CN111819284B - 3-羟基异丁酸酯和甲基丙烯酸酯的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种3‑羟基异丁酸酯的制造方法，其为使用生物催化剂的3‑羟基异丁酸酯的制造方法，包括在存在醇酰基转移酶的条件下使醇或酚类与3‑羟基异丁酰‑CoA作用而生成3‑羟基异丁酸酯的工序。

Description

3-羟基异丁酸酯和甲基丙烯酸酯的制造方法

技术领域

本发明涉及3-羟基异丁酸酯和甲基丙烯酸酯的制造方法。更详细地，涉及利用醇酰基转移酶的催化反应由3-羟基异丁酰-CoA生成3-羟基异丁酸酯的方法等。

背景技术

甲基丙烯酸酯主要作为丙烯酸树脂的原料使用，作为涂料、粘接剂和树脂改性剂等领域的共聚单体也有大量需要。甲基丙烯酸酯例如可以通过利用化学方法使3-羟基异丁酸酯脱水而生成。

醇酰基转移酶是作为果味合成酶为人知晓。专利文献1、2中公开了在存在醇酰基转移酶的条件下使醇或酚类与甲基丙烯酰-CoA作用从而生成甲基丙烯酸酯的反应。这些反应以由链烃构成的CoA化合物为起始物质。

在CoA化合物的链烃中导入了羟基时，可以预料CoA化合物的物理化学性质会发生变化，但对于由羟化的链烃构成的CoA化合物，尚不明确醇酰基转移酶是否能够催化其酯化。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开2014/038214号

专利文献2：国际公开2015/133146号

专利文献3：日本特开平7-17909号公报

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的主要目的在于，提供一种使用生物催化剂的3-羟基异丁酸酯的制造方法。

用于解决课题的方法

为了解决上述课题，本发明提供以下的[1]～[19]。

[1]一种3-羟基异丁酸酯的制造方法，包括在存在醇酰基转移酶的条件下使醇或酚类与3-羟基异丁酰-CoA作用而生成3-羟基异丁酸酯的工序。

[2]根据[1]的3-羟基异丁酸酯的制造方法，前述醇酰基转移酶来源于植物。

[3]根据[2]的3-羟基异丁酸酯的制造方法，前述植物属于锦葵目、蔷薇目或茄目。

[4]根据[2]的3-羟基异丁酸酯的制造方法，前述植物属于锦葵科、蔷薇科或茄科。

[5]根据[2]的3-羟基异丁酸酯的制造方法，前述植物属于榴莲属、苹果属或茄属。

[6]根据[2]的3-羟基异丁酸酯的制造方法，前述植物为榴莲、苹果或番茄。

[7]根据[1]～[6]中任一项的3-羟基异丁酸酯的制造方法，前述醇酰基转移酶包含以下(1)～(4)中的任一氨基酸序列：

(1)序列编号1、序列编号5或序列编号7的氨基酸序列。

(2)在序列编号1、序列编号5或序列编号7的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸的缺失、插入、替换和/或添加的氨基酸序列。

(3)相对于序列编号1、序列编号5或序列编号7的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列。

(4)在严格条件下与序列编号2、序列编号6或序列编号8的碱基序列的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列。

[8]根据[1]～[7]中任一项的3-羟基异丁酸酯的制造方法，使用表达前述醇酰基转移酶的基因重组微生物。

[9]根据[8]的3-羟基异丁酸酯的制造方法，3-羟基异丁酰-CoA是在前述微生物的生物体内由甲基丙烯酰-CoA合成的。

[10]一种甲基丙烯酸酯的制造方法，包括

在存在醇酰基转移酶的条件下使醇或酚类与3-羟基异丁酰-CoA作用而生成3-羟基异丁酸酯的工序，以及

通过3-羟基异丁酸酯的脱水反应生成甲基丙烯酸酯的工序。

[11]根据[10]的甲基丙烯酸酯的制造方法，前述醇酰基转移酶来源于植物。

[12]根据[11]的甲基丙烯酸酯的制造方法，前述植物属于锦葵目、蔷薇目或茄目。

[13]根据[11]的甲基丙烯酸酯的制造方法，前述植物属于锦葵科、蔷薇科或茄科。

[14]根据[11]的甲基丙烯酸酯的制造方法，前述植物属于榴莲属、苹果属或茄属。

[15]根据[11]的甲基丙烯酸酯的制造方法，前述植物为榴莲、苹果或番茄。

[16]根据[10]～[15]中任一项的甲基丙烯酸酯的制造方法，前述醇酰基转移酶包含以下(1)～(4)中的任一氨基酸序列：

(1)序列编号1、序列编号5或序列编号7的氨基酸序列。

(2)在序列编号1、序列编号5或序列编号7的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸的缺失、插入、替换和/或添加的氨基酸序列。

(3)相对于序列编号1、序列编号5或序列编号7的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列。

(4)在严格条件下与序列编号2、序列编号6或序列编号8的碱基序列的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列。

[17]根据[10]～[16]中任一项的甲基丙烯酸酯的制造方法，使用表达前述醇酰基转移酶的基因重组微生物。

[18]根据[17]的甲基丙烯酸酯的制造方法，3-羟基异丁酰-CoA是在前述微生物的生物体内由甲基丙烯酰-CoA合成的。

[19]以下(1)～(4)中的任一蛋白质。

(1)包含序列编号1的氨基酸序列的蛋白质。

(2)包含在序列编号1的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸的缺失、插入、替换和/或添加的氨基酸序列、且具有催化3-羟基异丁酰-CoA的酯化的醇酰基转移酶活性的蛋白质。

(3)包含序列编号1的氨基酸序列或相对于序列编号1的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列、且具有催化3-羟基异丁酰-CoA的酯化的醇酰基转移酶活性的蛋白质。

(4)包含在严格条件下与序列编号2的碱基序列或序列编号2的碱基序列的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列、且具有催化3-羟基异丁酰-CoA的酯化的醇酰基转移酶活性的蛋白质。

发明效果

根据本发明，提供一种使用生物催化剂的3-羟基异丁酸酯的制造方法。

具体实施方式

以下对用于实施本发明的优选方式进行说明。但以下说明的实施方式显示的是本发明代表性实施方式的一例，不能由此对本发明的范围进行狭隘的解释。

[3-羟基异丁酸酯和甲基丙烯酸酯的制造方法]

本发明涉及的3-羟基异丁酸酯的制造方法包括以下的“工序A”。此外，本发明涉及的甲基丙烯酸酯的制造方法除了工序A以外还包括以下的“工序B”。

工序A：在存在醇酰基转移酶的条件下使醇或酚类与3-羟基异丁酰-CoA作用而生成3-羟基异丁酸酯的工序。

工序B：通过3-羟基异丁酸酯的脱水反应生成甲基丙烯酸酯的工序。

将工序A和工序B示于下文。

[化1]

本发明中，“甲基丙烯酸酯”是式1所示化合物。式1中，R表示直链或支链的碳数1～20的烃基。烃基可以为饱和或不饱和的非环式，也可以为饱和或不饱和的环式。优选为直链或支链的碳数1～10的无取代烷基、芳烷基或芳基。特别优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、正己基、异己基、2-己基、二甲基丁基、乙基丁基、庚基、辛基、2-乙基己基等碳数1～8的烷基、苄基或苯基。

