KR102630689B1

KR102630689B1 - 호기 및 에어로졸 분석을 이용한 호흡기 질환 진단

Info

Publication number: KR102630689B1
Application number: KR1020227035599A
Authority: KR
Inventors: 다펭 첸; 웨인 에이 브라이든; 마이클 맥러린
Original assignee: 제테오 테크, 인코포레이티드
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2024-01-29
Also published as: ZA202400813B; EP4125569A4; JP2023528725A; US11839463B2; KR20230005825A; JP2024116220A; EP4125569A1; WO2021201905A1; JP7504499B2; US20230157573A1; KR20240013274A

Abstract

COVID-19와 같은 호흡기 질환을 포함한 여러 질병에 대한 신속하고 저렴한 현장 진단을 가능하게 하는 다양한 진단 도구를 사용하여 호기 및 기타 에어로졸 중의 비휘발성 유기물을 분석하는 방법 및 장치가 개시된다. 상기 개시된 방법 및 시스템은 호기 중의 비휘발성 유기물 및 충전층 컬럼 중의 기타 에어로졸을 선택적으로 포착한다. 상기 비휘발성 유기물을 용리하고 MALDI-TOFMS를 포함한 진단 장치를 사용하여 샘플을 분석한다. 상기 개시된 시스템 및 방법은 약 20분 이내에 진단 테스트 결과를 제공하고 최소한의 인간 개입으로 자율 작동을 제공한다.

Description

호기 및 에어로졸 분석을 이용한 호흡기 질환 진단

본 출원은 미국 가출원 제63/005179호(2020.04.03 출원) "호기를 이용한 호흡기 질환 진단"과 미국 가출원 제63/010029호(2020.04.14 출원) "호기를 이용한 호흡기 질환 진단" 및 미국 가출원 제63/069029호(2020.08.22 출원) "호기 및 에어로졸 분석을 이용한 호흡기 질환 진단"과 관련되고 이의 혜택을 주장하며, 이들 전체가 참고로서 여기에 포함된다.

본 개시내용은 호흡기 질환에 대해 신속하고 저비용이며 자율적인 현장 진료 분석이 가능하도록 다양한 진단 도구를 사용하여 호기 및 기타 에어로졸 내의 비휘발성 유기물을 분석하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 그러나 이에 제한되는 것은 아니지만, 본 발명은 MALDI-TOFMS를 포함하는 질량 분석기를 사용하여 COVID-19 및 결핵 진단과 같은 호흡기 질환을 검출하기 위해 호기 및 기타 비휘발성 유기물을 분석하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.

코로나바이러스 질병(COVID-19)은 새로 출현한 코로나바이러스 SARS-CoV-2에 의해 유발되는 질병이다. 이 신종 코로나바이러스는 호흡기 바이러스로서 감염자가 기침이나 재채기를 할 때 발생하는 비말이나 침이나 코 분비물의 비말을 통해 주로 전파된다. 새로운 상기 코로나바이러스는 전염성이 매우 강하며 이 바이러스가 인플루엔자보다 더 빠르게 확산되고 있음을 시사하는 계속 진행중인 COVID-19 대유행을 일으켰다. 경감을 지원하기 위해서는 신속한 검출 도구가 필요하다.

또한, 결핵(tuberculosis: TB)은 매일 4000명 이상이 사망하는 글로벌한 살인자로서 HIV/AIDS를 능가했다(Benjamin Patterson, Carl Morrow, Vinayak Singh, Atica Moosa, Melitta Gqada, Jeremy Woodward, Valerie Mizrahi, Wayne Bryden, Charles Call, Shwetak Patel, Digby Warner, Robin Wood, "Detection of Mycobacterium tuberculosis bacilli in bio-aerosols from untreated TB patients," Gates Open Research 2018, 1:11). 발병률 감소율은 보고된 연간 1.5%로 여전히 불충분하며 치료만으로는 질병의 부담을 상당히 줄일 수 있을 것 같지는 않다. HIV가 널리 퍼진 지역사회에 있어서, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis: Mtb) 유전자형 연구에 따르면, 재활성화보다는 최근 전파가 TB 발병 사례의 대부분(54%)을 차지한다. TB 전파의 물리적 과정은 아직 제대로 이해되지 않고 있고 감염성 에어로졸 생성, 방출 및 흡입에서의 주요 이벤트들을 설명하기 위한 신기술의 적용은 느리다. 공기 중 감염성 입자를 특성화하기 위한 경험적 연구는 드물다. 조사를 괴롭히는 2가지 주요 어려움은 자연적으로 생성된 Mtb 입자의 낮다고 알려진 농도와 공기 중 검체의 환경 및 환자 유래 박테리아와 곰팡이 오염의 합병증이다. 그럼에도, 공기 중 검출에 대한 많은 시도가 있어 왔다. 우간다에서의 2004년 개념 입증 연구와 후속 타당성 연구에서는 TB 환자로부터 기침으로 생성된 에어로졸을 샘플링했다. 2개의 자립형 캐스케이드 임팩터(viable cascade impactor)가 장착된 샘플링 챔버 내로 직접 기침을 하면 1~6일간의 화학 요법을 받았음에도 불구하고 참가자의 4분의 1 이상이 양성 배양 결과로 나왔다. 동일 장치를 사용한 후속 작업에서는 에어로졸 세균 부하가 더 높은 참가자가 더 높은 가정 전파율과 질병 발견의 발전과 연결될 수 있음이 발견되었고, 이는 정량적 공기 중 샘플링이 감염성의 임상 관련 척도로서 기능할 수 있음을 시사한다. 따라서, 전파의 중단은 TB 발병률에 빠르고 측정 가능한 영향을 미칠 것이다.

결핵의 전염을 통제하는 가장 좋은 방법은 능동적 TB 사례(active TB case)를 즉시 식별하고 치료하는 것이다(Rachel C. Wood, Angelique K. Luabeya, Kris M. Weigel, Alicia K. Wilbur, Lisa Jones-Engel, Mark Hatherill, and Gerard A. Cangelosi, "Detection of Mycobacterium tuberculosis DNA on the oral mucosa of tuberculosis patients," Sci. Rep. 5, 8668 (2015)). 폐결핵의 진단은 보통 환자 가래의 미생물학적, 현미경적 또는 분자적 분석에 의해 수행된다. 대부분의 개발도상국에서 TB 감염에 대한 "최적 표준(gold standard)" 테스트는 가래 검체를 기반으로 한 도말 배양이다. 상기 검체를 배양 플레이트에 문지르고 Mtb에 특이적 염색을 부가하여 상기 염색된 세포를 현미경을 사용하여 카운트한다. 만일 상기 도말에서 세포들의 농도가 설정된 임계값보다 크면, 상기 검체는 양성으로 분류된다. 만일 상기 TB 수가 이러한 임계값 미만이면, 음성으로 분류된다. 진단에는 수 시간이 소요될 수 있다. 진단 검체로서 가래의 필요성은 환자로부터 수집하는 어려움과 복잡한 조성으로 인해 하나의 제한 요소이다. 상기 재료의 점도는 테스트 감도를 제한하고 검체들 간 이질성을 증가시키며, 테스트와 관련된 비용과 노동력을 증가시킨다. 또한, 가래 생성(기침이 필요함)은 의료 종사자에게는 하나의 직업 재해이다. 가래는 검체 배지로서 몇 가지 단점이 있다. 첫째, 환자의 약 50%만이 양호한 가래 검체를 제공할 수 있다. 예컨대, 약 8세 미만의 어린이는 요청시 검체를 생산할 수 없는 경우가 종종 있다. 이는 일반적으로 목구멍 깊은 곳에서 가래를 "기침해내는" 능력이 발달하지 않았기 때문이다. 노인과 병자는 가래를 뱉어낼 힘이 없을 수 있다. 기타 사람들은 단순히 목에 가래가 없을 수 있다. 따라서, 객담(가래) 분석에 기반한 진단 방법은 진단이 필요한 환자의 50% 정도에서 진단을 제공하지 못할 수 있다. 또한, 가래는 더 이상 폐 깊숙한 곳의 질병 상태를 나타내지 않기 때문에 사람이 항생제 치료를 받은 후 1~2일 후에 채취하는 경우에는 진단용 검체로서 유용하지 않고, 치료 개시 후 수일 이내에 가래 내의 살아있는 Mtb의 수가 크게 감소한다. 소변과 혈액이 TB 감염의 진단을 위한 검체 배지로 제안된 바 있다. 혈액은 매우 침습적이며 세계의 일부 지역에서 많은 TB 환자들이 HIV 동시 감염을 갖고 있기 때문에 종종 HIV 양성인 혈액 샘플을 처리하는 데 더 높은 비용이 수반된다. 또한, 능동적 TB 감염 환자는 혈액 내에 순환하는 TB 세포가 많지 않을 수 있다. 소변 기반의 진단 또한 제안된 바 있지만, 이들 검사는 살아있는 TB 간균(bacilli) 이외의 질병의 바이오마커(biomarker)를 찾는 것이고 광범위한 임상 사용에 대해 검증된 것은 아무것도 없다.

검체가 채취 및 취급이 더 쉽고 안전하며 균일하면, TB 진단이 단순화될 것이다. 호기(exhaled breath)에는 에어로졸(aerosols: "EBA")과 증기가 포함되어 있어 이들을 비침습적으로 채취하고 특성을 분석하여 폐 내의 생리학적 및 병리학적 과정을 설명할 수 있다(Hunt, J., "Exhaled breath condensate: An evolving tool for noninvasive evaluation of lung disease," J. Allergy Clin. Immunol. 2002; 110:28-34). 분석용의 상기 호기를 포착(capture)하기 위해, 호기된 공기는 응축 장치를 통과하여 호기 응축물(exhaled breath condensate: "EBC")이라고 하는 유체 축적물을 생성한다. 주로 수증기에서 유래하지만, EBC는 사이토카인, 지질, 계면활성제, 이온, 산화 생성물, 아데노신, 히스타민, 아세틸콜린 및 세로토닌을 포함한 비휘발성 화합물 내에 용해되었다. 또한, EBC는 암모니아, 과산화수소, 에탄올 및 기타 휘발성 유기 화합물을 포함한 잠재적으로 휘발성인 수용성 화합물을 포착한다. EBC는 pH를 쉽게 측정할 수 있다. EBC는 에어로졸화된 기도 내막액과 폐 내에서 진행 중인 생화학적 및 염증성 활동의 비침습적 징후를 제공하는 휘발성 화합물을 포함한다. EBC에 대한 관심의 급속한 증가는 폐질환에서 EBC가 감염된 개인과 건강한 개인을 구별하는 데 사용할 수 있는 측정 가능한 특성을 갖는다는 인식에서 비롯되었다. 이들 분석은 급성 및 만성 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 성인 호흡곤란 증후군, 직업병, 및 낭포성 섬유증에서 기도 및 폐 산화환원 편차(lung redox deviation), 산-염기 상태, 염증의 정도 및 유형에 대한 증거를 제공해왔다. 불확실하고 다양한 희석도를 특징으로 하는 EBC는 고유한 기도 내막액 내의 개별 용질 농도에 대한 정확한 평가는 제공하지 않을 수 있다. 그러나, 농도가 건강과 질병 간에 크게 다르거나 검체 내에서 발견되는 용질의 비율을 기반으로 하는 경우에는 유용한 정보를 제공할 수 있다.

Patterson 등(2018)은 환자 유도 호기 에어로졸 샘플링을 최적화하고 단일 환자로부터 호흡 가능한 에어로졸을 분리 및 축적하도록 설계된 새로운 장치인 맞춤형 호흡 에어로졸 샘플링 챔버(respiratory aerosol sampling chamber: RASC)를 사용했다(Benjamin Patterson, Carl Morrow, Vinayak Singh, Atica Moosa, Melitta Gqada, Jeremy Woodward, Valerie Mizrahi, Wayne Bryden, Charles Call, Shwetak Patel, Digby Warner, Robin Wood, "Detection of Mycobacterium tuberculosis bacilli in bio-aerosols from untreated TB patients," Gates Open Research 2018, 1:11). 환경 샘플링은 챔버 대기에서 일정 기간 에이징 후 존재하는 Mtb를 검출한다. 신규 진단된 35명의 GeneXpert(Cepheid, Inc., Sunnyvale, CA) 객담 양성 환자들이 약 1.4m³의 부피를 갖는 RASC 챔버 내에 1시간 격리되는 동안 모니터링되었다. 상기 GeneXpert 유전자 분석은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 기반으로 하며 TB 진단을 위한 검체를 분석하고 TB 검체 내에 약물 내성 유전자가 있는지 여부를 나타내는 데 사용할 수 있다. TB에 대한 상기 GeneXpert PCR 분석은 가래 샘플을 받아 약 1시간 내에 양성 또는 음성 결과를 제공할 수 있다. 상기 챔버에는 공기역학적 입자 크기 검출, 자립형(viable) 및 비자립형(non-viable) 샘플링 장치, 실시간 CO₂ 모니터링 및 기침 소리 녹음이 통합되었다. 미생물 배양 및 ddPCR(droplet digital polymerase chain reaction: 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응)을 사용하여 각 바이오 에어로졸 수집 장치에서 Mtb를 검출했다. Mtb는 77%의 에어로졸 검체들에서 검출되었고 42%의 검체들은 미코박테리아 배양에서 양성이었고 92%는 ddPCR에서 양성이었다. 기침률과 배양 가능한 바이오 에어로졸 간에는 상관관계가 발견되었다. Mtb는 모든 자립형 캐스케이드 임팩터 단계들에서 에어로졸 크기 2.0~3.5 ㎛에서 피크를 갖는 것으로 검출되었다. 이는 에어로졸 배양 양성에 대한 호기 공기의 0.09 CFU/리터의 중앙값(median)과 호기 미립자 바이오 에어로졸의 4.5×10⁷ CFU/㎖의 추정 중앙값 농도를 시사한다. Mtb는 상기 RASC 챔버를 사용하여 치료를 받지 않은 대부분의 TB 환자가 호기한 바이오 에어로졸 내에서 검출되었다. 분자 검출은 고체 배지 상의 Mtb 배양보다 더 민감한 것으로 밝혀졌다.

Mtb는 배양, ddPCR, 전자 현미경, 면역분석 및 세포 염색(예컨대, oramine 및 dmnTre)에 의해 EBA에서 식별될 수 있다. 이들 중에서, PCR 및 면역분석은 종 수준에 대해 신속하고 특이적일 가능성을 갖는다. PCR 및 기타 게놈 기반 기술은 균주 수준에 따라 다를 수 있다. 질량 분석법은 또한 박테리아 감염에서 얻은 배양물의 균주 수준에 특이적인 것으로 나타났다. 예를 들어, Bruker Daltonics(독일)의 Biotyper는 인간에게 감염을 일으키는 최대 15000종의 박테리아를 식별할 수 있는 것으로 나타났다. 이들 기술은 EBA로부터 TB 감염을 식별할 수 있는 것으로 나타났다. 리포아라비노만난(lipoarabinomannan)에 기반한 것과 같은 Mtb 검출을 위한 면역분석법도 잘 알려져있다.

