CN114814065B - 幽门螺旋杆菌的唾液中voc标志物及其在制备诊断试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种幽门螺旋杆菌的唾液中VOC标志物，其特征在于，该VOC标志物为以下组合：丙酮、2‑甲基‑2‑丙醇、乙醇、2‑戊酮、1‑丙醇、2‑甲基‑1‑丙醇、2‑戊醇、1‑丁醇、2‑甲基‑1‑丁醇、乙偶姻、吡咯、对甲基苯甲醛。所述诊断试剂是指通过检测被试者唾液中所述幽门螺旋杆菌相关VOC标志物的含量，进行幽门螺旋杆菌感染的非标记诊断，本发明提供了唾液中多种挥发性有机物作为标志物用于幽门螺旋杆菌感染的诊断，在幽门螺旋杆菌的筛查与诊断中应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及幽门螺旋杆菌的检测技术领域，具体涉及一种唾液中的VOC标志物及其在制备诊断试剂中的应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌是一种消化系统内的致病菌，属于微需氧型革兰氏阴性菌，能够再胃内极低PH酸性环境中生存，致全球约50％的人口感染。幽门螺旋杆菌已经被证实与慢性活动性胃炎、胃溃疡甚至胃癌、胃黏膜相关淋巴瘤等胃肠道疾病密切相关，被列为第一类致癌物。
目前对于幽门螺旋杆菌感染的诊断方式主要有碳13/14标记的尿素呼气实验、粪便抗原检测、血清学抗体检测、尿液抗体检测，以及侵入性检查，如内镜检查、组织学检测、免疫组织化学染色、细菌培养等。其中，呼气检测方法通过使被试者服用碳13/14标记的尿素胶囊后一定时间，使用质谱仪检测呼气中的二氧化碳是否含有碳13/14元素，进而确定是否感染幽门螺旋杆菌，由于其无创性、成本低的特点被广泛应用。
但这种呼气诊断方法具有以下弊端：(1)额外的操作步骤，需要提前服用带有同位素标记的药物；(2)需要专门的质谱分析仪，目前没有小型家用传感器能够实现同位素区分，因此需将呼气是收集到期待中，送至专门的检测机构；(3)碳14虽然价格较低，但具有一定的放射性，不适合儿童和孕妇服用(4)样本运输不便，且呼气中的成分容易吸附在气袋内壁上。
专利CN113866307A公开了一种幽门螺旋杆菌VOC标志物、其应用及检测系统，标志物是指以下挥发性有机物的多种或全部组合：正己烷、乙酸乙酯、异丁醇、乙醇、甲苯、1-丙醇、正己醛、邻二甲苯、吡啶、壬醛、甲酰胺、十六烷-1,4-内酯。
专利CN113984948A公开了一种基于VOC标志物的幽门螺旋杆菌感染的联合诊断模型，VOC标志物包括丙酮、丁酮、甲苯、二甲基二硫、丙二醇甲醚醋酸酯、月桂酸、十四酸、棕榈酸；所述细胞/细菌培养基中VOC标志物包括丙酮、丁酮、异丙醇、戊酮、二甲基二硫、2-(全氟己基辛烷)乙醇、2,4,6-三甲基吡啶、十四烷、甲基壬基酮、十一醇。
专利CN110045035B公开了一种唾液中的胃癌VOC标志物及其在制备胃癌诊断试剂中的应用，标志物是指以下挥发性有机物的多种或全部的组合：乙醛、2-甲基丁醛、异丙醇、己醛、正丁醇、桉树脑、壬醛、薄荷酮、2-乙基己醇、薄荷醇、茴香脑、十二醇。
然而，现有技术公开的关于幽门螺旋杆菌的检测技术中，如专利CN113866307A中，基于呼气样本中的VOC标志物进行诊断的方法，呼气样本不易储存和运输，呼气中的VOC标志物成分容易吸附在采气袋内壁或因保存时间过长而发生变化；专利CN113984948A中是针对幽门螺旋杆菌菌株与胃粘膜上皮细胞进行对比筛选VOC标志物，需要进行胃黏膜组织的采样、菌株和细胞培养，步骤繁琐、专业性强并且采样过程会给被试者带来不适感；而专利CN110045035B公开的是一种唾液中的VOC标志物在胃癌诊断中的应用，幽门螺旋杆菌感染被认为是导致胃癌的一种可能性诱因，因此在感染幽门螺旋杆菌阶段及时进行诊断有望有效降低胃癌发生率。