CH₂＝C(CH₃)COO-R (式1)

[醇·酚类]

工序A中使用的“醇”或“酚类”是以下的式2所示化合物。醇或酚类的结构对应于甲基丙烯酸酯，因而其结构与前述式1的R为同样的定义，表示直链或支链的碳数1～20的烃基。烃基可以为饱和或不饱和的非环式，也可以为饱和或不饱和的环式。优选为直链或支链的碳数1～10的无取代的醇、芳烷醇或酚类，更优选为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、叔戊醇、正己醇、异己醇、2-己醇、二甲基丁醇、乙基丁醇、庚醇、辛醇、2-乙基己醇等碳数1～8的烷基醇、苄基醇或酚。特别优选为甲醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、正己醇。

R-OH (式2)

[醇酰基转移酶]

醇酰基转移酶(以下也称为“AAT”)具有催化将酰基-CoA的酰基转移至醇或酚类而生成酯的反应的活性。据说，AAT与各种水果中酯的生成相关。已知AAT存在于姜目(香蕉)、蔷薇目(草莓、苹果、梨、桃子)、葫芦目(甜瓜)、杜鹃花目(猕猴桃)、唇形目(橄榄)、茄目(番茄)、无患子目(柠檬、芒果)等植物中。

特别地，工序A中使用的AAT具有催化将3-羟基异丁酰-CoA的酰基转移至醇或酚类而生成3-羟基异丁酸酯的反应的活性(以下也简单地称为“催化活性”或“AAT活性”)。

工序A中使用的AAT只要具有上述催化活性即可，其来源没有限定。AAT优选来源于植物。例如可以适当使用来自属于姜目(Zingiberales)、蔷薇目(Rosales)、杜鹃花目(Ericales)、葫芦目(Cucurbitales)、十字花目(Brassicales)、樟目(Laurales)、禾本目(Poales)、棕榈目(Arecales)、天门冬目(Asparagales)、虎耳草目(Saxifragales)、石竹目(Caryophyllales)、葡萄目(Vitales)、金虎尾目(Malpighiales)、酢浆草目(Oxalidales)、豆目(Fabales)、无患子目(Sapindales)、锦葵目(Malvales)、桃金娘目(Myrtales)、毛莨目(Ranunculales)、茄目(Solanales)、唇形目(Lamiales)、龙胆目(Gentianales)、木兰目(Magnoliales)和菊目(Asterales)各个目的植物的AAT。其中，更优选来自属于锦葵目、蔷薇目和茄目的植物的AAT。

其中，本发明中，植物的分类按照APG植物分类体系第3版(Botanical Journal ofthe Linnean Society(林奈学会植物学杂质)，2009，161，105121)进行。

AAT可以通过以下方法容易地从前述植物获得。即，首先根据需要将植物组织的合适部位切断。在切断的部位添加含有3-羟基异丁酰-CoA以及醇或酚类的溶液并振荡，使其反应一定时间。通过GC(气相色谱)确认反应液中3-羟基异丁酸酯的有无，从而确认催化活性。具体地，例如将叶、花、花蕾、果肉或果皮切断，添加含有0.01～10mM的3-羟基异丁酰-CoA和2～50倍摩尔量的正丁醇的溶液，在30℃振荡1～10小时。反应结束后，通过GC确认3-羟基异丁酸丁酯的有无，从而能够获得可在本发明中利用的AAT。

作为属于姜目的植物，芭蕉科(Musaceae)和姜科(Zingiberaceae)是优选的；

作为属于蔷薇目的植物，蔷薇科(Rosaceae)和桑科(Moraceae)是优选的；

作为属于杜鹃花目的植物，杜鹃花科(Ericaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、柿科(Ebenaceae)和茶科(Theaceae)是优选的；

作为属于葫芦目的植物，葫芦科(Cucurbitaceae)是优选的；

作为属于十字花目的植物，番木瓜科(Caricaceae)和十字花科(Brassicaceae)是优选的；

作为属于樟目的植物，樟科(Lauraceae)是优选的；

作为属于禾本目的植物，凤梨科(Bromeliaceae)和禾本科(Poaceae)是优选的；

作为属于棕榈目的植物，棕榈科(Arecaceae)是优选的；

作为属于天门冬目的植物，兰科(Orchidaceae)和鸢尾科(Iridaceae)是优选的；

作为属于虎耳草目的植物，茶藨子科(Grossulariaceae)是优选的；

作为属于石竹目的植物，石竹科(Caryophyllaceae)是优选的；

作为属于葡萄目的植物，葡萄科(Vitaceae)是优选的；

作为属于金虎尾目的植物，金虎尾科(Malpighiaceae)、西番莲科(Passifloraceae)、大戟科(Euphorbiaceae)和杨柳科(Salicaceae)是优选的；

作为属于酢浆草目的植物，酢浆草科(Oxalidaceae)是优选的；

作为属于豆目的植物，豆科(Fabaceae)是优选的；

作为属于无患子目的植物，漆树科(Anacardiaceae)、熏倒牛科(Biebersteiniaceae)、橄榄科(Burseraceae)、四合椿科(Kirkiaceae)、楝科(Meliaceae)、白刺科(Nitrariaceae)、芸香科(Rutaceae)、无患子科(Sapindaceae)和苦木科(Simaroubaceae)是优选的；

作为属于锦葵目的植物，红木科(Bixaceae)、半日花科(Cistaceae)、岩寄生科(Cytinaceae)、龙脑香科(Dipterocarpaceae)、锦葵科(Malvaceae)、文定果科(Muntingiaceae)、沙莓草科(Neuradaceae)、苞杯花科(Sarcolaenaceae)、球萼树科(Sphaerosepalaceae)和瑞香科(Thymelaeaceae)是优选的；

作为属于桃金娘目的植物，千屈菜科(Lythraceae)、柳叶菜科(Onagraceae)和桃金娘科(Myrtaceae)是优选的；

作为属于毛莨目的植物，毛茛科(Ranunculaceae)和罂粟科(Papaveraceae)是优选的；

作为属于茄目的植物，茄科(Solanaceae)是优选的；

作为属于唇形目的植物，爵床科(Acanthaceae)、紫葳科(Bignoniaceae)、腺毛草科(Byblidaceae)、蒲包花科(Calceolariaceae)、香茜科(Carlemanniaceae)、苦苣苔科(Gesneriaceae)、唇形科(Lamiaceae)、母草科(Linderniaceae)、狸藻科(Lentibulariaceae)、角胡麻科(Martyniaceae)、木犀科(Oleaceae)、列当科(Orobanchaceae)、泡桐科(Paulowniaceae)、胡麻科(Pedaliaceae)、透骨草科(Phrymaceae)、车前科(Plantaginaceae)、环生籽科(Plocospermataceae)、钟萼桐科(Schlegeliaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、密穗草科(Stilbaceae)、四粉草科(Tetrachondraceae)、猩猩茶科(Thomandersiaceae)和马鞭草科(Verbenaceae)是优选的；