결핵(TB)의 경우, TB 감염자는 개인이 진료소에 내원할 때 수동적 사례 발견을 통해 진단되는 경우가 많다. 능동적 환자 발견 방식(active case finding: "ACF")은 일반적으로 일차 의료 시스템 외부에서 TB 감염이 의심되는 사람들에게 연락하는 다른 방법을 포함하는 것으로 고려된다. WHO에 따르면, ACF는 "신속하게 적용할 수 있는 테스트, 시험 또는 기타 절차를 사용하여 능동적 TB가 의심되는 사람을 체계적으로 식별하는 것"이다. ACF의 목표는 감염된 사람들을 조기에 치료하여 평균 감염 기간을 줄임으로써 질병의 확산을 감소시키는 것이다. TB의 경우, 개인이 도움을 받기 위해 진료소에 갈 때쯤에는, 그 사람은 약 10명 내지 약 115명의 다른 사람들에게 TB 감염을 전파했었을 수 있다. ACF는 심각한 TB 전파를 줄이거나 예방하는 데 도움이 될 수 있다. 객담(가래) 분석 및 혈액 분석과 같은 진단 시스템과 방법은 자동화되지도 않았고 자율적으로 운영되지도 않으며 신속하지도 않다. 많은 사람들이 각 분석에 소모되는 값비싼 분석법을 사용하므로, 특히 개발도상국 및 저개발 국가에서는 상기 능동적 환자 발견 방식을 위한 일반적인 유틸리티가 없다. 앞서 기술했듯이, EBA 분석은 값비싼 분석 및 소모품의 필요성이 제거되었기 때문에 신속한 분석과 휴대성 및 저렴한 비용을 제공하는 TB 검출용의 강력한 진단 도구로 보인다. McDevitt 등(2013)은 인플루엔자 진단을 위한 EBA 분석 장치 및 방법을 보고했다(James J. McDevitt, Petros Koutrakis, Stephen T. Ferguson, Jack M. Wolfson, M. Patricia Fabian, Marco Martins, Jovan Pantelic, and Donald K. Milton, "Development and Performance Evaluation of an Exhaled-Breath Bioaerosol Collector for Influenza Virus," Aerosol Sci. Technol. 2013 January 1; 47(4): 444-451). 임팩터(impactor)는 호기에서 큰 입자(＞4㎛)를 제거하는 데 사용되며, 그 다음에는 더 작은 입자(＜4㎛)에 대한 습식 막 수집기(wetted-film collector)가 사용된다. 수집된 입자들의 두 가지 사이즈 빈(bin)은 게놈 기반 방법인 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction: rt-PCR)을 사용하여 인플루엔자 바이러스에 대해 분석되었다. PCR 기술은 효소를 포함한 다른 생체 분자와 결합된 생체 분자 프로브를 사용하여 DNA의 특정 서열이 검체에 존재하는 경우 상기 특정 서열을 증폭한다. 표적 서열은 확인되는 질병에 특이적인 것으로 여겨진다. McDevitt 등은 EBA 검체가 인플루엔자 진단에 사용될 수 있음을 보여주었다(James J. McDevitt, Petros Koutrakis, Stephen T. Ferguson, Jack M. Wolfson, M. Patricia Fabian, Marco Martins, Jovan Pantelic, and Donald K. Milton, "Development and Performance Evaluation of an Exhaled-Breath Bioaerosol Collector for Influenza Virus," Aerosol Sci. Technol. 2013 January 1; 47(4): 444-451). 상기 개시된 장치 및 방법은 실용적인 관점에서는 몇 가지 단점이 있다. 첫째, 호흡 에어로졸 검체(샘플)는 부피가 수 밀리리터인 개별 샘플로 수집되므로, 상기 샘플을 농축하는 데 상당한 노력이 필요하다. 또한, 진단 장치가 샘플 수집기에 연결되거나 통합되지 않으며 ACF 도구로 잘 사용할 수 없다. TB 분석용의 자율적 진단 도구를 만들기 위해 RNA 분석을 자동화하는 기능은 명확하지 않다. 특정 환자에 의한 충분한 양의 기침이나 호흡 에어로졸이 발생했는지 여부를 확인하는 방법은 설명되어있지 않다. 그 결과, 만일 검체가 인플루엔자에 대해 음성으로 밝혀지는 경우, 이는 부적절한 검체 수집으로 인한 위음성 때문일 수 있다. 다양한 호흡 기동 도중에 생성되는 에어로졸화된 폐액의 양과 관련하여 인간들 간에 큰 변동성이 있다는 점이 잘 알려져 있다.

GeneXpert Ultra는 PCR 기술을 사용하는 첨단 게놈학 기반의 현장 진료 진단 장치이다. 결핵(TB) 및 기타 호흡기 질환의 ACF를 수행하도록 EBA 샘플 수집 방법과 통합될 수 있지만 상기 샘플 수집 시간이 너무 길어 실용적이지 않다. Patterson 등은 20 내지 200 TB의 간균이 일반적으로 EBA에서 생산되며 1시간의 샘플링 기간에 걸쳐 수집될 수 있음을 보여주었다(Benjamin Patterson, Carl Morrow, Vinayak Singh, Atica Moosa, Melitta Gqada, Jeremy Woodward, Valerie Mizrahi, Wayne Bryden, Charles Call, Shwetak Patel, Digby Warner, Robin Wood, "Detection of Mycobacterium tuberculosis bacilli in bio-aerosols from untreated TB patients," Gates Open Research 2018, 1:11). 상기 GeneXpert Ultra를 진단 분석으로 사용하려면 최소 1시간의 샘플링이 필요하다. 상기 GeneXpert는 공기 중 병원체에 대한 공기 샘플을 분석하기 위해 공기를 샘플링하는 시스템과 통합될 수 있다. 상기 BDS 시스템(Northup Grumman, Edgewood, MD)은 우편물이 유통 센터를 통과할 때 탄저병을 유발하는 박테리아 포자에 대해 US Postal Service 우편물을 검사하는 데 사용된다. 습식 벽 사이클론(wetted-wall cyclone)을 GeneXpert PCR 시스템에 결합하여 자동으로 공기를 샘플링하고 병원체 존재 여부를 보고한다. 그러나, 상기 GeneXpert Ultra 분석은 테스트당 비용이 상대적으로 높으며 분석을 완료하고 결과를 제공하는 데 약 1시간이 걸린다. 일반적으로, PCR 기반 진단은 샘플링 및 분석에 필요한 시간이 길고 테스트당 비용이 상대적으로 높아 ACF 적용을 위한 TB 스크리닝에는 적합하지 않다.

진단 분석에 연관된 시간은 현장 테스트 또는 "현장 진료" 테스트의 중요한 매개변수이다. ACF는 정의에 따라 의료 시스템 외부에서 발생하기 때문에 현장 진단 분석의 한 예이다. 미국에서 현장 진료 테스트는 20분 이내에 답을 제공해야 한다. 그렇지 않으면, 테스트가 너무 느리고 짧은 환자 대기 시간을 달성하기에는 적합하지 않은 것으로 간주된다. 개발 도상국, 특히 TB 유병률이 있는 국가에서는, 상기 GeneXpert를 사용하여 약 1시간 내에 진단을 제공할 수 있다. 전술한 대로, 이 분석은 "테스트당 비용" 기준으로 구현에 비용이 많이 들기 때문에 아직 널리 배포되지는 않았다. 높은 비용으로 인해, 건강해 보이지만(무증상) TB 감염 가능성이 있는 환자를 선별하는 데 사용되지는 않고, 그보다는 차라리 다른 검사나 요인에 의해 강력하게 의심되는 진단을 확인하는 데 사용된다.

Fennelly 등(2004)은 기침 에어로졸과, 능동적인 환자(active patient)를 갖는 것으로 알려진 개인들을 이용하는 2개의 Anderson 캐스케이드 임팩터가 수용된 수집 챔버를 사용한 TB 분석을 기술하였다(Fennelly K.P., Martyny J.W., Fulton K.E., Orme I.M., Cave D.M., et al. (2004) Cough-generated aerosols of Mycobacterium tuberculosis: a new method to study infectiousness. Am J Respir Crit Care Med 169: 604-609). 개인들은 5분 동안 2번의 강렬한 기침을 하도록 요구되었다. 임팩트 받은 샘플을 배양하는 데는 30~60일이 걸렸으므로, 이러한 접근 방식은 자동화에 부합하지는 않는다. 임상 샘플로서 EBA의 어려운 측면은 호흡에서 수집할 수 있는 호기 미립자의 부피가 상대적으로 작은 샘플이다. 또한, 상기 수집된 질량의 상당 부분은 물이다. 진단 정보를 포함하는 분자("바이오마커(biomarker)")는 나노리터 또는 피코그램의 양으로 존재한다. 결과적으로, 상기 에어로졸 수집 방법은 호기(exhaled breath)에서 바이오매스(biomass)의 많은 부분을 포착하는 데 효과적이어야 한다. 호기에는 들숨, 심호흡, 기침, 재채기를 포함한 여러 동작을 통해 폐에서 내쉬는 공기가 포함된다. 강제 폐활량(forced vital capacity: FVC)과 같은 특정 유형의 심호흡 기동은 호기의 량을 최대화하기 위해 가능한 한 많이 숨을 들이쉬고 최대한 멀리(또는 깊게) 내쉼으로써 폐활량의 최대 부피를 측정하는 데 사용할 수 있다. 강제 호기량(forced expiratory volume: FEV)은 강제 호흡 중에 한 사람이 얼마나 많이 내쉴 수 있는지를 측정한다. 호기된 공기의 양은 상기 강제 호흡의 제1초(FEV1), 제2초(FEV2) 및/또는 제3초(FEV3) 동안 측정될 수 있다. 강제 폐활량(forced vital capacity: FVC)은 FEV 테스트 동안 내쉬는 총 공기량이다. 강제 호기량 및 강제 폐활량은 폐활량 측정 중에 측정되는 폐 기능 테스트이다. 강제 호기량은 폐 기능의 중요한 측정값이다.

호흡 에어로졸과 호흡 응축물로 호흡기 질환을 검출할 수 있다는 연구 결과가 있지만, 결핵, 인플루엔자, 폐렴과 같은 감염 또는 질병에 대한 현대 임상 검사는 가래, 혈액 또는 비강 면봉을 계속 사용한다. 호기 분석 도구는 호기 내에 존재하는 미량의 분석 물질을 효율적으로 수집 및 농축하는 방법과 장치가 부족하여 상용화되지 않았다. 또한, 특정 진단을 위해 호기가 얼마나 충분한지를 평가하는 표준이나 방법론이 없다. 개시된 예시적 장치 및 방법은 호기 에어로졸 및 호흡 응축물을 고유속 및 고효율로 그리고 비교적 농축된 샘플로 수집함으로써 이러한 한계를 극복한다. 또한, 에어로졸의 크기 분류를 통합하여 분석 물질을 수집하기 이전에 특정 분석 물질에 대한 신호 대 잡음비를 증가시킬 수 있다. 그 다음, 상기 농축된 샘플은 여러 방법으로 분석할 수 있지만, 관심 분석 물질에 민감하고 신속하며 매우 특이적인 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 분석은 신속하고 실시간에 가까운 것이 보다 바람직하다. 질량분석기, 실시간 PCR 및 면역분석은 민감하고 특이적이고 거의 실시간에 가까운 잠재력을 지닌다.

신속 및 민감하고 특이적이고 바람직하게는 테스트당 저렴한 비용을 특징으로 하는 진단 분석을 제공하기 위해서는, 객담 분석보다 더 빠르고 더 신뢰성이 있고 혈액 분석보다 덜 침습적인 질량 분석법(mass spectrometry: "MS")과 같은 빠른 진단 도구와 결합될 수 있는 샘플 수집 방법이 필요하다. 이러한 시스템은 TB 및 기타 폐 또는 호흡기 질환의 능동적 환자 발견 방식(ACF)에 사용될 수 있다. ACF용 시스템이 효과적이려면, "진단당" 기준으로 신속 및 저렴해야 한다. 낮은 검사당 비용은 실제로 TB 감염된 소수를 검색하도록 TB 전파를 사전에 방지하기 위해 다수의 개인을 선별하기 위한 요구 사항이다. "일반 감기"에 감염되었을 가능성이 있는 환자는 리노바이러스(rhinovirus)에 감염되었을 수 있기 때문에, 인플루엔자 및 기타 병원성 바이러스의 현장 진단을 위해서는 저렴한 장치 및 방법 또한 필요하다. 일부 경우, 상기 호흡기 감염이 박테리아나 곰팡이 미생물에 의해 유발되고 항생제로 치료할 수 있다. 다른 경우에는 상기 미생물이 항생제에 내성을 가질 수 있어 항생제에 대한 미생물 내성을 확인할 수 있는 진단 방법이 바람직하다. 기도의 바이러스 감염과 세균 감염 간을 구별하기 위한 신속한 EBA 방법이 요구되면서도, 불충분한 샘플 볼륨으로 인한 위음성의 발생을 최소화해야 한다. 질량분석법, PCR을 포함한 게놈학 방법 및 면역분석법이 민감하고 특이적일 가능성이 가장 높다. 질량 분석기, 특히 MALDI 비행시간 질량 분석기(MALDI time-of-flight mass spectrometry: MALDI-TOFMS)는 민감하고 특이적이며 근 실시간(near real-time)임이 입증되었으므로 EBA 및 EBC 샘플 분석에 선호되는 진단 도구이다.

호기(exhaled breath)를 사용하여 호흡기 질환 진단을 위한 호흡 샘플 수집 시스템이 개시되며, 상기 호흡 샘플 수집 시스템은, 물, 휘발성 유기 성분(VOC) 및 비휘발성 유기 성분을 포함하는 호기를 수집하기 위해 개인의 얼굴을 수용하도록 구성된 호흡 수집 요소(breath collection element)와, 상기 비휘발성 유기 성분을 선택적으로 포착하고 상기 호흡 수집 요소에 제거 가능하고 유동적으로 연결되는 충전층 컬럼(packed bed column)을 포함하는 샘플 포착 요소(sample capture element)와, 상기 샘플 포착 요소와 유체 연통하고 호기를 상기 샘플 포착 요소 내로 끌어들이도록 구성된 펌프를 포함한다. 호기 중의 상기 비휘발성 성분은 상기 호흡기 질환의 특징인, 미생물(microbes), 바이러스(virus), 대사산물 바이오마커(metabolite biomarkers), 지질 바이오마커(lipid biomarkers), 및 단백질체 바이오마커(proteomic biomarkers) 중 적어도 하나를 포함하는 호흡 에어로졸 입자를 포함할 수 있다. 상기 개시된 시스템은, 상기 호흡 수집 요소와 상기 샘플 포착 요소 사이에 배치된 흐름 분할기(flow splitter)를 더 포함하여 호기의 흐름을 분할하여 상기 흐름의 첫 번째 부분이 상기 샘플 포착 요소로 향하고 흐름의 두 번째 부분이 HEPA 필터로 향하게 된다. 상기 시스템은 상기 샘플 포착 요소의 하류측에 배치되고 상기 샘플 포착 요소에서 상기 펌프를 향해 나가는 흐름 아래에서 개방 위치로 배치되고 그렇지 않으면 폐쇄 위치로 배치되는 일방향 밸브를 더 포함할 수 있다. 상기 시스템은, 호흡 응축물(breath condensate)의 대형 입자가 충전된 상기 샘플 포착 요소에 도달하는 것으로부터 가두는 대형 입자 트랩(제1트랩)을 더 포함할 수 있다. 상기 대형 입자 트랩에서의 상기 대형 입자의 크기는 적어도 약 10 마이크론일 수 있다. 상기 충전층 컬럼은, 수지, 셀룰로오스, 실리카, 아가로스 및 수화 Fe₃O₄ 나노입자 중 적어도 하나를 포함하는 고체 입자를 포함할 수 있다. 상기 충전층 컬럼은 표면상에 옥타데실 아크릴레이트(octadecyl acrylate, C18) 작용기를 갖는 수지 비드를 포함할 수 있다. 상기 수지 비드는 약 12㎛ 내지 약 20㎛의 공칭 직경을 가질 수 있다. 상기 수지 비드는 2개의 다공성 폴리머 프릿 디스크 사이에 충전(packing)될 수 있다. 상기 충전층 컬럼의 입구 말단에 배치된 상기 폴리머 프릿 디스크는 평균 기공 크기가 35㎛ 이상임을 특징으로 할 수 있다. 상기 충전층 컬럼의 출구단에 배치된 상기 폴리머 프릿 디스크는 평균 기공 크기가 약 10㎛임을 특징으로 할 수 있다. 상기 충전층(packed bed)의 무게는 약 25㎎일 수 있다. 상기 펌프는 격막(diaphragm) 펌프일 수 있다. 상기 펌프의 공칭 유량(인출 속도(pull rate))는 약 200㎖/분 내지 약 600㎖/분일 수 있다. 상기 호흡 추출 요소는 CPR 구조 마스크, CPAP 마스크, 인공호흡기(ventilator) 마스크 및 분무기 마우스피스 중의 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 시스템은 상기 샘플 포착 요소와 상기 펌프 사이에 배치되고 상기 충전층을 통과하는 수증기, 휘발성 유기 성분 및 비휘발성 유기 성분 중 적어도 하나를 포함하는 호기 응축물(exhaled breath condensate: EBC)를 가두도록 구성된 제2트랩을 더 포함할 수 있다. 상기 제2트랩은 주변 온도 미만으로 냉각될 수 있다. 상기 고체 입자는 상기 고체 입자의 표면에 고정화된(immobilized) 작용기를 포함하고, 상기 작용기는, C18(옥타데실)(C18(octadecyl)), 옥틸(octyl), 에틸(ethyl), 시클로헥실(cyclohexyl), 페닐(phenyl), 시아노프로필(cyanopropyl), 아미노프로필(aminopropyl), 2,3-디히드록시프로폭시프로필(2,3-dihydroxypropoxypropyl), 트리메틸-아미노프로필(trimethyl-aminopropyl), 카르복시프로필(carboxypropyl), 벤젠설폰산(benzenesulfonic acid), 프로필설폰산(propylsulfonic acid), 이온 교환 상(ion exchange phase), 폴리머 상(polymer phase), 항체, 글리칸(glycan), 지질(lipid), DNA 및 RNA 중의 하나 이상을 포함한다. 상기 이온 교환 상은 디에틸아미노에틸 셀룰로오스(diethylaminoethyl cellulose), QAE 세파덱스(QAE Sephadex), Q 세파로스(Q sepharose), 및 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 폴리머 상은 폴리스티렌-co-1,4-디비닐벤젠(polystyrene-co-1,4-divinylbenzene), 메타크릴레이트(methacrylates), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 전분(starch) 및 아가로스(agarose) 중 적어도 하나를 포함한다. 상기 항체는 항-인간 알부민(anti-human albumin), 항-인플루엔자 A 바이러스 NP(anti-Influenza A virus NP) 및 항-SARS-CoV-2 바이러스(Anti-SARS-CoV-2 virus) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 항체는 단백질 A/G 아가로스 비드(protein A/G agarose beads)에 고정될 수 있다. 상기 포착 요소는 주변 온도 이하의 온도로 냉각될 수 있다. 상기 호흡 샘플 수집 시스템은 호기를 가습하고 상기 충전층 컬럼 내의 습도를 증가시키기 위해 상기 포착 요소에 대한 입구의 상류측에 배치된 가습기를 더 포함할 수 있다.

