、変性処理済みサンプルを１レ−ンあたり５μｌずつアプライし、電気泳動分析を行い、ヒドロキシニトリルリア−ゼは約３０ｋＤａのバンドとして観察された。
（１）で得られた細胞抽出液全画分を、それぞれ菌濃度換算でＯＤ６３０＝１２．５となるよう、１０ｍＭ リン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した。希釈した各株由来の細胞抽出液全画分を等量のポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファ−（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ｗ／ｖ ＳＤＳ、１２％ｖ／ｖβメルカプトエタノ−ル、２０％ｖ／ｖグリセロ−ル、微量ブロモフェノ−ルブル−）と混合し、５分間煮沸し変性処理を行った。１０％ポリアクリルアミドゲルを作製し、変性処理済みサンプルを１レ−ンあたり５μｌずつアプライし、電気泳動分析を行い、ヒドロキシニトリルリア−ゼは約３０ｋＤａのバンドとして観察された。
実施例４
低立体選択的ニトリラーゼ遺伝子の取得およびニトリラーゼ発現形質転換体の作製
（その１）：Bradyrhizobium由来のニトリラーゼ様遺伝子の取得
Bradyrhizobium japonicum USDA110株はゲノム配列情報が公開されており、２種のニトリラーゼ様配列を持つ遺伝子がアノテーションされている。しかしながら、これらのニトリラーゼ様遺伝子が真にニトリラーゼ活性を有するかどうかは明らかではなかった。これらの遺伝子はRhodococcus rhodochrous Ｊ−１株（FERM BP-1478）、Rhodococcus erythropolis ＳＫ−９２株（FERM BP-3324）、Alcaligenes faecalis ＪＭ３株（FERM P-13277）等由来の入手容易なニトリラーゼ遺伝子とはホモロジーが低く、これらとは性質等が大きく異なる可能性がある。本発明の目的に叶うものであるかどうかを確かめるため、Bradyrhizobium japonicum ＵＳＤＡ１１０株（（独）製品評価技術基盤機構 NBRC14792）由来の遺伝子をクローニングし、その活性を調べた。
低立体選択的ニトリラーゼ遺伝子の取得およびニトリラーゼ発現形質転換体の作製
（その１）：Bradyrhizobium由来のニトリラーゼ様遺伝子の取得
Bradyrhizobium japonicum USDA110株はゲノム配列情報が公開されており、２種のニトリラーゼ様配列を持つ遺伝子がアノテーションされている。しかしながら、これらのニトリラーゼ様遺伝子が真にニトリラーゼ活性を有するかどうかは明らかではなかった。これらの遺伝子はRhodococcus rhodochrous Ｊ−１株（FERM BP-1478）、Rhodococcus erythropolis ＳＫ−９２株（FERM BP-3324）、Alcaligenes faecalis ＪＭ３株（FERM P-13277）等由来の入手容易なニトリラーゼ遺伝子とはホモロジーが低く、これらとは性質等が大きく異なる可能性がある。本発明の目的に叶うものであるかどうかを確かめるため、Bradyrhizobium japonicum ＵＳＤＡ１１０株（（独）製品評価技術基盤機構 NBRC14792）由来の遺伝子をクローニングし、その活性を調べた。
（１）Bradyrhizobium japonicumからの染色体ＤＮＡの調製
寒天培地（０．５％マンニトール、０．１％バクトイ−ストエキス、０．０７％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０１％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５％ 寒天）上で生育させたBradyrhizobium japonicum ＵＳＤＡ１１０株を１０ｍｌの液体培地（０．５％マンニトール、０．１％バクトイ−ストエキス、０．０７％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０１％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）に植菌し、３０℃にて５日間振盪培養を行った。培養終了後、２ｍｌの培養液より菌体を遠心により回収し、Wizard Genomic DNA Purification Kit（プロメガ株式会社）を用いてゲノムＤＮＡ１００μｌを取得した。
寒天培地（０．５％マンニトール、０．１％バクトイ−ストエキス、０．０７％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０１％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５％ 寒天）上で生育させたBradyrhizobium japonicum ＵＳＤＡ１１０株を１０ｍｌの液体培地（０．５％マンニトール、０．１％バクトイ−ストエキス、０．０７％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０１％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）に植菌し、３０℃にて５日間振盪培養を行った。培養終了後、２ｍｌの培養液より菌体を遠心により回収し、Wizard Genomic DNA Purification Kit（プロメガ株式会社）を用いてゲノムＤＮＡ１００μｌを取得した。
（２）ニトリラーゼ遺伝子の取得と発現プラスミドの作製
ニトリラーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌの１０ ｘ Ｐｆｕバッファ−、４μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ（それぞれ２．５ｍＭ）、２．５μｌのＤＭＳＯ、１μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラ−ゼ、３０．５μｌの蒸留水、１μｌのセンスおよびアンチセンスプライマ−、並びに鋳型として上記ゲノムＤＮＡを１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で１分の変性を行った後、９５℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１０分を３０サイクル行った。センスプライマ−は、ＮＬＲ−１３（配列番号５３、４０ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＧＡＧでアスパラギン酸をコ−ドする）およびＮＬＲ−２２（配列番号５４、４０ヌクレオチドからなり、その配列中にＢｓｐＨＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＡＧでリジンをコ−ドする）である。また、アンチセンスプライマ−は、ＮＬＲ−１４（配列番号５５、４１ヌクレオチドからなり、その配列中にSse8387I認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
ニトリラーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌの１０ ｘ Ｐｆｕバッファ−、４μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ（それぞれ２．５ｍＭ）、２．５μｌのＤＭＳＯ、１μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラ−ゼ、３０．５μｌの蒸留水、１μｌのセンスおよびアンチセンスプライマ−、並びに鋳型として上記ゲノムＤＮＡを１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で１分の変性を行った後、９５℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１０分を３０サイクル行った。センスプライマ−は、ＮＬＲ−１３（配列番号５３、４０ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＧＡＧでアスパラギン酸をコ−ドする）およびＮＬＲ−２２（配列番号５４、４０ヌクレオチドからなり、その配列中にＢｓｐＨＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＡＧでリジンをコ−ドする）である。また、アンチセンスプライマ−は、ＮＬＲ−１４（配列番号５５、４１ヌクレオチドからなり、その配列中にSse8387I認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
センスプライマ−ＮＬＲ−１３：
GGCCATGGAGGACACGAAATTCAAAGTCGCGGTCGTTCAG（配列番号５３；下線部は制限酵素ＮｃｏＩ認識部位を示す）