作为属于龙胆目的植物，夹竹桃科(Apocynaceae)是优选的；

作为属于木兰目的植物，番荔枝科(Annonaceae)、单心木兰科(Degeneriaceae)、帽花木科(Eupomatiaceae)、舌蕊花科(Himantandraceae)、木兰科(Magnoliaceae)和肉豆蔻科(Myristicacea)是优选的；

作为属于菊目的植物，假海桐科(Alseuosmiaceae)、雪叶科(Argophyllaceae)、菊科(Asteraceae)、萼角花科(Calyceraceae)、桔梗科(Campanulaceae)、草海桐科(Goodeniaceae)、睡菜科(Menyanthaceae)、五膜草科(Pentaphragmataceae)、新冬青科(Phellinaceae)、守宫花科(Rousseaceae)和花柱草科(Stylidiaceae)的植物是优选的。也可以利用上述植物的近缘物种。

其中，更优选属于锦葵科、蔷薇科或茄科的植物。

作为属于芭蕉科的植物，芭蕉(Musa)属是优选的；

作为属于姜科(Zingiberaceae)的植物，姜属(Zingiber)是优选的；

作为属于蔷薇科的植物，草莓(Fragaria)属、苹果(Malus)属、李(Prunus)属、梨(Pyrus)属、枇杷(Eriobotrya)属、木瓜(Chaenomeles)属、悬钩子(Rubus)属和蔷薇(Rosa)属是优选的；

作为属于桑科(Moraceae)的植物，榕(Ficus)属是优选的；

作为属于杜鹃花科的植物，越橘(Vaccinium)属是优选的；

作为属于猕猴桃科的植物，猕猴桃(Actinidia)属是优选的；

作为属于柿科的植物，柿(Diospyros)属是优选的；

作为属于茶科的植物，茶(Camellia)属是优选的；

作为属于葫芦科的植物，黄瓜(Cucumis)属和西瓜(Citrullus)属是优选的；

作为属于番木瓜科的植物，番木瓜(Carica)属和徒木瓜(Vasconcellea)属是优选的；

作为属于十字花科的植物，拟南芥(Arabidopsis)属是优选的；

作为属于樟科的植物，鳄梨(Persea)属是优选的；

作为属于凤梨科的植物，凤梨属(Ananas)是优选的；

作为属于禾本科的植物，稻(Oryza)属、小麦(Triticum)属、大麦(Hordeum)属、玉蜀黍(Zea)属、高粱(Sorghum)属和短柄草(Brachypodium)属是优选的；

作为属于棕榈科的植物，椰子(Cocos)属是优选的；

作为属于兰科的植物，万代兰(Vanda)属是优选的；

作为属于鸢尾科的植物，鸢尾(Iris)属是优选的；

作为属于茶藨子科的植物，茶藨子(Ribes)属是优选的；

作为属于石竹科的植物，石头花属(Gypsophila)是优选的；

作为属于葡萄科的植物，葡萄属(Vitis)、蛇葡萄属(Ampelopsis)、乌蔹莓属(Cayratia)、白粉藤属(Cissus)、葡萄瓮属(Cyphostemma)、火筒树属(Leea)、地锦属(Parthenocissus)和崖爬藤属(Tetrastigma)是优选的；

作为属于金虎尾科的植物，金虎尾(Malpighia)属是优选的；

作为属于西番莲科的植物，西番莲(Passiflora)属是优选的；

作为属于大戟科的植物，蓖麻(Ricinus)属是优选的；

作为属于杨柳科的植物，杨(Populus)属是优选的；

作为属于酢浆草科的植物，阳桃(Averrhoa)属是优选的；

作为属于豆科的植物，苜蓿(Medicago)属、羽扇豆(Lupinus)属、大豆(Glycine)属和蝶豆(Clitoria)属是优选的；

作为属于漆树科的植物，芒果(Mangifera)属是优选的；

作为属于芸香科的植物，柑橘属(Citrus)、木橘属(Aegle)、花椒属(Zanthoxylum)、九里香属(Murraya)、芸香属(Ruta)、臭常山属(Orixa)、茵芋属(Skimmia)、洋茱萸属(Euodia)、黄檗属(Phellodendron)、波罗尼亚属(Boronia)、山油柑属(Acronychia)、黄皮属(Clausena)、钟南香属(Correa)、山小橘属(Glycosmis)和蜜茱萸属(Melicope)是优选的；

作为属于无患子科的植物，荔枝(Litchi)属是优选的；

作为属于锦葵科的植物，榴莲属(Durio)、可可属(Theobroma)、苘麻属(Abutilon)、秋葵属(Abelmoschus)、棉属(Gossypium)、粉葵属(Pavonia)、木槿属(Hibiscus)、黄花稔属(Sida)和锦葵属(Malva)是优选的；

作为属于千屈菜科的植物，石榴(Punica)属是优选的；作为属于柳叶菜科的植物，山字草(Clarkia)属是优选的；

作为属于桃金娘科的植物，番石榴(Psidium)属是优选的；

作为属于毛茛科的植物，类叶升麻(Actaea)属；作为属于罂粟科的植物，罂粟(Papaver)属是优选的；

作为属于茄科的植物，茄(Solanum)属、辣椒(Capsicum)属、烟草(Nicotiana)属和矮牵牛(Petunia)属是优选的；

作为属于木犀科的植物，木犀属(Osmanthus)和橄榄属(Olea)、茉莉属(Jasminum)、连翘属(Forsythia)、丁香属(Syringa)、流苏树属(Chionanthus)梣属(Fraxinus)和女贞属(Ligustrum)是优选的；

作为属于唇形科的植物，鼠尾草(Salvia)属是优选的；

作为属于马鞭草科的植物，美女樱(Glandularia)属是优选的；

作为属于夹竹桃科的植物，萝芙木(Rauvolfia)属和长春花(Catharanthus)属是优选的；

作为属于木兰科的植物，木兰属(Magnolia)是优选的；

作为属于菊科的植物，果香菊属(Chamaemelum)、蓍属(Achillea)、紫松果菊属(Echinacea)、洋甘菊属(Matricaria)、菊蒿属(Tanacetum)、蒲公英属(Taraxacum)、蒿属(Artemisia)、蜂斗菜属(Petasites)、蜡菊属(Helichrysum)、药麻菊属(Santolina)、菜蓟属(Cynara)、水飞蓟属(Silybum)、金盏花属(Calendula)、菊苣属(Cichorium)、番红花属(Carthamus)和菊属(Chrysanthemum)的植物是优选的。

其中，更优选属于榴莲属、苹果属或茄属的植物。

作为属于芭蕉属的植物，大蕉(Musaxparadisiaca)、芭蕉(Musabasjoo)、红花蕉(Musacoccinea)和小果野蕉(Musaacuminata)是优选的；

作为属于姜属的植物，姜(Zingiberofficinale)是优选的；

作为属于草莓属的植物，草莓(Fragariaxananassa)、弗州草莓(Fragariavirginiana)、智利草莓(Fragariachiloensis)和野草莓(Fragariavesca)是优选的；