호기를 사용하여 호흡기 질환을 진단하기 위한 호흡 샘플 수집 시스템이 개시되고, 상기 시스템은, 물, 휘발성 유기 성분(VOC) 및 비휘발성 유기 성분을 포함하는 호기를 수집하기 위해 개인의 얼굴을 수용하도록 구성된 호흡 수집 요소와, 하나 이상의 샘플 포착 요소로서 상기 호흡 샘플 수집 시스템이 하나 초과의 샘플 포착 요소를 포함할 때 서로 평행하게 배치되며 각 포착 요소는 상기 비휘발성 유기 성분을 선택적으로 포착하고 상기 호흡 수집 요소에 제거 가능하고 유동적으로 연결되는 충전층 컬럼을 포함하는 하나 이상의 샘플 포착 요소와, 하나 이상의 샘플 포착 요소와 유체 연통하고 호기를 상기 하나 이상의 샘플 포착 요소 내로 끌어들이도록 구성된 하나 이상의 펌프를 포함한다. 상기 하나 이상의 펌프의 공칭 유량은 약 2.5리터/분일 수 있다. 일 측면에서, 여러 샘플 캡처 요소가 서로 평행하게 배치될 때 이러한 캡처 요소 각각은 그의 자체 펌프에 유동적으로 연결된다.

호흡 중의 비휘발성 유기 성분을 선택적으로 포착하기 위한 충전층 컬럼을 포함하는 호기를 이용한 호흡기 질환 진단을 위한 샘플 포착 요소가 개시되고, 상기 충전층 컬럼은, 수지, 셀룰로오스, 실리카, 아가로스 및 수화 Fe₃O₄ 나노입자 중의 하나 이상을 포함하는 고체 입자와, 상기 고체 입자 표면상에 고정화되고, C18(옥타데실), 옥틸, 에틸, 시클로헥실, 페닐, 시아노프로필, 아미노프로필, 2,3-디히드록시프로폭시프로필, 트리메틸-아미노프로필, 카르복시프로필, 벤젠술폰산, 프로필설폰산, 이온 교환 상, 폴리머 상, 항체, 글리칸, 지질, DNA 및 RNA 중의 하나 이상을 포함하는 작용기를 포함한다. 상기 고체 입자는 약 12㎛ 내지 약 20㎛의 공칭 직경을 가질 수 있다. 상기 고체 입자는 2개의 다공성 고분자 프릿 디스크 사이에 충전될 수 있다. 상기 충전층 컬럼의 입구 말단에 배치되는 상기 폴리머 프릿 디스크는 평균 기공 크기가 35㎛ 이상임을 특징으로 할 수 있다. 상기 충전층 컬럼의 출구단에 배치된 상기 폴리머 프릿 디스크는 평균 기공 크기가 약 10㎛임을 특징으로 할 수 있다. 상기 이온 교환 상은 디에틸아미노에틸 셀룰로오스, QAE 세파덱스, Q 세파로스, 및 카르복시메틸 셀룰로오스 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 폴리머 상은 폴리스티렌-co-1,4-디비닐벤젠, 메타크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 전분 및 아가로스 중 적어도 하나를 포함한다. 상기 항체는 항-인간 알부민, 항-인플루엔자 A 바이러스 NP 및 항-SARS-CoV-2 바이러스 항체 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 항체는 단백질 A/G 아가로스 비드 상에 고정될 수 있다.

호기를 사용하여 호흡기 질환을 진단하기 위한 시스템이 개시되며, 이 시스템은, 물, 휘발성 유기 성분(VOC) 및 비휘발성 유기 성분을 포함하는 호기를 수집하기 위해 개인의 얼굴을 수용하도록 구성된 호흡 수집 요소와, 상기 비휘발성 유기 성분을 선택적으로 포착하고 상기 호흡 수집 요소에 제거 가능하고 유동적으로 연결되는 충전층 컬럼을 포함하는 샘플 포착 요소와, 상기 샘플 포착 요소와 유체 소통하고 호기를 상기 샘플 포착 요소 내로 끌어들이도록 구성된 펌프를 포함하는 호흡 샘플 수집 시스템과; 상기 충전층 컬럼에서 비휘발성 유기물을 추출하기 위한 샘플 추출 시스템과; 샘플 플레이트 상에서 수집된 샘플을 처리하고 농축하기 위한 샘플 처리 시스템과, 상기 샘플을 분석하기 위한 진단 장치를 포함하는 샘플 분석 시스템을 포함한다. 상기 진단 장치는 PCR, rt-PCR, 질량 분석기(MS), MALDI-MS, ESI-MS 및 MALDI-TOFMS 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 진단 장치는 MALDI-TOFMS를 포함한다. 상기 추출 시스템은 상기 충전층 컬럼을 용매로 플러싱(flushing)하고 비휘발성 유기물을 포함하는 용매를 상기 충전층으로부터 제거하는 수단을 포함할 수 있다. 상기 용매는 아세토니트릴, 메탄올, 산, 이소프로판올 중 적어도 하나를 포함할 수 있고 나머지는 물이다. 상기 용매는 물 중 약 50부피% 내지 약 70부피%의 아세토니트릴을 포함할 수 있다. 상기 용매는 물 중 약 50부피% 내지 약 70부피%의 이소프로판올을 포함할 수 있다. 상기 용매는 물 중 약 50부피% 내지 약 70부피%의 메탄올을 포함할 수 있다. 상기 추출 시스템은 상기 충전층 컬럼을 약 12.5% 아세트산, 약 70% 이소프로판올, 약 5% TFA, 약 5% 포름산 및 약 10% HCl 중 적어도 하나로 플러싱하는 수단을 포함할 수 있다.

호기를 사용하여 적어도 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2를 포함하는 바이러스에 의해 유발된 호흡기 질환 진단을 위한 시스템이 개시되며, 상기 시스템은, 물, 휘발성 유기 성분(VOC) 및 비휘발성 유기 성분을 포함하는 호기를 수집하기 위해 개인의 얼굴을 수용하도록 구성된 호흡 수집 요소와, 상기 비휘발성 유기 성분을 선택적으로 포착하고 상기 호흡 수집 요소에 제거 가능하고 유동적으로 연결되는 충전층 컬럼을 포함하는 샘플 포착 요소와, 상기 샘플 포착 요소와 유체 소통하고 호기를 상기 샘플 포착 요소 내로 끌어들이도록 구성된 펌프를 포함하는 호흡 샘플 수집 시스템과; 상기 충전층 컬럼에서 비휘발성 유기물을 추출하기 위한 샘플 추출 시스템과; 상기 바이러스의 특징적인 펩티드 샘플을 생성하기 위해 상기 샘플 추출 시스템으로부터 추출된 바이러스 입자를 포함한 비휘발성 유기물의 고온 산 소화(hot acid digestion)를 위한 수단을 포함하는 샘플 처리 시스템과; 상기 펩티드 샘플을 분석하기 위한 진단 장치를 포함한다. 상기 추출 시스템은 상기 충전층 컬럼을 약 12.5% 아세트산, 약 70% 이소프로판올, 약 5% TFA, 약 5% 포름산 및 약 10% HCl 중 적어도 하나로 플러싱(flushing)하는 수단을 포함할 수 있다. 상기 충전층 컬럼은 글리칸(glycan), 헤파린(heparin), 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 및 덱스트란(dextran)과 같은 탄수화물(carbohydrates) 중 적어도 하나를 포함하는 작용기가 입자의 표면에 고정화된 작용기를 갖는 고체 입자를 포함할 수 있다.

호기를 사용하여 적어도 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2를 포함하는 바이러스에 의해 유발되는 호흡기 질환의 진단 방법이 개시되며, 상기 방법은, 물, 휘발성 유기 성분(VOC) 및 비휘발성 유기 성분을 포함하는 호기를 수집하기 위해 개인의 얼굴을 수용하도록 구성된 호흡 수집 요소를 제공하는 단계와, 펌프를 사용하여 상기 비휘발성 유기 성분을 선택적으로 포착하기 위해 충전층 컬럼을 포함하는 샘플 포착 요소 내로 호기를 끌어들이는 단계를 포함하는 개인으로부터 호흡 샘플을 수집하는 단계와; 샘플 추출 시스템에서 약 12.5% 아세트산, 약 70% 이소프로판올, 약 5% TFA, 약 5% 포름산, 및 약 10% HCl 중의 하나 이상을 사용하여 상기 충전층 컬럼으로부터 바이러스 입자를 포함하는 비휘발성 유기물을 추출하는 단계와; 추출된 상기 비휘발성 유기물을 소화(digesing)하여 상기 바이러스의 특징적인 펩티드 샘플을 생성하는 단계와; 진단 장치를 사용하여 상기 펩티드 샘플을 분석하는 단계를 포함한다. 상기 분석 단계는 MALDI 매트릭스 코팅된 샘플 플레이트 상에 상기 펩티드 샘플을 플레이팅하고 MALDI-TOFMS를 사용하여 플레이팅된 상기 샘플을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 상기 충전층 컬럼은 글리칸, 헤파린, 헤파란 설페이트, 및 덱스트란과 같은 탄수화물 중 적어도 하나를 포함하는 작용기가 입자의 표면에 고정화된 작용기를 갖는 고체 입자를 포함할 수 있다.

호기를 사용하여 적어도 하나의 호흡기 질환을 진단하기 위한 호흡 샘플 수집 시스템이 개시되고, 상기 시스템은, 물, 휘발성 유기 성분(VOC) 및 비휘발성 유기 성분을 포함하는 호기를 수집하기 위해 개인의 얼굴을 수용하도록 구성되고 스템(stem) 및 상기 스템 하부에 배치된 포트를 포함하는 마스크와, 상기 마스크의 상기 스템에 제거 가능하고 유동적으로 연결된 HEPA 필터와, 호기 중에서 상기 비휘발성 유기 성분을 선택적으로 포착하고 상기 포트에 제거 가능하고 유동적으로 연결되는 충전층 컬럼을 포함하는 샘플 포착 요소와, 상기 샘플 포착 요소와 유체 연통하고 호기를 상기 샘플 포착 요소 내로 끌어들이도록 구성된 펌프를 포함한다. 호기 중의 상기 비휘발성 성분은, 호흡기 질환의 특징인 미생물, 바이러스, 대사산물 바이오마커, 지질 바이오마커, 및 단백질체 바이오마커 중 적어도 하나를 포함하는 호흡 에어로졸 입자를 포함할 수 있다. 상기 충전층 컬럼은, 수지, 셀룰로오스, 실리카, 아가로스 및 수화 Fe₃O₄ 나노입자 중 적어도 하나를 포함하는 고체 입자를 포함할 수 있다. 상기 충전층 컬럼은 표면에 C18 작용기를 갖는 수지 비드를 포함할 수 있다. 상기 수지 비드는 약 12㎛ 내지 약 20㎛의 공칭 직경을 가질 수 있다. 상기 수지 비드는 2개의 다공성 폴리머 프릿 디스크 사이에 충전될 수 있다. 상기 고체 입자는 상기 고체 입자의 표면에 고정화된 작용기를 포함할 수 있으며, 상기 작용기는, C18(옥타데실), 옥틸, 에틸, 시클로헥실, 페닐, 시아노프로필, 아미노프로필, 2,3-디히드록시프로폭시프로필, 트리메틸-아미노프로필, 카르복시프로필, 벤젠술폰산, 프로필술폰산, 이온 교환 상, 폴리머 상, 항체, 글리칸, 지질, DNA 및 RNA 중 적어도 하나를 포함한다. 상기 시스템은 상기 샘플 포착 요소와 상기 펌프 사이에 배치되고 상기 충전층을 통과하는 수증기, 휘발성 유기 성분 및 비휘발성 유기 성분 중 적어도 하나를 포함하는 호기 응축물(EBC)을 가두도록 구성된 트랩을 더 포함할 수 있다. 상기 트랩은 주변 온도 이하로 냉각될 수 있다. 상기 고체 입자는 상기 입자의 표면에 고정화된 작용기를 포함할 수 있고, 여기서 상기 작용기는, C18(옥타데실), 옥틸, 에틸, 시클로헥실, 페닐, 시아노프로필, 아미노프로필, 2,3-디히드록시프로폭시프로필, 트리메틸-아미노프로필, 카르복시프로필, 벤젠술폰산, 프로필술폰산, 이온 교환 상, 폴리머 상, 항체, 글리칸, 지질, DNA 및 RNA를 포함한다.

적어도 하나의 호흡기 질환의 진단을 위한 에어로졸 입자를 수집하기 위한 예시적인 샘플 수집 시스템이 개시되고, 상기 시스템은, 상기 에어로졸 중의 비휘발성 유기 성분을 선택적으로 포착하기 위한 충전층 컬럼을 포함하는 샘플 포착 요소와, 상기 샘플 포착 요소와 유체 연통하고 상기 에어로졸을 상기 샘플 포착 요소 내로 끌어들이도록 구성된 펌프를 포함한다. 상기 에어로졸 중의 비휘발성 성분은 호흡기 질환의 특징인 미생물, 바이러스, 대사산물 바이오마커, 지질 바이오마커 및 단백질체 바이오마커 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 충전층 컬럼은 수지, 셀룰로오스, 실리카, 아가로스 및 수화 Fe₃O₄ 나노입자 중 적어도 하나를 포함하는 고체 입자를 포함할 수 있다. 상기 충전층 컬럼은 표면상에 C18 작용기를 갖는 수지 비드를 포함할 수 있다. 상기 수지 비드는 약 12㎛ 내지 약 20㎛의 공칭 직경을 가질 수 있다.

에어로졸화된 박테리아 및 바이러스 입자에 의해 유발되는 호흡기 질환의 진단을 위한 예시적인 시스템이 개시되고, 상기 시스템은, 본 명세서에 개시된 예시적인 샘플 수집 시스템과, 상기 충전층 컬럼에서 비휘발성 유기물을 추출하기 위한 샘플 추출 시스템과, 추출된 상기 비휘발성 유기물 샘플을 분석하는 진단 장치를 포함한다. 상기 추출 시스템은, 상기 충전층 컬럼을 약 12.5% 아세트산, 약 5% TFA, 약 70% 이소프로판올, 약 5% 포름산, 및 약 10% HCl 중 적어도 하나로 플러싱(flushing)하는 수단을 포함할 수 있다. 상기 진단 장치는 PCR, ELISA, rt-PCR, MS(mass spectrometer), MALDI-MS, ESI-MS 및 MALDI-TOFMS 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 시스템은 수집된 샘플을 샘플 플레이트 상에 처리 및 농축하기 위한 샘플 처리 시스템을 더 포함할 수 있다. 상기 샘플 처리 시스템은 상기 샘플을 MALDI 매트릭스와 혼합하고 혼합된 샘플과 MALDI 매트릭스를 샘플 플레이트에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 상기 샘플 처리 시스템은 상기 샘플 플레이트에 상기 혼합된 샘플 및 MALDI 매트릭스를 적용한 후 상기 샘플 플레이트를 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 샘플 처리 시스템은 상기 샘플 추출 시스템으로부터 추출된 바이러스 입자를 포함하는 비휘발성 유기물의 고온 산 소화(hot acid digestion)를 위한 수단을 포함하여 상기 바이러스의 펩티드 샘플 특성을 생성하고, 상기 펩타이드 샘플을 MALDI 매트릭스와 혼합하고, 상기 혼합된 샘플 및 MALDI 매트릭스를 샘플 플레이트에 적용할 수 있다. 상기 시스템은 상기 샘플 플레이트에 상기 혼합된 샘플 및 MALDI 매트릭스를 적용한 후 상기 샘플 플레이트를 건조시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 MALDI 매트릭스는 α-시아노-4-히드록시신남산(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid), 아세토니트릴(acetonitrile), TFA 및 물을 포함할 수 있다. 상기 에어로졸화된 바이러스 입자는 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.

본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 부분적으로 하기 발명의 상세한 설명 및 첨부 도면에 설명될 것이며, 여기서 본 개시내용의 바람직한 양태들이 설명 및 도시되고 부분적으로는 첨부된 도면과 함께 취해진 하기의 상세한 설명을 검토함으로써 통상의 기술자에게 명백해지거나 또는 본 개시내용의 실시에 의해 학습될 수 있다. 본 개시내용의 이점은 특허청구범위에서 특히 지적된 수단들 및 조합들에 의해 실현되고 달성될 수 있다.

