CN104619851A - 甲基丙烯酸酯的制造方法 - Google Patents

Abstract

提供一种甲基丙烯酸酯的制造方法，作为利用生物催化剂的甲基丙烯酸酯的制造方法，包含在醇酰基转移酶存在下使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A，从而合成甲基丙烯酸酯的工序。根据该制造方法，与以往的化学制造工艺相比，可以显著减少对能源、资源、环境造成的负荷，且可以高效制造甲基丙烯酸酯。

Description

甲基丙烯酸酯的制造方法

技术领域

本发明涉及使用生物催化剂的甲基丙烯酸酯的制造方法。

背景技术

甲基丙烯酸酯主要作为丙烯酸树脂的原料使用，作为涂料、粘接剂、树脂改性剂等领域的共聚单体也有较多需求。作为工业性制法存在若干方法，例如已知以丙酮和氰化氢为原料的ACH(丙酮氰醇)法、以异丁烯和叔丁醇为原料的直接氧化法。这些化学制造方法依赖于化石原料，且需要大量的能源。

近年来，从防止地球变暖及环境保护的观点考虑，生物物质作为以往的化石原料的替代品的碳源，由其制造各种化学制品的技术备受瞩目。虽然由生物物质制造甲基丙烯酸酯也备受期待，但是使用生物催化剂由生物物质原料制造甲基丙烯酸酯的具体例子尚无报道。

例如，提出了利用天然存在的微生物，由糖等天然物质生产作为甲基丙烯酸前体的2-羟基异丁酸和3-羟基异丁酸的方法(参照专利文献1、2及非专利文献1)。但是，这些方法中，使前体脱水生成甲基丙烯酸的工序依然依赖于化学方法。

此外，虽然提出了使用导入有多种酶基因的、非天然存在的重组微生物由葡萄糖生成甲基丙烯酸的方法，但是这些方法是将已知的酶反应及由此类推的假想酶反应进行组合的方法，并未进行实际验证(参照专利文献3～5)。特别是在专利文献5中，虽然列举了常见的具有酯生成活性的多种生物催化剂(水解酶、蜡酯合成酶、醇乙酰基转移酶)，但是，所列举的生物催化剂是否具有甲基丙烯酸酯合成活性并不清楚。

进而，在专利文献6中，公开了在丙烯酰辅酶A和醇存在下用水解酶进行作用来制造丙烯酸酯的方法。该文献中给出了甲基丙烯酸酯也可以同样制造的启示。但是，若考虑生物催化剂的多样性、底物特异性，则其不过是表明能够通过一部分水解酶制造丙烯酸酯，而结构不同的甲基丙烯酸酯是否能够同样地通过水解酶制造则不清楚。进而，是否能够通过反应机理不同的其他种类的生物催化剂来制造也完全不清楚。此外，可以预想通过专利文献6记载的水解酶来合成酯时，生成的酯本来就会由于水解活性而被分解，很难认为是有效的制造方法。

另一方面，醇酰基转移酶作为果味香精(fruity flavor)合成酶而广为人知。专利文献7中，鉴定了特定的果实中包含的该酶的基因，提出了作为水果香精的各种酯的合成方法。但是，关于甲基丙烯酸酯是否能够通过这些酶来合成则没有报道，完全不清楚。

如上所述，虽然提出了若干方案或者进行了若干研究，但并不存在实际利用微生物来制造甲基丙烯酸衍生物的例子，期待建立有效的制造方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:国际公开第2007/110394号小册子

专利文献2:国际公开第2008/145737号小册子

专利文献3:国际公开第2009/135074号小册子

专利文献4:国际公开第2011/031897号小册子

专利文献5:国际公开第2012/135789号小册子

专利文献6:国际公开第2007/039415号小册子

专利文献7:国际公开第00/32789号小册子

专利文献8:日本特开2011-200133号公报

专利文献9:日本特开平5-64589号公报

专利文献10:日本特开平10-337185号

专利文献11:日本特开平10-24867号

非专利文献

非专利文献1:Green Chemistry,2012,14,1942-1948

非专利文献2:Methods in Enzymology,2000,324,73-79

非专利文献3:Botanical Journal of the Linnean Society,2009,161,105121

非专利文献4:Microbiology,1999,145,2323-2334

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于提供一种利用生物催化剂的甲基丙烯酸酯的制造方法。

用于解决课题的手段

发现醇酰基转移酶具有能够合成甲基丙烯酸酯的活性，由此完成了本发明。即，本发明如下所述。

(1)一种甲基丙烯酸酯的制造方法，其包含在醇酰基转移酶存在下使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A，从而合成甲基丙烯酸酯的工序。

(2)根据(1)的甲基丙烯酸酯的制造方法，其使甲基丙烯酸酯累积0.001mM以上。

(3)根据(1)或(2)的甲基丙烯酸酯的制造方法，其进一步包含由异丁酰辅酶A或3-羟基异丁酰辅酶A制造甲基丙烯酰辅酶A的工序。

(4)根据(3)的甲基丙烯酸酯的制造方法，其特征在于，异丁酰辅酶A由2-氧代异戊酸制造。

(5)根据(1)～(4)中任一项记载的甲基丙烯酸酯的制造方法，其中，醇酰基转移酶来源于植物。

(6)根据(5)的甲基丙烯酸酯的制造方法，其中，植物为属于选自由以下的目组成的组中的任意目的植物：姜(Zingiberales)目、蔷薇(Rosales)目、杜鹃花(Ericales)目、葫芦(Cucurbitales)目、十字花(Brassicales)目以及樟(Laurales)目。

(7)根据(5)的甲基丙烯酸酯的制造方法，植物为属于选自由以下的科组成的组中的任意科的植物：芭蕉(Musaceae)科、蔷薇(Rosaceae)科、杜鹃花(Ericaceae)科、猕猴桃(Actinidiaceae)科、葫芦(Cucurbitaceae)科、番木瓜(Caricaceae)科以及樟(Lauraceae)科。

(8)根据(5)的甲基丙烯酸酯的制造方法，植物为属于选自由以下的属组成的组中的任意属的植物：芭蕉(Musa)属、草莓(Fragaria)属、苹果(Malus)属、李(Prunus)属、梨(Pyrus)属、越桔(Vaccinium)属、猕猴桃(Actinidia)属、黄瓜(Cucumis)属、番木瓜(Carica)属以及鳄梨(Persea)属。

(9)根据(5)的甲基丙烯酸酯的制造方法，植物为属于选自由以下的属组成的组中的任意属的植物：芭蕉属、苹果属、李属、梨属、越桔属、猕猴桃属、黄瓜属、番木瓜属以及鳄梨属。

(10)根据(5)的甲基丙烯酸酯的制造方法，植物为属于选自由以下的属所组成的组中的任意属的植物：芭蕉属、苹果属、梨属、猕猴桃属、黄瓜属、番木瓜属以及鳄梨属。

(11)根据(5)的甲基丙烯酸酯的制造方法，植物为选自由香蕉、草莓、苹果、梅子、西洋梨、蓝莓、猕猴桃、甜瓜、番木瓜以及鳄梨组成的组中的任意者。

(12)根据(5)的甲基丙烯酸酯的制造方法，植物为选自由香蕉、苹果、梅子、西洋梨、蓝莓、猕猴桃、甜瓜、番木瓜以及鳄梨组成的组中的任意者。

(13)根据(5)的甲基丙烯酸酯的制造方法，植物为选自由香蕉、苹果、西洋梨、猕猴桃、甜瓜、番木瓜以及鳄梨组成的组中的任意者。

(14)根据(1)～(13)中任一项所述的甲基丙烯酸酯的制造方法，其使用以表达醇酰基转移酶的方式导入有基因的基因重组微生物。

此外，本发明的另一方面如下所述。

(15)一种甲基丙烯酸酯的制造方法，其使用属于红球菌(Rhodococcus)属的微生物来制造甲基丙烯酸酯。

(16)根据(15)的甲基丙烯酸酯的制造方法，其使用属于红球菌属的、具有包含如下序列的16SrDNA的微生物，所述序列相对于序列号31所示的16SrDNA的碱基序列具有95％以上的同一性(identity)。

(17)根据(15)或(16)的甲基丙烯酸酯的制造方法，属于红球菌属的微生物为红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)。

(18)根据(15)或(16)的甲基丙烯酸酯的制造方法，作为属于红球菌属的微生物，使用该微生物的衍生株。

(19)根据(18)的甲基丙烯酸酯的制造方法，属于红球菌属的微生物为红串红球菌PR-4株或其衍生株。

(20)根据(18)的甲基丙烯酸酯的制造方法，衍生株为具有以下所示的(a)或(b)中至少一种改变的基因改变株。

(a)通过导入支链酮酸脱氢酶基因和/或酰基辅酶A脱氢酶基因引起的改变。

(b)使烯酰辅酶A水合酶基因、3-羟基异丁酰辅酶A水合酶基因和/或3-羟基异丁酸脱氢酶基因缺损或失活的改变。

(21)根据(19)或(20)的甲基丙烯酸酯的制造方法，衍生株具有醇酰基转移酶和/或酰基辅酶A脱氢酶表达用质粒。

发明的效果

根据本发明，可以利用生物催化剂制造甲基丙烯酸酯。通过将本发明的制造方法与生物体内代谢组合，还可以实现甲基丙烯酸酯的发酵生产。其结果是，与以往的化学制造工艺相比，可以显著减少对能源、资源、环境的负荷，且能够高效制造甲基丙烯酸酯。

附图说明

图1为表示由3-羟基异丁酰辅酶A制造甲基丙烯酸酯的制造工序的图。

图2为表示由2-氧代异戊酸制造甲基丙烯酸酯的制造工序的图。

图3为表示LigD同源基因缺失用质粒的结构的图。

图4为对使用In Fusion法的基因缺失用质粒的制作方法进行说明的图。

图5为表示ACD-AAT双表达用质粒的结构的图。

具体实施方式

以下，参照附图对用于实施本发明的优选方式进行说明。另外，以下说明的实施方式表示的是本发明的代表性实施方式的一例，并非由此对本发明的范围作限定性解释。

1.利用醇酰基转移酶的甲基丙烯酸酯的制造方法

[甲基丙烯酸酯]

本发明中，甲基丙烯酸酯为式1所示的化合物。式1中，R表示直链或支链的碳原子数1～20的烃基。烃基可以是饱和或不饱和的非环状烃基，也可以是饱和或不饱和的环状烃基。优选为直链或支链的碳原子数1～10的无取代的烷基、芳烷基或芳基。特别优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、正己基、异己基、2-己基、二甲基丁基、乙基丁基、庚基、辛基、2-乙基己基这些碳原子数1～8的烷基、苄基或苯基。