GGCCATGGAGGACACGAAATTCAAAGTCGCGGTCGTTCAG（配列番号５３；下線部は制限酵素ＮｃｏＩ認識部位を示す）
センスプライマ−ＮＬＲ−２２：
GGTCATGAAGGACACGAAATTCAAAGTCGCGGTCGTTCAG（配列番号５４；下線部は制限酵素ＢｓｐＨＩ認識部位を示す）
GGTCATGAAGGACACGAAATTCAAAGTCGCGGTCGTTCAG（配列番号５４；下線部は制限酵素ＢｓｐＨＩ認識部位を示す）
アンチセンスプライマ−ＮＬＲ−１４：
GGCCTGCAGGATCGCGTAGACCGTTCAAGTCTCGGTGAAAG（配列番号５５；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
GGCCTGCAGGATCGCGTAGACCGTTCAAGTCTCGGTGAAAG（配列番号５５；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、NcoIおよびSse8387I又はBspHIおよびSse8387Iによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。
実施例２と同様にして、これらの断片をベクターpTrc99AおよびpKK233-2に組込み、発現プラスミドpNLB001(pTrc99A NcoI-Sse8387I断片)、pNLB002(pKK233-2 NcoI-Sse8387I断片)pNLB004(pTrc99A BspHI-Sse8387I断片)およびpNLB010(pKK233-2 BspHI-Sse8387I断片)を作製した。
（３）形質転換体の作製および該形質転換体のニトリラーゼ活性評価
実施例２と同様にして、これらのプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ニトリラーゼ発現形質転換体、すなわち、ＪM109/pNLB001、JM109/pNLB002、JM109/pNLB004、JM109/pNLB010およびコントロールとしてJM109/pTrc99Aを、実施例3と同様にして培養した。
実施例２と同様にして、これらのプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ニトリラーゼ発現形質転換体、すなわち、ＪM109/pNLB001、JM109/pNLB002、JM109/pNLB004、JM109/pNLB010およびコントロールとしてJM109/pTrc99Aを、実施例3と同様にして培養した。
これらの培養菌体を用いてマンデロニトリルを基質としてニトリラーゼ活性を測定した。
マンデロニトリルを基質とした場合、１．５ｍｌのマイクロチューブ０．５ｍｌの４０ｍＭ マンデロニトリル水溶液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２））を３０℃、５分間プレインキュベートし、これに１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）に懸濁された菌体懸濁液を０．５ｍｌを加え混合し、３０℃にて３０分間反応させる。０．２ｍｌの１Ｍリン酸を添加することにより反応を停止させ、遠心（１５０００ｒｐｍ／５ｍｉｎ）により菌体を除去し上清を取得した。０．２ｍｌの上清に１．８ｍｌの２５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．２）を加えて希釈し、１０μｌを高速液体クロマトグラフィー（分析カラム 東ソーＯＤＳ−１２０Ａ（４．６ｘ２５０ｍｍ）３５℃、キャリヤー ０．１％リン酸：アセトニトリル＝８：２、ＵＶ検出波長＝２５４ｎｍ）にて分析した。１分間に１μｍｏｌのマンデル酸が生成する活性を１ユニットとした。生成したマンデル酸の光学純度の測定は下記のように行った。上清０．５ｍｌに酢酸エチル０．５ｍｌを加え攪拌後、遠心し、酢酸エチル相を回収した。酢酸エチル相に０．５ｍｌの２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．２）を加えて攪拌し、遠心後、酢酸エチル相を得た。遠心エバポレーターにて溶媒を完全に除去し、残渣を１００μｌの水に溶かし、更に水にて３０倍希釈後、５μｌを高速液体クロマトグラフィー（分析カラム 三菱化学ＭＣＩ−ＧＥＬ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６ｘ２５０ｍｍ）３５℃、キャリヤー ２ｍＭ ＣｕＳＯ４：アセトニトリル＝８５：１５、ＵＶ検出波長＝２５４ｎｍ）にて分析した。結果は表２に示す。
（４）Bradyrhizobiumニトリラーゼ活性に及ぼすｐＨの影響
緩衝液として、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６、６．４、７、８）およびクエン酸緩衝液（ｐＨ４、５、６）を用いて、（３）と同様にしてニトリラーゼ活性を測定した。JM109/pNLB004菌体懸濁液を用いた。結果は表３に示す。
緩衝液として、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６、６．４、７、８）およびクエン酸緩衝液（ｐＨ４、５、６）を用いて、（３）と同様にしてニトリラーゼ活性を測定した。JM109/pNLB004菌体懸濁液を用いた。結果は表３に示す。
実施例５
低立体選択的ニトリラーゼ遺伝子の取得およびニトリラーゼ発現組換え体の作製
（その２）：環境中より得られたニトリラーゼ遺伝子の取得
（１）ＰＣＲによるニトリラーゼ遺伝子の作製
Robertson, D. E．ら、Appl. Environ. Microbiol．７０，２４２９−２４３６（２００４）記載およびGenBank accession number ＡＹ４８７４７３の塩基配列を元に、２Ａ４ニトリラーゼ遺伝子をＰＣＲ法により合成した。具体的には、２０種のオリゴヌクレオチドＳＮＹ５０９Ｆ０１〜ＳＮＹ５０９Ｆ１０およびＳＮＹ５０９Ｒ０１〜ＳＮＹ５０９Ｒ１１（配列番号２７〜４７）を設計および合成した。オリゴヌクレオチドに相補的に設定された２０種のオリゴヌクレオチドは、それぞれ約２０塩基ずつ重なるように設計した（図３）。これらのオリゴヌクレオチドを用い実施例１と同様にして遺伝子を合成した。こうして得られた目的の配列を有するプラスミドＤＮＡのひとつをｐＳＹＮ５９０と命名した。
低立体選択的ニトリラーゼ遺伝子の取得およびニトリラーゼ発現組換え体の作製
（その２）：環境中より得られたニトリラーゼ遺伝子の取得
（１）ＰＣＲによるニトリラーゼ遺伝子の作製
Robertson, D. E．ら、Appl. Environ. Microbiol．７０，２４２９−２４３６（２００４）記載およびGenBank accession number ＡＹ４８７４７３の塩基配列を元に、２Ａ４ニトリラーゼ遺伝子をＰＣＲ法により合成した。具体的には、２０種のオリゴヌクレオチドＳＮＹ５０９Ｆ０１〜ＳＮＹ５０９Ｆ１０およびＳＮＹ５０９Ｒ０１〜ＳＮＹ５０９Ｒ１１（配列番号２７〜４７）を設計および合成した。オリゴヌクレオチドに相補的に設定された２０種のオリゴヌクレオチドは、それぞれ約２０塩基ずつ重なるように設計した（図３）。これらのオリゴヌクレオチドを用い実施例１と同様にして遺伝子を合成した。こうして得られた目的の配列を有するプラスミドＤＮＡのひとつをｐＳＹＮ５９０と命名した。
（２）ニトリラーゼ発現プラスミドpNLA001およびpNLA010の作製
ニトリラーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようpSYN590を鋳型としてＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲ用の反応混合物は、ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌの１０ ｘ Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏバッファ−、４μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ（それぞれ２．５ｍＭ）、２．５μｌのＤＭＳＯ、１μｌのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ、３０．５μｌの蒸留水、１μｌのセンスおよびアンチセンスプライマ−、並びに鋳型としてプラスミドｐＳＹＮ１５９を１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で１分の変性を行った後、９５℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１０分を３０サイクル行った。センスプライマ−は、ＮＬＲ−１９（配列番号５６、３０ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＧＣＴでアラニンをコ−ドする）である。また、アンチセンスプライマ−は、ＮＬＲ−２１（配列番号５７、２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
ニトリラーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようpSYN590を鋳型としてＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲ用の反応混合物は、ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌの１０ ｘ Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏバッファ−、４μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ（それぞれ２．５ｍＭ）、２．５μｌのＤＭＳＯ、１μｌのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ、３０．５μｌの蒸留水、１μｌのセンスおよびアンチセンスプライマ−、並びに鋳型としてプラスミドｐＳＹＮ１５９を１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で１分の変性を行った後、９５℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１０分を３０サイクル行った。センスプライマ−は、ＮＬＲ−１９（配列番号５６、３０ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＧＣＴでアラニンをコ−ドする）である。また、アンチセンスプライマ−は、ＮＬＲ−２１（配列番号５７、２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
センスプライマ−ＮＬＲ−１９：
AGACCATGGCTGAAACAGCCTTCAAGATCG（配列番号５６；下線部は制限酵素ＮｃｏＩ認識部位を示す）
AGACCATGGCTGAAACAGCCTTCAAGATCG（配列番号５６；下線部は制限酵素ＮｃｏＩ認識部位を示す）
アンチセンスプライマ−ＮＬＲ−２１：
ATGCCTGCAGGTCACTCCGCTTTTGC（配列番号５７；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
ATGCCTGCAGGTCACTCCGCTTTTGC（配列番号５７；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、NcoIおよびSse8387I又はBspHIおよびSse8387Iによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。
実施例２と同様にして、本断片をベクターpTrc99AおよびpKK233-2に組込み、発現プラスミドpNLA001(pTrc99A NcoI-Sse8387I断片）およびpNLA010(pKK233-2 BspHI-Sse8387I断片)を作製した。
（３）形質転換体の作製および該形質転換体のニトリラーゼ活性評価
これらのプラスミドにより大腸菌JM109株を形質転換し、ニトリラーゼ発現形質転換体、JM109/pNLA001およびJM109/pNLA010を得た。これらの形質転換体およびコントロールとしてJM109/pTrc99Aを、実施例３と同様にして培養し、実施例４と同様にしてマンデロニトリルを基質としてニトリラーゼ活性および生成物であるマンデル酸の光学純度を測定した。結果は表４に示す。
これらのプラスミドにより大腸菌JM109株を形質転換し、ニトリラーゼ発現形質転換体、JM109/pNLA001およびJM109/pNLA010を得た。これらの形質転換体およびコントロールとしてJM109/pTrc99Aを、実施例３と同様にして培養し、実施例４と同様にしてマンデロニトリルを基質としてニトリラーゼ活性および生成物であるマンデル酸の光学純度を測定した。結果は表４に示す。
（４）２Ａ４ニトリラーゼ活性に及ぼすｐＨの影響
緩衝液として、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６、６．４、７、８）およびクエン酸緩衝液（ｐＨ４、５、６）を用いて、（３）と同様にしてニトリラーゼ活性を測定した。結果は表５に示す。JM109/pNLAO10菌体懸濁液を用いた。
緩衝液として、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６、６．４、７、８）およびクエン酸緩衝液（ｐＨ４、５、６）を用いて、（３）と同様にしてニトリラーゼ活性を測定した。結果は表５に示す。JM109/pNLAO10菌体懸濁液を用いた。
実施例６
（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼと低立体選択的ニトリラーゼを有する大腸菌形質転換体の作製
（１）（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の下流にBradyrhizobium由来ニトリラーゼ遺伝子を導入したプラスミドの作製
（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼと低立体選択的ニトリラーゼを有する大腸菌形質転換体の作製
（１）（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の下流にBradyrhizobium由来ニトリラーゼ遺伝子を導入したプラスミドの作製
ニトリラーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドpOXN103V2IおよびpOXN103V2Rのヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の下流に導入可能な制限酵素Sse8387I認識部位が付加された形となるようpNLB001を鋳型として実施例５と同様にＰＣＲ法により作製した。センスプライマ−は、ＮＬＲ−３１（配列番号５８、３８ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｓｔＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有する）およびＮＬＲ−３３（配列番号５９、３８ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｓｔＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＡＧでリジンをコ−ドする）ある。また、アンチセンスプライマ−は、ＮＬＲ−１２（配列番号６０、２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
センスプライマーＮＬＲ−３１：
GGCTGCAGAGGAAACAGACCATGCAGGACACGAAATTC（配列番号５８；下線部は制限酵素ＰｓｔＩ認識部位を示す）
GGCTGCAGAGGAAACAGACCATGCAGGACACGAAATTC（配列番号５８；下線部は制限酵素ＰｓｔＩ認識部位を示す）
センスプライマーＮＬＲ−３３：
GGCTGCAGAGGAAACAGACCATGAAGGACACGAAATTC（配列番号５９；下線部は制限酵素ＰｓｔＩ認識部位を示す）
GGCTGCAGAGGAAACAGACCATGAAGGACACGAAATTC（配列番号５９；下線部は制限酵素ＰｓｔＩ認識部位を示す）
アンチセンスプライマーＮＬＲ−１２：
GGCCTGCAGGATCGCGTAGACCGTTCAAGTCTCGGT（配列番号６０；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩＩ認識部位を示す）
GGCCTGCAGGATCGCGTAGACCGTTCAAGTCTCGGT（配列番号６０；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩＩ認識部位を示す）
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、ＰｓｔＩによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。