본 개시내용의 전술한 양태들과 많은 부수적인 이점들은 첨부 도면들과 함께 취해질 때 하기의 상세한 설명을 참조함으로써 더 잘 이해되면서 더욱 쉽게 인식될 것이다.
도 1은 충전층을 포함하는 예시적인 호기 샘플 수집 시스템의 개략도이다.
도 2는 샘플 수집 시스템을 포함하는 예시적인 호흡기 질환 진단 시스템의 개략도이다.
도 3은 충전층 컬럼을 포함하는 시스템을 사용하는 예시적인 진단 방법의 개략도이다.
도 4는 예시적인 충전층 컬럼을 사용한 입자 포착 효율 측정값이다.
도 5a~5e는 예시적인 충전층 컬럼을 사용하여 수집되고 질량 분석기를 사용하여 분석된 비휘발성 유기 분자의 결과를 보인다.
도 6a~6b는 호기 샘플에서 단백질의 SDS-PAGE 전기영동을 사용한 은 염색 이미지 및 호기 샘플의 LC-MS 분석에서 총 이온 크로마토그래피(TIC)를 사용하여 수집된 스펙트럼을 각각 도시한다.
도 7은 충전층 컬럼을 포함하는 예시적인 호기 샘플 수집 시스템의 개략도이다.
도 8a~8b는 예시적인 충전층 컬럼을 사용하여 포획되고 MALDI TOF-MS를 사용하여 분석된 에어로졸화된 박테리아 및 바이러스의 결과를 보인다.
상기 도면들에서 참조를 위한 모든 도면부호, 지시선 및 설명선은 여기 상세히 설명된 것처럼 이러한 참조에 의해 통합된다. 도면의 일 요소에 부호를 매기지 않았다고 해서 권리를 포기하는 것은 아니다. 부호가 없는 참조는 도면과 청구항에서 문자로도 식별할 수도 있다.

하기의 상세한 설명은 발명의 상세한 설명의 일부를 형성하는 첨부 도면들에 대한 참조를 포함한다. 도면들은 예시로서 개시된 시스템 및 방법이 실시될 수 있는 특정 실시예들을 도시한다. "예시(example)" 또는 "선택(option)"으로서 이해되어야 하는 이들 실시예는, 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 실시할 수 있도록 충분히 상세하게 설명된다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서, 실시예들이 결합될 수 있고, 다른 실시예들이 활용될 수 있거나, 구조적 또는 논리적인 변경이 이루어질 수 있다. 따라서, 하기의 상세한 설명은 제한적인 의미로 받아들여서는 안 되며 본 발명의 범위는 특허청구범위 및 그의 법적 등가물에 의해 정의된다.

본 개시내용에서, 에어로졸은 일반적으로 공기 중 또는 기체 중에 분산된 입자의 부유(suspension)를 의미한다. "자율적(autonomous)" 진단 시스템 및 방법은 "의료 전문가의 개입없이 또는 최소한의 개입으로" 진단 테스트 결과를 생성함을 의미한다. 미국 FDA는 의료 장치와 관련된 위험을 기반으로 장치의 안전성과 유효성을 합리적으로 보장하는 규제의 양을 평가하여 의료 장치를 분류한다. 장치는 클래스 I, 클래스 II 또는 클래스 III의 3가지 규제 클래스 중의 하나로 분류된다. 클래스 I에는 가장 낮은 위험도의 장치가 포함되고 클래스 III에는 가장 높은 위험도의 장치가 포함된다. 모든 클래스의 장치들은 일반 통제(General Control) 대상이다. 일반 통제는 모든 의료 장치에 적용되는 식품, 의약품 및 화장품 법(the Food, Drug and Cosmetic (FD&C) Act))의 기본 요건이다. 체외(in vitro) 진단 제품은 질병 또는 그의 후유증을 치유(cure), 경감(mitigate), 치료(treat) 또는 예방(prevent)하기 위해 건강 상태 결정을 포함하여 질병 또는 기타 증상의 진단에 사용하도록 의도된 시약, 도구 및 시스템이다. 이러한 제품은 인체에서 채취한 표본의 수집, 준비 및 검사에 사용하도록 의도된다. 여기 개시된 예시적인 장치는 자율적으로 작동하고 높은 신뢰도의 결과를 생성할 수 있으며 결과적으로 클래스 I 장치로서 규제받을 가능성이 있다. 결핵(TB) 감염률이 높은 일부 지역에서는 의료 훈련을 받은 직원에 대한 접근은 매우 제한적이다. 자율적 진단 시스템은 자율적이지 않은 시스템보다 선호된다.

용어 "a" 또는 "an"은 하나 이상을 포함하는 데 사용되며, 용어 "또는"은 달리 표시되지 않는 한 비배타적인 "또는"을 나타내는 데 사용된다. 또한, 본 명세서에 사용된 어구 또는 용어는 달리 정의되지 않은 한 단지 설명을 위한 것이지 제한을 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 본 개시내용에서 달리 명시되지 않는 한, 용어 "약"의 범위를 해석함에 있어서 개시된 값(치수, 작동 조건 등)과 관련된 오차 범위는 본 개시내용에서 지시된 값의 ±10%이다. 백분율로 개시된 값과 관련된 오류 범위는 표시된 백분율의 ±1%이다. 특정 단어 앞에 사용된 "실질적으로"라는 단어에는 "특정된 범위에서 상당한 수준" 및 "대부분이 특정되나 전체가 특정되는 것이 아닌"의 의미가 포함된다.

호흡 에어로졸 입자는 대사산물, 지질 및 단백질과 같은 다양한 비휘발성 유기 생체분자를 함유한다. 또한, 상기 비휘발성 분자는 서브-마이크론 크기에서 대략 10 마이크론 크기 범위의 넓은 입자 크기 분포를 갖는다. 호기(exhaled breath)로부터 다양한 입자 크기의 다양한 유형의 비휘발성 분자들을 효율적으로 포착(capture) 할 수 있는 호흡 수집 및 질병 진단 시스템 및 방법이 요구된다. 본 발명의 특정 측면은 개시된 방법 및 시스템의 구성, 원리 및 작동을 설명하기 위한 목적으로 아래 매우 상세하게 설명된다. 그러나, 다양한 변형이 가능하며, 본 발명의 범위는 기술되는 예시적인 측면들로 한정되는 것은 아니다.

호기 분석(exhaled breath analysis: "EBA")에 기반한 예시적인 진단 시스템(2000)(도 2)은 샘플 추출 시스템(2002) 및 분석 시스템(2003)과 유체 소통하도록 배치된 호흡 샘플 수집 시스템(1000)을 포함할 수 있다.

예시적인 호기 샘플 수집 시스템(1000)(도 1)은 박테리아 및 바이러스를 포함하나 이에 국한되지 않는 비휘발성 유기체를 포함하는 호흡 에어로졸과, 작은 분자, 지질 및 단백질을 포함하는 분자들을 매우 높은 효율의 흡착제 재료상에 선택적으로 포착하기 위한 충전층 컬럼(packed bed column)을 포함하는 샘플 포착 요소(1001)를 포함할 수 있다. 트랩(trap, 1003)은 튜브(1002)를 사용하여 컬럼(1001)과 유체 소통한다. 트랩(1003)은 글라스 또는 플라스틱 재료로 만들어질 수 있다. 트랩(1003)은 빙욕 또는 기타 적절한 수단을 사용하여 주위 온도 미만으로 냉각될 수 있다. 트랩(1003)은 호기 응축물(exhaled breath condensate: EBC)로서 상기 수집 컬럼을 통과할 수 있는 수증기, 기타 휘발성(체크) 및 비휘발성 분자를 수집하는 데 사용될 수 있다. 인공호흡기를 사용하여 호흡하는 환자의 호흡 분석 중에, 샘플 포착 요소(1001)는 인공호흡기의 호흡기 관에 있는 카프노그래피(capnography) 포트에 제거 가능하게 연결되어 이를 환자의 폐로부터 출구에 매우 가깝게 또는 바로 출구에 배치할 수 있다. 정상적으로 호흡하는 사람의 호흡 분석 동안, 샘플 포착 요소(1001)는 환자가 호흡하도록 지시받거나 아니면 본 명세서에서 앞서 개시된 호흡 기동을 실행하도록 지시받은 마우스피스(도시되지 않음) 내로 제거 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 샘플 포착 요소(1001)는 호흡 분석 중에 환자가 착용하는 응급 처치 CPR 구조 마스크(예컨대, Dixie USA EMS Supply Co.사에 의해 공급되는 모델번호 EVR-CPR01)와 같은 호흡 수집 요소(1007)(도 1)의 하류 측에(출구에) 제거 가능하게 연결될 수 있다. 흐름 분할기(1008)는, 호기의 첫 번째 부분이 샘플 포착 요소(1001)로 향하고 두 번째 부분이 HEPA 필터(1009)를 향하도록 호기의 흐름을 분할하기 위해, 호흡 수집 요소(1007)와 샘플 포착 요소(1001) 사이에 배치될 수 있다. 흐름 분할기(1008)는 수집 요소(1007) 내에 통합될 수 있다. 또한, 큰 입자 트랩(1012)은 샘플 포착 요소(1001)의 상류측에 배치되어 샘플 포착 요소(1001)에 들어가기 전에 상기 호기 스트림에서 큰 입자의 호흡 응축물(약 10㎛ 초과)을 제거할 수 있다. 호기를 샘플 포착 요소(1001)의 상기 충전층 컬럼 내로 끌어들이는 데는 펌프(1006)가 사용될 수 있다. 한 예시적인 펌프(1006)로는 휴대형 격막 펌프(예컨대, Parker Hannifin Corp.사, 부품번호: D737-23-01)이다. 펌프(1006) 밖으로의 유속은 니들 밸브(1005)를 사용하여 조정함으로써 원하는 유속을 달성할 수 있다. 체크 밸브(일방향 흐름 밸브)(1011)가 펌프(1006)와 샘플 포착 요소(1001) 간에 배치될 수 있으며 펌프(1006)가 충전층 컬럼을 통해 호기를 끌어당길 때만 개방 위치에 있도록 구성된다. 흐름이 없을 때, 밸브(1011)는 폐쇄 위치로 배치된다. 약 200㎖/min과 600㎖/min 사이의 공칭 유속이 사용될 수 있다. 또한, 여러 샘플 포착 요소(1001)가 병렬로 사용되어 상기 유속을 12L/min까지 증가시킬 수 있다. 또한, 하나 이상의 샘플 포착 요소가 수집 모드에 있을 때, 하나 이상이 용리 모드에 있을 수 있고 일부는 대기 모드에 있을 수 있다. 호기 샘플 부피가 적절한지 여부를 결정하기 위해, CO₂ 센서 및 입자 계수기(도시되지 않음)가 호흡 수집 요소(1007)와 샘플 포착 요소(1001) 간에 배치될 수 있다. CO₂ 모니터링 및 입자 계수는 호기 부피 비율의 근사치를 허용한다. HEPA 필터는 또한 트랩(1003)의 하류측에 배치될 수 있다. 샘플 포착 요소(1001)는 비휘발성 유기물 입자의 수집 효율을 증가시키기 위해 주위 온도 미만으로 온도를 감소시키도록 냉각 재킷 또는 기타 수단을 사용하여 냉각될 수 있다. 상기 호흡 샘플 수집 시스템은, 호기를 가습하고 상기 충전층 컬럼 내의 습도를 증가시키도록 상기 포착 요소에 대해 상기 입구의 상류측에 배치된 가습기(1010)를 추가로 포함할 수 있다.

호흡 수집 요소(1007)는 개인의 얼굴을 수용하도록 구성된 밀착 마스크를 포함할 수 있고, 이는 스트랩 등을 사용하여 환자/개인의 얼굴/머리에 제거 가능하게 부착될 수 있다. 개인은 임의의 격납 부스 내에 앉음으로써 환자의 EBA를 검사실 또는 검사구역 내의 주변 공기로부터 격리할 수 있다. 호흡 수집 요소(1007)는 에어로졸 입자를 호흡 수집 요소(1007)의 벽 상에 침착시킴이 없이 전술한 바와 같이 펌프(1006)를 사용하여 환자의 입과 코를 통해 방출된 호흡 에어로졸 입자를 수집하고 샘플 포착 요소(1001)로 안내하는 데 사용될 수 있다. 호흡 수집 요소(1007)는 환자가 이전 환자에 의해 방출된 병원체에 오염되거나 감염될 위험을 제한하도록 일회용으로 사용할 수 있다. 대안적으로, 호흡 수집 요소(1007)는 재사용 가능할 수 있고 이 경우 멸균될 수 있다.

샘플 포착 요소(1001)의 예시적인 상기 충전층 컬럼은 Sigma Aldrich 및 기타 공급업체에 의해 공급되는 Hamilton PRP-C18 수지 비드를 포함할 수 있다. 상기 충전층은 프릿 디스크 등의 2개 다공성 필터 플레이트 간에 제자리에 고정될 수 있다. 예를 들어, 평균 기공 크기가 35㎛ 초과인 폴리에틸렌 디스크를 상기 충전층의 상류측에 놓고 평균 기공 크기가 10㎛인 폴리에틸렌 디스크(Boca Scientific사, Dedham, MA)를 상기 충전층의 하류측에 놓을 수 있다. 상기 35㎛ 프릿 디스크는 더 빠른 공기 유속을 허용하는 반면, 더 작은 10㎛ 프릿 디스크는 모든 C18 수지를 잘 포획한다. 예시적인 샘플 포착 요소(1001)에서, 상기 충전층은 약 12㎛와 약 20㎛ 간의 공칭 직경을 갖는 약 25㎎의 C18 수지 비드를 포함할 수 있다. 호기에서의 비휘발성 유기 성분은 상기 비드의 C18 작용기와 제거 가능하게 상호 작용하여 포획된다. 물, 휘발성 물질 및 기타 친수성 분자는 상기 충전층을 통과하고 글라스 트랩(1003) 내에 포획될 수 있다.

C18 작용기 외에, 비휘발성 분자에 친화성을 나타내는 기타 작용기가 수지 비드와 같은 고체상 비드 상에 고정화된 상기 컬럼 내에서 흡착제로서 사용될 수 있다. 상기 고체상 비드는, 폴리머와, 수지, 셀룰로오스, 실리카, 아가로스 및 수화 Fe₃O₄ 나노입자와 같은 입자로 제조될 수 있다. 흡착제 물질은 고체상 비드 상에 옥타데실, 옥틸, 에틸, 시클로헥실, 페닐, 시아노프로필, 아미노프로필, 2,3-디히드록시프로폭시프로필, 트리메틸-아미노프로필, 카르복시프로필, 벤젠술폰산, 및 프로필술폰산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 작용기를 포함할 수 있다. 작용기는 또한 이온 교환 상, 폴리머 상, 항체, 글리칸, 지질, DNA 및 RNA 중의 적어도 하나를 포함할 수 있다.

예시적인 진단 시스템(2000)(도 2)은 샘플 추출 시스템(2002) 및 분석 시스템(2003)과 유체 연통하도록 배치된 호흡 샘플 수집 시스템(2001)을 포함할 수 있다. 샘플 수집 시스템(2001)은 전술했듯이 예시적인 샘플 수집 시스템(1000)(도 2)을 포함할 수 있다. 샘플 추출 시스템(2002)은 샘플 수집 시스템(1000)에서의 상기 충전층 컬럼으로부터 포획된 비휘발성 유기물을 추출하는 데 사용될 수 있으며 진단 시스템(2000)에서 인라인 또는 오프라인으로 배치될 수 있다. 샘플 추출 시스템(2002)이 오프라인으로 배치될 때, 호기 샘플 수집의 체결부에서, 샘플 포착 요소(1001)가 샘플 수집 시스템(1000)에서 제거되고 샘플 추출 시스템(2002)에서 유기 용매로 용리됨으로써 상기 충전층 컬럼으로부터 비휘발성 유기물을 제거할 수 있다. 예시적인 유기 용매로는, 상기 충전층 컬럼으로부터 포획된 비휘발성 유기물(강극성 비휘발성 유기 분자, 단백질 등)을 추출하도록 수중 약 50~70% 아세토니트릴을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 상기 추출은 상기 충전층으로부터 보다 덜 극성인 지질 분자를 추출하기 위해 수중 50~70% 이소프로판올을 포함하나 이에 제한되지는 않는 동일하거나 다른 용매를 사용하여 반복될 수 있다. 기타 유기 용매로는, 수중 약 50% 내지 약 70% 메탄올, 및 약 50% 클로로포름 중 약 50% 메탄올을 포함한다. 샘플 추출 시스템(2002)이 인라인으로 배치되는 경우, CO₂ 센서 및 입자 계수기 중의 적어도 하나가 샘플 추출 시스템(2002)의 상류측에 배치될 수 있다. 샘플 추출 시스템(2002)은 용매 용기, 상기 용매 용기로부터 충전층 컬럼으로 용매를 전달하기 위한 펌프 및 상기 비휘발성 바이오마커를 포함하는 용매를 다른 용기 또는 컵 내로 수집하기 위한 용기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 샘플 추출 시스템(2002)은 용매를 상기 충전층 컬럼 내에 주입하고 비휘발성 유기물 및 바이오마커를 포함하는 추출 액체를 적합한 컵이나 용기 또는 작은 부피를 갖는 다른 시험관(laboratory tube) 내에 수집하기 위한 주입기를 포함할 수 있다. 용매에 포착된 샘플은 분석 시스템(2003)에서 추가로 처리 및 분석될 수 있다.