CH₂＝C(CH₃)COO-R    (式1)

“甲基丙烯酸”(IUPAC名：2-甲基-2-丙烯酸)是指具有下述式的化合物，也包括其任意的盐或离子化的形态。作为甲基丙烯酸的盐，可以列举例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐等。

CH₂＝C(CH₃)COOH

[甲基丙烯酰辅酶A]

本发明中，甲基丙烯酰辅酶A是指以下的结构式表示的化合物。已知甲基丙烯酰辅酶A在生物体内为缬氨酸的代谢中间体。本发明中使用的甲基丙烯酰辅酶A可以是通过公知的或新的方法制造的甲基丙烯酰辅酶A。作为其合成方法，已知有由甲基丙烯酸酐和辅酶通过有机化学方式合成的方法(Methods in Enzymology.324,73-79(2000))或使用酶反应的合成方法。

[化学式1]

本发明中，在这些之中，可以优选使用以异丁酰辅酶A为原料、利用酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.3)(以下称作ACD)的作用转变而成的甲基丙烯酰辅酶A(参照图2)，或利用烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)(以下称作ECH)的作用由3-羟基异丁酰辅酶A转变而成的甲基丙烯酰辅酶A(参照图1)。即，本发明的方法优选进一步包含由异丁酰辅酶A或3-羟基异丁酰辅酶A制造甲基丙烯酰辅酶A的工序。通过利用酶的连续反应，可以在与收率提高和杂质抑制相联系的同时，不经由或不副产对生物体毒性高的甲基丙烯酸地直接合成甲基丙烯酸酯。根据上述方法，可以实现通过环境负荷低的生物体内连续反应(代谢发酵)来制造甲基丙烯酸酯。

本发明中使用的异丁酰辅酶A可以使用由2-氧代异戊酸制造的异丁酰辅酶A(参照图2)。即，本发明的方法也可以进一步包含由2-氧代异戊酸制造异丁酰辅酶A的工序。

[醇、酚类]

作为本发明中的甲基丙烯酸酯的制造原料的醇或酚类，为以下的式2表示的化合物。醇或酚类的结构与甲基丙烯酸酯是对应的，因此关于其结构，与上述式1的R的定义相同，表示直链或支链的碳原子数1～20的烃基。烃基可以是饱和或不饱和的非环状烃基，也可以是饱和或不饱和的环状烃基。优选为直链或支链的碳原子数1～10的无取代的醇、芳烷醇(Aralkyl alcohol)或酚类，特别优选为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、叔戊醇、正己醇、异己醇、2-己醇、二甲基丁醇、乙基丁醇、庚醇、辛醇、2-乙基己醇这些碳原子数1～8的烷基醇、苯甲醇或苯酚。

R-OH   (式2)

[醇酰基转移酶]

本发明的醇酰基转移酶(以下称为AAT)是具有将酰基辅酶A的酰基转移给醇或酚类而合成酯的催化作用的酶。据称，AAT参与各种水果中的酯的生成。已知AAT存在于姜目(香蕉)、蔷薇目(草莓、苹果、梨、桃)、葫芦目(甜瓜)、杜鹃花目(猕猴桃)、唇形目(橄榄)、茄目(番茄)、无患子目(柠檬、芒果)等植物中。

本发明中使用的AAT只要是具有以甲基丙烯酰辅酶A和醇或酚类为原料制造甲基丙烯酸酯的能力的来源于生物体的催化剂就没有特别限定，无论其种类及起源如何。作为酶源，优选来源于植物，其中优选被分类为被子植物的植物。

适用于本发明的AAT可以通过以下方法容易地从上述植物中选择。根据需要，将组织的合适部位切断从而获取该部位。在该切断部位添加包含甲基丙烯酰辅酶A和式2所示的醇或酚类的溶液，进行振荡，使其反应一定时间。通过GC(气相色谱法，Gas Chromatography)确认该反应液中甲基丙烯酸酯的有无，从而可以确认合成活性。具体而言，例如，将果肉或果皮切断，对其添加含有1～10mM的甲基丙烯酰辅酶A、0.35M KCl以及5～50倍摩尔量的正丁醇的溶液，在30℃下振荡1～10小时。反应结束后，通过GC确认甲基丙烯酸酯的有无，从而可以选择能够应用于本发明的AAT。

作为适用于本发明的AAT的酶源，例如是属于选自由以下的目组成的组中的任意目的植物：姜目(Zingiberales)、蔷薇目(Rosales)、杜鹃花目(Ericales)、葫芦目(Cucurbitales)、十字花目(Brassicales)、樟目(Laurales)、禾本目(Poales)、棕榈目(Arecales)、天门冬目(Asparagales)、虎耳草目(Saxifragales)、石竹目(Caryophyllales)、葡萄目(Vitales)、金虎尾目(Malpighiales)、酢浆草目(Oxalidales)、豆目(Fabales)、无患子目(Sapindales)、锦葵目(Malvales)、桃金娘目(Myrtales)、毛茛目(Ranunculales)、茄目(Solanales)、唇形目(Lamiales)、龙胆目(Gentianales)以及菊目(Asterales)。其中，优选为属于选自由以下的目组成的组中的任意目的植物：姜目(Zingiberales)、蔷薇目(Rosales)、杜鹃花目(Ericales)、葫芦目(Cucurbitales)、十字花目(Brassicales)以及樟目(Laurales)。

作为属于姜目的植物，优选芭蕉科(Musaceae)以及姜科(Zingiberaceae)的植物；作为属于蔷薇目的植物，优选蔷薇科(Rosaceae)以及桑科(Moraceae)的植物；作为属于杜鹃花目的植物，优选杜鹃花科(Ericaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、柿树科(Ebenaceae)以及山茶科(Theaceae)的植物；作为属于葫芦目的植物，优选葫芦科(Cucurbitaceae)的植物；作为属于十字花目的植物，优选番木瓜科(Caricaceae)以及十字花科(Brassicaceae)的植物；作为属于樟目的植物，优选樟科(Lauraceae)的植物；作为属于禾本目的植物，优选凤梨科(Bromeliaceae)以及禾本科(Poaceae)的植物；作为属于棕榈目的植物，优选槟榔科(Arecaceae)的植物；作为属于天门冬目的植物，优选兰科(Orchidaceae)以及鸢尾科(Iridaceae)的植物；作为属于虎耳草目的植物，优选茶藨子科(Grossulariaceae)的植物；作为属于石竹目的植物，优选石竹科(Caryophyllaceae)的植物；作为属于葡萄目的植物，优选葡萄科(Vitaceae)的植物；作为属于金虎尾目的植物，优选金虎尾科(Malpighiaceae)、西番莲科(Passifloraceae)、大戟科(Euphorbiaceae)以及杨柳科(Salicaceae)的植物；作为属于酢浆草目的植物，优选酢浆草科(Oxalidaceae)的植物；作为属于豆目的植物，优选豆科(Fabaceae)的植物；作为属于无患子目的植物，优选芸香科(Rutaceae)、无患子科(Sapindaceae)以及漆树科(Anacardiaceae)的植物；作为属于锦葵目的植物，优选锦葵科(Malvaceae)的植物；作为属于桃金娘目的植物，优选千屈菜科(Lythraceae)、柳叶菜科(Onagraceae)以及桃金娘科(Myrtaceae)的植物；作为属于毛茛目的植物，优选毛茛科(Ranunculaceae)以及罂粟科(Papaveraceae)的植物；作为属于茄目的植物，优选茄科(Solanaceae)的植物；作为属于唇形目的植物，优选木樨科(Oleaceae)、马鞭草科(Verbenaceae)以及唇形科(Lamiaceae)的植物；作为属于龙胆目的植物，优选夹竹桃科(Apocynaceae)的植物；作为属于菊目(Asterales)的植物，优选菊科(Asteraceae)的植物。也可以利用上述植物的近缘种。在它们之中，进一步优选为属于芭蕉科(Musaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、番木瓜科(Caricaceae)以及樟科(Lauraceae)的植物。

具体而言，作为属于芭蕉科的植物，优选芭蕉(Musa)属的植物；作为属于姜科(Zingiberaceae)的植物，优选姜属(Zingiber)的植物；作为属于蔷薇科的植物，优选草莓(Fragaria)属、苹果(Malus)属、李(Prunus)属、梨(Pyrus)属、枇杷(Eriobotrya)属、木瓜(Chaenomeles)属、悬钩子(Rubus)属以及蔷薇(Rosa)属的植物；作为属于桑科(Moraceae)的植物，优选无花果(Ficus)属的植物；作为属于杜鹃花科的植物，优选越桔(Vaccinium)属的植物；作为属于猕猴桃科的植物，优选猕猴桃(Actinidia)属的植物；作为属于柿树科的植物，优选柿树(Diospyros)属的植物；作为属于山茶科的植物，优选山茶(Camellia)属的植物；作为属于葫芦科的植物，优选黄瓜(Cucumis)属以及西瓜(Citrullus)属的植物；作为属于番木瓜科的植物，优选番木瓜(Carica)属以及美洲番木瓜(Vasconcellea)属的植物；作为属于十字花科的植物，优选拟南芥(Arabidopsis)属的植物；作为属于樟科的植物，优选鳄梨(Persea)属的植物；作为属于凤梨科的植物，优选凤梨属(Ananas)的植物；作为属于禾本科的植物，优选稻(Oryza)属、小麦(Triticum)属、大麦(Hordeum)属、玉蜀黍(Zea)属、高粱(Sorghum)属以及短柄草(Brachypodium)属的植物；作为属于棕榈科的植物，优选椰子(Cocos)属的植物；作为属于兰科的植物，优选万代兰(Vanda)属的植物；作为属于鸢尾科的植物，优选鸢尾(Iris)属的植物；作为属于茶藨子科的植物，优选醋栗(Ribes)属的植物；作为属于石竹科的植物，优选石头花属(Gypsophila)的植物；作为属于葡萄科的植物，优选葡萄(Vitis)属的植物；作为属于金虎尾科的植物，优选金虎尾(Malpighia)属的植物；作为属于西番莲科的植物，优选西番莲(Passiflora)属的植物；作为属于大戟科的植物，优选蓖麻(Ricinus)属的植物；作为属于杨柳科的植物，优选杨属(Populus)的植物；作为属于酢浆草科的植物，优选杨桃(Averrhoa)属的植物；作为属于豆科的植物，优选苜蓿(Medicago)属、羽扇豆(Lupinus)属、大豆(Glycine)属以及蝶豆(Clitoria)属的植物；作为属于芸香科的植物，优选柑橘(Citrus)属以及木橘(Aegle)属的植物；作为属于无患子科的植物，优选荔枝(Litchi)属的植物；作为属于漆树科的植物，优选芒果(Mangifera)属的植物；作为属于锦葵科的植物，优选榴莲(Durio)属以及可可(Theobroma)属的植物；作为属于千屈菜科的植物，优选石榴(Punica)属的植物；作为属于柳叶菜科的植物，优选克拉花(Clarkia)属的植物；作为属于桃金娘科的植物，优选番石榴(Psidium)属的植物；作为属于毛茛科的植物，优选类叶升麻(Actaea)属的植物；作为属于罂粟科的植物，优选罂粟(Papaver)属的植物；作为属于茄科的植物，优选茄(Solanum)属、辣椒(Capsicum)属、烟草(Nicotiana)属以及碧冬茄(Petunia)属的植物；作为属于木樨科的植物，优选木犀榄属(Olea)属的植物；作为属于马鞭草科的植物，优选马鞭草(Glandularia)属的植物；作为属于唇形科的植物，优选鼠尾草(Salvia)属的植物；作为属于夹竹桃科的植物，优选萝芙木(Rauvolfia)属以及长春花(Catharanthus)属的植物；作为属于菊科的植物，优选果香菊(Chamaemelum)属的植物。其中，更优选属于芭蕉属、草莓属、苹果属、李属、梨属、越桔属、猕猴桃属、黄瓜属、番木瓜属或鳄梨属的植物。