作为属于苹果属的植物，苹果(Maluspumila、Malusdomestica、Malusbaccata)、垂丝海棠(Malushalliana)、多花海棠(Malusfloribunda)和楸子(Malusprunifolia)是优选的；

作为属于李属的植物，梅(Prunusmume)、欧洲甜樱桃(Prunusavium)、桃子(Prunuspersica)、杏(Prunusarmeniaca)、扁桃(Prunusdulcis)、李子(Prunussalicina)和欧洲李(Prunusdomestica)是优选的；

作为属于梨属的植物，西洋梨(Pyruscommunis)、沙梨(Pyruspyrifolia)、豆梨(Pyruscalleryana)和野生梨(Pyruspyraster)是优选的；

作为属于枇杷属的植物，枇杷(Eriobotryajaponica)是优选的；

作为属于木瓜属的植物，木瓜(Chaenomelessinensis)是优选的；

作为属于悬钩子属的植物，覆盆子(Rubusidaeus)和黑莓(Rubusfruticosus)是优选的；

作为属于蔷薇属的植物，玫瑰(Rosarugosa)是优选的；

作为属于榕属的植物，无花果(Ficuscarica)是优选的；

作为属于越橘属的植物，蓝莓(Vacciniumcorymbosum(伞房花越橘)、Vacciniumangustifolium(狭叶越橘))、欧洲越橘(Vacciniummyrtillus)、越橘(Vacciniumvitis-idaea)和红莓苔子(Vacciniumoxycoccos)是优选的；

作为属于猕猴桃属的植物，猕猴桃(Actinidiachinensis、Actinidiadeliciosa)、软枣猕猴桃(Actinidiaarguta)、褐枝猕猴桃(Actinidiarufa)和褐枣猕猴桃(Actinidiapolygama)是优选的；

作为属于柿属的植物，柿(Diospyroskaki)是优选的；

作为属于茶属的植物，茶(Camelliasinensis)是优选的；

作为属于黄瓜属的植物，黄瓜(Cucumissativus)、甜瓜(Cucumismelo)、小黄瓜(Cucumisanguria)和刺角瓜(Cucumismetulifer)是优选的；

作为属于西瓜属的植物，西瓜(Citrulluslanatus)是优选的；

作为属于番木瓜属的植物，番木瓜(Caricapapaya)是优选的；

作为属于徒木瓜属的植物，徒木瓜(Vasconcelleacundinamarcensis)是优选的；

作为属于拟南芥属的植物，拟南芥(Arabidopsisthaliana)和琴叶拟南芥(Arabidopsislyrata)是优选的；

作为属于鳄梨属的植物，鳄梨(Perseaamericana)是优选的；

作为属于凤梨属的植物，菠萝(Ananascomosus)是优选的；

作为属于稻属的植物，稻(Oryzasativa)是优选的；

作为属于小麦属的植物，小麦(Triticumaestivum)是优选的；

作为属于大麦属的植物，大麦(Hordeumvulgare)是优选的；

作为属于玉蜀黍属的植物，玉蜀黍(Zeamays)是优选的；

作为属于高粱属的植物，高粱(Sorghumbicolor)是优选的；

作为属于短柄草属的植物，二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)是优选的；

作为属于椰子属的植物，椰子(Cocosnucifera)是优选的；

作为属于万代兰属的植物，万代兰(Vandahybridcultivar)是优选的；

作为属于鸢尾属的植物，荷兰鸢尾(Irisxhollandica)是优选的；

作为属于茶藨子属的植物，黑茶镳子(Cassis)(Ribesnigrum)是优选的；

作为属于石头花属的植物，石头花(Gypsophilapaniculata(圆锥石头花)、Gypsophilaelegans(霞草))是优选的；

作为属于葡萄属的植物，葡萄(Vitisvinifera(欧洲葡萄)、Vitislabrusca(美洲葡萄))、夏葡萄(Vitisaestivalis)、毛葡萄(Vitiscoignetiae)和桑叶葡萄(Vitisficifolia)是优选的；

作为属于金虎尾属的植物，光滑金虎尾(Malpighiaglabra)是优选的；

作为属于西番莲属的植物，鸡蛋果(Passifloraedulis)是优选的；

作为属于蓖麻属的植物，蓖麻(Ricinuscommunis)是优选的；

作为属于杨属的植物，毛果杨(Populustrichocarpa)是优选的；

作为属于阳桃属的植物，阳桃(Averrhoacarambola)是优选的；

作为属于苜蓿属的植物，蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)是优选的；

作为属于羽扇豆属的植物，羽扇豆(白花羽扇豆)(Lupinusalbus)是优选的；

作为属于大豆属的植物，大豆(Glycinemax)是优选的；

作为属于蝶豆属的植物，蝶豆(Clitoriaternatea)是优选的；

作为属于芒果属的植物，芒果(Mangiferaindica)是优选的；

作为属于榴莲属的植物，榴莲(Duriozibethinus(榴莲)、Duriotestudinarius(龟榴莲)、Duriokutejensis(古泰榴莲)、Duriooxleyanus(奥氏榴莲)、Duriograveolens(臭榴莲)、Duriodulcis(红壳榴莲))是优选的；

作为属于柑橘属的植物，柠檬(Citruslimon)、酢橘(Citrussudachi)、香母酢(Citrussphaerocarpa)、葡萄柚(Citrusxparadisi)、香橙(Citrusjunos)、来檬(Citrusaurantifolia)、温州蜜柑(Citrusunshiu)和甜橙(Citrussinensis)；

作为属于木橘属的植物，木橘(Aeglemarmelos)是优选的；

作为属于荔枝属的植物，荔枝(Litchichinensis)是优选的；

作为属于可可属的植物，可可(Theobromacacao)是优选的；

作为属于石榴属的植物，石榴(Punicagranatum)是优选的；

作为属于山字草属的植物，仙花扇(fairyfans)(Clarkiabreweri，啤酒花)和红丝带(Redribbons)(Clarkiaconcinna，矮古代稀)是优选的；

作为属于番石榴属的植物，番石榴(Psidiumguajava)是优选的；

作为属于类叶升麻属的植物，美类叶升麻(Actaearacemosa)是优选的；

作为属于罂粟属的植物，罂粟(Papaversomniferum)、东方罂粟(Papaverorientale)和大红罂粟(Papaverbracteatum)是优选的；

作为属于茄属的植物，番茄(Solanumlycopersicum)是优选的；

作为属于辣椒属的植物，番椒(Capsicumannuum)和中华辣椒(Capsicumchinense)是优选的；

作为属于烟草属的植物，烟草(Nicotianatabacum(普通烟草)、Nicotianaattenuata(渐狭叶烟草))是优选的；

作为属于矮牵牛属的植物，矮牵牛(Petuniaxhybrida)是优选的；

作为属于木犀属的植物，木犀(银木犀、金木犀、薄黄木犀、白木犀)(Osmanthusfragrans)、柊树(Osmanthusheterophyllus)、厚边木犀(Osmanthusmarginatus)、齿叶木犀(Osmanthus×fortunei)和岛屿木犀(Osmanthusinsularis)是优选的；