분석 시스템(2003)은 샘플 처리 시스템(2004) 및 적어도 하나의 진단 장치(2005)를 포함할 수 있다. 샘플 처리 시스템(2004)은 다음 단계들 중 하나 이상을 수행하는 데 필요한 요소를 포함할 수 있다:

(a) 샘플을 컵, 바이알(vial) 및 샘플 플레이트 중의 적어도 하나에 놓는 단계. 예를 들어, 시리즈 110A 점적 샘플러(Spot Sampler, Aerosol Devices)는 원형 웰(well) 형상(75㎕ 웰 부피) 또는 눈물방울 웰(teardrop well) 형상(120㎕ 웰 부피)의 32개 웰 플레이트를 사용하고 이는 가열되어 상기 샘플 내의 상기 용매와 과잉 유체/액체를 증발시킴으로써 상기 샘플을 농축한다.

(b) 상기 샘플을 컵 안에 넣고 진공 또는 동결 건조 장치에 노출시킴으로써 상기 용매를 증발시켜 상기 샘플을 농축시키는 단계; 및

(c) 단백질 및 바이러스 입자의 고온 소화(digestion) 단계.

샘플은 화학적 오염 입자를 제거하기 위해 원심분리될 수 있다. 많은 진단장치들이 분석 시스템(2003)에서 사용하도록 조정될 수 있고, 이는 게놈 기반 분석(예컨대, PCR, rt-PCR 및 전체 게놈 시퀀싱), 바이오마커 인식 분석(예컨대, ELISA), 및 질량 분석(MS)과 같은 스펙트럼 분석을 수행하는 장치들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이들 진단 장치 중에서 MS는 그의 분석 속도 때문에 선호된다. 바이오마커 식별에 바람직한 MS 기술은 전자분무 이온화(electrospray ionization: ESI) 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(matrix assisted laser desorption ionization: MALDI) 비행 시간 MS(time of flight MS: TOFMS)이다. ESI는 고해상도 질량 분석기에 결합될 수 있다. MALDI-TOFMS 장치는 컴팩트하고 가벼우며 100와트 미만의 전력을 소비하고 15분 이내에 샘플 분석을 제공할 수 있다. MALDI-TOFMS는 ACF에 적합한 현장 진단에 바람직한 진단 장치이다. 상기 샘플은 MS의 진공 챔버 내에 삽입되고 자외선 레이저의 레이저 펄스를 받기 이전에 건조되어야 한다. 샘플과 레이저 간의 이러한 상호 작용은 생물학적 물질의 특징인 크고 유익한 생물학적 이온 클러스터를 생성한다. 농축된 샘플이 미량 수준의 물 또는 미량 수준의 유기 용매(예컨대, 수중 50%~70%의, 아세토니트릴, 메탄올 및 이소프로판올 중 하나)를 포함하는 샘플 처리 시스템(2004)에서 제공되는 경우, 상기 샘플에서 물을 증발시키는 데 더 적은 시간이 필요하므로, MS를 사용한 샘플 분석은 5분 미만이(샘플 준비를 포함하여) 소요될 수 있다.

MALDI-TOFMS는, B. 탄저균 포자(B. anthracis spores, 다중 균주), Y. 페스티스(Y. pestis), F. 툴라렌시스(F. tularensis), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus: VEE), 서부 말 뇌척수염 바이러스(Western equine encephalomyelitis virus: WEE), 동부 말 뇌염 바이러스(Eastern equine encephalitis virus: EEE), 보툴리눔 신경독(botulinum neurotoxins: BoNT), 포도상구균 장독소(staphylococcus Enterotoxin: SEA), 포도상구균 장독소 B(Staphylococcal enterotoxin B: SEB), 리신(ricin), 아브린(abrin), 에볼라 자이르 균주(Ebola Zaire strain), 아플라톡신(aflatoxins), 삭시톡신(saxitoxin), 코노톡신(conotoxins), 엔테로박테리아 파지 T2(Enterobacteria phage T2: T2), HT-2 독소(HT2), 코브라 독소(cobra toxin)와, B. globigii 포자를 포함한 생물 위협 모사체, B. cereus 포자, B. thuringiensis Al Hakam 포자, B. anthracis Sterne 포자, Y. enterocolitica, E. coli, MS2 바이러스, T2 바이러스, 아데노 바이러스(Adenovirus), 및 NGA(비휘발성), 브래디키닌(bradykinin), 옥시토신(oxytocin), 물질 P(Substance P), 안지오텐신(angiotensin), 디아제팜(diazepam), 코카인(cocaine), 헤로인(heroin) 및 펜타닐(fentanyl)을 포함한 비휘발성 생화학적 위협물을 포함하나 이에 국한되지 않는 살아있는/활성제를 식별하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 예시적인 시스템 및 방법은 인간의 호흡 샘플로부터 SARS-CoV-2의 정확한 검출 및 식별을 달성하는 데 사용될 수 있다.

"매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화"(matrix assisted laser desorption ionization: MALDI)에서, 표적 입자(분석물)는 레이저로부터의 광(종종 자외선 파장)을 우선적으로 흡수하는 매트릭스 화학 물질에 의해 코팅된다. 매트릭스가 없으면, 생물학적 분자는 질량 분석기의 레이저 빔에 노출될 때 열분해에 의해 분해된다. 상기 매트릭스 화학 물질은 또한 기화된 분자에 전하를 전달하여 이온을 생성한 다음, 전기장에 의해 비행관 아래로 가속된다. 미생물학(microbiology)과 단백질체학(proteomics)은 질량 분석의 주요 응용 분야가 되었고, 예로는 박테리아 식별, 화학 구조 발견, 및 단백질 기능 유도 등을 포함한다. MALDI-MS는 조류의 지질 프로파일링에도 사용된 바 있다. MALDI-MS 동안, 일반적으로 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid: TFA)과 같은 산과 알파-시아노-4-하이드록시신남산(alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid)과 같은 MALDI 매트릭스 화학 물질로 구성된 액체가 용매에 용해되어 샘플에 추가된다. 용매에는 아세토니트릴, 물, 에탄올 및 아세톤이 포함된다. TFA는 일반적으로 샘플의 질량 스펙트럼에 대한 염 불순물의 영향을 억제하기 위해 추가된다. 물은 친수성 단백질이 용해될 수 있게 하고, 아세토니트릴은 소수성 단백질이 용해될 수 있게 한다. 상기 MALDI 매트릭스 용액은 MALDI 플레이트 상의 샘플에 점적(spot)되어 샘플 상에 MALDI 매트릭스 물질의 균일한 균질층을 생성한다. 용매가 증발하고 매트릭스 결정을 통해 샘플이 퍼진 재결정된 매트릭스만 남게 된다. 상기 산은 샘플의 세포막을 부분적으로 분해하여 단백질을 MS에서 이온화 및 분석에 사용가능하게 한다. 다른 MALDI 매트릭스 물질로는 미국 특허 제8,409,870호에 기술되어 있듯이 3,5-디메톡시-4-히드록시신남산(시나핀산)(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (sinapinic acid)), α-시아노-4-히드록시신남산(α-시아노 또는 α-매트릭스)(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (α-cyano or α-matrix)) 및 2,5-디히드록시벤조산((2,5-dihydroxybenzoic acid)(DHB)이 포함된다.

또한, 트랩(1003)(도 1)에 수집된 휘발성 유기 화합물은 히터를 사용하여 가온됨으로써 상기 휘발성 화합물을 GC-MS, GC-IMS, 휘발성 이온 크로마토그래피 또는 휘발성 유기 화합물 분석에 적합한 기타 유형의 분석 방법 등의 진단장치 내로 몰아낸다.

바이러스(예컨대, SARS-CoV-2) 검출은 바이러스 단백질 검출에 중점을 두고 있는데, 이는 어려운 과제이다. 바이러스 검출을 위한 예시적인 방법은 배경 매트릭스(background matrix)(예컨대, 다른 비바이러스 생체분자, 오염물질)로부터 표적 바이러스를 끌어내기 위한 글리칸 기반 포착 매트릭스(glycan-based capture matrix)(비드(bead))를 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플 수집 시스템(1000)을 사용하여 수집한 바이러스를 함유할 수 있는 샘플의 분취량은 다른 배경 오염 물질도 포함할 수 있으며 포착 프로브를 운반하는 비드에 적용될 수 있다. 글리칸, 헤파린 및 탄수화물 중 적어도 하나는 수지 비드 또는 일부 다른 유형의 비드 상에 결합된 포착 물질 또는 프로브로 사용될 수 있다. 선택적 세척 단계를 사용하여 표적이 아닌 바이러스 오염 물질을 제거할 수 있다. 농축되고 정제된 바이러스는 포름산 또는 아세트산을 포함할 수 있는 유기산을 함유한 밀봉된 가열 챔버 내로 적합한 용매를 사용하여 비드로부터 용리될 수 있고 약 10분 동안 120℃로 가열되어 단백질성 독소를 특정의 펩티드 단편들로 분해할 수 있다. 이 뜨거운 산성 단백질 소화 프로토콜은 아스파라긴산 잔기에서 단백질을 절단하여 재현성이 높은 펩티드 패턴을 생성한다. 기술된 포착 및 소화 과정은 각각 항체와 효소로 수행할 수 있다. MALDI-TOFMS에 대한 이 예시적인 샘플 처리를 사용하여, 깨끗한 완충액에서 100ng/mL(약 50:1의 S/N으로)보다 더 양호한 리신 생물독소에 대한 감도가 달성되었다. 3:1의 S/N(신호 대 잡음비)에서 10ng/mL 미만의 검출 한계(limits of detection: LOD)를 달성할 수 있다. MALDI-TOFMS 분석 시스템에 사용되는 1μL 샘플의 경우, 약 10ng/mL LOD는 프로브 상에서 약 10pg(10^-12g)의 총 질량에 해당하며, 이는 약 20,000개의 바이러스 입자에 해당한다. 위 개시된 방법을 구현하기 위한 예시적인 미세유체 샘플 처리 시스템은 공기 또는 비강 면봉과 같은 다른 소스에서 수집된 샘플을 분석하도록 구성될 수 있다. 글리칸 기반 포착 컬럼 및 기타 미세 유체 구성요소는 재사용할 수 있다. 버퍼, 약산 및 알코올이 들어 있는 대형 유체 저장소는 상기 시스템의 한 채널 내에서 100개의 샘플을 측정하기에 충분한 용량을 제공하는 데 사용될 수 있다. 다수의 시스템을 병렬로 실행하여 다수의 샘플을 동시에 처리할 수 있다. 깨지기 쉽고 값비싼 생체분자 시약이 필요하지 않기 때문에, 상기 시스템은 비용 효율적이다.

고온의 산 소화(acid digestion)는 단백질을 아스파르트산 잔기에서 재현 가능하게 절단하여 공지된 질량을 갖는 공지된 펩티드 서열을 생성한다. 이들 펩티드 질량 분포는 전구 단백질의 특징이다. 따라서, 관심의 단백질이 배경 물질과 크게 분리되어 있는 경우, 소화는 뛰어난 특이성을 제공한다. 또한, 상기 펩티드 질량 분포는 번역후 변형(post-translational modification)을 설명하여 게놈에 의해 직접 결정된다. 새로운 바이러스가 분리되자마자, 그것은 신속하게 시퀀싱된다. SARS-CoV-2 바이러스의 RNA 서열은 현대 생물정보학 도구(ExPASy 생물정보학 포털)로 단백질 서열을 정확하게 예측하는 데 사용될 수 있다. 그런 다음, 이들 단백질은 생물학적 정보학 도구를 사용하는 인실리코(in silico)로 "소화(digest)"되어 이론적인 펩티드 맵을 생성할 수 있다. 따라서, SARS-COV-2 소화로부터 발생하는 펩티드를 예측하고 실험 데이터와 비교하여 유기체의 특정 MALDI TOFMS 서명을 생성할 수 있다. 보고서에 따르면, SARS-CoV의 주요 단백질은 약 46kDa 뉴클레오캡시드 단백질과 139kDa 스파이크 단백질을 특징으로 한다. 합리적 풍부한(reasonable abundance) 다른 단백질은 E, M 및 N 단백질이다.

표적 바이러스의 검출 특이성은, 특히 배경이 다른 단백질을 포함하는 경우에는 일정 수준의 배경 제거를 필요로 한다. 많은 양의 외인성 단백질이 존재하는 경우, 상기 펩티드 맵은 비표적 펩티드에 의해 지배될 수 있다. 전술한 바와 같이, 글리칸 장식 아가로스 비드(glycan-decorated agarose beads)를 기반으로 한 바이러스 독소에 대한 친화성 포착 프로브는 심지어 과량의 배경 단백질 및 기타 생체 분자에서도 상기 독소를 쉽게 청소하는 데 사용할 수 있다. SARS-CoV-2, 기타 인간 단백질(도 6 및 실시예 3)과 같은 바이러스 표적에 대한 호기를 분석할 때, 호흡에서 검출 특이성이 방해받을 수 있다. 최고의 특이성을 보장하기 위해서는 샘플의 친화도 기반의 청소가 필요하다. 바이러스 검출은 전술한 글리칸 장식 비드에 비해 더 선택적인 친화성을 제공하는 비드 물질이 필요할 수 있다. 예를 들어, 덱스트란 기반(dextran-based)의 흡착제는 코로나 바이러스를 비롯한 바이러스들을 정제하는 데 사용할 수 있지만, 표적 바이러스에 대한 이 수지의 친화도는 만족스럽지 않을 수 있다. 대안으로서, 탄수화물이 SARS-CoV 및 SARS-CoV-2와 같은 표적 바이러스를 포함한 바이러스 및 단백질 정제에 사용될 수 있다. 또한, 헤파린(heparin) 및 헤파란 설페이트(heparan sulfate)가 수지 비드에 결합된 결합제로 사용될 수 있다. 세파로스 비드(sepharose beads)에 공유 결합된 헤파린(GE Healthcare Life Sciences, Heparin Sepharose 6 Fast Flow 친화성 수지 제품 # 17099801)을 글리칸 포착 비드 대신에 사용할 수 있다. 이 수지는 호기에서 바이러스 입자를 수집하기 위한 비드 기반 포착 친화성 포착 시스템을 가능하게 할 수 있다. 한 예시적인 진단 시스템에서, 호기된 호흡 샘플은 샘플 수집 시스템(1000)의 포착 베드를 통해 끌어 당겨져 상기 호흡으로부터 입자를 수집할 수 있다. 상기 수지 비드(베드)는 세척하여 배경 물질을 제거할 수 있다. 상기 비드에 흡착된 바이러스 입자는 약 12.5% 아세트산, 약 5% TFA, 약 5% 포름산 및 약 10% HCl 중의 적어도 하나와 같은 고농도의 산 용액을 사용하여 고온 산 소화 챔버(hot acid digestion chamber) 내로 용리되어 특징적인 펩티드를 생성한다. 상기 펩티드 샘플은 MALDI 매트릭스와 혼합되어 MALDI TOFMS 분석에 적합한 기질 상으로 침착될 수 있다. 상기 샘플은 또한 MALDI 매트릭스로 사전 코팅된 적절한 기판 또는 디스크 상에 침착될 수 있다.

도 3은 예시적인 시스템(2000)을 사용하는 예시적인 진단 방법(3000)의 개략도이다. 예시적인 방법(3000)은 호기에 기반한 자율 현장 진료 진단을 수행하는데 사용될 수 있다. 단계(3001)에서, 개인(또는 환자)이 착석하도록 지시받을 수 있고; 의자는 선택적으로 격리 부스에 위치할 수 있다. 단계(3002)에서 샘플 호흡 수집 요소(1007)는 개인의 머리에 제거 가능하게 장착될 수 있다. 그 다음, 개인은 사전 설정된 반복 횟수를 포함할 수 있는 하나 이상의 사전 결정된 기동(3003)을 호흡하거나 수행하도록 지시받는다. 호흡에서의 비휘발성 유기물은 호흡 샘플 수집 시스템(1000)을 사용하여 포착되고 단계(3004)에서 상기 시스템(2002)을 사용하여 추출되고 적절한 용매를 사용하여 용리된다. 샘플을 수집하는 동안 사람이 내쉬는 호흡은 풀링 펌프에 의해 추출된 사전 결정된 유속으로 상기 컬럼을 통과한다. 상기 호기 내에 함유되어있는 비휘발성 분자는 포착 요소(1001)의 관능화 비드(functionalized beads)(예컨대, 수지 비드 상에 고정화된 C18 작용기(C18 functional groups))와 상호 작용하기 때문에, 이들 분자는 요소(1001)의 컬럼 베드 내에 갇히는 반면, 상기 호흡에서 대부분이 물과 수성 전해질로 구성된 친수성 분자는 상기 컬럼을 통과하게 된다. 인간의 호흡에 있는 비휘발성 유기 분자는 수소 결합 및 비공유 상호작용을 포함한 분자간 힘(intermolecular force)을 통해 알킬 쇄에 대해 강한 친화력을 보인다. 상기 컬럼 베드로부터의 비휘발성 분자의 용리는 전술했듯이 아세토니트릴, 메탄올 및 이소프로판올을 포함하나 이에 국한되지 않는 유기 용매를 사용하여 달성될 수 있다. 상기 샘플은 구성 요소(2004)를 사용하여 단계(3005)에서 추가로 처리될 수 있다. 샘플 처리 유형은 진단 장치의 유형과 관심 있는 비휘발성 분석 물질 입자에 따라 달라진다. 전술한 바와 같이, 바이러스 샘플은 특징적인 펩티드를 생성하기 위해 고온 산 소화 챔버를 거칠 수 있다. 상기 펩티드 샘플은 MALDI 매트릭스와 혼합되어 MALDI TOFMS 분석에 적합한 기질 상으로 침착될 수 있다. 상기 샘플은 또한 MALDI 매트릭스로 사전 코팅된 적절한 기판 또는 디스크 상에 침착될 수 있다. 그 다음, 상기 샘플은 단계(3006)에서 진단 장치에 의해 분석된다. 상기 진단 장치가 MALDI-TOFMS인 경우, 샘플 처리는 또한 상기 샘플을 MALDI-TOFMS 샘플 디스크 상으로 플레이팅하는 단계, 상기 디스크를 가열하여 상기 샘플을 농축시키는 단계, 및 상기 디스크를 건조시키는 단계를 포함할 수 있다. 그런 다음, 상기 샘플 디스크는 MALDI-TOFMS를 사용하여 분석된다. 상기 TOFMS 검출기는 MALDI-TOF/MS 동안 단편화되는 COVID-19 유형 바이러스 펩티드의 분석 및 시퀀싱을 가능하게 하도록 이온 게이트(ion gate) 및 리플렉트론(reflectron)을 통합하도록 수정될 수 있다. 획득한 스펙트럼은 특정 호흡기 감염에 대해 양성으로 알려진 샘플의 스펙트럼, 알려진 데이터베이스에서의 스펙트럼, 그리고 건강한 것으로 알려진 환자의 샘플 스펙트럼과 비교되어 환자의 진단이 생성된다. 이후, 그 결과는 임상의나 환자에게 전달될 수 있다.