进而，其中特别优选属于芭蕉属、苹果属、梨属、猕猴桃属、黄瓜属、番木瓜属或鳄梨属的植物。

进而，具体而言，作为属于芭蕉属的植物，特别优选香蕉(Musaxparadisiaca)、芭蕉(Musabasjoo)、红蕉(Musacoccinea)以及小果野蕉(Musaacuminata)；作为属于姜属的植物，特别优选姜(Zingiber officinale)；作为属于草莓属的植物，特别优选草莓(Fragariaxananassa)、弗州草莓(Fragariavirginiana)、智利草莓(Fragariachiloensis)以及野草莓(Fragariavesca)；作为属于苹果属的植物，特别优选苹果(Maluspumila、Malusdomestica、Malusbaccata)、垂丝海棠(Malushalliana)、多花海棠(Malusfloribunda)以及海棠果(Malusprunifolia)；作为属于李属的植物，特别优选梅子(Prunusmume)、欧洲甜樱桃(Prunusavium)、桃(Prunuspersica)、杏(Prunusarmeniaca)、扁桃(Prunusdulcis)、李(Prunussalicina)以及欧洲李(Prunusdomestica)；作为属于梨属的植物，特别优选西洋梨(Pyruscommunis)、梨(Pyruspyrifolia)、豆梨(Pyruscalleryana)以及野生西洋梨(Pyruspyraster)；作为属于枇杷属的植物，特别优选枇杷(Eriobotryajaponica)；作为属于木瓜属的植物，特别优选木瓜(Chaenomelessinensis)；作为属于悬钩子属的植物，特别优选覆盆子(Rubusidaeus)以及黑莓(Rubusfruticosus)；作为属于蔷薇属的植物，特别优选玫瑰(Rosarugosa)；作为属于无花果属的植物，特别优选无花果(Ficuscarica)；作为属于越桔属的植物，特别优选蓝莓(Vacciniumcorymbosum、Vacciniumangustifolium)、欧洲越橘(Vacciniummyrtillus)、越橘(Vacciniumvitis-idaea)以及红莓苔子(Vacciniumoxycoccos)；作为属于猕猴桃属的植物，特别优选猕猴桃(Actinidiachinensis、Actinidiadeliciosa)、软枣猕猴桃(Actinidiaarguta)、山梨猕猴桃(Actinidiarufa)以及葛枣猕猴桃(Actinidiapolygama)；作为属于柿树属的植物，特别优选柿(Diospyroskaki)；作为属于山茶属的植物，特别优选茶树(Camelliasinensis)；作为属于黄瓜属的植物，特别优选黄瓜(Cucumissativus)、甜瓜(Cucumismelo)、西印度瓜(Cucumisanguria)以及刺角瓜(Cucumismetulifer)；作为属于西瓜属的植物，特别优选西瓜(Citrulluslanatus)；作为属于番木瓜属的植物，特别优选番木瓜(Caricapapaya)；作为属于美洲番木瓜(Vasconcellea)属的植物，特别优选山地番木瓜(Vasconcelleacundinamarcensis)；作为属于拟南芥属的植物，特别优选拟南芥(Arabidopsisthaliana)以及琴叶拟南芥(Arabidopsislyrata)；作为属于鳄梨属的植物，特别优选鳄梨(Perseaamericana)；作为属于凤梨属的植物，特别优选菠萝(Ananascomosus)；作为属于禾本属的植物，特别优选水稻(Oryzasativa)；作为属于小麦属的植物，特别优选小麦(Triticumaestivum)；作为属于大麦属的植物，特别优选大麦(Hordeumvulgare)；作为属于玉蜀黍属的植物，特别优选玉蜀黍(Zeamays)；作为属于高粱属的植物，特别优选高粱(Sorghumbicolor)；作为属于短柄草属的植物，特别优选二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)；作为属于椰子属的植物，特别优选椰子(Cocosnucifera)；作为属于万代兰属的植物，特别优选万代兰(Vandahybridcultivar)；作为属于鸢尾属的植物，特别优选荷兰鸢尾(Irisxhollandica)；作为属于醋栗属的植物，特别优选黑加仑(黑醋栗)(Ribesnigrum)；作为属于石头花属的植物，特别优选石头花(Gypsophilapaniculata、Gypsophilaelegans)；作为属于葡萄属的植物，特别优选葡萄(Vitisvinifera、Vitislabrusca)；作为属于金虎尾属的植物，特别优选西印度樱桃(Malpighiaglabra)；作为属于西番莲属的植物，特别优选西番莲(Passifloraedulis)；作为属于蓖麻属的植物，特别优选蓖麻(Ricinuscommunis)；作为属于杨属的植物，特别优选欧洲大叶杨(Populustrichocarpa)；作为属于杨桃属的植物，特别优选杨桃(Averrhoacarambola)；作为属于苜蓿属的植物，特别优选蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)；作为属于羽扇豆属的植物，特别优选羽扇豆(白羽扇豆)(Lupinusalbus)；作为属于大豆属的植物，特别优选大豆(Glycinemax)；作为属于蝶豆属的植物，特别优选蝶豆(Clitoriaternatea)；作为属于芸香属的植物，特别优选柠檬(Citruslimon)、酢橘(Citrussudachi)、臭橙(Citrussphaerocarpa)、葡萄柚(Citrusxparadisi)、日本柚子(Citrusjunos)、来檬(Citrusaurantifolia)、温州蜜柑(Citrusunshiu)以及橙子(Citrussinensis)；作为属于木橘属的植物，特别优选木橘(Aeglemarmelos)；作为属于荔枝属的植物，特别优选荔枝(Litchichinensis)；作为属于芒果属的植物，特别优选芒果(Mangiferaindica)；作为属于榴莲属的植物，特别优选榴莲(Duriozibethinus)；作为属于可可属的植物，特别优选可可(Theobromacacao)；作为属于石榴属的植物，特别优选石榴(Punicagranatum)；作为属于克拉花属的植物，特别优选仙女扇(fairyfans)(Clarkiabreweri)以及红丝带(Redribbons)(Clarkiaconcinna)；作为属于番石榴属的植物，特别优选番石榴(Psidiumguajava)；作为属于类叶升麻属的植物，特别优选黑升麻(Actaearacemosa)；作为属于罂粟属的植物，特别优选罂粟(Papaversomniferum)、东方罂粟(Papaverorientale)以及大红罂粟(Papaverbracteatum)；作为属于茄属的植物，特别优选番茄(Solanumlycopersicum)；作为属于辣椒属的植物，特别优选辣椒(Capsicumannuum)以及黄灯笼辣椒(Capsicumchinense)；作为属于烟草属的植物，特别优选烟草(Nicotianatabacum、Nicotianaattenuata)；作为属于碧冬茄属的植物，特别优选矮牵牛(Petuniaxhybrida)；作为属于木犀榄属的植物，特别优选油橄榄(Oleaeuropaea)；作为属于马鞭草属的植物，特别优选美女樱(Glandulariaxhybrida)；作为属于鼠尾草属的植物，特别优选一串红(Salviasplendens)；作为属于萝芙木属的植物，特别优选印度萝芙木(Rauvolfiaserpentina)；作为属于长春花属的植物，特别优选长春花(Catharanthusroseus)；作为属于果香菊属的植物，特别优选罗马甘菊(Chamaemelumnobile)。其中，更优选香蕉、草莓、苹果、梅子、西洋梨、蓝莓、猕猴桃、甜瓜、番木瓜或鳄梨。进而，在其中特别优选香蕉、苹果、西洋梨、猕猴桃、甜瓜、番木瓜或鳄梨。

另外，在直接使用植物作为酶源进行合成反应时，在将碳原子数1～2的醇作为底物的情况下，尤其更优选使用属于苹果属、番木瓜属以及鳄梨属的植物。因为生成效率比属于其他属的植物更高。

本发明中，植物分类是基于APG植物分类体系第3版(Botanical Journal ofthe Linnean Society，2009，161，105121)的。

本发明中，将AAT供于反应时，只要显示出上述的催化剂活性则对其使用形态没有特别限定，也可以直接使用生物组织或其处理物。作为这样的生物组织，可以使用植物体全体、植物器官(例如果实、叶、花瓣、茎、种子等)、植物组织(例如果实表皮、果肉等)。作为其处理物，可以列举从这些生物组织中提取AAT而获得的粗酶液或纯化酶等。

[AAT活性表达用重组微生物]

进而，将AAT供于反应时，也可以利用将上述AAT的基因分离并导入到例如常见宿主载体系统中并用该载体系统进行转化而获得的微生物。作为宿主，细菌中可以列举大肠杆菌、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)等；酵母中可以列举酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、裂殖酵母属(Shizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)；丝状菌中可以列举曲霉菌属(Aspergillus)等。其中，特别是利用大肠杆菌简便且效率高，故而优选。