作为属于橄榄属的植物，油橄榄(Oleaeuropaea)是优选的；

作为属于鼠尾草属的植物，一串红(Salviasplendens)是优选的；

作为属于美女樱属的植物，美女樱(Glandulariaxhybrida)是优选的；

作为属于萝芙木属的植物，印度萝芙木(Rauvolfiaserpentina)是优选的；

作为属于长春花属的植物，长春花(Catharanthusroseus)是优选的；

作为属于木兰属的植物，含笑花(Magnoliafigo)、台湾含笑(Magnoliacompressa)、黄兰含笑(Magnoliachampaca)、紫玉兰(Magnolialiliiflora)、日本辛夷(Magnoliakobus)、木兰(Magnoliaobovata(日本厚朴)和Magnolialaevifolia(溜叶含笑))是优选的；

作为属于果香菊属的植物，果香菊(Chamaemelumnobile和Chamaemelumfuscatum)是优选的。

其中，更优选榴莲、苹果或番茄。

榴莲AAT包含序列编号1的氨基酸序列。将与序列编号1的氨基酸序列对应的碱基序列示于序列编号2。此外，苹果AAT可以包含序列编号3的氨基酸序列或序列编号7的氨基酸序列。包含序列编号3的氨基酸序列的苹果AAT为野生型，包含序列编号7的氨基酸序列的AAT是野生型AAT的48位、167位、270位、274位和447位的半胱氨酸全部替换为丙氨酸、150位的半胱氨酸替换为精氨酸、且具有A64V、K117Q、V248A和Q363K四重突变的突变型AAT(参照日本特愿2017-538070号)。与序列编号3的氨基酸序列和序列编号7的氨基酸序列对应的碱基序列分别示于序列编号4和序列编号8。

番茄AAT可以包含序列编号5的氨基酸序列。包含序列编号5的氨基酸序列的番茄AAT是番茄(野生物种)野生型AAT的第2个氨基酸由丙氨酸替换为赖氨酸的番茄(野生物种)A2K型AAT。将与序列编号5的氨基酸序列对应的碱基序列示于序列编号6。

AAT优选包含序列编号1、3、5或7的氨基酸序列，更优选包含序列编号1、5或7的氨基酸序列。

AAT例如也可以使用包含在序列编号1、3、5或7的氨基酸序列中、优选在序列编号1、5或7的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸的缺失、插入、替换和/或添加的氨基酸序列的蛋白质。这里，上述蛋白质维持了催化3-羟基异丁酰-CoA的酯化的醇酰基转移酶活性。

这里，“多个”是指1～40个，优选为1～20个，更优选为1～10个，特别优选为5个以下。在氨基酸序列中导入缺失等时，可以通过Kunkel法、Gapped duplex法等公知方法，使用利用定点诱变方法的突变导入用试剂盒，例如QuikChangeTM Site-Directed MutagenesisKit(Stratagene公司)、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等，宝生物公司)等。或者，也可以人工合成具有包含缺失等的序列的整个基因。

此外，AAT例如也可以使用包含相对于序列编号1、3、5或7的氨基酸序列、优选相对于序列编号1、5或7的氨基酸序列具有80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为99.5％以上、特别优选为99.9％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。这里，上述蛋白质维持了催化3-羟基异丁酰-CoA的酯化的醇酰基转移酶活性。

这里，“序列同一性”是，以要进行比较的2条氨基酸序列的残基尽可能多地一致的方式使两条序列对齐，将用一致的残基数除以总残基数而得的值用百分率表示。上述对齐时，根据需要在进行比较的两条序列的一方或双方中插入适当的间隔。这样的序列的对齐例如可以使用BLAST、FASTA、CLUSTALW等公知的程序来进行。插入有间隔的情况下，上述总残基数是将1个间隔作为1个残基计算而得的残基数。以这种方式计算的总残基数在进行比较的2条序列间不同的情况下，用一致的残基数除以较长的序列的总残基数，算出同一性(％)。

进一步，AAT例如也可以使用包含在严格条件下与序列编号2、4、6或8的碱基序列的互补链、优选为序列编号2、6或8的碱基序列的互补链杂交的DNA所编码的氨基酸序列的蛋白质。这里，上述蛋白质维持了催化3-羟基异丁酰-CoA的酯化的醇酰基转移酶活性。

作为严格的条件，例如可以列举将固定有DNA的尼龙膜在含有6×SSC(1×SSC是将氯化钠8.76g、柠檬酸钠4.41g溶于1升水中而成)、1％SDS、100μg/ml鲑鱼精子DNA、0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficoll的溶液中与探针一起在65℃保温20小时进行杂交的条件，但不限定于该条件。只要是本领域技术人员，则可以在这样的缓冲液的盐浓度、温度等条件的基础上一并考虑其他的探针浓度、探针长度、反应时间等各项条件来设定杂交的条件。作为杂交后的洗涤条件，可以列举例如“2×SSC、0.1％SDS、42℃”、“1×SSC、0.1％SDS、37℃”，作为更严格的条件，可以列举例如“1×SSC、0.1％SDS、65℃”、“0.5×SSC、0.1％SDS、50℃”等条件。

关于杂交方法的详细步骤，可以参考《分子克隆实验指南(第二版)》(MolecularCloning，A Laboratory Manual 2nd ed.)(冷泉港实验室出版社(1989))、《最新分子生物学实验方法汇编》(Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons(1987-1997))等。

将AAT用于反应时，只要显示前述催化活性即可，其使用形态没有特别限定，也可以直接使用含有AAT的生物组织或其处理物。作为这样的生物组织，可以使用整个植物体、植物器官(例如果实、叶、花朵、茎、种子等)、植物组织(例如果实表皮、果肉等)。作为生物组织的处理物，可列举从生物组织提取的AAT粗酶液或纯化酶等。

作为纯化AAT的方法没有特别限制，可以优选通过以下的方法纯化。将上述植物的具有AAT活性的组织破碎后，悬浮在Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液等缓冲液中。关于该粗酶液，单独或适当组合应用在酶的纯化中常用的(1)利用沉淀进行分级、(2)各种色谱、(3)利用透析、超滤等将低分子物质除去的方法等。

作为AAT的纯化方法，优选的方式如下。将生物组织用液氮等冷冻并研磨后，用含有5倍量的DTT(二硫苏糖醇)和甘油等的Tris-HCl缓冲液提取。接下来，将粗酶提取液用于离子交换色谱，回收其非吸附部分，从而获得酶提取液。对于一些粗酶提取液的制备方法进行了研究，结果判明，通过该方法，能够排除植物含有的多酚的影响，稳定且有效地获得。可以将得到的酶提取液用于离子交换色谱、凝胶过滤柱等，高效纯化酶蛋白质。

[AAT表达基因重组微生物]