일단 호흡 수집 요소(1007)가 환자에게 부착되고 샘플 추출이 시작되면, 상기 예시적인 시스템 및 방법은 바람직하게 자율적일 수 있고(필요한 기동을 수행한 후에는 환자에게 의자에서 나가도록 요청하는 것을 제외하고는) 진단의 테스트 결과를 생성한다. SARS-CoV-2와 같은 바이러스 입자의 경우, 상기 입자는 직경이 약 0.1마이크론이며 민감도는 약 10³~10⁴개의 바이러스 입자일 수 있다.

보고에 따르면, 인플루엔자 환자 및 COVID-19 환자의 코 및 인후 면봉 분석은 약 10³개 내지 10¹⁰개 바이러스 입자의 바이러스 계수를 생성한다. 환자의 호흡에 있는 바이러스 입자 수에 대해서는 알려진 바가 더 적다. 다른 보고서에 따르면, 인플루엔자 환자는 약 30분 동안의 호흡에서 ＞10⁴개의 입자를 내뿜었다. 만일 SARS-CoV-2의 산출량이 인플루엔자의 산출량과 유사하다면, 입자 수집 효율이 ＞ 99.9%인 호기 중에서의 10³~10⁴개 입자의 산출량은 여기 개시된 상기 예시적인 방법 및 시스템을 사용하여 호기 중의 표적 바이러스 입자를 식별하기에 충분해야 한다. 상기 예시적인 시스템 및 방법을 사용한 검출 시간은 샘플 추출(호흡 기동) 단계, 샘플 수집 단계, 샘플 처리(소화) 단계, 및 MALDI TOF-MS를 사용한 분석 단계를 포함하여 약 10분에서 20분 사이일 수 있다. 이 검출 시간은 기존의 검출 시스템에 비해 상당히 빠른 것이다.

한 예시적인 샘플 처리 구성요소는, 상기 충전층 컬럼(1001)으로부터 샘플을 자율적으로 추출하고 샘플 청소를 수행하고 고온 산 소화를 수행하고 MALDI-TOFS 샘플 기판 또는 디스크 상에 플레이팅 준비가 된 샘플을 제공하기 위한, 고온 산 소화 모듈 또는 카트리지를 포함할 수 있다. 상기 카트리지는 사용 간에 상기 카트리지를 플러싱(flushing)하는 기능을 추가하여 재사용할 수 있도록 설계할 수 있다.

다른 예시적인 샘플 수집 시스템(7000)이 개시된다(도 7). 예시적인 샘플 포착 요소(7001)는 C18-결합 수지 비드를 포함하는 충전층 컬럼을 포함할 수 있다. 이들 수지 비드는 표면상에 고정화된 C18 작용기를 갖는다. 포착 요소(7001)는 약간의 수정부들을 갖는 응급 처치 CPR 구조 마스크(7007)에 연결되거나 제거 가능하게 설치될 수 있다. 일반적으로 소생백(resuscitation bag)에 연결되는 마스크(7007)의 스템(7008)은 HEPA 필터(7009)에 제거 가능하게 연결되도록 수정될 수 있다. 상기 HEPA 필터는 주변 공기의 오염 물질에 의한 호기의 오염을 방지한다. 일반적으로 상기 스템 아래에 위치하고 인간 피험자가 마스크를 착용할 때 피험자의 턱에 근접하도록 구성된 마스크에 대한 산소 주입구(7010)는, 포착 요소(7001)에 제거 가능하게 연결되도록 수정될 수 있다. 포착 요소(7001)는 입구(7010)를 통해 마스크(7007) 내에 제거 가능하게 삽입되거나, 아니면 마스크(7007)와 실질적으로 누설 방지 맞춤(leak-tight fit)을 형성하도록 마스크(7007) 내에 제거 가능하게 연결되거나 삽입될 수 있다. 마스크(7007)는 환자의 얼굴에 상기 마스크를 밀봉하기 위해 인간 피험자의 머리 뒤에서 고리를 만들 수 있는 탄성 밴드 또는 타이를 포함할 수 있다. 위와 같이 구성된 마스크(7007)는 입과, 포착 요소(7001)의 컬럼 입구 간의 직접적인 접촉을 방지하고 타액에 의한 상기 컬럼 입구의 오염을 최소화하거나 제거하며, 또한 호기로부터의 비휘발성 유기 입자 수집을 최대화한다. 빙수에 잠긴 트랩(7003)은 포착 요소(7001)의 뒤에(하류에) 설치될 수 있다. 펌프(7006)를 사용하는 유속(공기 인출 속도)은 약 600mL/min을 끌어내도록 니들 밸브(7005)를 사용하여 제어될 수 있다. 약 200ml/min 내지 600ml/min의 공칭 유속이 사용될 수 있다. 선택적인 HEPA 필터(7011)는 트랩(7003)과 니들 밸브(7005) 사이에 설치될 수 있다. 체크 밸브(도 1 참조)와 같은 다른 유체 구성요소가 포착 요소(7001)의 상기 컬럼 베드 내로의 역류를 방지하기 위해 시스템(7000)에 설치될 수 있다. 호기에서의 CO₂는 포착 요소(7001)의 컬럼 베드를 통과한다. 호기 샘플 부피 및/또는 호흡 기동이 적절한지 여부를 결정하기 위해, CO₂ 센서를 호흡 포착 요소(7001)의 출구와 트랩(7003) 간에 배치할 수 있다. CO₂ 모니터링을 통해 호기된 공기량의 비율을 추정할 수 있다. 입자 계수기가 포착 요소(7001)의 출구와 트랩(7003) 사이에 설치되어 상기 컬럼 베드에서 나오는 입자의 크기와 개수를 감지할 수 있으며, 이는 상기 베드의 포화 및 상기 컬럼 베드로부터의 비휘발성 유기 분자의 돌파를 감지하는 데에도 사용할 수 있다. 예시적인 시스템(7000)은 또한 포착 요소(7001)의 컬럼 베드 내로 라우팅하기 전에 호흡 부피의 표준화가 가능하도록 포착 요소(7001) 바이패스 라인(도시되지 않음)을 포함할 수 있다. CO₂ 센서 및 입자 계수기는 또한 상기 바이패스 라인에 유동적으로 연결될 수 있다. 비휘발성 유기 분자를 포착하기 위한 포착 요소(7001)의 상기 컬럼 베드에서 작용기로 고정화된 고체 비드의 용량은 약 0.05㎎(비휘발성 유기물)/㎎ 비드 내지 약 0.5㎎/㎎일 수 있다. 예시적인 포착 요소에서의 상기 컬럼 베드에서 C18-결합 수지 비드의 용량은 약 0.1㎎/㎎일 수 있다. 즉, 25㎎의 C18 비드를 갖는 컬럼 베드는 약 2.5㎎의 비휘발성 유기 분자를 포획 또는 흡착하는 용량을 갖게 된다.

C18 작용기 외에도, 비휘발성 분자에 친화성을 나타내는 다른 작용기가 수지 비드와 같은 고체상 비드 상에 고정화된 컬럼에서 흡착제로 사용될 수 있다. 상기 고체상 비드는, 수지, 셀룰로오스, 실리카, 아가로스 및 수화 Fe₃O₄ 나노입자와 같은 중합체 및 입자로 만들어질 수 있다. 흡착제 물질은, 고체상 비드 상에 배치된, 옥타데실, 옥틸, 에틸, 시클로헥실, 페닐, 시아노프로필, 아미노프로필, 2,3-디히드록시프로폭시프로필, 트리메틸-아미노프로필, 카르복시프로필, 벤젠술폰산, 및 프로필술폰산을 포함하지만 이에 국한되지 않는 기타 작용기를 포함할 수 있다. 작용기는 또한 이온 교환 상, 폴리머 상, 항체, 글리칸, 지질, DNA 및 RNA 중의 적어도 하나를 포함할 수 있다.

본 명세서에 기술된 예시적인 시스템 및 방법은 호흡기 감염에 대한 그의 진단 성능이 반드시 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 폐암은 또한 바이오마커를 말초 폐액 내로 방출할 수 있으며, 이들 바이오마커는 개시된 시스템 및 방법에 의해 쉽게 검출될 것이다. 또한, 혈액은 폐에서 폐포 내막과 밀접하게 접촉하기 때문에, 신체의 다른 부분(폐 너머)에 있는 감염 및 암의 바이오마커가 상기 폐포 내막을 통해 상기 말초 폐액 내로 전이될 수 있고 따라서 EBA 분석에 의해 검출될 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 범위는 호흡기 질환의 검출 및 진단으로 한정되지 않는다. 예시적인 시스템 및 방법은 리신과 같은 에어로졸 화학 입자를 포착하고 화학 공격 위협을 방지하기 위해 입자를 분석하는 데 사용될 수 있다.

실시예

실시예 1. 예시적 충전층 컬럼(1001)을 사용한 입자 포착 효율

약 200μL의 HPLC 등급 물을 휴대용 Aeroneb Go 분무기(Philips, Amsterdam, Netherlands)를 사용하여 2리터 챔버 내로 에어로졸화하여 약 0.3㎛ 내지 5㎛ 크기의 입자를 생성하였다. 컬럼 입구 입자 크기를 측정하였다. 입자 수는 4가지 테스트 조건(입자 베드가 없는 베어(bare) 컬럼, 약 0.2㎛ 기공 크기 × 25㎜ ID 시린지 필터를 갖는 컬럼(VWR International, Radnor, PA), 30㎎의 C18 수지 비드(C18 컬럼)를 포함하는 컬럼(1001), 및 30분의 실행 시간(30분 배양) 후의 C18 비드룰 포함하는 컬럼(1001))에서 휴대형 레이저 입자 계수기(Met One Instruments, Grants Pass, OR)를 사용하여 기록되었다. 입자 계수기는 상기 컬럼의 하류측에 배치되었다. 0.3㎛ 입자의 입자 수는 C18 충전 컬럼이 없는 경우 약 37000개였으며 C18 충전 컬럼이 있는 경우에는 약 480개로 떨어졌고(도 4) 이는 포집 효율이 99% 초과임을 나타낸다. 연구된 다른 크기의 입자들에 대해서도 유사한 포착 효율이 관찰되었다. 더 중요한 것은, 약 30분 동안 수집을 실행한 후에도 높은 포착 효율이 유지되었다는 점이다. 0.3미크론 크기의 빈(bin)(필터에 대해 가장 침투적인 입자 크기)의 경우, 실험실 내 배경 수는 146000개 입자/L였다. 수집 컬럼이 부착되었을 때, 개수는 14개 입자/L로 떨어졌는데, 이는 약 99.99% 수집 효율(도 4)이며, HEPA 필터와 동등하거나 더 우수한 것이다.

실시예 2. 예시적 충전층 컬럼 (1001) 및 MS를 사용하여 수집된 비휘발성 유기 분자의 분석

크기 및 화학적 특성에 기초하여, 비휘발성 유기 분자는 3개의 넓은 범주로 나눌 수 있다: 작은 극성 분자, 작은 비극성 분자(지질), 및 거대분자(펩티드 및 단백질). C18 비드의 베드를 포함하는 예시적 컬럼(1001)을 사용하여 이러한 3가지 유형 분자의 수집 효율성을 입증하기 위해, 정확한 질량 측정을 위해 고해상도 질량 분석기를 사용하여 각 범주의 대표적인 분자들을 선택하고 특성화하였다. 10nM 메타돈(methadone)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)은 작은 극성 분자를 나타내기 위해 선택되었고, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine)(Matreya LLC, State College, PA)은 지질을 나타내기 위해 선택되었고, 돼지 췌장으로부터의 인슐린(Sigma-Aldrich)은 펩티드와 단백질을 나타내기위해 선택되었다. HPLC 등급의 물에서 준비된 약 200μL의 각 화학 물질을 휴대형 Aeroneb Go 분무기(Philips)를 사용하여 약 50℃로 유지되는 가열 블록 상의 50mL 원추형 튜브 내로 에어로졸화하였다. 약 30㎎의 C18 비드를 포함하는 컬럼(1001)이 상기 50mL 원추형 튜브의 바닥에 설치되었고 펌프(1006)의 유속은 약 200mL/분으로 설정되었다. 각 경우의 에어로졸화된 화학 물질은 컬럼(1001)의 베드에서 약 5분 동안 수집되었다. 메타돈 및 인슐린 수집 후, 수집 컬럼은 400μL의 물로 4회 세척되었다. 빠른 원심분리(이는 선택적인 단계이다) 후에, 400μL의 70% 아세토니트릴을 사용하여 메타돈과 인슐린을 용리하였다. 포스포릴콜린의 경우, 약 400μL의 70% 아세토니트릴로 상기 컬럼을 3회 세척하고 400μL의 70% 이소프로판올로 용리(흡착물 추출)를 수행하였다. 각 경우에 상기 베드에서 나오는 세척 용액은 분석을 위해 저장되었다. 컬럼(1001)의 베드에서 수집(추출)된 메타돈 및 인슐린은 동결건조하고 1% 아세트산이 포함된 70% 아세토니트릴 200μL에 재현탁하였다. 컬럼(1001)의 베드에서 수집된 포스포릴콜린은 동결건조하고 200μL의 50% 이소프로판올, 25% 아세토니트릴 및 1% 아세트산에 재현탁하였다. 메타돈, 포스포릴콜린 및 인슐린의 질량 분석 데이터는 양이온 모드에서 직접 주입을 통해 Orbitrap LTQ 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수집되었다. 직접 주입의 유속은 3μL/min으로 설정하고 데이터 수집은 200m/z에서 약 60000의 분해능으로 10분 동안 기록되었다. 표적 분자들은 정확한 질량 측정으로 식별하였다. 도 5에 도시하듯이, 각 대표 분자에 대한 질량분석 신호는 상기 C18 베드에서 추출된 분자를 포함하는 용리액에서만 검출되었고 세척액에서는 검출되지 않았다. 따라서, C18 비드의 베드가 있는 예시적 컬럼(1001)은 작은 극성 분자, 작은 비극성 분자(지질) 및 거대분자(펩티드 및 단백질)를 수집하는 데 있어 효과적이며 이들 유형의 비휘발성 유기 분자의 고효율 샘플 수집이 가능하다.

실시예 3. 인간 대상체로부터 수집된 호기의 분석

전술한 예시적인 시스템(7000)에서, 요소(7001)의 컬럼은 약 25㎎의 C18 비드를 포함하였다. 호흡 샘플은 동일한 유량으로 호흡량이 다른 4명의 건강한 인간 피험자로부터 수집되었다: 피험자 1은 144L 호흡량, 피험자 2는 40L, 피험자 3 및 피험자 4는 81L이었다. 호흡 샘플 수집 후, 수집 컬럼을 제거하고 작은 극성 분자 및 단백질의 수집을 위해 400μL의 70% 아세토니트릴로 용리하였다. 단백질 샘플은 동결건조하여 용매를 제거하고 100μL의 0.1% 포름산에 재현탁시켰다. 그런 다음, 상기 컬럼은 비극성 분자(지질) 수집을 위해 70% 이소프로판올 400μL로 용리하였다.