已经公开了若干种AAT基因(例如，参照专利文献7)。也可以基于该信息制作DNA探针、例如制作用于PCR的引物，进行PCR，从而分离该基因。此外，还可以通过常规方法整个合成AAT基因的碱基序列。关于这些基因信息为已知的AAT是否具有甲基丙烯酸酯合成活性，可以通过上述方法同样地进行确认。另一方面，对于基因信息尚不清楚的AAT，可以纯化AAT，基于其蛋白质通过基因工程学方法获得基因信息。

本发明中，作为优选的AAT基因，只要其翻译产物具有制造甲基丙烯酸酯的能力就没有特别限定，可以从上述AAT酶源中适当选择。特别优选列举苹果来源AAT基因(序列号2)、草莓来源AAT基因(序列号4)、草莓来源AAT基因(序列号6)。

另外，本发明中AAT基因还包括编码如下蛋白质的基因，所述蛋白质包含在野生型氨基酸序列中置换、缺失或附加1或多个氨基酸而成的氨基酸序列，且具有由甲基丙烯酰辅酶A和醇生成甲基丙烯酸酯的活性。

这里，用语“数个”是指1～40个，优选为1～20个，更优选为10个以下。为了在基因中导入变异，可以通过Kunkel法、Gapped duplex法等公知方法，使用利用位点特异性突变诱导法的变异导入用试剂盒，例如QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司)、GeneTailorTM Site-DirectedMutagenesis System(Invitrogen公司)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：宝生物公司)等。或者，也可以人工合成具有包含变异的序列的整个基因。

本发明中，DNA的碱基序列的确认可以通过利用惯用的方法进行序列确定来进行。例如，还可以基于桑格(Sanger)法使用适当的DNA测序仪对序列进行确认。

此外，本发明中，AAT基因还包括编码如下蛋白质的基因，所述蛋白质与由野生型氨基酸序列构成的蛋白质显示90％以上、优选95％以上、更优选99.5％以上、进一步优选99.9％以上的同一性，且具有由甲基丙烯酰辅酶A和醇生成甲基丙烯酸酯的活性。

进而，本发明中，AAT基因还包括如下基因，所述基因与具有和野生型碱基序列互补的碱基序列的多聚核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有由甲基丙烯酰辅酶A和醇生成甲基丙烯酸酯的活性的蛋白质。作为上述的严格条件，可以列举例如：将固定有DNA的尼龙膜在包含6×SSC(1×SSC为在1升水中溶解氯化钠8.76g、柠檬酸钠4.41g而成的溶液)、1％SDS、100μg/ml鲑鱼精DNA、0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯基吡咯烷酮、0.1％Ficoll的溶液中于65℃下与探针一起保温20小时进行杂交的条件，但并非仅限于此。本领域技术人员可以在这样的缓冲液的盐浓度、温度等条件的基础上考虑其它的探针浓度、探针长度、反应时间等各项条件来设定杂交的条件。作为杂交后的洗涤条件，可以列举例如“2×SSC、0.1％SDS、42℃”、“1×SSC、0.1％SDS、37℃”，作为更严格的条件，可以列举例如“1×SSC、0.1％SDS、65℃”、“0.5×SSC、0.1％SDS、50℃”等条件。

关于杂交法的详细步骤，可以参照Molecular Cloning，A Laboratory Manual2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))、Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons(1987-1997))等。

进而，本发明中，AAT基因还包括如下基因，所述基因由使用BLAST等(例如默认值，即初始设定的参数)计算时与野生型碱基序列具有80％以上、更优选90％以上、最优选95％以上的同一性的碱基序列构成，且编码具有由甲基丙烯酰辅酶A和醇生成甲基丙烯酸酯的活性的蛋白质。此外，上述AAT基因的密码子可以根据转化中使用的微生物宿主的密码子使用频率进行变换。

这里，序列的“同一性”是指：在为碱基序列时，按照欲比较的2个碱基序列的碱基尽量多地达到一致的方式将两碱基序列对齐，将一致的碱基数除以全部碱基数而得的值以百分率表示。进行上述对齐时，根据需要，在进行比较的2个序列的一者或两者中适当插入间隔。这样的序列的对齐化可以使用例如BLAST、FASTA、CLUSTALW等公知的程序来进行。在插入了间隔时，上述全部碱基数为将1个间隔作为1个碱基计数时的碱基数。这样计数获得的全部碱基数在进行比较的2个序列间不同的情况下，同一性(％)通过用一致的碱基数除以较长的序列的全部碱基数而算出。关于氨基酸序列的同一性也同样。

在甲基丙烯酸酯合成反应中，可以直接使用对上述重组微生物进行培养而获得的培养液，或者使用通过离心分离等收集菌体的操作从该培养液获得的菌体或其处理物等。作为菌体处理物，可以列举用丙酮、甲苯处理过的菌体、冷冻干燥菌体、菌体破碎物、将菌体破碎而获得的无细胞提取物、从这些之中提取酶而获得的粗酶或纯化酶等。

也可以同时导入AAT基因与ACD基因或ECH基因，以异丁酰辅酶A或3-羟基异丁酰辅酶A为原料合成甲基丙烯酸酯(参照图1及图2)。进而，还可以通过组合导入2-氧代异戊酸脱氢酶基因(以下称为BCKAD)，由2-氧代异戊酸合成甲基丙烯酸酯。

对于本发明中的ACD、ECH以及BCKAD的来源没有特别限定，可以列举以下所示的微生物。

属于下述属的微生物：磁螺菌属(Magnetospirillum)、红螺菌属(Rhodospirillum)、固氮螺菌属(Azospirillum)、替斯崔纳菌属(Tistrella)、嗜酸菌属(Acidiphilium)、红细菌属(Rhodobacter)、副球菌属(Paracoccus)、鲁杰氏菌属(Ruegeria)、简纳西氏菌属(Jannaschia)、玫瑰杆菌属(Roseobacter)、沟鞭藻玫瑰杆菌属(DinoRoseobacter)、假弧菌属(Pseudovibrio)、暗棕色杆菌属(Phaeobacter)、十八杆菌属(Octadecabacter)、生丝单胞菌属(Hyphomonas)、海茎状菌属(Maricaulis)、赫奇氏菌属(Hirschia)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、新鞘氨醇菌属(Novosphingobium)、鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)、鞘氨醇菌属(Sphingobium)、赤杆菌属(Erythrobacter)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、柄杆菌属(Caulobacter)、苯基杆菌属(Phenylobacterium)、不黏柄菌属(Asticcacaulis)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、布鲁氏菌属(Brucella)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、中间根瘤菌属(Mesorhizobium)、克拉提菌属(Chelativorans)、橙色单胞菌属(Aurantimonas)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、农单胞菌属(Agromonas)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、硝化杆菌属(Nitrobacter)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、红微菌属(Rhodomicrobium)、外海芽孢杆菌属(Pelagibacterium)、细小棒状菌属(Parvibaculum)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、细小棒菌属(Parvularcula)、伯克氏菌属(Burkholderia)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、多核杆菌属(Polynucleobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、鲍特氏菌属(Bordetella)、泰勒氏菌属(Taylorella)、极小单胞菌属(Pusillimonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、嗜脂环物菌属(Alicycliphilus)、戴尔福特菌属(Delftia)、沙壤土杆菌属(Ramlibacter)、红育菌属(Rhodoferax)、贪噬菌属(Variovorax)、极单胞菌属(Polaromonas)、食酸菌属(Acidovorax)、蚯蚓肾杆菌属(Verminephrobacter)、赫山单胞菌属(Herminiimonas)、草螺菌属(Herbaspirillum)、山冈单胞菌属(Collimonas)、色杆菌属(Chromobacterium)、鸥杆菌属(Laribacter)、假古布尔班克氏菌属(Pseudogulbenkiania)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、固氮弧菌属(Aromatoleum)、固氮弯曲菌属(Azoarcus)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、索氏菌属(Thauera)、固氮螺形菌(脱氯弯杆菌)属(Azospira(Dechlorosoma))、莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)、需盐红螺菌属(Halorhodospira)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、罗河杆菌属(Rhodanobacter)、弗郎西斯氏菌属(Francisella)、解环菌属(Cycloclasticus)、大洋螺菌属(Oceanospirillum)、霍氏菌属(Hahella)、盐单胞菌属(Halomonas)、食烷菌属(Alcanivorax)、康氏菌属(Kangiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、别样谢瓦氏菌属(Alishewanella)、交替单胞菌属(Alteromonas)、居水菌属(Glaciecola)、海杆菌属(Marinobacter)、海细菌属(Marinobacterium)、噬糖菌属(Saccharophagus)、希瓦氏菌属(Shewanella)、铁还原单胞菌属(Ferrimonas)、海源菌属(Idiomarina)、科维尔氏菌属(Colwellia)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、利斯顿氏菌属(Listonella)、弧菌属(Vibrio)、发光杆菌属(Photobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、大洋单胞菌属(Oceanimonas)、盐水球形菌属(Salinisphaera)、军团菌属(Legionella)、考克斯氏体属(Coxiella)、脱硫球菌属(Desulfococcus)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、脱硫酸盐杆菌属(Desulfatibacillum)、脱硫叶菌属(Desulfobulbus)、脱硫弓菌属(Desulfarculus)、地杆菌属(Geobacter)、互营杆菌属(Syntrophobacter)、共养菌属(Syntrophus)、脱硫假丝酵母属(Desulfomonile)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、噬菌属(Bacteriovorax)、标桩菌属(Stigmatella)、黏球菌属(Myxococcus)、厌氧黏杆细菌属(Anaeromyxobacter)、堆囊菌属(Sorangium)、海无柄孢囊黏细菌属(Haliangium)、酸杆菌属(Acidobacterium)、短链小球菌属(Granulicella)、水沉积物杆菌属(Ilumatobacter)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)、高温单孢菌属(Thermomonospora)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、嗜热双孢菌属(Thermobispora)、放线束丝菌属(Actinosynnema)、小单孢菌属(Micromonospora)、盐水孢菌属(Salinispora)、疣孢菌属(Verrucosispora)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、韩国生工菌属(Kribbella)、棒杆菌属(Corynebacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、红球菌属(Rhodococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、分支杆菌属(Mycobacterium)、分枝菌酸球菌属(Amycolicicoccus)、塚村氏菌属(Tsukamurella)、脂肪酸慢出菌属(Segniliparus)、小杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、节杆菌属(Arthrobacter)、柠檬球菌属(Citricoccus)、肾杆菌属(Renibacterium)、考克氏菌属(Kocuria)、皮肤球菌属(Kytococcus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、间孢囊菌属(Intrasporangium)、丝氨酸球菌属(Serinicoccus)、弗兰克氏菌属(Frankia)、酸栖热菌属(Acidothermus)、中村氏菌属(Nakamurella)、地嗜皮菌属(Geodermatophilus)、斯塔克布朗氏菌属(Stackebrandtia)、链霉菌属(Streptomyces)、细小链孢菌属(Catenulispora)、红色杆菌属(Rubrobacter)、康奈斯氏杆菌属(Conexibacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、凯皮迪亚属(Kyrpidia)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、梭菌属(Clostridium)、嗜碱菌属(Alkaliphilus)、共养单胞菌属(Syntrophomonas)、互养栖热菌属(Syntrophothermus)、真杆菌属(Eubacterium)、脱亚硫酸杆菌属(Desulfitobacterium)、脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)、暗色厌氧香肠状菌属(Pelotomaculum)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)、震颤杆菌属(Oscillibacter)、嗜热厌氧杆状菌属(Thermoanaerobacter)、一氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)、需碱厌氧菌属(Natranaerobius)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、土地杆菌属(Pedobacter)、束缚杆菌属(Haliscomenobacter)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、臭气杆菌属(Odoribacter)、螺状菌属(Spirosoma)、古字状菌属(Runella)、海菌属(Maribacter)、奇异球菌属(Deinococcus)、栖热菌属(Thermus)、稍栖热菌属(Meiothermus)、大洋栖热菌属(Oceanithermus)、海栖热菌属(Marinithermus)、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、玫瑰弯菌属(Roseiflexus)、滑柱菌属(Herpetosiphon)、热微菌属(Thermomicrobium)、栖热袍菌属(Thermotoga)、栖热腔菌属(Thermosipho)、闪烁杆菌属(Fervidobacterium)、脱铁杆菌属(Deferribacter)、热土弧菌属(Calditerrivibrio)、曲揉杆菌属(Flexistipes)、生金球菌属(Metallosphaera)、气火菌属(Aeropyrum)、热棒菌属(Pyrobaculum)、热杆菌属(Caldivirga)、火山热泉杆菌属(Vulcanisaeta)、酸叶菌属(Acidilobus)、盐盒菌属(Haloarcula)、盐方形菌属(Haloquadratum)、嗜盐碱单孢菌属(Natronomonas)、盐红菌属(Halorubrum)、盐土生古菌属(Haloterrigena)、无色需碱菌属(Natrialba)、盐碱球菌属(Halalkalicoccus)、盐几何形菌属(Halogeometricum)、热原体属(Thermoplasma)、嗜酸古菌属(Picrophilus)、铁原体属(Ferroplasma)、古生球菌属(Archaeoglobus)、铁球菌属(Ferroglobus)、多形菌属(Polymorphum)、云母弧菌属(Micavibrio)、多贺氏菌属(Simiduia)、纤发菌属(Leptothrix)、硫单胞菌属(Thiomonas)、红长命菌属(Rubrivivax)、甲基养菌属(Methylibium)、微小杆菌属(Exiguobacterium)及厌氧球菌属(Anaerococcus)。