制限酵素Sse8387Iにより切断したヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドpOXN103V2IおよびpOXN103V2Rに、上記２種の断片をそれぞれライゲーションにより結合させ、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子とニトリラーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドpOXN701（ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｉ、野生型Bradyrhizobiumニトリラーゼ）、pOXN703（ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｉ、野生型Bradyrhizobiumニトリラーゼ）、pOXN711（ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｒ、BradyrhizobiumニトリラーゼＱ２Ｋ）およびpOXN713（ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｒ BradyrhizobiumニトリラーゼＱ２Ｋ）を作製した。
これらのプラスミドにより大腸菌JM109株を形質転換し、ヒドロキシニトリルリアーゼとニトリラーゼの共発現組換え体、JM109/pOXN701、JM109/pOXN703、JM109/pOXN711およびJM109/pOXN713を作製し、実施例３と同様にして培養した。培養後、実施例３と同様にしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行い、それぞれヒドロキシニトリルリアーゼおよびBradyrhizobiumニトリラーゼに相当する約３０ｋＤａおよび約３７ｋＤａのバンドを確認した。
（２）（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の下流に環境ＤＮＡ由来２Ａ４ニトリラーゼ遺伝子を導入したプラスミドの作製
ニトリラーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドpOXN103V2IおよびpOXN103V2Rのヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の下流に導入可能な制限酵素Sse8387I認識部位が付加された形となるようpNLA001を鋳型として実施例５と同様にＰＣＲ法により作製した。センスプライマ−は、ＮＬＲ−３４（配列番号６１、３８ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｓｔＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有する）である。また、アンチセンスプライマ−は、ＮＬＲ−２１（配列番号５７、２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
ニトリラーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドpOXN103V2IおよびpOXN103V2Rのヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の下流に導入可能な制限酵素Sse8387I認識部位が付加された形となるようpNLA001を鋳型として実施例５と同様にＰＣＲ法により作製した。センスプライマ−は、ＮＬＲ−３４（配列番号６１、３８ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｓｔＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有する）である。また、アンチセンスプライマ−は、ＮＬＲ−２１（配列番号５７、２６ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
センスプライマーＮＬＲ−３４：
GGCTGCAGAGGAAACAGACCATGGCTGAAACAGCCTTC（配列番号６１；下線部は制限酵素PstI認識部位を示す）
GGCTGCAGAGGAAACAGACCATGGCTGAAACAGCCTTC（配列番号６１；下線部は制限酵素PstI認識部位を示す）
アンチセンスプライマーＮＬＲ−２１：
ATGCCTGCAGGTCACTCCGCTTTTGC（配列番号５７；下線部は制限酵素Sse8387II認識部位を示す）
ATGCCTGCAGGTCACTCCGCTTTTGC（配列番号５７；下線部は制限酵素Sse8387II認識部位を示す）
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、ＰｓｔＩによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。
制限酵素Sse8387Iにより切断したヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドに、上記断片をライゲーションにより結合させ、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子とニトリラーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドpOXN721（ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｉ、２Ａ４ニトリラーゼＳ２Ａ）およびpOXN723（ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｒ、２Ａ４ニトリラーゼＳ２Ａ）を作製した。
これらのプラスミドにより大腸菌JM109株を形質転換し、ヒドロキシニトリルリアーゼとニトリラーゼの共発現組換え体、JM109/pOXN721およびJM109/pOXN723を作製し、実施例３と同様にして培養した。培養後、実施例３と同様にしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行い、ヒドロキシニトリルリアーゼおよび２Ａ４ニトリラーゼに相当する約３０ｋＤａおよび約３５ｋＤａのバンドを確認した。
（３）Bradyrhizobium由来ニトリラーゼ遺伝子の下流に（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を導入したプラスミドの作製
ヒドロキシニトリルリアーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、ニトリラーゼ発現プラスミドpNLB004およびpNLB010のニトリラーゼ遺伝子の下流に導入可能な制限酵素Sse8387I認識部位が付加された形となるようpOXN103V2IおよびpOXN103V2Rを鋳型として実施例５と同様にＰＣＲ法により作製した。センスプライマ−は、ＯＸＹＮ−６２（鋳型としてｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉを用いた場合）（配列番号６２、３１ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｓｔＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＴＣでイソロイシンをコ−ドする、）およびＯＸＹＮ−６３（鋳型としてｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒを用いた場合）（配列番号６３、３１ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｓｔＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＣＧＴでアルギニンをコ−ドする）ある。また、アンチセンスプライマ−は、ＯＸＹＮ−０９（配列番号４９、３３ヌクレオチドからなり、その配列中にSse8387I認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
ヒドロキシニトリルリアーゼをコ−ドするＤＮＡ断片を、ニトリラーゼ発現プラスミドpNLB004およびpNLB010のニトリラーゼ遺伝子の下流に導入可能な制限酵素Sse8387I認識部位が付加された形となるようpOXN103V2IおよびpOXN103V2Rを鋳型として実施例５と同様にＰＣＲ法により作製した。センスプライマ−は、ＯＸＹＮ−６２（鋳型としてｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉを用いた場合）（配列番号６２、３１ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｓｔＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＴＣでイソロイシンをコ−ドする、）およびＯＸＹＮ−６３（鋳型としてｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒを用いた場合）（配列番号６３、３１ヌクレオチドからなり、その配列中にＰｓｔＩ認識部位およびニトリラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＣＧＴでアルギニンをコ−ドする）ある。また、アンチセンスプライマ−は、ＯＸＹＮ−０９（配列番号４９、３３ヌクレオチドからなり、その配列中にSse8387I認識部位およびニトリラーゼ遺伝子の終止コドンを含む）である。