将AAT用于反应时，也可以分离AAT基因、导入至一般的宿主载体体系、利用用该载体体系转化的微生物。作为宿主，细菌中可列举大肠杆菌、红球菌属(Rhodococcus属)、假单胞菌属(Pseudomonas属)、棒杆菌属(Corynebacterium属)、芽孢杆菌属(Bacillus属)、链球菌属(Streptococcus属)、链霉菌属(Streptomyces属)等，酵母中可列举酵母属(Saccharomyces属)、念珠菌属(Candida属)、裂殖酵母属(Shizosaccharomyces属)、毕赤酵母属(Pichia属)，丝状真菌中可列举曲霉属(Aspergillus属)等。其中，特别是大肠杆菌，使用简便，效率也高，是优选的。

公知的AAT基因的分离可以利用数据库公开的基因信息、使用PCR等通用的分子生物学方法来进行。此外，还可以通过通常的方法合成整个AAT基因的碱基序列。另一方面，基因信息未知的AAT也可以通过利用基于纯化的蛋白质的氨基酸序列通过分子生物学方法推测的基因的序列信息，与公知的AAT基因同样地分离。公知或新的AAT是否具有本发明的催化活性可以通过前述方法来确认。

可以直接使用对重组微生物进行培养而得到的培养液，或者使用通过离心分离等集菌操作而从该培养液得到的菌体或其处理物等。作为菌体处理物，可列举用丙酮和甲苯等处理的菌体、冷冻干燥菌体、菌体破碎物、将菌体破碎而得的无细胞提取物、以及从它们提取酶而得的粗酶或纯化酶等。

3-羟基异丁酰-CoA可以在微生物的生物体内由甲基丙烯酰-CoA合成。

醇酰基转移酶不仅对3-羟基异丁酰-CoA具有反应性，对甲基丙烯酰-CoA也具有反应性，从甲基丙烯酰-CoA生成甲基丙烯酸酯。如果醇酰基转移酶对甲基丙烯酰-CoA具有高反应性，则在由3-羟基异丁酰-CoA向3-羟基异丁酸酯的反应中发挥功能的醇酰基转移酶的量减少。结果，作为目标的3-羟基异丁酸酯的生成效率降低。

因此，为了高效地由3-羟基异丁酰-CoA生成3-羟基异丁酸酯，醇酰基转移酶优选使用对甲基丙烯酰-CoA的活性与对3-羟基异丁酰-CoA的活性之比(对3-羟基异丁酰-CoA活性/对甲基丙烯酰-CoA活性)更高的酶。作为这样的醇酰基转移酶，可以适当采用榴莲的醇酰基转移酶(参照实施例4)。

3-羟基异丁酸酯和作为其原料的3-羟基异丁酰-CoA与甲基丙烯酸酯和可作为其原料的甲基丙烯酸和甲基丙烯酰-CoA不同，不具有反应性高的α位双键，因此毒性低。此外，3-羟基异丁酸酯与甲基丙烯酸相比具有高水溶性。以毒性低且水溶性高的3-羟基异丁酸酯为原料的本发明涉及的甲基丙烯酸酯的制造方法尤其在利用微生物的反应体系中发挥有利的效果。

在工序A中，在溶剂中添加3-羟基异丁酰CoA和醇或酚类，使其溶解或悬浮。然后，使AAT与该溶液或悬浊液接触，在控制温度等条件的同时使3-羟基异丁酰CoA与醇或酚类反应。通过前述反应，3-羟基异丁酰CoA的3-羟基异丁酰基被转移至醇或酚类，生成3-羟基异丁酸酯。

溶剂通常使用缓冲液等水性溶剂。

使用菌体的情况下，为了使反应顺利进行，可以利用渗透压调节剂等来控制摩尔渗透压浓度和/或离子强度。作为渗透压调节剂，只要是出于调节为相对于菌体内细胞液的渗透压为等渗或高渗的方式的目的而加入的水溶性物质即可，例如为盐或糖类，优选为盐。盐优选为金属盐，更优选为碱金属盐，更优选为卤化碱金属，例如可列举氯化钠、氯化钾。糖类优选为单糖类或寡糖类，更优选为单糖类或二糖类，例如可列举葡萄糖、蔗糖、甘露醇等。渗透压调节剂优选以1mM以上的浓度添加，特别优选以与使用的菌体内细胞液相比为等渗或高渗的方式进行调节。

此外，出于将生成的3-羟基异丁酸酯分离的目的，也可以预先添加有机溶剂，在2相体系中反应。作为有机溶剂，例如可以单独使用或混合使用2种以上直链状、支链状或环状的、饱和或不饱和脂肪族烃、饱和或不饱和芳香族烃等。具体地，可列举例如烃系溶剂(例如戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯、二甲苯等)、卤化烃系溶剂(例如二氯甲烷、氯仿等)、醚系溶剂(例如乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、叔丁基甲基醚、二甲氧基乙烷等)、酯系溶剂(例如甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸甲酯)等。有时，通过添加有这些有机溶剂，3-羟基异丁酸酯移至有机相，反应有效地进行。

3-羟基异丁酰CoA和醇或酚类以及AAT的摩尔比和浓度没有特别限制，可以适当调节。例如，3-羟基异丁酰CoA和醇或酚类以及AAT优选为100pM～10mM:10μM～1M:1pM～10mM。反应温度或反应时间等各种条件也没有特别限定，可以适当确定。反应温度和反应时间通常设为5～80℃20分钟～1周，优选为10～70℃20分钟～120小时，更优选为同一温度域20分钟～60小时，进一步优选为20分钟～40小时。反应液的pH也没有特别限定，例如在pH4～10的范围，优选为pH5.0～9.0。

[3-羟基异丁酸酯的脱水反应]

在工序B中，通过以往公知的化学方法使3-羟基异丁酸酯脱水，生成甲基丙烯酸酯。

作为化学方法，例如可以采用专利文献3中记载的方法。具体地，可以通过使用二氧化硅、二氧化硅-氧化铝、沸石和固体磷酸等固体催化剂的、常压、温度200～500℃下的气相反应来脱水。此外，也可以通过使用硫酸和磷酸等的液相反应进行脱水。

生成的甲基丙烯酸酯可以通过高速液相色谱和LC-MS等通常的方法来检测、定量。此外，在培养容器或反应容器的气相部(头部空间部)中挥发的甲基丙烯酸酯可以使用气相色谱等通常的方法来检测、定量。

关于甲基丙烯酸酯从反应液的分离，可以根据需要适当组合进行过滤、离心分离、真空浓缩、离子交换或吸附色谱、溶剂提取、蒸馏和结晶等公知的操作。得到的甲基丙烯酸酯可以作为丙烯酸树脂的原料、涂料、粘接剂和树脂改性剂等的共聚单体利用。

[实施例]

[实施例1：榴莲AAT的活性测定]

1.榴莲AAT的纯化

将榴莲(Durio zibethinus)的果实在液氮中研磨成粉末状，悬浮在缓冲液(200mMTris-HCl(pH8.0)、5mM 2-巯基乙醇)中，用纱布过滤。对滤液离心分离，分离出上清。在上清中加入己烷并混和后，通过离心分离使油层和水层分离，得到作为粗酶液的水层。通过后述方法测定粗酶液的AAT活性。