进而，作为分类在磁螺菌属(Magnetospirillum)的微生物，特别优选趋磁磁螺菌(Magnetospirillum magneticum)；作为分类在红螺菌属(Rhodospirillum)的微生物，特别优选深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、世纪红螺菌(Rhodospirillum centenum)及度光红螺菌(Rhodospirillumphotometricum)；作为分类在固氮螺菌属(Azospirillum)的微生物，特别优选生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)及巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)；作为分类在替斯崔纳菌属(Tistrella)的微生物，特别优选运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)；作为分类在嗜酸菌属(Acidiphilium)的微生物，特别优选隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)及多嗜嗜酸菌(Acidiphiliummultivorum)；作为分类在红细菌属(Rhodobacter)的微生物，特别优选类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)及荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)；作为分类在副球菌属(Paracoccus)的微生物，特别优选脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、嗜胺副球菌(Paracoccus aminophilus)；作为分类在鲁杰氏菌属(Ruegeria)的微生物，特别优选帕氏鲁杰氏菌(Ruegeria pomeroyi)；作为分类在玫瑰杆菌属(Roseobacter)的微生物，特别优选反硝化玫瑰杆菌(Roseobacter denitrificans)及海滨玫瑰杆菌(Roseobacter litoralis)；作为分类在沟鞭藻玫瑰杆菌(DinoRoseobacter)的微生物，特别优选恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(Dinoroseobacter shibae)；作为分类在暗棕色杆菌属(Phaeobacter)的微生物，特别优选加利西亚暗棕色杆菌(Phaeobacter gallaeciensis)；作为分类在十八杆菌属(Octadecabacter)的微生物，特别优选南极十八杆菌(Octadecabacter antarcticus)及北极十八杆菌(Octadecabacter arcticus)；作为分类在生丝单胞菌属(Hyphomonas)的微生物，特别优选海王生丝单胞菌(Hyphomonas neptunium)；作为分类在海茎状菌属(Maricaulis)的微生物，特别优选海海茎状菌(Maricaulis maris)；作为分类在赫奇氏菌属(Hirschia)的微生物，特别优选波罗的海赫奇氏菌(Hirschia baltica)；作为分类在鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的微生物，特别优选少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)及维氏鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas wittichii)；作为分类在新鞘氨醇菌属(Novosphingobium)的微生物，特别优选溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Novosphingobium aromaticivorans)；作为分类在鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)的微生物，特别优选阿拉斯加鞘氨醇盒菌(Sphingopyxisalaskensis)；作为分类在鞘氨醇菌属(Sphingobium)的微生物，特别优选日本鞘氨醇菌(Sphingobium japonicum)及氯酚鞘氨醇菌(Sphingobiumchlorophenolicum)；作为分类在赤杆菌属(Erythrobacter)的微生物，特别优选海滨赤杆菌(Erythrobacter litoralis)；作为分类在短波单胞菌属(Brevundimonas)的微生物，特别优选缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)、近弧状短波单胞菌(Brevundimonas subvibrioides)及泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)；作为分类在柄杆菌属(Caulobacter)的微生物，特别优选新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)及迟缓柄杆菌(Caulobactersegnis)；作为分类在苯基杆菌属(Phenylobacterium)的微生物，特别优选族新苯基杆菌(Phenylobacterium zucineum)；作为分类在不黏柄菌属(Asticcacaulis)的微生物，特别优选离中不黏柄菌(Asticcacaulis excentricus)；作为分类在土壤杆菌属(Agrobacterium)的微生物，特别优选根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射杆状根瘤菌(Agrobacterium radiobacter)及藤黄土壤杆菌(Agrobacterium luteum)；作为分类在根瘤菌属(Rhizobium)的微生物，特别优选豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、豆根瘤菌(Rhizobium etli)及热带根瘤菌(Rhizobium tropici)；作为分类在中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的微生物，特别优选草木栖中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)及弗氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)；作为分类在黄色杆菌属(Xanthobacter)的微生物，特别优选敏捷黄色杆菌(Xanthobacter agilis)、氧化胺黄色杆菌(Xanthobacteraminoxidans)、自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)、黄黄色杆菌(Xanthobacter flavus)、万寿菊黄色杆菌(Xanthobacter tagetidis)、黏黄色杆菌(Xanthobacter viscosus)；作为分类在固氮根瘤菌属(Azorhizobium)的微生物，特别优选茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)；作为分类在布鲁氏菌属(Brucella)的微生物，特别优选马耳他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、布鲁氏菌(Brucella suis)、羊布鲁氏菌(Brucella ovis)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、田鼠布鲁氏菌(Brucella microti)、有鳍动物布鲁氏菌(Brucella pinnipedialis)及鳍脚动物布鲁氏菌(Brucella ceti)；作为分类在苍白杆菌属(Ochrobactrum)的微生物，特别优选人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、金雀儿根瘤苍白杆菌(Ochrobactrum cytisi)、大田市苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)、鸡粪苍白杆菌(Ochrobactrumgallinifaecis)、格里朗苍白杆菌(Ochrobactrum grignonense)、嗜血苍白杆菌(Ochrobactrum haemophilum)、中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)、羽扇豆苍白杆菌(Ochrobactrum lupini)、水稻苍白杆菌(Ochrobactrum oryzae)、假中间苍白杆菌(Ochrobactrum pseudintermedium)、假格里朗苍白杆菌(Ochrobactrum pseudogrignonense)、食噻吩苍白杆菌(Ochrobactrumthiophenivorans)、小麦苍白杆菌(Ochrobactrum tritici)；作为分类在中间根瘤菌属(Mesorhizobium)的微生物，特别优选骆驼刺中慢生根瘤菌(Mesorhizobium alhagi)、合欢中间根瘤菌(Mesorhizobium albiziae)、紫穗槐中间根瘤菌(Mesorhizobium amorphae)、澳大利亚中间根瘤菌(Mesorhizobium australicum)、锦鸡儿中间根瘤菌(Mesorhizobium caraganae)、埃尔查柯中间根瘤菌(Mesorhizobium chacoense)、鹰嘴豆中间根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、戈壁中间根瘤菌(Mesorhizobium gobiense)、百脉根中间根瘤菌(Mesorhizobium loti)、地中海中间根瘤菌(Mesorhizobiummediterraneum)、耐金属中间根瘤菌(Mesorhizobium metallidurans)、机会中间根瘤菌(Mesorhizobium opportunistum)、多源中间根瘤菌(Mesorhizobiumplurifarium)、华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、北方中间根瘤菌(Mesorhizobium septentrionale)、香格里拉中间根瘤菌(Mesorhizobiumshangrilense)、塔里木中间根瘤菌(Mesorhizobium tarimense)、温暖区中间根瘤菌(Mesorhizobium temperatum)、硫恒河中间根瘤菌(Mesorhizobiumthiogangeticu)、天山中间根瘤菌(Mesorhizobium tianshanense)；作为分类在橙色单胞菌属(Aurantimonas)的微生物，特别优选锰氧化橙色单胞菌(Aurantimonas manganoxydans)；作为分类在慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的微生物，特别优选日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)；作为分类在农单胞菌属(Agromonas)的微生物，特别优选寡养农单胞菌(Agromonasoligotrophica)；作为分类在红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)的微生物，特别优选沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；作为分类在硝化杆菌属(Nitrobacter)的微生物，特别优选维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)及汉堡硝化杆菌(Nitrobacter hamburgensis)；作为分类在甲基杆菌属(Methylobacterium)的微生物，特别优选扭托甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、耐辐射甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)及结瘤甲基杆菌(Methylobacterium nodulans)；作为分类在红微菌属(Rhodomicrobium)的微生物，特别优选万尼氏红微菌(Rhodomicrobium vannielii)；作为分类在外海芽孢杆菌属(Pelagibacterium)的微生物，特别优选耐盐外海芽孢杆菌(Pelagibacterium halotolerans)；作为分类在细小棒状菌属(Parvibaculum)的微生物，特别优选食淋洗物细小棒状菌(Parvibaculum lavamentivorans)；作为分类在细小棒菌属(Parvularcula)的微生物，特别优选百慕大细小棒菌(Parvularcula bermudensis)；作为分类在伯克氏菌属(Burkholderia)的微生物，特别优选鼻疽伯克氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)、泰国伯克氏菌(Burkholderia thailandensis)、越南伯克氏菌(Burkholderia vietnamiensis)、新洋葱伯克氏菌(Burkholderiacenocepacia)、双向伯克氏菌(Burkholderia ambifaria)、多噬伯克氏菌(Burkholderia multivorans)、洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)、食异生素伯克氏菌(Burkholderia xenovorans)、瘤块伯克氏菌(Burkholderia phymatum)、强壮植物伯克氏菌(Burkholderia phytofirmans)、荚壳伯克氏菌(Burkholderiaglumae)、产素伯克氏菌(Burkholderia rhizoxinica)、唐菖蒲伯克氏菌(Burkholderia gladioli)、解卤酚伯克氏菌(Burkholderia phenoliruptrix)及俄克拉荷马伯克氏菌(Burkholderia oklahomensis)；作为分类在罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)的微生物，特别优选茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)、皮氏罗尔斯通氏菌(Ralstonia pickettii)及富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)；作为分类在贪铜菌属(Cupriavidus)的微生物，特别优选耐重金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)、台湾贪铜菌(Cupriavidus taiwanensis)及杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)；作为分类在多核杆菌属(Polynucleobacter)的微生物，特别优选必需多核杆菌(Polynucleobacter necessarius)；作为分类在无色杆菌属(Achromobacter)的微生物，特别优选砷氧化无色杆菌属(Achromobacter arsenitoxydans)、考利诺无色杆菌(Achromobactercholinophagum)、裂环无色杆菌(Achromobacter