センスプライマ−ＯＸＹＮ−６２：
GGCTGCAGGAAACAGACCATGATCACTGCAC（配列番号６２；下線部は制限酵素ＰｓｔＩ認識部位を示す）
GGCTGCAGGAAACAGACCATGATCACTGCAC（配列番号６２；下線部は制限酵素ＰｓｔＩ認識部位を示す）
センスプライマ−ＯＸＹＮ−６３：
GGCTGCAGGAAACAGACCATGCGTACTGCAC（配列番号６３；下線部は制限酵素ＰｓｔＩ認識部位を示す）
GGCTGCAGGAAACAGACCATGCGTACTGCAC（配列番号６３；下線部は制限酵素ＰｓｔＩ認識部位を示す）
アンチセンスプライマ−ＯＸＹＮ−０９：
GGCCTGCAGGTTAACTTAATAGGAGCTAAAAGC（配列番号４９；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩＩ認識部位を示す）
GGCCTGCAGGTTAACTTAATAGGAGCTAAAAGC（配列番号４９；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩＩ認識部位を示す）
ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、ＰｓｔＩによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。
制限酵素Sse8387Iにより切断したニトリラーゼ発現プラスミドｐＮＬＢ００４およびｐＮＬＢ０１０に、上記断片をライゲーションにより結合させ、ニトリラーゼ遺伝子とヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドpNLB201（ベクターpTrc99A、BradyrhizobiumニトリラーゼQ2K、ヒドロキシニトリルリアーゼV2I）、pNLB203（ベクターpTrc99A、BradyrhizobiumニトリラーゼQ2K、ヒドロキシニトリルリアーゼV2R）、pNLB211（ベクターpKK233-2、BradyrhizobiumニトリラーゼQ2K、ヒドロキシニトリルリアーゼV2I）、pNLB213（ベクターpKK233-2、BradyrhizobiumニトリラーゼQ2K、ヒドロキシニトリルリアーゼV2R）を作製した。
これらのプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ニトリラーゼとヒドロキシニトリルリアーゼの共発現組換え体、JM109/pNLB201、JM109/pNLB203、JM109/pNLB211、およびJM109/pNLB213を作製し、実施例３と同様にして培養した。培養後、実施例３と同様にしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行い、ヒドロキシニトリルリアーゼおよびBradyrhizobiumニトリラーゼに相当する約３０ｋＤａおよび約３７ｋＤａのバンドを確認した。
（４）２Ａ４由来ニトリラーゼ遺伝子に（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を導入したプラスミドの作製
制限酵素Sse8387Iにより切断したニトリラーゼ発現プラスミドｐＮＬＡ００１およびｐＮＬＡ０１０に、（３）で作製したＤＮＡ断片をライゲーションにより結合させ、ニトリラーゼ遺伝子とヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドｐＮＬＡ２０１（ベクターｐＴｒｃ９９、２Ａ４ニトリラーゼＳ２Ａ、ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｉ）およびｐＮＬＡ２０３（ベクターｐＴｒｃ９９、２Ａ４ニトリラーゼＳ２Ａ、ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｒ）ｐＮＬＡ２０１（ベクターｐＫＫ２３３−２、２Ａ４ニトリラーゼＡＳ２Ａ、ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｉ）およびｐＮＬＡ２０３（ベクターｐＫＫ２３３−２、２Ａ４ニトリラーゼＳ２Ａ、ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｒ）を作製した。
制限酵素Sse8387Iにより切断したニトリラーゼ発現プラスミドｐＮＬＡ００１およびｐＮＬＡ０１０に、（３）で作製したＤＮＡ断片をライゲーションにより結合させ、ニトリラーゼ遺伝子とヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドｐＮＬＡ２０１（ベクターｐＴｒｃ９９、２Ａ４ニトリラーゼＳ２Ａ、ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｉ）およびｐＮＬＡ２０３（ベクターｐＴｒｃ９９、２Ａ４ニトリラーゼＳ２Ａ、ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｒ）ｐＮＬＡ２０１（ベクターｐＫＫ２３３−２、２Ａ４ニトリラーゼＡＳ２Ａ、ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｉ）およびｐＮＬＡ２０３（ベクターｐＫＫ２３３−２、２Ａ４ニトリラーゼＳ２Ａ、ヒドロキシニトリルリアーゼＶ２Ｒ）を作製した。
これらのプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ニトリラーゼとヒドロキシニトリルリアーゼの共発現組換え体、ＪＭ１０９／ｐＮＬＡ２０１、ＪＭ１０９／ｐＮＬＡ２０３、ＪＭ１０９／ｐＮＬＡ２１１およびＪＭ１０９／ｐＮＬＡ２１３を作製し、実施例３と同様にして培養した。培養後、実施例３と同様にしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行い、ヒドロキシニトリルリアーゼおよび２Ａ４ニトリラーゼに相当する約３０ｋＤａおよび約３５ｋＤａのバンドを確認した。
実施例７
（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼと低立体選択的ニトリラーゼを有する大腸菌組換え体による、ベンズアルデヒドとＫＣＮからのＳ−マンデル酸の合成
（１）JM109/pOXN701およびJM109/pOXN703
実施例６で作製した（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼと低立体選択的ニトリラーゼを有する大腸菌形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７０１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７０３を用いて、ベンズアルデヒドとＫＣＮからの（Ｓ）−マンデル酸の合成を試みた。マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ ５）３００μｌと蒸留水１９５μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、５μｌのベンズアルデヒド（終濃度４７ｍＭ）を溶解させ、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液４００μｌを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１ＭのＫＣＮを加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、上清を実施例４と同様の方法により生成したマンデル酸の分析を行った。
（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼと低立体選択的ニトリラーゼを有する大腸菌組換え体による、ベンズアルデヒドとＫＣＮからのＳ−マンデル酸の合成
（１）JM109/pOXN701およびJM109/pOXN703
実施例６で作製した（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼと低立体選択的ニトリラーゼを有する大腸菌形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７０１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７０３を用いて、ベンズアルデヒドとＫＣＮからの（Ｓ）−マンデル酸の合成を試みた。マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ ５）３００μｌと蒸留水１９５μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、５μｌのベンズアルデヒド（終濃度４７ｍＭ）を溶解させ、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液４００μｌを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１ＭのＫＣＮを加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、上清を実施例４と同様の方法により生成したマンデル酸の分析を行った。