샘플은 SDS-PAGE 전기영동 및 상향식 프로테오믹스(bottom-up proteomics)를 사용하여 분석하였다. 전기영동은 Criterion Tris-HCl Gel system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하고 각 피험자에 해당하는 약 25μL의 수집된 샘플을 사용하여 수행되었다. SDS-PAGE 전기영동 후, SDS-PAGE 겔을 단백질 가시화를 위해 은 염색(Thermo Fisher Scientific)으로 처리하였다. 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin: BSA)을 내부 양성 대조군으로 사용하였다. 상향식 프로테오믹스 동안, 각 피험자에 해당하는 약 50μL의 총 수집 샘플이 여기에 설명된 대로 처리되었다. 간단히 말해서, 약 50μL의 50mM 암모니아 중탄산염(pH 8.5)을 각 샘플에 첨가하였다. 디티오트레이톨을 최종 농도가 5mM이 되도록 첨가하여 단백질 환원을 수행하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 환원 후, 단백질 알킬화에 이어서 요오도아세트아미드를 15mM의 최종 농도로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 트립신(Thermo Fisher Scientific)을 밤새 단백질 소화에 사용하였다. 소화 후, 펩티드는 C18 충전 팁(Glygen, Columbia, MD)을 사용하여 세척되었다. 최종 펩티드 샘플은 질량 분석 분석을 위해 20μL의 0.1% 포름산에 구성되었다. 상기 샘플은 Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)에 연결된 EASY-nLC 1000 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 처리되었다. 탠덤 질량분석기 분석 동안, 펩티드는 유속 5μl/min으로 Acclaim PepMap 100 C18 트랩 컬럼(0.2㎜×20㎜, Thermo Fisher Scientific)에 로딩되었고 EASY-Spray HPLC 컬럼(75㎛×150㎜, Thermo Fisher Scientific) 상에서 분리되었다. HPLC 구배는 5~55%의 이동상(75% 아세토니트릴 및 0.1% 포름산)을 사용하여 60분 동안 300nL/min의 유속으로 수행하였다. 질량 분석 데이터 수집은 데이터 종속 수집 모드(data-dependent acquisition mode)에서 수행되었다. 전구체 스캐닝 분해능(precursor scanning resolution)은 60000으로, 생성물 이온 스캐닝 분해능(product ion scanning resolution)은 15000으로 설정되었다. 총 에너지의 약 27%로 고에너지 충돌 유도 해리(high energy collision-induced disassociation: HCD)를 사용하여 생성물 이온 단편화(product ion fragmentation)를 수행하였다. 상향식 프로테오믹스 로우 데이터 파일은 UniProt 인간 단백질 데이터베이스/지식기반에 대해 MaxQuant-Andromeda 소프트웨어로 처리되었다.

도 6a는 4명의 피험자에 대한 겔 전기영동 은 염색 이미지를 나타낸다. "X" 표시는 샘플이 함유되지 않은 레인을 나타내며 내부 음성 대조군으로 사용되었다. 단백질 밴드는 트랩(7003) 내에 수집된 응축물(EBC) 샘플에서는 관찰되지 않았다. 단백질 밴드의 어둠 강도는 모든 샘플에서의 단백질 함량이 단백질 밴드당 10ng보다 더 컸음을 시사하며, 이는 순차적 상향식 프로테오믹스에 적합하다. 또한,가장 강한 단백질 밴드가 약 50kDa 내지 약 75kDa(밴드 #1), 약 37kDa(밴드 #2), 및 약 10kDa 내지 약 15kDa(밴드 #3)에서 나타나므로, 인간 피험자들에 대한 유사한 단백질 밴드 패턴이 관찰될 수 있다. 탠덤 질량분석법을 사용하여, 밴드 #1에 해당하는 단백질은 혈청 알부민(serum albumin)과 케라틴(keratin)으로, 밴드 #2에 해당하는 단백질은 아연-알파-2-당단백질(zinc-alpha-2-glycoprotein)로, 밴드 #3에 해당하는 단백질은 시스타틴(cystatin), 덤시딘(dermcidin), S100 단백질로 식별되었다. 또한, 약 37 kDa(밴드 #2)의 단백질 클러스터는, 단백질 번역후 변형(protein posttranslational modification), 아마도 글리코실화가 발생할 수 있음을 시사한다. 상향식 프로테오믹스 및 단백질 데이터베이스 검색을 통하여, 이 단백질이 4개의 알려진 N-연결 글리코실화 부위가 있는 단백질인 아연-알파-2-당단백질(zinc-alpha-2-glycoprotein)임을 확인하였다(UniProt 지식기반). 그 결과는 상향식 프로테오믹스로 결합된 은 염색 기반의 단백질 시각화가 매우 낮은 단백질 농도에서도 호기 샘플에서 단백질 프로파일을 식별하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한, 상기 단백질 밴드들의 강도는, 약 144리터의 호기를 생성하는 피험자 1이 가장 어두운 단백질 밴드를 나타내고 피험자 2(40리터)가 가장 밝은 밴드를 나타내므로, 수집된 호흡량과 상관관계가 있을 수 있다. 호흡 방식 또는 프로토콜의 차이도 각 피험자로부터의 에어로졸 입자 생성물 생산에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 다른 피험자들에서 고르지 않은 단백질 분포의 원인이 될 수 있었다. 위 운동에서는 호흡 방식에 대한 특정 지침이 사용되지 않았다. 탠덤 질량 분광법을 사용하여 TIC 프로파일에서 유사한 단백질 패턴을 추가로 확인하였다(도 6b). 다양한 단백질 분석 기술을 사용함으로써, 그 결과 상기 컬럼 수집 시스템이 호기에서 단백질을 포착할 수 있었고 호흡 샘플에서의 단백질 함량이 상향식 프로테오믹스를 사용하여 순차적인 단백질 식별을 촉진함을 강력하게 나타낸다. 또한, 알파 아밀라아제와 같은 타액의 주요 단백질은 확인되지 않았으며, 이는 예시적인 안면 마스크(7007)에 대한 수정이 피험자의 입 및 포착 요소(7001)와의 직접적인 접촉을 방지했음을 시사한다. 여기에 개시된 상기 예시적인 호흡 수집 시스템은 하기도로부터 단백질을 효과적으로 포착하기 위해 사용될 수 있다.

4명의 피험자로부터 수집된 호기에서의 단백질 패턴들의 유사성은 도 6b에 도시된 바와 같이 LC-MS 분석에서 총 이온 크로마토그래피(total ion chromatography: TIC)에 의해 추가로 확인되었다. 이온 크로마토그래피 피크 패턴은 4명의 피험자에 대해 유사했으며 피험자 1은 도 6a의 염색 이미지들에서 보이는 더 강한 밴드들과 유사한 상대적으로 더 강한 피크를 나타냈다.

상기 수집된 호기 샘플들에서 단백질의 식별을 위해 상향식 프로테오믹스를 사용하였다. 피험자 1에서 197개 단백질이, 피험자 2에서 47개 단백질이, 피험자 3에서 25개 단백질이, 피험자 4에서 64개 단백질이 식별되었다. 피험자 1에서 가장 많은 단백질이 식별되었기 때문에, 단백질 식별 번호들은 상기 샘플들에서의 단백질 함량과 일치한다. 통틀어, 상기 4명의 피험자로부터 총 303개의 단백질이 식별되었다. 스펙트럼 일치(spectral matching)를 기반으로 식별된 가장 풍부한(abundant) 단백질들은 표 1에 나열되어 있고, 시스타틴-A(cystatin-A), 덤시딘(dermcidin), 및 S100 단백질 패밀리의 여러 원을 포함한다.

4명 피험자의 호흡 샘플에 해당하는 단백질
Accession	Protein Identification	Sequence coverage [ % ]	Mol . weight [kDa]	Sequence length (aa)	MS/MS count
P01040	HUMAN Cystatin-A OS=Homo sapiens OX=9606 GN=CSTA PE=1 SV=1	100	11	98	46
P00441	HUMAN Superoxide dismutase [Cu-Zn] OS=Homo sapiens OX=9606 GN=SOD1 PE=1 SV=2	99.4	16	154	17
P25311	HUMAN Zinc-alpha-2-glycoprotein OS=Homo sapiens OX=9606 GN=AZGP1 PE=1 SV=2	41.6	34	298	12
P01036	HUMAN Cystatin-S OS=Homo sapiens OX=9606 GN=CST4 PE=1 SV=3	59.6	16	141	11
P02768	HUMAN Serum albumin OS=Homo sapiens OX=9606 GN=ALB PE=1 SV=2	14.6	69	609	10
P04264	HUMAN Keratin, type II cytoskeletal 1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=KRT1 PE=1 SV=6;	18.3	66	644	9
P13645	HUMAN Keratin, type I cytoskeletal 10 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=KRT10 PE=1 SV=6;	7.4	59	584	6
P31025	HUMAN Lipocalin-1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=LCN1 PE=1 SV=1;sp	19.3	19	176	5
Q01469	HUMAN Fatty acid-binding protein 5 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=FABP5 PE=1 SV=3	23.7	15	135	4
Q04695	HUMAN Keratin, type I cytoskeletal 17 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=KRT17 PE=1 SV=2;	11.1	48	432	4
P06702	HUMAN Protein S100-A9 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=S100A9 PE=1 SV=1	28.9	13	114	4
P29508	HUMAN Serpin B3 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=SERPINB3 PE=1 SV=2	13.1	45	390	4
P10599	HUMAN Thioredoxin OS=Homo sapiens OX=9606 GN=TXN PE=1 SV=3	50.5	12	105	4
P04040	HUMAN Catalase OS=Homo sapiens OX=9606 GN=CAT PE=1 SV=3	9.1	60	527	3
P01037	HUMAN Cystatin-SN OS=Homo sapiens OX=9606 GN=CST1 PE=1 SV=3	33.3	16	141	3
P04406	HUMAN Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase OS=Homo sapiens OX=9606 GN=GAPDH PE=1 SV=3	15.2	36	335	3
P12273	HUMAN Prolactin-inducible protein OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PIP PE=1 SV=1	19.9	17	146	3
P04075	HUMAN Fructose-bisphosphate aldolase A OS=Homo sapiens OX=9606 GN=ALDOA PE=1 SV=2	10.7	39	364	2
P07355	HUMAN Annexin A2 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=ANXA2 PE=1 SV=2;sp	6.8	39	339	2
P01833	HUMAN Polymeric immunoglobulin receptor OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PIGR PE=1 SV=4	3.4	83	764	2
Q06830	HUMAN Peroxiredoxin-1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PRDX1 PE=1 SV=1	13.1	22	199	2
P32119	HUMAN Peroxiredoxin-2 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PRDX2 PE=1 SV=5	16.7	22	198	2
P63104	HUMAN 14-3-3 protein zeta/delta OS=Homo sapiens OX=9606 GN=YWHAZ PE=1 SV=1	5.7	28	245	1
P01011	HUMAN Alpha-1-antichymotrypsin OS=Homo sapiens OX=9606 GN=SERPINA3 PE=1 SV=2	7.1	48	423	1
P17174	HUMAN Aspartate aminotransferase, cytoplasmic OS=Homo sapiens OX=9606 GN=GOT1 PE=1 SV=3	3.4	46	413	1
P30838	HUMAN Aldehyde dehydrogenase, dimeric NADP-preferring OS=Homo sapiens OX=9606 GN=ALDH3A1 SV=3	2.6	50	453	1
P04083	HUMAN Annexin A1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=ANXA1 PE=1 SV=2	4.6	39	346	1
P05089	HUMAN Arginase-1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=ARG1 PE=1 SV=2	4.7	35	322	1
Q13867	HUMAN Bleomycin hydrolase OS=Homo sapiens OX=9606 GN=BLMH PE=1 SV=1	3.5	53	455	1
P13987	HUMAN CD59 glycoprotein OS=Homo sapiens OX=9606 GN=CD59 PE=1 SV=1	8.6	14	128	1
P23528	HUMAN Cofilin-1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=CFL1 PE=1 SV=3	7.2	19	166	1
P54108	HUMAN Cysteine-rich secretory protein 3 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=CRISP3 PE=1 SV=1	5.7	28	245	1
P04080	HUMAN Cystatin-B OS=Homo sapiens OX=9606 GN=CSTB PE=1 SV=2	24.5	11	98	1
P28325	HUMAN Cystatin-D OS=Homo sapiens OX=9606 GN=CST5 PE=1 SV=1	9.9	16	142	1
Q15828	HUMAN Cystatin-M OS=Homo sapiens OX=9606 GN=CST6 PE=1 SV=1	7.4	17	149	1
P09228	HUMAN Cystatin-SA OS=Homo sapiens OX=9606 GN=CST2 PE=1 SV=1	23.4	16	141	1
Q8TDM 6	HUMAN Disks large homolog 5 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=DLG5 PE=1 SV=4	1	214	1919	1
P78417	HUMAN Glutathione S-transferase omega-1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=GSTO1 PE=1 SV=2	7.5	28	241	1
P04792	HUMAN Heat shock protein beta-1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=HSPB1 PE=1 SV=2	11.7	23	205	1
P35527	HUMAN Keratin, type I cytoskeletal 9 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=KRT9 PE=1 SV=3;	3.4	62	623	1
P35908	HUMAN Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal OS=Homo sapiens OX=9606 GN=KRT2 PE=1 SV=2;;	3.9	65	639	1
P30086	HUMAN Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PEBP1 PE=1 SV=3	8	21	187	1
P30041	HUMAN Peroxiredoxin-6 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PRDX6 PE=1 SV=3	10.3	25	224	1
P25789	HUMAN Proteasome subunit alpha type-4 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PSMA4 PE=1 SV=1	3.4	29	261	1
P06454	HUMAN Prothymosin alpha OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PTMA PE=1 SV=2	15.3	12	111	1
O00391	HUMAN Sulfhydryl oxidase 1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=QSOX1 PE=1 SV=3	1.5	83	747	1
Q8NFJ5	HUMAN Retinoic acid-induced protein 3 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=GPRC5A PE=1 SV=2	3.9	40	357	1
P31949	HUMAN Protein S100-A11 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=S100A11 PE=1 SV=2	10.5	12	105	1
P60174	HUMAN Triosephosphate isomerase OS=Homo sapiens OX=9606 GN=TPI1 PE=1 SV=3	3.8	31	286	1
P35030	HUMAN Trypsin-3 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PRSS3 PE=1 SV=2	4.3	33	304	1
Q13404	HUMAN Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=UBE2V1 PE=1 SV=2	8.2	16	147	1
P14618	HUMAN Pyruvate kinase PKM OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PKM PE=1 SV=4;sp	2.1	58	531	1
O95613	HUMAN Pericentrin OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PCNT PE=1 SV=4	0.3	378	3336	1
Q96FV2	HUMAN Secernin-2 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=SCRN2 PE=1 SV=3	7.3	47	425	1
Q07955	HUMAN Serine/arginine-rich splicing factor 1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=SRSF1 PE=1 SV=2	12.1	28	248	1
O14979	HUMAN Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like OS=Homo sapiens OX=9606 GN=HNRNPDL PE=1 SV=3	1	6	6	1
P08727	HUMAN Keratin, type I cytoskeletal 19 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=KRT19 PE=1 SV=4;;;sp	1	2	1.8	1
Q14152	HUMAN Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit A OS=Homo sapiens OX=9606 GN=EIF3A PE=1 SV=1	1.3	167	1382	1
P15586	HUMAN N-acetylglucosamine-6-sulfatase OS=Homo sapiens OX=9606 GN=GNS PE=1 SV=3	2.4	62	552	1
Q96T58	HUMAN Msx2-interacting protein OS=Homo sapiens OX=9606 GN=SPEN PE=1 SV=1	1	1	0.6	1
P00734	HUMAN Prothrombin OS=Homo sapiens OX=9606 GN=F2 PE=1 SV=2	1	3	3.1	1
Q687X5	HUMAN Metalloreductase STEAP4 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=STEAP4 PE=1 SV=1	1	4	4.1	1
P23470	HUMAN Receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PTPRG PE=1 SV=4	1	0	0	1

호기에 함유된 비휘발성 유기 분자는 상기도 및 하기도 모두에서 유래할 수 있다. 위에서 설명한 연구에서 식별된 단백질들의 조직 기원을 밝히기 위하여, 식별된 단백질들을 기관지폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid: BALF)으로부터의 공개된 5개의 프로테옴 데이터베이스(proteome database)와 비교하였다. BALF 호흡 샘플링 방법은 하기도의 기원으로부터의 단백질을 생산하는 것으로 잘 알려져 있다. 비교에 따르면, 위에서 설명한 연구에서 식별된 약 63개의 단백질(표 2)이 BALF 단백질체학 데이터베이스(BALF proteomics databases)에서 보고된 것으로, 이는 본 명세서에 개시된 상기 예시적인 호흡 샘플 수집 시스템 및 방법이 폐 조직과 같은 하기도에서 유래하는 단백질들을 포착하는 데 효과적임을 시사한다. 박테리아나 바이러스와 상관관계가 있는 단백질은 확인되지 않았으며 이는 지원자들이 실제로 건강했음을 시사한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 상기 예시적인 방법 및 시스템은 호기에서 단백질의 식별에 기반한 호흡기 질환의 검출을 위한 진단 도구로서 사용될 수 있다.