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种唾液中的VOC标志物在制备幽门螺旋杆菌感染的非标记诊断试剂中的应用，通过对唾液中特定VOC标志物组合的相对含量的检测快速诊断是否感染幽门螺旋杆菌。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种幽门螺旋杆菌的唾液中VOC标志物，该VOC标志物为以下组合：丙酮、2-甲基-2-丙醇、乙醇、2-戊酮、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、2-戊醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、乙偶姻、吡咯、对甲基苯甲醛。
由于幽门螺旋杆菌的代谢物，以及幽门螺旋杆菌对胃黏膜、消化道等的影响，感染者的胃部会产生特异性化合物，部分进入血液，经过循环系统到达唾液样本，另外一部分挥发出的标志物直接到达唾液。从唾液中提取的挥发性有机物作为幽门螺旋杆菌感染的标志物，提供了一种有效的非侵入性手段监测健康状况、疾病发生和进展以及治疗结果。
所述的VOC标志物用于制备幽门螺旋杆菌诊断试剂，所述诊断试剂通过检测被试者唾液中的所述幽门螺旋杆菌标志物的含量，进而诊断是否感染幽门螺旋杆菌。
用于检测幽门螺旋杆菌感染标志物的检测系统，该检测系统包括唾液收集装置、顶空进样装置、固相微萃取装置和气相色谱-质谱仪，所述唾液收集装置收集到的唾液样本经过顶空进样装置进样、固相微萃取装置浓缩后递送至气相色谱-质谱仪检测幽门螺旋杆菌标志物的含量；
所述标志物包括丙酮、2-甲基-2-丙醇、乙醇、2-戊酮、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、2-戊醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、乙偶姻、吡咯、对甲基苯甲醛。
当检测到唾液中下列VOC的峰面积百分比：丙酮大于3.2％，2-戊酮大于0.5％，1-丁醇大于0.16％，2-甲基-1-丁醇大于0.13％，吡咯大于0.05％，对甲基苯甲醛大于0.6％，条件中的至少三项满足条件时，确定被试者感染幽门螺旋杆菌。
当检测到唾液中下列VOC的峰面积百分比：2-甲基-2-丙醇大于1％，乙醇大于0.2％，1-丙醇大于0.11％，2-甲基-1-丙醇大于0.08％，2-戊醇大于0.15％，乙偶姻大于0.45％，至少有两项满足条件时，辅助诊断为被试者感染幽门螺旋杆菌。
优选地，所述的检测为通过顶空微萃取-气相色谱-质谱分析方法检测被试者唾液中的所述幽门螺旋杆菌感染的诊断标志物的含量。
优选地，所述的一种用于检测幽门螺旋杆菌诊断标志物的检测系统，其特征在于，包括唾液收集装置、顶空进样装置、固相微萃取装置和气相色谱-质谱仪，所述唾液收集装置收集到的唾液样本经过顶空进样装置进样、固相微萃取装置浓缩后递送至气相色谱-质谱仪检测幽门螺旋杆菌标志物的含量；所述标志物包括丙酮、2-甲基-2-丙醇、乙醇、2-戊酮、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、2-戊醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、乙偶姻、吡咯、对甲基苯甲醛。
优选地，所述的通过唾液中的VOC标志物诊断是否感染幽门螺旋杆菌的应用，其特征在于，所述用途包括如下步骤：当检测到唾液中下列VOC的峰面积百分比：丙酮大于3.2％，2-戊酮大于0.5％，1-丁醇大于0.16％，2-甲基-1-丁醇大于0.13％，吡咯大于0.05％，对甲基苯甲醛大于0.6％，条件中的至少三项满足条件，则诊断被试者感染幽门螺旋杆菌；