在粗酶液中添加硫酸铵，在缓冲液A(20mM Tris-HCl(pH8.0),5mM 2-巯基乙醇)中对添加浓度30％～60％的级分进行透析(透析级分1)。

将透析级分1上样于Q-琼脂糖柱，用缓冲液A充分洗涤后，提高氯化钠的浓度进行洗脱。回收洗脱液，在缓冲液B(20mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM 2-巯基乙醇、30％饱和硫酸铵)中进行透析(透析级分2)。

接下来，将透析级分2上样于Resource PHE柱，用缓冲液B充分洗涤后，降低硫酸铵浓度进行洗脱。回收洗脱液，在缓冲液A中进行透析(透析级分3)。

进一步将透析级分3上样于MonoQ 10/100柱，用缓冲液A充分洗涤后，提高氯化钠的浓度进行洗脱。回收洗脱液，在缓冲液C(50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM 2-巯基乙醇、150mM氯化钠)中进行透析(透析级分4)。

最后，将透析级分4上样于用缓冲液C平衡的Superdex 200柱。回收洗脱液作为纯化酶液。将纯化酶用于SDS-PAGE，结果确认到53kDa的单一条带。

2.AAT活性的测定方法

通过以下记载的方法测定粗酶液、透析级分1～4和纯化酶液的AAT活性。

制备100μl反应液(100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、40mM正丁醇、0.50mM甲基丙烯酰-CoA)。添加粗酶液、透析级分1～4或纯化酶液并密闭，在30℃反应30分钟。反应后，添加10μl10mM 2-己酮作为内标，使用100μl辛烷进行溶剂提取。将8μl通过离心分离得到的分离液注射于气相色谱(GC)，测定通过酶反应生成的甲基丙烯酸丁酯量。甲基丙烯酸酯量是制成通过内标法得到的校正曲线而算出的。

GC分析条件

色谱柱：DB-WAX(内径0.25mm×60m，0.5μm，Agilent Technologies)

柱温：100℃·5分钟，其后以40℃/分钟升温，200℃·2分钟

载气：氦气

检测：FID

进样温度：230℃

检测温度：250℃

将各纯化阶段中酶组合物的收获量和活性示于“表1”。通过硫酸铵级分和4次柱分离，得到纯化至活性2334倍的195mU/mg AAT。

[表1]

[实施例2：榴莲AAT基因的鉴定]

使用市售试剂盒(PureLink Plant RNA Reagent，赛默飞世尔科技公司)从榴莲的种皮、子房和种子提取总RNA。使用市售试剂盒(SMART RACE cDNA Amplification Kit，宝生物公司；或GeneRacer Kit，赛默飞世尔科技公司)从总RNA合成cDNA。

基于植物来源的AAT中保存的碱基序列设计引物对，从cDNA进行DNA片段的扩增。确定得到的扩增片段(700bp)的碱基序列。

基于上述扩增片段的碱基序列设计引物，进行使用cDNA的5'RACE和3'RACE。确定得到的扩增片段(约1.1kbp和约1.0kbp)的碱基序列，得到序列编号2的榴莲AAT基因序列。

[实施例3：表达榴莲AAT基因的重组大肠杆菌的制作和重组榴莲AAT的纯化]

1.AAT表达载体(pET21-NHisMBPTEV-optDzibAAT)的制作

将包含His-tag序列、MBP(麦芽糖结合蛋白，Maltose Binding Protein)序列和TEV蛋白质酶切序列的DNA片段插入载体pET21a(Novagen公司)，得到载体pET21-NHisMBPTEV。

将序列编号2的榴莲AAT基因序列的密码子针对大肠杆菌进行优化，委托合成序列编号9的密码子优化AAT基因序列(包含TEV蛋白质酶切序列和限制酶识别序列作为添加序列)，插入载体pET21-NHisMBPTEV，得到表达载体pET21-NHisMBPTEV-optDzibAAT。

将表达载体pET21-NHisMBPTEV-optDzibAAT导入大肠杆菌NiCo21(DE3)(NewEngland Biolabs公司)，得到重组体NiCo21(DE3)/pET21-NHisMBPTEV-optDzibAAT。

2.重组榴莲AAT的纯化

将大肠杆菌重组体NiCo21(DE3)/pET21-NHisMBPTEV-optDzibAAT接种于200mL含有氨苄西林的2×YT液体培养基，在37℃进行16小时预培养。取100mL培养液，添加于20L的相同培养基中，在37℃培养。振荡培养至浊度(OD)为1.2后，添加IPTG(终浓度0.5mM)，使培养温度降至20℃，进一步振荡培养16小时。通过离心分离从得到的培养液回收菌体，悬浮于缓冲液D(20mM Tris-HCl(pH8.0)、300mM NaCl、10mM咪唑、0.2mM Tris(2-羧乙基)膦盐酸盐)。在对菌体悬浊液进行冰冷却的同时，使用超声波破碎机破碎30分钟，然后，进行离心分离，得到作为细胞提取液的上清。

将细胞提取液上样于Ni-NTA柱，用缓冲液D充分洗涤后，提高咪唑浓度进行洗脱。回收在280nm具有吸光的级分，用于SDS-PAGE，回收分子量与MBP和AAT融合而成的目的蛋白质一致的条带，在缓冲液D中，在4℃透析16小时(透析级分1)。

接下来，在透析级分1中添加500U的TEV蛋白酶(ProTEV Plus，Promega公司)，在4℃放置48小时，对His tag-MBP进行切割。将透析级分1上样于Ni-NTA柱，吸附切下的Histag-MBP，在含有AAT的通过级分中，以形成25％饱和硫酸铵的方式加入80％饱和硫酸铵溶液，上样于直链淀粉柱(New England Biolabs公司)，得到通过级分。将通过级分上样于TOYOPEARL Butyl-600柱(东曹公司)，用含有25％饱和硫酸铵的缓冲液E(20mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、1mM DTT)充分洗涤后，降低硫酸铵浓度进行洗脱。回收在280nm具有吸光的级分，用于SDS-PAGE，回收分子量与AAT一致的条带，在缓冲液E中，在4℃透析16小时(透析级分2)。

最后，将透析级分3上样于SP Sepharose柱(GE Healthcare公司)，用缓冲液E充分洗涤后，提高氯化钠的浓度进行洗脱。回收得到的洗脱液作为纯化酶液。

通过实施例1记载的方法测定细胞提取液、透析级分1、2和纯化酶液的AAT活性。将各纯化阶段中的酶组合物的收获量和活性示于“表2”。通过3次柱分离，得到活性纯化至1195倍的16.4U/mg AAT。

[表2]

[实施例4：利用AAT生成3-羟基异丁酸丁酯]

制备100μl反应液(100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、40mM正丁醇、0.5mM3-羟基异丁酰-CoA)。添加实施例3中得到的纯化酶液并密闭，在30℃反应30分钟。反应后，加入10μl10mM 2-己酮作为内标，使用100μl辛烷进行溶剂提取。将8μl通过离心分离得到的分离液注射于气相色谱(GC)，测定通过酶反应生成的3-羟基异丁酸丁酯。3-羟基异丁酸酯量是制成通过内标法得到的校正曲线而算出的。

GC分析条件

色谱柱：DB-WAX(内径0.25mm×60m，0.5μm，Agilent Technologies)