cycloclastes)、脱氮无色杆菌(Achromobacter denitrificans)、费氏无色杆菌(Achromobacter fischeri)、哈特无色杆菌(Achromobacter hartlebii)、不动无色杆菌(Achromobacterimmobilis)、罕见无色杆菌(Achromobacter insolitus)、解乳消化无色杆菌(Achromobacter lactolyticus)、水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)、嗜甲醇无色杆菌(Achromobacter methanolophila)、细疫无色杆菌(Achromobacterpestifer)、皮氏无色杆菌(Achromobacter piechaudii)、拉氏无色杆菌(Achromobacter ruhlandii)、少见无色杆菌(Achromobacter spanios)、黏无色杆菌(Achromobacter viscosus)、干燥无色杆菌(Achromobacter xerosis)、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)；作为分类在鲍特氏菌属(Bordetella)的微生物，特别优选百日咳鲍特氏菌(Bordetella pertussis)、副百日咳鲍特氏菌(Bordetella parapertussis)、彼氏鲍特氏菌(Bordetella petrii)及鸟鲍特氏菌(Bordetella avium)；作为分类在泰勒氏菌属(Taylorella)的微生物，特别优选马生殖器泰勒氏菌(Taylorella equigenitalis)；作为分类在丛毛单胞菌属(Comamonas)的微生物，特别优选食酸丛毛单胞菌(Comamonasacidovorans)、水丛毛单胞菌(Comamonas aquatica)、微红褐丛毛单胞菌(Comamonas badia)、堆肥丛毛单胞菌(Comamonas composti)、脱氮丛毛单胞菌(Comamonas denitrificans)、颗粒丛毛单胞菌(Comamonas granuli)、克氏丛毛单胞菌(Comamonas kerstersii)、韩国丛毛单胞菌(Comamonaskoreensis)、食硝酸盐丛毛单胞菌(Comamonas nitrativorans)、白蚁丛毛单胞菌(Comamonas odontotermites)、土地丛毛单胞菌(Comamonas terrae)、土生丛毛单胞菌(Comamonas terrigena)、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)、氧化硫丛毛单胞菌(Comamonas thiooxydans)、综联丛毛单胞菌(Comamonas zonglianii)；作为分类在嗜脂环物菌属(Alicycliphilus)的微生物，特别优选脱氮嗜脂环物菌(Alicycliphilus denitrificans)；作为分类在戴尔福特菌属(Delftia)的微生物，特别优选食酸戴尔福特菌(Delftiaacidovorans)；作为分类在沙壤土杆菌属(Ramlibacter)的微生物，特别优选泰塔温沙壤土杆菌(Ramlibacter tataouinensis)；作为分类在红育菌属(Rhodoferax)的微生物，特别优选还原铁红育菌(Rhodoferax ferrireducens)；作为分类在贪噬菌属(Variovorax)的微生物，特别优选争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)；作为分类在极单胞菌属(Polaromonas)的微生物，特别优选食萘极单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)；作为分类在食酸菌属(Acidovorax)的微生物，特别优选西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)、埃布瑞斯食酸菌(Acidovorax ebreus)及燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)；作为分类在蚯蚓肾杆菌属(Verminephrobacter)的微生物，特别优选艾森蚯蚓肾杆菌(Verminephrobacter eiseniae)；作为分类在赫山单胞菌属(Herminiimonas)的微生物，特别优选砷氧化赫山单胞菌(Herminiimonas arsenicoxydans)；作为分类在草螺菌属(Herbaspirillum)的微生物，特别优选织片草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)；作为分类在山冈单胞菌属(Collimonas)的微生物，特别优选食真菌山冈单胞菌(Collimonas fungivorans)；作为分类在色杆菌属(Chromobacterium)的微生物，特别优选紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)；作为分类在鸥杆菌属(Laribacter)的微生物，特别优选香港鸥杆菌(Laribacter hongkongensis)；作为分类在假古布尔班克氏菌属(Pseudogulbenkiania)的微生物，特别优选氧化亚铁假古布尔班克氏菌(Pseudogulbenkiania ferrooxidans)；作为分类在亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)的微生物，特别优选欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)；作为分类在亚硝化螺菌属(Nitrosospira)的微生物，特别优选多形亚硝化螺菌(Nitrosospira multiformis)；作为分类在固氮弧菌属(Aromatoleum)的微生物，特别优选丁香固氮弧菌(Aromatoleumaromaticum)；作为分类在脱氯单胞菌属(Dechloromonas)的微生物，特别优选芳香脱氯单胞菌(Dechloromonas aromatica)；作为分类在固氮螺形菌(脱氯弯杆菌)属(Azospira(Dechlorosoma))的微生物，特别优选水稻固氮螺形菌(猪脱氯弯杆菌)(Azospira oryzae(Dechlorosoma suillum))；作为分类在莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)的微生物，特别优选南海莱茵海默氏菌(Rheinheimera nanhaiensis)；作为分类在亚硝化球菌属(Nitrosococcus)的微生物，特别优选海洋亚硝化球菌(Nitrosococcus oceani)；作为分类在需盐红螺菌属(Halorhodospira)的微生物，特别优选嗜盐需盐红螺菌(Halorhodospirahalophila)；作为分类在黄单胞菌属(Xanthomonas)的微生物，特别优选野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonasaxonopodis)、水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)、白纹黄单胞菌(Xanthomonas albilineans)及柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)；作为分类在寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)的微生物，特别优选嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)；作为分类在假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)的微生物，特别优选水原假黄色单胞菌(Pseudoxanthomonas suwonensis)及枣褐色假黄色单胞菌(Pseudoxanthomonasspadix)；作为分类在弗郎西斯氏菌属(Francisella)的微生物，特别优选土拉热弗郎西斯氏菌(Francisella tularensis)及新凶手弗郎西斯氏菌(Francisellanovicida)；作为分类在解环菌属(Cycloclasticus)的微生物，特别优选赞可解环菌(Cycloclasticus zancles)；作为分类在霍氏菌属(Hahella)的微生物，特别优选济州岛霍氏菌(Hahella chejuensis)；作为分类在盐单胞菌属(Halomonas)的微生物，特别优选伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)；作为分类在食烷菌属(Alcanivorax)的微生物，特别优选泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)及柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)；作为分类在康氏菌属(Kangiella)的微生物，特别优选韩国康氏菌(Kangiellakoreensis)；作为分类在假单胞菌属(Pseudomonas)的微生物，特别优选例如绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、伞菌假单胞菌(Pseudomonas agarici)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、杏仁核假单胞菌(Pseudomonas amygdale)及施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)；作为分类在固氮菌属(Azotobacter)的微生物，特别优选瓦恩兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)；作为分类在不动杆菌属(Acinetobacter)的微生物，特别优选鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、贝氏不动杆菌(Acinetobacter aylyi)、酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、吉氏不动杆菌(Acinetobacter gyllenbergii)、溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)、嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)、细小不动杆菌(Acinetobacter parvus)；作为分类在嗜冷杆菌属(Psychrobacter)的微生物，特别优选北极嗜冷杆菌(Psychrobacter arcticus)及盐晶嗜冷杆菌(Psychrobacter cryohalolentis)；作为分类在别样谢瓦氏菌属(Alishewanella)的微生物，特别优选发酵海鲜异希瓦氏菌(Alishewanella jeotgali)；作为分类在交替单胞菌属(Alteromonas)的微生物，特别优选麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)；作为分类在居水菌属(Glaciecola)的微生物，特别优选脱氮居水菌(Glaciecolanitratireducens)、嗜冷居水菌(Glaciecola psychrophila)及浅粉红色居水菌(Glaciecola punicea)；作为分类在海杆菌属(Marinobacter)的微生物，特别优选水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)、除烃海杆菌(Marinobacterhydrocarbonoclasticus)、粘着海杆菌(Marinobacter adhaerens)、栖藻海杆菌(Marinobacter algicola)及锰氧化海杆菌(Marinobacter manganoxydans)；作为分类在海细菌属(Marinobacterium)的微生物，特别优选斯氏海细菌(Marinobacterium stanieri)；作为分类在噬糖菌属(Saccharophagus)的微生物，特别优选降解噬糖菌(Saccharophagus degradans)；作为分类在希瓦氏菌属(Shewanella)的微生物，特别优选耐压希瓦氏菌(Shewanella piezotolerans)、深渊希瓦氏菌(Shewanella abyssi)、邻近希瓦氏菌(Shewanella affinis)、海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)、栖冷鱼希瓦氏菌(Shewanella algidipiscicola)、亚马逊希瓦氏菌(Shewanella amazonensis)、海水希瓦氏菌(Shewanellaaquimarina)、北极希瓦氏菌(Shewanella arctica)、大西洋希瓦氏菌(Shewanellaatlantica)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)、玄武岩希瓦氏菌(Shewanellabasaltis)、深海希瓦氏菌(Shewanella benthica)、加拿大希瓦氏菌(Shewanellacandadensis)、吉尔卡湖希瓦氏菌(Shewanella chilikensis)、科氏希瓦氏菌(Shewanella colwelliana)、珊瑚希瓦氏菌(Shewanella corallii)、脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)、反硝化希瓦氏菌(Shewanella denitrificans)、东海希瓦氏菌(Shewanella donghaensis)、真实希瓦氏菌(Shewanella fidelis)、小短背希瓦氏菌(Shewanella fodinae)、冷海希瓦氏菌(Shewanellafrigidimarina)、潮汐希瓦氏菌(Shewanella gaetbuli)、冰海希瓦氏菌(Shewanellagelidimarina)、栖水鱼希瓦氏菌(Shewanella glacialipiscicola)、高弗希瓦氏菌(Shewanella gopherii)、哈夫尼希瓦氏菌(Shewanella hafniensis)、哈利法克斯希瓦氏菌(Shewanella halifaxensis)、鲍希瓦氏菌(Shewanella haliotis)、羽田氏希瓦氏菌(Shewanella hanedai)、日本希瓦氏菌(Shewanella japonica)、开氏希瓦氏菌(Shewanella kaireitica)、利文斯顿岛希瓦氏菌(Shewanellaivingstonensis)、光伏希瓦氏菌(Shewanella loihica)、海洋希瓦氏菌(Shewanellamarina)、海动物肠希瓦氏菌(Shewanella marinintestina)、黄海希瓦氏菌(Shewanella marisflavi)、鳕鱼希瓦氏菌(Shewanella morhuae)、奥氏希瓦氏菌(Shewanella olleyana)、奥奈达湖希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)、太平洋希瓦氏菌(Shewanella pacifica)、乌贼希瓦氏菌(Shewanella pealeana)、肺鲐希瓦氏菌(Shewanella