优选地，所述的通过唾液中的VOC标志物诊断是否感染幽门螺旋杆菌的应用，其特征在于，所述用途包括如下步骤：当检测到唾液中下列VOC的峰面积百分比：丙酮大于3.2％，2-戊酮大于0.5％，1-丁醇大于0.16％，2-甲基-1-丁醇大于0.13％，吡咯大于0.05％，对甲基苯甲醛大于0.6％，条件中的至少三项满足条件，则诊断被试者感染幽门螺旋杆菌；
基于人体唾液中VOC成分检测的非标记呼气诊断系统有望解决上述问题，并且可以基于特定的VOC标志物设计便携式传感器，有利于幽门螺旋杆菌感染的及时诊断和治疗。研究发现，体液(包括血液、尿液、汗液、唾液等)中存在多种代谢物，其中包括与特定疾病相关的VOC标志物，通过对特定的VOC标志物的检测能够进行疾病的快速精准诊断。另外，与血液和尿液相比，唾液成分更简单，基质效应干扰小，相对于呼气样本，具有采集迅速、性质稳定、易于储存和运输等优点，可以作为诊断幽门螺旋杆菌感染的筛查样本。且幽门螺旋杆菌可以通过口-口传播，唾液中也曾被发现存在少量的幽门螺旋杆菌，因此唾液样本更好的选择，目前尚未有通过唾液中的VOC标志物进行幽门螺旋杆菌感染的诊断方法的报道。
与现有技术相比，本发明具有如下突出优势：
1、与专利CN113866307A相比，使用唾液样本进行检测，具有样本性质稳定、便于采集、非侵入性、成本低廉、易于储存和运输等优点。
2、所筛选的唾液中的幽门螺旋杆菌感染的标志物包括12种不同性质的VOC，通过多种指标的检测，确保诊断结果准确性高。
3、与专利CN113984948A相比，所筛选的唾液中的幽门螺旋杆菌标志物直接来自于人体唾液样本，在幽门螺旋杆菌阳性组和阴性组之间存在显著性差异，保证诊断效果准确可靠。
附图说明
图1为幽门螺旋杆菌感染阳性组和阴性组的唾液样本的色谱图及相应的标志物；
图2为幽门螺旋杆菌感染阳性组和阴性组的唾液样本中标志物含量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
唾液样本的采集
46名提供唾液的志愿者(17名癌症患者和29名正常人)均不患有其他消化道疾病或代谢系统疾病。对每个受试者的唾液进行分析，使用共计46个唾液样品。46名志愿者提前经过C14呼气实验和胃镜取胃黏膜标本进行细菌培养进行双重验证，确诊为幽门螺旋杆菌感染阳性组与阴性组。样本收集前，每个志愿者要在48小时内保持自然平和的情绪，24小时内，不得抽烟和喝酒。记录每个志愿者年龄、性别、幽门螺旋杆菌检测值、抽烟饮酒史、当前服用药物情况、近三天饮食状况等信息。样本收集前1小时内，所有志愿者禁止摄入任何食物以保持口腔清洁。采样开始前，先用纯水漱口，5分钟后开始收集，每名志愿者需要采集2毫升的唾液样本。
实施例2
唾液样本的预处理与检测
将所得的唾液样本放入离心管中，12000转/分的转速离心15分钟，去除食物残渣等杂志，精确控制进样量为1毫升，将样品加热30分钟至65度以保证蒸气达到化学平衡。将顶空进样装置连接至固相微萃取装置，经75微米CAR/PDMS涂层的固相微萃取头，对样本中的标志物进行预浓缩处理。样本中VOCs进行预浓缩，浓缩时间分别为30分钟。GC-MS分析：将萃取头于GC-MS进样口，高温280度，瞬间解吸附5分钟，无分流方式进样。5分钟后，打开分流阀。色谱分离用DB-WAX色谱柱，0.25微米×30米×0.25毫米。升温程序：起始温度40度，保持时间5分钟，10度/分升温至250度，保持5分钟。质谱仪全范围扫描40-400amu，电子轰击能量70eV，四级杆质谱离子源温度250度，载气为高纯氦气，流速1毫升/分。
实施例3
唾液样本中幽门螺旋杆菌感染标志物的筛选