柱温：100℃·5分钟，其后以40℃/分钟升温，240℃·2分钟

载气：氦气

检测：FID

进样温度：300℃

检测温度：300℃

加入1μg/ml作为纯化酶的榴莲AAT，对反应后的溶液进行GC分析。从加入榴莲AAT的反应溶液检测到了0.13mM 3-羟基异丁酸丁酯。比活性度为6.1(U/mg)。

榴莲AAT对3-羟基异丁酰-CoA的活性与对甲基丙烯酰-CoA的活性之比(对3-羟基异丁酰-CoA活性/对甲基丙烯酰-CoA活性)为37％(6.1/16.4)。该值明显比后述苹果AAT和番茄AAT的值高，表明榴莲AAT对异丁酰-CoA具有高反应性。

[实施例5：利用各植物AAT生成3-羟基异丁酸丁酯]

1.表达苹果AAT基因的重组大肠杆菌和表达番茄AAT基因的重组大肠杆菌

通过文献(日本特愿2017-538070号)记载的方法，制成包含野生型苹果AAT(序列编号3)的48位、167位、270位、274位和447位的半胱氨酸全部替换为丙氨酸、150位的半胱氨酸替换为精氨酸、且具有A64V、K117Q、V248A和Q363K四重突变的突变型AAT(序列编号7)基因的质粒pAAT154。

此外，委托合成(Genscript公司，以下相同)包含番茄(野生物种)野生型AAT的第2个氨基酸由丙氨酸替换为赖氨酸的番茄(野生物种)A2K型AAT(序列编号5)基因的质粒pAAT032。

将苹果AAT表达载体pAAT154和番茄AAT表达载体pAAT032导入大肠杆菌JM109株，得到重组体。

2.含有AAT的细胞提取液的制备

在含有氨苄西林的LB(1％Bacto Trypton(胰蛋白胨)、0.5％Bacto YeastExtract(酵母提取物)、1％NaCl)培养基中接种大肠杆菌转化体，在37℃进行7小时预培养。

取200μl培养液，加入至100ml的相同培养基(含有1mM IPTG)，在37℃振荡培养15小时。

从培养液回收菌体，用50mM磷酸-钠缓冲液(pH7.0)洗涤，然后，悬浮在相同缓冲液中。

以OD630为20的方式对得到的菌体悬浊液进行调节。

通过超声波处理将细胞破碎，通过离心分离将菌体和膜级分除去。其后，使用Nalgene Rapid-flow Bottle Top Filter(瓶顶过滤器)(孔径0.2μm，赛默飞世尔科技公司制)过滤，制备细胞提取液。

3.含有AAT的细胞提取液的浓缩

以14,400g的离心力将得到的细胞提取液离心分离30分钟，分离上清。将上清用于截留分子量1,000,000的超滤膜Vivaspin(Sartorius公司制)，得到通过级分，将其用于截留分子量30,000的超滤膜Amicon Ultra(默克公司制)，浓缩至1/10～1/20的液量。

4.经浓缩处理的含有AAT的细胞提取液的AAT活性测定

在含有0.5mM 3-羟基异丁酰-CoA和40mM正丁醇的180μl反应液中添加20μl细胞提取液，开始3-羟基异丁酸丁酯的生成反应。反应在2ml容量的小瓶中进行。将小瓶在30℃温育，使反应进行15～35小时。反应结束后，在小瓶中的反应液中添加0.8ml乙酸乙酯并混和，将静置后的乙酸乙酯层分离用于GC分析。

GC分析条件

装置：GC-2010(岛津制作所)

色谱柱：DB-1 30m×0.25mmID 0.25μm

柱流量：He 1.0mL/分钟

升温条件：50℃，其后以10℃/分钟升温至150℃，进一步以20℃/分钟升温至300℃

检测：FID

进样温度：220℃

检测温度：300℃

分流比：1/20

GC上样量：1.0μL

此外，在含有0.5mM甲基丙烯酰-CoA和40mM正丁醇的900μl反应液中添加100μl细胞提取液，开始甲基丙烯酸丁酯的生成反应。反应在10ml容量的样品瓶(GC用)中进行。将样品瓶在30℃温育，使反应进行1～5小时。反应结束后，在样品瓶中的反应液中添加1ml乙腈并混和。其后，使用注射式过滤器DISMIC(孔径0.45μm，ADVANTEC公司制)过滤后用于HPLC分析。

HPLC分析条件：

装置：Waters 2695

色谱柱：Shiseido CAPCELL PAK C18 UG120 5μm

流动相：65％MeOH、0.2％磷酸

流量：0.25ml/分钟

柱温：35℃

检测：UV210nm

上样量：10μL

从加入含有苹果AAT或番茄AAT或榴莲AAT的细胞提取液的反应液中检测到了3-羟基异丁酸丁酯。

根据3-羟基异丁酸丁酯和甲基丙烯酸丁酯的生成量，评价苹果AAT和番茄AAT对3-羟基异丁酰-CoA(3HIBA-CoA)和甲基丙烯酰-CoA(MAA-CoA)的活性(参照表3)。

[表3]

N.D.＝Not Detected(未检测到)

序列表自由文本

序列编号1：榴莲AAT的氨基酸序列

序列编号2：榴莲AAT基因的碱基序列

序列编号3：苹果AAT的氨基酸序列

序列编号4：密码子优化苹果AAT基因序列

序列编号5：番茄A2K型AAT的氨基酸序列

序列编号6：密码子优化番茄A2K型AAT基因序列

序列编号7：突变型苹果AAT的氨基酸序列

序列编号8：密码子优化突变型苹果AAT基因序列

序列编号9：密码子优化榴莲AAT基因序列(包含TEV蛋白质酶切序列和限制酶识别序列作为添加序列)

Claims (4)

1.一种3-羟基异丁酸酯的制造方法，包括在存在醇酰基转移酶的条件下使醇或酚类与3-羟基异丁酰-CoA作用而生成3-羟基异丁酸酯的工序，

前述醇酰基转移酶为序列编号1的氨基酸序列，

所述醇或酚类用R-OH表示，R是碳数1～20的直链或支链的烃基，所述烃基为饱和或不饱和的非环式、或者饱和或不饱和的环式。

2.根据权利要求1所述的3-羟基异丁酸酯的制造方法，使用表达前述醇酰基转移酶的基因重组微生物。

3.根据权利要求2所述的3-羟基异丁酸酯的制造方法，3-羟基异丁酰-CoA是在前述微生物的生物体内由甲基丙烯酰-CoA合成的。

4.一种甲基丙烯酸酯的制造方法，包括：

在存在醇酰基转移酶的条件下使醇或酚类与3-羟基异丁酰-CoA作用而生成3-羟基异丁酸酯的工序，以及

通过3-羟基异丁酸酯的脱水反应生成甲基丙烯酸酯的工序，

前述醇酰基转移酶为序列编号1的氨基酸序列，

所述醇或酚类用R-OH表示，R是碳数1～20的直链或支链的烃基，所述烃基为饱和或不饱和的非环式、或者饱和或不饱和的环式。