JM109/pOXN701およびJM109/pOXN703は、それぞれ０．３９ｍＭおよび２．７５ｍＭ（比活性6.2および18.8mU/mg dry cell）のマンデル酸を生成していた。
（２）C600/pOXN701およびC600/pOXN703
大腸菌Ｃ６００株を実施例１に従ってｐＯＸＮ７０１およびｐＯＸＮ７０３を用いて形質転換を行い、形質転換体Ｃ６００／ｐＯＸＮ７０１およびＣ６００／ｐＯＸＮ７０３を得た。これらをＩＰＴＧ無添加であることを除けば実施例２と同様にして培養を行い、菌体懸濁液を得た。
大腸菌Ｃ６００株を実施例１に従ってｐＯＸＮ７０１およびｐＯＸＮ７０３を用いて形質転換を行い、形質転換体Ｃ６００／ｐＯＸＮ７０１およびＣ６００／ｐＯＸＮ７０３を得た。これらをＩＰＴＧ無添加であることを除けば実施例２と同様にして培養を行い、菌体懸濁液を得た。
マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ ５）３００μｌと蒸留水１００μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、１００μｌの２０ｍＭベンズアルデヒド（終濃度２ｍＭ）を加え、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液４００μｌを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１００ｍＭのＫＣＮ（終濃度１０ｍＭ）を加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、上清を実施例４と同様の方法により生成したマンデル酸の分析を行った。
Ｃ６００／ｐＯＸＮ７０１およびＣ６００／ｐＯＸＮ７０３は、ベンズアルデヒドを全量消費し、それぞれ１．８０ｍＭおよび１．８１ｍＭ（比活性４．４５ｍＵ以上、および４．８３ｍＵ以上／ｍｇ ｄｒｙ ｃｅｌｌ）の、いずれも光学純度１００％ｅ．ｅ．のＳ−マンデル酸を生成していた。
（３）JM109/pOXN711、JM109/pOXN713、JM109/pOXN721およびJM109/pOXN723
実施例６で作製した（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼとBradyrhizobiumニトリラーゼを有する大腸菌形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１３、および（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼと２Ａ４ニトリラーゼを有する大腸菌形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７２１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７２３を実施例６に記載の条件で培養を行ない、菌体懸濁液を得た。これらを用いて、ベンズアルデヒドとＫＣＮからの（Ｓ）−マンデル酸の合成を試みた。マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ ４）３００μｌと蒸留水１００μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、１００μｌの５０ｍＭベンズアルデヒド（終濃度５ｍＭ）を溶解させ、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液４００μｌを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１００ｍＭのＫＣＮ（終濃度１０ｍＭ）を加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、上清を（実施例４）と同様の方法により生成したマンデル酸の分析を行った。
実施例６で作製した（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼとBradyrhizobiumニトリラーゼを有する大腸菌形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１３、および（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼと２Ａ４ニトリラーゼを有する大腸菌形質転換体ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７２１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７２３を実施例６に記載の条件で培養を行ない、菌体懸濁液を得た。これらを用いて、ベンズアルデヒドとＫＣＮからの（Ｓ）−マンデル酸の合成を試みた。マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ ４）３００μｌと蒸留水１００μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、１００μｌの５０ｍＭベンズアルデヒド（終濃度５ｍＭ）を溶解させ、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液４００μｌを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１００ｍＭのＫＣＮ（終濃度１０ｍＭ）を加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、上清を（実施例４）と同様の方法により生成したマンデル酸の分析を行った。
ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１３は、ベンズアルデヒドを全量消費し、それぞれ４．１５ｍＭおよび４．４７ｍＭ（比活性２３０ｍＵおよび２４７ｍＵ／ｍｇ ｄｒｙ ｃｅｌｌ以上）の、いずれも光学純度１００％ｅ．ｅ．のＳ−マンデル酸が生成していた。
ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７２１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７２３は、それぞれ１．５９ｍＭおよび１．３５ｍＭ（比活性８８．４ｍＵおよび７４．９ｍＵ／ｍｇ ｄｒｙ ｃｅｌｌ以上）の、光学純度はそれぞれ９８．９および１００％ｅ．ｅ．のＳ−マンデル酸が生成していた。
（４）基質ベンズアルデヒド濃度の影響（ＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１３）
（３）で得られたＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１３菌体懸濁液を用いて、ベンズアルデヒド濃度以外は（３）と同様にしてＳ−マンデル酸の合成を行った。ベンズアルデヒドの終濃度は０．５、１、２および５ｍＭとした。
（３）で得られたＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１１およびＪＭ１０９／ｐＯＸＮ７１３菌体懸濁液を用いて、ベンズアルデヒド濃度以外は（３）と同様にしてＳ−マンデル酸の合成を行った。ベンズアルデヒドの終濃度は０．５、１、２および５ｍＭとした。
ベンズアルデヒド濃度が２ｍＭ以上の場合に、比活性が低下していることから、本濃度領域では酵素の失活が起こっていると考えられる。Ｓ−マンデル酸を高濃度蓄積させるためには、ベンズアルデヒドを５ｍＭ以下、できれば２ｍＭ以下に維持しながら、分割添加して反応すべきことが明らかとなった。
（５）ｐＨの効果
反応時のｐＨの影響を調べるために、実施例６で得られたＪＭ１０９／ｐＮＬＡ２０１を用いて反応を行った。
反応時のｐＨの影響を調べるために、実施例６で得られたＪＭ１０９／ｐＮＬＡ２０１を用いて反応を行った。
マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ４、４．５、５）３００μｌと蒸留水１９５μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、５μｌのベンズアルデヒド（終濃度４７ｍＭ）を溶解させ、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液４００μｌを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１ＭのＫＣＮ（終濃度１００ｍＭ）を加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、上清を実施例４と同様の方法により生成したマンデル酸の分析を行った。
その結果、緩衝液のｐＨ４および５においては反応は進行せず、ｐＨ５においてのみ３．１ｍＭのマンデル酸が生成し、その光学純度は４２％ｅ．ｅ．（Ｓ体）であった。
次に、ベンズアルデヒド濃度を２ｍＭおよびＫＣＮ濃度を１０ｍＭに下げて、同様の実験を行った。マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ３．５、４、４．５、５）３００μｌと蒸留水１００μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、１００μｌの２０ｍＭベンズアルデヒド（終濃度２ｍＭ）を加え、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液４００μｌを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１００ｍＭのＫＣＮ（終濃度１０ｍＭ）を加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、上清を実施例４と同様の方法により生成したマンデル酸の分析を行った。その結果、いずれの場合もほぼ全量のベンズアルデヒドが消費され、高い光学純度のＳ−マンデル酸を生成した。
条件１：４７ｍＭベンズアルデヒド−１００ｍＭ ＫＣＮ
条件２：２ｍＭベンズアルデヒド−１０ｍＭ ＫＣＮ
条件２：２ｍＭベンズアルデヒド−１０ｍＭ ＫＣＮ
実施例８
ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミド、および該プラスミドを含むヒドロキシニトリルリア−ゼ発現ロドコッカス組換え体の作製
（１）ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミドの作製
実施例１で得られたキャッサバ由来のヒドロキシニトリルリアーゼの合成遺伝子を鋳型として、実施例４の条件でＰＣＲ反応を行い、ロドコッカス発現ベクターｐＳＪ０３４に挿入するためのＤＮＡ断片を得た。センスプライマーとしてＯＸＹＮ−０１（配列番号６４、３２ヌクレオチドからなり、その配列中にＸｂａＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有する）、アンチセンスプライマーとしてＯＸＹＮ−０９（配列番号４９、３３ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位を含む）を用いた。
ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミド、および該プラスミドを含むヒドロキシニトリルリア−ゼ発現ロドコッカス組換え体の作製
（１）ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミドの作製
実施例１で得られたキャッサバ由来のヒドロキシニトリルリアーゼの合成遺伝子を鋳型として、実施例４の条件でＰＣＲ反応を行い、ロドコッカス発現ベクターｐＳＪ０３４に挿入するためのＤＮＡ断片を得た。センスプライマーとしてＯＸＹＮ−０１（配列番号６４、３２ヌクレオチドからなり、その配列中にＸｂａＩ認識部位およびヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有する）、アンチセンスプライマーとしてＯＸＹＮ−０９（配列番号４９、３３ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位を含む）を用いた。
センスプライマーＯＸＹＮ−０１：
TTTCTAGAATGGTAACTGCACATTTTGTTCTG（配列番号６４；下線部は制限酵素ＸｂａＩ認識部位を示す）
TTTCTAGAATGGTAACTGCACATTTTGTTCTG（配列番号６４；下線部は制限酵素ＸｂａＩ認識部位を示す）
アンチセンスプライマーＯＸＹＮ−０９：
ggcctgcaggttaacttaataggagctaaaagc（配列番号４９；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
ggcctgcaggttaacttaataggagctaaaagc（配列番号４９；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
以下、実施例１と同様の手法によりヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドを作製した。ＰＣＲにより得られた増幅ＰＣＲ産物は、ＸｂａＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉによって消化し、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、その後QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。制限酵素ＸｂａＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉにより切断したｐＳＪ０３４に、上記断片をライゲーションにより結合させ、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドｐＯＸＮ０３１を得た。
なお、ｐＳＪ０３４はプラスミドｐＳＪ０２３より特開平１０−３３７１８５号明細書記載の方法により作製したものである。ｐＳＪ０２３は形質転換体 R.rhodochrous ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３２）として産業総合技術研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
（２）（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子とBradyrhizobium由来ニトリラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＯＸＮ６１１およびｐＯＸＮ６１２の作製
実施例６（１）で得られた増幅ＰＣＲ産物をＰｓｔＩで消化し精製されたＤＮＡ断片を、Ｓｓｅ８３８７Ｉにより切断したヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドｐＯＸＮ０３１に、ライゲーションにより結合させ、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子とニトリラーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドｐＯＸＮ６１１（野生型Bradyrhizobiumニトリラーゼ）およびｐＯＸＮ６１２（BradyrhizobiumニトリラーゼＱ２Ｋ）を作製した。
実施例６（１）で得られた増幅ＰＣＲ産物をＰｓｔＩで消化し精製されたＤＮＡ断片を、Ｓｓｅ８３８７Ｉにより切断したヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミドｐＯＸＮ０３１に、ライゲーションにより結合させ、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子とニトリラーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミドｐＯＸＮ６１１（野生型Bradyrhizobiumニトリラーゼ）およびｐＯＸＮ６１２（BradyrhizobiumニトリラーゼＱ２Ｋ）を作製した。
これらのプラスミドによりロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株を形質転換し、ヒドロキシニトリルリアーゼとニトリラーゼの共発現組換え体、ＡＴＣＣ１２６７４株／ｐＯＸＮ６１１およびＡＴＣＣ１２６７４株／ｐＯＸＮ６１２を作製した。
ＡＴＣＣ１２６７４株の形質転換は次のようにして行った。ＡＴＣＣ１２６７４株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。上記のプラスミド溶液１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷した。これを遺伝子導入装置Gene Pulser（ＢＩＯ ＲＡＤ）用キュベットに移し、同装置を用いて２．０ＫＶ、２００ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置後、３７℃で１０分間インキュベートし、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ ＨＰＯ４、０．２％ ＫＨ２ ＰＯ４）５００μｌ を加え、３０℃、５時間静置した後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃、３日間培養した。得られたコロニーを培養し、プラスミドが導入されていることを確認した。