被检出物质用质谱自带NIST14图库进行初步定性，相似度90％以上的物质使用峰面积含量百分比定量。幽门螺旋杆菌感染阳性组和阴性组的唾液样本的色谱图、含量对比图和对应的特异性VOC标志物如图1、图2和表1所示。
表1幽门螺旋杆菌感染相关地VOC标志物
| 峰号 | 化学名称 |
| 1 | 丙酮 |
| 2 | 2-甲基-2-丙醇 |
| 3 | 乙醇 |
| 4 | 2-戊酮 |
| 5 | 1-丙醇 |
| 6 | 2-甲基-1-丙醇 |
| 7 | 2-戊醇 |
| 8 | 1-丁醇 |
| 9 | 2-甲基-1-丁醇 |
| 10 | 乙偶姻 |
| 11 | 吡咯 |
| 12 | 对甲基苯甲醛 |
通过唾液中的VOC标志物诊断是否感染幽门螺旋杆菌的应用，当检测到唾液中下列VOC的峰面积百分比：丙酮大于3.2％，2-戊酮大于0.5％，1-丁醇大于0.16％，2-甲基-1-丁醇大于0.13％，吡咯大于0.05％，对甲基苯甲醛大于0.6％，条件中的至少三项满足条件，则诊断被试者感染幽门螺旋杆菌；当检测到唾液中下列VOC的峰面积百分比：丙酮大于3.2％，2-戊酮大于0.5％，1-丁醇大于0.16％，2-甲基-1-丁醇大于0.13％，吡咯大于0.05％，对甲基苯甲醛大于0.6％，条件中的至少三项满足条件，则诊断被试者感染幽门螺旋杆菌；
实施例4
唾液中的VOC标志物诊断是否感染幽门螺旋杆菌的验证
如实施例1-3所述采集并检测10名确诊的幽门螺旋杆菌阳性志愿者和10名幽门螺旋杆菌阴性志愿者的唾液样本，得到20份样本中VOC含量信息。依据唾液中VOC的峰面积百分比：丙酮大于3.2％，2-戊酮大于0.5％，1-丁醇大于0.16％，2-甲基-1-丁醇大于0.13％，吡咯大于0.05％，对甲基苯甲醛大于0.6％，条件中的至少三项满足条件，判定11份样本符合幽门螺旋杆菌阳性筛查指标；进而依据条件：丙酮大于3.2％，2-戊酮大于0.5％，1-丁醇大于0.16％，2-甲基-1-丁醇大于0.13％，吡咯大于0.05％，对甲基苯甲醛大于0.6％，条件中的至少三项满足条件进行辅助筛查，结果发现10份样本符合幽门螺旋杆菌阳性筛查指标，因此通过检测唾液中特定的VOC标志物组合的含量百分比可以快速准确地进行幽门螺旋杆菌地筛查。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种用于检测幽门螺旋杆菌感染标志物的检测系统，其特征在于，该检测系统包括唾液收集装置、顶空进样装置、固相微萃取装置和气相色谱-质谱仪，所述唾液收集装置收集到的唾液样本经过顶空进样装置进样、固相微萃取装置浓缩后递送至气相色谱-质谱仪检测幽门螺旋杆菌标志物的含量；
所述标志物包括丙酮、2-甲基-2-丙醇、乙醇、2-戊酮、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、2-戊醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、乙偶姻、吡咯、对甲基苯甲醛；
当检测到唾液中下列VOC的峰面积百分比：丙酮大于3.2%，2-戊酮大于0.5%，1-丁醇大于0.16%，2-甲基-1-丁醇大于0.13%，吡咯大于0.05%，对甲基苯甲醛大于0.6%，条件中的至少三项满足条件时，确定被试者感染幽门螺旋杆菌；
当检测到唾液中下列VOC的峰面积百分比：2-甲基-2-丙醇大于1%，乙醇大于0.2%，1-丙醇大于0.11%，2-甲基-1-丙醇大于0.08%，2-戊醇大于0.15%，乙偶姻大于0.45%，至少有两项满足条件时，辅助诊断为被试者感染幽门螺旋杆菌。
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