pneumatophori)、深层希瓦氏菌(Shewanellaprofunda)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、竹刀鱼希瓦氏菌(Shewanella sairae)、真鲴希瓦氏菌(Shewanella schlegeliana)、沉积物希瓦氏菌(Shewanella sediminis)、骏河湾希瓦氏菌(Shewanella surugensis)、小泡希瓦氏菌(Shewanella vesiculosa)、紫色希瓦氏菌(Shewanella violacea)、瓦氏希瓦氏菌(Shewanella waksmanii)、武氏希瓦氏菌(Shewanella woodyi)、厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis)；作为分类在铁单胞菌属(Ferrimonas)的微生物，特别优选巴利阿里铁单胞菌(Ferrimonas balearica)；作为分类在海源菌属(Idiomarina)的微生物，特别优选罗伊赫海源菌(Idiomarina loihiensis)及波罗的海海源菌(Idiomarina baltica)；作为分类在科维尔氏菌属(Colwellia)的微生物，特别优选冷红科维尔氏菌(Colwellia psychrerythraea)；作为分类在假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)的微生物，特别优选游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonasatlantica)及长衫假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tunicata)；作为分类在利斯顿氏菌属(Listonella)的微生物，特别优选安圭拉利斯顿氏菌(Listonellaanguillara)、鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)及海利斯顿氏菌(Listonellapelagia)；作为分类在弧菌属(Vibrio)的微生物，特别优选副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、弗氏弧菌(Vibrio furnissii)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、锡那罗州弧菌(Vibriosinaloensis)、轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)、东方弧菌(Vibrio orientalis)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、解珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、卡氏弧菌(Vibrio caribbenthicus)、巴西弧菌(Vibrio brasiliensis)及解藻酸弧菌(Vibrioalginolyticus)；作为分类在发光杆菌属(Photobacterium)的微生物，特别优选深层发光杆菌(Photobacterium profundum)；作为分类在气单胞菌属(Aeromonas)的微生物，特别优选嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)及维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)；作为分类在盐水球形菌属(Salinisphaera)的微生物，特别优选深层盐水球形菌(Salinisphaera shabanensis)；作为分类在军团菌属(Legionella)的微生物，特别优选嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)及长滩军团菌(Legionellalongbeachae)；作为分类在考克斯氏体属(Coxiella)的微生物，特别优选伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)；作为分类在脱硫球菌属(Desulfococcus)的微生物，特别优选噬油脱硫球菌(Desulfococcus oleovorans)；作为分类在脱硫杆菌属(Desulfobacterium)的微生物，特别优选自养脱硫杆菌(Desulfobacterium autotrophicum)；作为分类在脱硫酸盐杆菌属(Desulfatibacillum)的微生物，特别优选食烃烯脱硫酸盐杆菌(Desulfatibacillum alkenivorans)；作为分类在脱硫叶菌属(Desulfobulbus)的微生物，特别优选丙酸脱硫叶菌(Desulfobulbus propionicus)；作为分类在脱硫弓菌属(Desulfarculus)的微生物，特别优选巴氏脱硫弓菌(Desulfarculusbaarsii)；作为分类在地杆菌属(Geobacter)的微生物，特别优选金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens)、还原铀地杆菌(Geobacter uraniireducens)及伯米吉地杆菌(Geobacter bemidjiensis)；作为分类在互营杆菌属(Syntrophobacter)的微生物，特别优选氧化延胡奈酸互营杆菌(Syntrophobacter fumaroxidans)；作为分类在共养菌属(Syntrophus)的微生物，特别优选食酸共养菌(Syntrophus aciditrophicus)；作为分类在脱硫假丝酵母属(Desulfomonile)的微生物，特别优选蒂氏脱硫假丝酵母(Desulfomoniletiedjei)；作为分类在蛭弧菌属(Bdellovibrio)的微生物，特别优选食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)及食表皮蛭弧菌(Bdellovibrio exovorus)；作为分类在噬菌属(Bacteriovorax)的微生物，特别优选海洋噬菌(Bacteriovoraxmarinus)；作为分类在标桩菌属(Stigmatella)的微生物，特别优选橙色标桩菌(Stigmatella aurantiaca)；作为分类在黏球菌属(Myxococcus)的微生物，特别优选橙黄色黏球菌(Myxococcus xanthus)及微红黄色黏球菌(Myxococcusfulvus)；作为分类在厌氧黏杆细菌属(Anaeromyxobacter)的微生物，特别优选脱卤厌氧黏杆细菌(Anaeromyxobacter dehalogenans)；作为分类在堆囊菌属(Sorangium)的微生物，特别优选纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)；作为分类在海无柄孢囊黏细菌属(Haliangium)的微生物，特别优选苍黄海无柄孢囊黏细菌(Haliangium ochraceum)；作为分类在酸杆菌属(Acidobacterium)的微生物，特别优选荚膜酸杆菌(Acidobacterium capsulatum)；作为分类在短链小球菌属(Granulicella)的微生物，特别优选唐德短链小球菌(Granulicellatundricola)；作为分类在水沉积物杆菌属(Ilumatobacter)的微生物，特别优选柯西氏水沉积物杆菌(Ilumatobacter coccineum)；作为分类在链孢囊菌属(Streptosporangium)的微生物，特别优选玫瑰链孢囊菌(Streptosporangiumroseum)；作为分类在拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)的微生物，特别优选达氏拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)；作为分类在喜热裂孢菌属(Thermobifida)的微生物，特别优选褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)；作为分类在高温单孢菌属(Thermomonospora)的微生物，特别优选弯曲高温单胞菌(Thermomonospora curvata)；作为分类在假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)的微生物，特别优选食二氯杂环己烷假诺卡氏菌(Pseudonocardia dioxanivorans)；作为分类在拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)的微生物，特别优选地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)；作为分类在糖单孢菌属(Saccharomonospora)的微生物，特别优选绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis)及新疆糖单孢菌(Saccharomonosporaxinjiangensis)；作为分类在糖多孢菌属(Saccharopolyspora)的微生物，特别优选红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)及刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)；作为分类在嗜热双孢菌属(Thermobispora)的微生物，特别优选双孢嗜热双孢菌(Thermobispora bispora)；作为分类在放线束丝菌属(Actinosynnema)的微生物，特别优选奇迹放线束丝菌(Actinosynnema mirum)；作为分类在小单孢菌属(Micromonospora)的微生物，特别优选橙色小单孢菌(Micromonospora aurantiaca)；作为分类在盐水孢菌属(Salinispora)的微生物，特别优选热带盐水孢菌(Salinispora tropica)及栖沙盐水孢菌(Salinispora arenicola)；作为分类在疣孢菌属(Verrucosispora)的微生物，特别优选海洋疣孢菌(Verrucosispora maris)；作为分类在韩国生工菌属(Kribbella)的微生物，特别优选苍黄韩国生工菌(Kribbella flavida)；作为分类在棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物，特别优选约-卡二氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)、解脲棒杆菌(Corynebacterium urealyticum)及克氏棒杆菌(Corynebacterium kroppenstedtii)；作为分类在诺卡氏菌属(Nocardia)的微生物，特别优选皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)、巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)及圣乔治教堂诺卡氏菌(Nocardiacyriacigeorgica)；作为分类在红球菌属(Rhodococcus)的微生物，特别优选玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、马红球菌(Rhodococcus equi)、椿象红球菌(Rhodococcusrhodnii)、珊瑚红球菌(Rhodococcus corallinus)、深红红球菌(Rhodococcusrubropertinctus)、嗜粪红球菌(Rhodococcus coprophilus)、圆红球菌(Rhodococcus globerulus)、氯酚红球菌(Rhodococcus chlorophenolicus)、藤黄红球菌(Rhodococcus luteus)、爱知红球菌(Rhodococcus aichiensis)、楚布红球菌(Rhodococcus chubuensis)、海水红球菌(Rhodococcus maris)及成束红球菌(Rhodococcus fascines)；作为分类在戈登氏菌属(Gordonia)的微生物，特别优选支气管戈登氏菌(Gordonia bronchialis)、新费氏戈登氏菌(Gordonianeofelifaecis)及土地戈登氏菌(Gordonia terrae)；作为分类在迪茨氏菌属(Dietzia)的微生物，特别优选肉桂色迪茨氏菌(Dietzia cinnamea)；作为分类在分支杆菌属(Mycobacterium)的微生物，特别优选结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)、麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)、鸟分支杆菌(Mycobacterium avium)、耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)、溃疡分支杆菌(Mycobacteriumulcerans)、范巴伦氏分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)、浅黄分支杆菌(Mycobacterium gilvum)、脓肿分支杆菌(Mycobacterium abscessus)、海分支杆菌(Mycobacterium marinu)、马赛分支杆菌(Mycobacterium massiliense)、草分支杆菌(Mycobacterium phlei)、抗热分支杆菌(Mycobacteriumthermoresistibile)、托斯卡纳分支杆菌(Mycobacterium tusciae)、蟾分支杆菌(Mycobacterium xenopi)及罗得西亚分支杆菌(Mycobacterium rhodesiae)；作为分类在分枝菌酸球菌属(Amycolicicoccus)的微生物，特别优选微黄分枝菌酸球菌(Amycolicicoccus subflavus)；作为分类在塚村氏菌属(Tsukamurella)的微生物，特别优选稍变塚村氏菌(Tsukamurella paurometabola)；作为分类在脂肪酸慢出菌属(Segniliparus)的微生物，特别优选光滑脂肪酸慢出菌(Segniliparus rotundus)；作为分类在小杆菌属(Microbacterium)的微生物，特别优选砖红色小杆菌(Microbacterium testaceum)；作为分类在微球菌属(Micrococcus)的微生物，特别优选藤黄微球菌(Micrococcus luteus)；作为分类在节杆菌属(Arthrobacter)的微生物，特别优选研究团队节杆菌(Arthrobacter arilaitensis)、氯酚节杆菌(Arthrobacter chlorophenolicus)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)及食菲节杆菌(Arthrobacterphenanthrenivorans)；作为分类在肾杆菌属(Renibacterium)的微生物，特别优选鲑亚科肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)；作为分类在考克氏菌属(Kocuria)的微生物，特别优选嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)；作为分类在皮肤球菌属(Kytococcus)的微生物，特别优选丛皮肤球菌(Kytococcussedentarius)；作为分类在纤维单胞菌属(Cellulomonas)的微生物，特别优选粪纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)；作为分类在间孢囊菌属(Intrasporangium)的微生物，特别优选秃裸间孢囊菌(Intrasporangium