실시예 4. 예시적 충전층 컬럼 (1001) 및 MALDI TOF -MS를 사용한 에어로졸화 된 박테리아 및 바이러스의 포착 및 분석

한 바이러스 샘플인 박테리오파지 MS2, 및 3개의 박테리아인 Escherichia coli (E. coli), Pseudomonas fluorescens 및 Yersinia rohdei는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)으로부터 입수하였다. 각 샘플 5μL를 200μL의 HPLC 등급 물 내에 준비하고 휴대형 Aeroneb Go 분무기(Philips)를 사용하여 50mL 튜브 내로 에어로졸화하였다. 25g 내지 35g의 C18 비드를 포함하는 수집 컬럼을 50mL 튜브의 바닥 근처에 유체 연결하고 펌프를 사용하여 상기 분무된 샘플을 상기 컬럼 내로 그리고 상기 컬럼을 통하여 끌어당겼다. 상기 펌프의 유속은 약 200mL/min으로 설정되었고 수집 시간은 약 10분이었다. 상기 수집 단계가 완료된 후, 상기 수집 컬럼을 400μL의 물로 4회 세척하였다. 이어서, 70% 이소프로판올 400μL로 상기 컬럼을 용리시켰다. 세척 용액과 용리 용액을 모두 수집하고 MALDI-TOFMS 분석을 위해 저장하였다.

CHCA(α-시아노-4-히드록시신남산) MALDI 매트릭스는 약 10㎎/mL의 농도에서 약 0.1% TFA(트리플루오로 아세트산)를 함유하는 약 50% 아세토니트릴 내에서 제조하였다. 약 1.5μL의 샘플을 약 0.5μL CHCA 매트릭스와 혼합하고 MALDI 플레이트에 적용하였다. 각각의 경우에, 상기 샘플이 충분히 건조된 후, 상기 플레이트를 Axima-CFR 비행시간 기기(Shimadzu Biotech에 의한 Kratos Analytical, Manchester, UK) 내에 삽입하였다. MALDI-TOF 질량 스펙트럼은 337㎚ N2 레이저(레이저 출력, 90 임의단위(arbitrary unit))를 사용하여 선형 모드에서 얻었고 모든 스펙트럼은 1000~15000m/z에서 평균 200개의 프로파일로 수집되었다.

도 8a는 E. coli(좌), Pseudomonas fluorescens(가운데) 및 Yersinia rohdei(우)의 대조군 샘플, 용리 샘플, 및 세척 샘플의 전체 세균 박테리아 분석의 MALDI 질량 스펙트럼을 나타낸다. 상기 박테리아 특징들은 용리 샘플에서 명확하게 볼 수 있지만 세척 샘플에서는 볼 수 없으며, 이는 상기 수집 컬럼이 에어로졸화된 박테리아를 포착할 수 있음을 나타낸다. 도 8b는, (A) 전체 바이러스 MS2 분석의 MALDI 질량 스펙트럼 및 (B) 바이러스 MS2의 고온 산 소화(hot acid digestion) 분석의 MALDI 질량 스펙트럼을 나타낸다. MALDI-TOF MS에서 MS2 캡시드 단백질(P03612)의 전체 질량과 그의 이중 하전 이온이 관찰되었다. 고온 산 소화 후, MALDI-TOF MS를 특징으로 하는 그의 소화된 펩티드뿐만 아니라 원형 캡시드 단백질(intact capsid protein)(빨간 점)이 관찰되었다.

요약서는 37 C.F.R. §1.72(b)에 따라 독자로 하여금 피상적인 검토로부터 기술 개시내용의 본질과 요지를 신속하게 결정할 수 있도록 한다. 이는 특허청구범위의 범위나 의미를 해석하거나 제한하는 데 사용되어서는 안 된다.

본 개시내용이 이를 실시하는 바람직한 형태와 관련하여 설명되었지만, 통상의 기술자는 본 개시의 정신을 벗어남이 없이 많은 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 개시내용의 범위는 위의 설명에 의해 어떤 방식으로든 제한되는 것으로 의도되지 않는다.

또한, 본 개시내용의 본질을 벗어남이 없이 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 변경들도 본 발명의 상세한 설명에 암시적으로 포함되는 것이다. 이것들은 여전히 본 개시내용의 범위에 속한다. 본 개시내용은 독립적으로 그리고 전체 시스템으로서, 그리고 방법 유형 및 장치 유형 모두에서, 본 개시내용의 다양한 측면을 포괄하는 특허를 산출하도록 의도된 것으로 이해되어야 한다.

또한, 본 개시내용 및 특허청구범위의 다양한 요소들 각각은 또한 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 본 개시내용은 임의의 장치 구현, 방법 구현 또는 프로세스 구현의 변형이든 간에, 또는 심지어 이들 중 단지 임의의 요소의 변형이든 간에, 그러한 각각의 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

특히, 각 요소에 대한 단어는 기능 또는 결과만이 동일하더라도 등가의 장치 용어 또는 방법 용어로 표현될 수 있음을 이해해야 한다. 이와 같은 동등하거나 더 광범위하거나 훨씬 더 일반적인 용어는 각 요소 또는 작용의 설명에 포함되는 것으로 간주되어야 한다. 이러한 용어는 본 개시내용의 권리가 주어지는 묵시적으로 광범위한 범위를 명시하도록 원하는 경우 대체될 수 있다. 모든 작용은 그 작용을 취하기 위한 수단으로 또는 그 작용을 유발하는 요소로 표현될 수 있음을 이해해야 한다. 유사하게, 개시된 각각의 물리적 요소는 그 물리적 요소가 용이하게 하는 작용의 개시를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

또한, 사용된 각 용어와 관련하여, 본 출원에서의 그 활용이 그러한 해석과 불일치하지 않는 한, 일반적인 사전적 정의는, 장인들에 의해 인정된 최신 기술사전들 중의 적어도 하나에 포함되어 있는 바와 같은, 각 용어 및 모든 정의, 대체 용어와 동의어에 대해 통합된 것으로 이해되어야 하고, Random House Webster의 Unabridged Dictionary(최신판)이 참조로 여기에 포함된다.

또한, 전환부 "포함하는(comprising)"의 사용은 전통적인 청구항 해석에 따라 여기서는 "개방형" 청구항을 유지하는 데 사용된다. 따라서, 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 명시된 요소나 단계, 또는 요소들 또는 단계들의 그룹을 포함하는 것을 의미하지만 다른 요소나 단계, 또는 요소들 또는 단계들의 그룹을 배제하지 않도록 의도된 것임이 이해되어야 한다. 이러한 용어는 법적으로 허용되는 가장 광범위한 범위를 본 출원인에게 제공하도록 가장 광범위한 형태로 해석되어야 한다.

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3. Dina Hashoul and Hossam Haick, "Sensors for detecting pulmonary diseases from exhaled breath," Eur. Respir. Rev. 2019; 28: 190011.

4. Hunt, J., "Exhaled breath condensate: An evolving tool for noninvasive evaluation of lung disease," J. Allergy Clin. Immunol. 2002; 110:28-34.

5. Maria D. King, Andrew R. McFarland, "Bioaerosol Sampling with a Wetted Wall Cyclone: Cell Culturability and DNA Integrity of Escherichia coli Bacteria," Aerosol Sci. Technol., 46:82-93, 2012.

6. James J. McDevitt, Petros Koutrakis, Stephen T. Ferguson, Jack M. Wolfson, M. Patricia Fabian, Marco Martins, Jovan Pantelic, and Donald K. Milton, "Development and Performance Evaluation of an Exhaled-Breath Bioaerosol Collector for Influenza Virus," Aerosol Sci. Technol. 2013 January 1; 47(4): 444-451.

7. Benjamin Patterson, Carl Morrow, Vinayak Singh, Atica Moosa, Melitta Gqada, Jeremy Woodward, Valerie Mizrahi, Wayne Bryden, Charles Call, Shwetak Patel, Digby Warner, Robin Wood, "Detection of Mycobacterium tuberculosis bacilli in bio-aerosols from untreated TB patients," Gates Open Research 2018, 1:11.

8. Wood R., Morrow C., Barry C.E., III, Bryden W.A., Call C.J., Hickey A.J., et al.: Real-Time Investigation of Tuberculosis Transmission: Developing the Respiratory Aerosol Sampling Chamber (RASC). PLoS One. 2016; 11(1): e0146658.

9. Rachel C. Wood, Angelique K. Luabeya, Kris M. Weigel, Alicia K. Wilbur, Lisa Jones-Engel, Mark Hatherill, and Gerard A. Cangelosi, "Detection of Mycobacterium tuberculosis DNA on the oral mucosa of tuberculosis patients," Sci. Rep. 5, 8668 (2015).

10. Fatima B. Wurie, Stephen D. Lawn, Helen Booth, Pam Sonnenberg, Andrew C. Hayward, "Bioaerosol production by patients with tuberculosis during normal tidal breathing: implications for transmission risk," Thorax 2016; 71: 549-554.

Claims

호기를 이용하여 하나 이상의 호흡기 질환을 진단하기 위한 호흡 샘플 수집 시스템에 있어서,
호기 중의 에어로졸화된 박테리아 및 바이러스 입자를 수집하기 위해 개인의 얼굴을 수용하도록 구성되되, 상기 개인의 얼굴에 밀착을 형성하는, 호흡 수집 요소;
상기 에어로졸화된 박테리아 및 바이러스 입자를 선택적으로 포착하도록 충전층 컬럼을 포함하되, 상호연결하는 튜브 없이 상기 개인의 얼굴 상에 상기 호흡 수집 요소가 배치될 때, 상기 개인의 턱에 근접하게 상기 호흡 수집 요소에 배치되는 포트에 제거 가능하게 그리고 직접 연결되는, 샘플 포착 요소; 및
상기 샘플 포착 요소와 유체 연통하고 호기를 상기 샘플 포착 요소 내로 끌어들이도록 구성되되, 상기 호흡 샘플 수집 시스템의 상기 입자의 포집 효율이 99%를 초과하는, 펌프를
포함하는 호흡 샘플 수집 시스템.
제1항에 있어서,
상기 충전층 컬럼이 수지, 셀룰로오스, 실리카, 아가로스 및 수화 Fe₃O₄나노입자 중의 하나 이상을 포함한 고체 입자를 포함하는 호흡 샘플 수집 시스템.
제1항에 있어서,
상기 충전층 컬럼이 표면상에 C18 작용기를 갖는 수지 비드를 포함하는 호흡 샘플 수집 시스템.
제3항에 있어서,
상기 수지 비드는 12±10% ㎛ 내지 20±10% ㎛의 공칭 직경을 갖는 호흡 샘플 수집 시스템.
제1항에 있어서,
상기 펌프에 의해 상기 충전층 컬럼을 통해 끌어 당겨지는 공칭 유속은 200±10% ㎖/min 내지 600±10 %㎖/min인 호흡 샘플 수집 시스템.
제1항에 있어서,
상기 호흡 수집 요소는 CPR 구조 마스크, CPAP 마스크 및 인공호흡기 마스크 중의 하나 이상을 포함하는 호흡 샘플 수집 시스템.
제1항에 있어서,
상기 샘플 포착 요소와 상기 펌프 간에 배치되고 상기 충전층을 통과하는 수증기, 휘발성 유기 성분 및 비휘발성 유기 성분 중의 하나 이상을 포함하는 호기 응축수(EBC)를 가두도록 구성된 트랩을 더 포함하되, 상기 트랩은 주위 온도 미만으로 냉각되는 호흡 샘플 수집 시스템.
제2항에 있어서,
상기 고체 입자는 상기 고체 입자의 표면에 고정화된 작용기를 포함하고, 상기 작용기는 C18(옥타데실), 옥틸, 에틸, 시클로헥실, 페닐, 시아노프로필, 아미노프로필, 2,3-디히드록시프로폭시프로필, 트리메틸-아미노프로필, 카르복시프로필, 벤젠술폰산, 프로필술폰산, 이온 교환 상, 폴리머상, 항체, 글리칸, 지질, DNA 및 RNA 중의 하나 이상을 포함하는 호흡 샘플 수집 시스템.
제1항에 있어서,
상기 샘플 포착 요소는 주위 온도 이하의 온도로 냉각되는 호흡 샘플 수집 시스템.
호기를 이용한 호흡기 질환의 진단을 위한 샘플 포착 요소에 있어서,
상기 샘플 포착 요소는 호기 중의 에어로졸화된 박테리아 및 바이러스 입자를 선택적으로 포착하기 위한 충전층 컬럼을 포함하되, 상기 호기는 펌프를 사용하여 상기 충전층 컬럼을 통해 끌어 당겨지고,
상기 충전층 컬럼은
수지, 셀룰로오스, 실리카, 아가로스 및 수화 Fe₃O₄ 나노입자 중의 하나 이상을 포함하고 12±10% ㎛ 내지 20±10% ㎛의 공칭 직경을 갖는 고체 입자; 및
상기 고체 입자 표면상에 고정화되고, C18(옥타데실), 옥틸, 에틸, 시클로헥실, 페닐, 시아노프로필, 아미노프로필, 2,3-디히드록시프로폭시프로필, 트리메틸-아미노프로필, 카르복시프로필, 벤젠술폰산, 프로필설폰산, 이온 교환 상, 폴리머 상, 항체, 글리칸, 지질, DNA 및 RNA 중의 하나 이상을 포함하는, 작용기를
포함하고,
상기 샘플 포착 요소의 상기 입자의 포집 효율은, 상기 펌프에 의해 상기 호기가 200±10% ㎖/min 내지 600±10% ㎖/min의 유속으로 상기 충전층 컬럼을 통해 끌어 당겨짐에 따라 99%를 초과하는, 샘플 포착 요소.
제10항에 있어서,
상기 고체 입자는 2개의 다공성 중합체 프릿 디스크 간에 충전된 샘플 포착 요소.
호기를 이용한 호흡기 질환 진단 시스템에 있어서,
제1항의 상기 호흡 샘플 수집 시스템;
상기 충전층 컬럼에서 포착된 박테리아 및 바이러스 입자를 추출하기 위한 샘플 추출 시스템; 및
샘플 플레이트 상에서 수집된 샘플을 처리하고 농축하기 위한 샘플 처리 시스템과, 상기 샘플을 분석하기 위한 진단 장치를 포함하는 샘플 분석 시스템을
포함하는 호흡기 질환 진단 시스템.
제12항에 있어서,
상기 진단 장치는 PCR, ELISA, rt-PCR, 질량 분석기(MS), MALDI-MS, ESI-MS, 및 MALDI-TOFMS 중의 하나 이상을 포함하는 호흡기 질환 진단 시스템.
제12항에 있어서,
상기 샘플 추출 시스템은 상기 충전층 컬럼을 용매로 플러싱하고 에어로졸화된 박테리아 및 바이러스 입자를 포함하는 상기 용매를 상기 충전층으로부터 제거하는 수단을 포함하는 호흡기 질환 진단 시스템.
제14항에 있어서,
상기 용매는 아세토니트릴, 메탄올, 산 및 이소프로판올 중의 하나 이상을 포함하고, 나머지는 물인 호흡기 질환 진단 시스템.
호기를 이용하여 하나 이상의 호흡기 질환을 진단하기 위한 호흡 샘플 수집 시스템에 있어서,
호기 중의 에어로졸화된 박테리아 및 바이러스 입자를 수집하기 위해 개인의 얼굴을 수용하도록 구성되는 마스크로서, 상기 마스크는 상기 개인의 얼굴에 밀착을 형성하고, 상기 마스크가 상기 개인의 얼굴 상에 배치될 때 상기 개인의 턱에 근접한 스템과 상기 스템 하부에 배치된 포트를 포함하는 것인, 마스크;
상기 마스크의 상기 스템에 제거 가능하게 그리고 유동적으로 연결된 HEPA 필터;
상기 에어로졸화된 박테리아 및 바이러스 입자를 선택적으로 포착하도록 충전층 컬럼을 포함하되, 상기 포트에 제거 가능하게 연결된 샘플 포착 요소; 및
상기 샘플 포착 요소와 유체 연통하고 호기를 상기 샘플 포착 요소 내로 끌어들이도록 구성된 펌프로서, 상기 펌프는
상기 펌프에 의해 상기 호기가 200±10% ㎖/min 내지 600±10% ㎖/min의 유속으로 상기 충전층 컬럼을 통해 끌어 당겨짐에 따라 상기 샘플 포착 요소의 상기 입자의 포집 효율이 99%를 초과하는 것인, 펌프를
포함하는 호흡 샘플 수집 시스템.
제16항에 있어서,
상기 충전층 컬럼은 수지, 셀룰로오스, 실리카, 아가로스 및 수화 Fe₃O₄나노입자 중의 하나 이상을 포함한 고체 입자를 포함하는 호흡 샘플 수집 시스템.
제16항에 있어서,
상기 충전층 컬럼은 표면에 C18 작용기를 갖는 수지 비드를 포함하는 호흡 샘플 수집 시스템.
제18항에 있어서,
상기 수지 비드는 12±10% ㎛ 내지 20±10% ㎛의 공칭 직경을 갖는 호흡 샘플 수집 시스템.
제12항에 있어서,
상기 샘플 처리 시스템은
상기 샘플 추출 시스템으로부터 추출된 상기 박테리아 및 바이러스 입자를 고온 산 소화하여 상기 입자의 펩티드 샘플 특징을 생성하는 수단;
상기 펩티드 샘플을 MALDI 매트릭스와 혼합하는 수단; 및
혼합된 상기 샘플과 MALDI 매트릭스를 샘플 플레이트에 적용하는 수단을
포함하는 호흡기 질환 진단 시스템.
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