培養は、次のように行った。カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＭＹＫ培地１０ｍｌに植菌し、３０℃にて２４時間前培養を行った。培養液を１ｍｌ取り１００ｍｌの同培地に加え、３０℃にて４８時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭ リン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。
培養後、実施例３と同様にしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行い、それぞれヒドロキシニトリルリアーゼおよびBradyrhizobiumニトリラーゼに相当する約３０ｋＤａおよび約３７ｋＤａのバンドを確認した。
比較例１
（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼを有する組換え体と低立体選択的ニトリラーゼを有する組換え体を含む反応系による、ベンズアルデヒドとＫＣＮからのＳ−マンデル酸の合成
実施例３で得られたヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒの菌体懸濁液、および実施例４で得られたニトリラーゼ活性を有するＪＭ１０９／ｐＮＬＢ０１０の菌体懸濁液を用いて、実施例７と同様にしてベンズアルデヒドとＫＣＮからのＳ−マンデル酸の合成を行った。
（Ｓ）選択的ヒドロキシニトリルリアーゼを有する組換え体と低立体選択的ニトリラーゼを有する組換え体を含む反応系による、ベンズアルデヒドとＫＣＮからのＳ−マンデル酸の合成
実施例３で得られたヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するＪＭ１０９／ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒの菌体懸濁液、および実施例４で得られたニトリラーゼ活性を有するＪＭ１０９／ｐＮＬＢ０１０の菌体懸濁液を用いて、実施例７と同様にしてベンズアルデヒドとＫＣＮからのＳ−マンデル酸の合成を行った。
マイクロチューブに１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ ５）３００μｌと蒸留水１００μｌを加え混合し、２０℃にて５分間インキュベートし、１００μｌの２０ｍＭベンズアルデヒド（終濃度２ｍＭ）を加え、更に５分間インキュベートした。これに菌体懸濁液各々２００μｌずつを加え攪拌し、２０℃にて１０分間インキュベートした後、１００μｌの１００ｍＭのＫＣＮ（終濃度１０ｍＭ）を加えることにより反応を開始した。３０分後に１００μｌの１Ｍリン酸を加えて反応を停止させ、遠心（１５，０００ｒｐｍ ５分間）により菌体を除去し、生成したマンデル酸の分析を行った。その結果、ベンズアルデヒドは全量消費され、１．８０ｍＭの光学純度８５．０％ｅ．ｅ．のＳ−マンデル酸を生成していた。
Claims (17)
- ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子、ニトリラーゼをコードする遺伝子が導入された形質転換微生物。
- 立体選択的ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、および立体選択性の低いまたは該ヒドロキシニトリルリアーゼと同じ立体選択性を有するニトリラーゼをコードする遺伝子が導入された形質転換微生物。
- ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターと、ニトリラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターとから得られる請求項１又は２記載の微生物。
- ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、およびニトリラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターから得られる請求項１又は２記載の微生物。
- ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子が、Manihot esculenta由来の遺伝子である、請求項３又は４記載の発現ベクター。
- ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である、請求項３又は４記載のベクター。
（ａ） 配列番号２で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号２で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。 - ニトリラーゼをコードする遺伝子がBradyrhizobium japonicum由来の遺伝子である請求項3〜６のいずれかに記載のベクター。
- ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である請求項３〜６のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号３で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号３で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。 - ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である請求項３〜６のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号４で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号４で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。 - ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である請求項３〜６のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号５で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号５で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。 - ニトリラーゼをコードする遺伝子が、以下のいずれかの遺伝子である請求項３〜６のいずれかに記載のベクター。
（ａ） 配列番号６で示す遺伝子。
（ｂ） 配列番号６で示す遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。 - ベクターが、プラスミドベクターである請求項３〜１１のいずれかに記載のベクター。
- プラスミドベクターが、ヒドロキシニトリルリアーゼ発現プラスミド（ｐＯＸＮ１０３、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｉ、ｐＯＸＮ１０３Ｖ２Ｒ）、ニトリラーゼ発現プラスミド（ｐＮＬＡ００１、ｐＮＬＡ０１０、ｐＮＬＢ００１、ｐＮＬＢ００２、ｐＮＬＢ００４、ｐＮＬＢ０１０）、ニトリラーゼ遺伝子及びヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子が組み込まれた発現プラスミド（ｐＮＬＡ２０１、ｐＮＬＡ２０３、ｐＮＬＡ２１１、ｐＮＬＡ２１３、ｐＮＬＢ２０１、ｐＮＬＢ２０３、ｐＮＬＢ２１１、ｐＮＬＢ２１３）のいずれかである請求項１２記載のベクター。
- 請求項３〜１３のいずれかに記載のベクターが導入された形質転換体。
- 形質転換体の宿主が、大腸菌又はロドコッカス(Rhodococcus)属細菌である請求項1４に記載の形質転換体。
- 形質転換体が、JM109/pNLA201、JM109/pNLA203、JM109/pNLA211、ATCC12674株/pOXN611、ATCC12674株/pOXN612のいずれかである請求項１５記載の形質転換体。
- カルボニル化合物及びシアニドドナーに請求項１，２，１４，１５，１６のいずれかの形質転換微生物を作用させることを含む、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
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