calvum)；作为分类在丝氨酸球菌属(Serinicoccus)的微生物，特别优选深丝氨酸球菌(Serinicoccusprofundi)；作为分类在弗兰克氏菌属(Frankia)的微生物，特别优选桤木弗兰克氏菌(Frankia alni)；作为分类在酸栖热菌属(Acidothermus)的微生物，特别优选解纤维酸栖热菌(Acidothermus cellulolyticus)；作为分类在中村氏菌属(Nakamurella)的微生物，特别优选多裂中村氏菌(Nakamurellamultipartita)；作为分类在地嗜皮菌属(Geodermatophilus)的微生物，特别优选昏暗地嗜皮菌(Geodermatophilus obscurus)；作为分类在斯塔克布朗氏菌属(Stackebrandtia)的微生物，特别优选拿骚斯塔克布朗氏菌(Stackebrandtianassauensis)；作为分类在链霉菌属(Streptomyces)的微生物，特别优选白色链霉菌(Streptomyces albus)、阿维菌素链霉菌(Streptomyces avermitilis)、冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)、教酒色链霉菌(Streptomyceschartreusis)、带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)、天蓝黄链霉菌(Streptomyces coelicoflavus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、加纳链霉菌(Streptomyces ghanaensis)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)、玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)、疮痂链霉菌(Streptomycesscabiei)、斯维链霉菌(Streptomyces sviceus)、委内瑞拉链霉菌(Streptomycesvenezuelae)、紫黑链霉菌(Streptomyces violaceusniger)及绿产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)；作为分类在细小链孢菌属(Catenulispora)的微生物，特别优选嗜酸细小链孢菌(Catenulispora acidiphila)；作为分类在红色杆菌属(Rubrobacter)的微生物，特别优选喜木聚糖红色杆菌(Rubrobacterxylanophilus)；作为分类在康奈斯氏杆菌属(Conexibacter)的微生物，特别优选伍氏康奈斯氏杆菌(Conexibacter woesei)；作为分类在芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，特别优选苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、巨兽芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、假坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，作为分类在地芽孢杆菌属(Geobacillus)的微生物，特别优选热解蛋白地芽孢杆菌(Geobacillus caldoproteolyticus)、热解木糖地芽孢杆菌(Geobacilluscaldoxylosilyticus)、脆弱地芽孢杆菌(Geobacillus debilis)、乳糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus galactosidasius)、加尔加泉地芽孢杆菌(Geobacillusgargensis)、侏罗纪地芽孢杆菌(Geobacillus jurassicus)、好热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)、立陶宛地芽孢杆菌(Geobacillus lituanicus)、苍白地芽孢杆菌(Geobacillus pallidus)、嗜热嗜脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、斯氏地芽孢杆菌(Geobacillus stromboliensis)、地表地芽孢杆菌(Geobacillus subterraneus)、喜温地芽孢杆菌(Geobacillustepidamans)、热小链地芽孢杆菌(Geobacillus thermocatenulatus)、嗜热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)、热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)、喜热嗜油地芽孢杆菌(Geobacillusthermoleovorans)、就地堆肥地芽孢杆菌(Geobacillus toebii)、乌津油田地芽孢杆菌(Geobacillus uzensis)、火神地芽孢杆菌(Geobacillus vulcani)、杂利地芽孢杆菌(Geobacillus zalihae)；作为分类在大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)的微生物，特别优选伊平屋桥大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)；作为分类在赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)的微生物，特别优选球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)；作为分类在喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)的微生物，特别优选嗜盐喜盐芽孢杆菌(Halobacillushalophilus)；作为分类在脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)的微生物，特别优选酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)；作为分类在凯皮迪亚属(Kyrpidia)的微生物，特别优选图氏凯皮迪亚菌(Kyrpidia tusci)；作为分类在类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的微生物，特别优选多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、胶胨样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)及地类芽孢杆菌(Paenibacillus terrae)；作为分类在乳杆菌属(Lactobacillus)的微生物，特别优选布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)；作为分类在梭菌属(Clostridium)的微生物，特别优选丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、科氏梭菌(Clostridium kluyveri)、噬纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)、艰难梭菌(Clostridium difficile)及斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)；作为分类在嗜碱菌属(Alkaliphilus)的微生物，特别优选金属还原嗜碱菌(Alkaliphilus metalliredigens)及奥氏嗜碱菌(Alkaliphilus oremlandii)；作为分类在共养单胞菌属(Syntrophomonas)的微生物，特别优选沃氏共养单胞菌(Syntrophomonas wolfei)；作为分类在互养栖热菌属(Syntrophothermus)的微生物，特别优选脂肪酸特异互养栖热菌(Syntrophothermus lipocalidus)；作为分类在真杆菌属(Eubacterium)的微生物，特别优选直肠真杆菌(Eubacterium rectale)及黏液真杆菌(Eubacteriumlimosum)；作为分类在脱亚硫酸杆菌属(Desulfitobacterium)的微生物，特别优选哥本哈根脱亚硫酸杆菌(Desulfitobacterium hafniense)；作为分类在脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)的微生物，特别优选还原脱硫肠状菌(Desulfotomaculum reducens)；作为分类在发酵菌属(Pelotomaculum)的微生物，特别优选喜热丙酸发酵菌(Pelotomaculum thermopropionicum)；作为分类在丁酸弧菌属(Butyrivibrio)的微生物，特别优选解朊丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus)；作为分类在罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)的微生物，特别优选人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)；作为分类在震颤杆菌属(Oscillibacter)的微生物，特别优选产戊酸震颤杆菌(Oscillibactervalericigenes)；作为分类在嗜热厌氧杆状菌属(Thermoanaerobacter)的微生物，特别优选腾冲嗜热厌氧杆状菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；作为分类在一氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)的微生物，特别优选生氢一氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)；作为分类在需碱厌氧菌属(Natranaerobius)的微生物，特别优选嗜热需碱厌氧菌(Natranaerobiusthermophilus)；作为分类在鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)的微生物，特别优选多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)、食醇鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium spiritivorum)、阿里门塔里乌姆鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium alimentarium)、安徽鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumanhuiense)、南极鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium antarcticum)、竹鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium bambusae)、加拿大鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumcanadense)、堆肥鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium composti)、大田市鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium daejeonense)、屎鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumfaecium)、肝素鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium heparinum)、北广岛鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium kitahiroshimense)、乳鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumlactis)、水氏鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium mizutaii)、杀线虫鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium nematocida)、鲤鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium piscium)、沙雅鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium shayense)、泗阳鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium siyangense)、嗜温鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumthalpophilum)、温西鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium wenxiniae)；作为分类在土地杆菌属(Pedobacter)的微生物，特别优选斯氏土地杆菌(Pedobactersteynii)、硬水土地杆菌(Pedobacter duraquae)、寡代谢土地杆菌(Pedobactermetabolipauper)、哈茨山土地杆菌(Pedobacter hartonius)、解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)、非洲土地杆菌(Pedobacter africanus)、野土地杆菌(Pedobacter agri)、冲积地土地杆菌(Pedobacter alluvius)及舞蹈土地杆菌(Pedobacter saltans)；作为分类在束缚杆菌属(Haliscomenobacter)的微生物，特别优选水束缚杆菌(Haliscomenobacter hydrossis)；作为分类在卟啉单胞菌属(Porphyromonas)的微生物，特别优选牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)及不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonas asaccharolytica)；作为分类在臭气杆菌属(Odoribacter)的微生物，特别优选内脏臭气杆菌(Odoribactersplanchnicus)；作为分类在螺状菌属(Spirosoma)的微生物，特别优选舌螺状菌(Spirosoma linguale)；作为分类在古字状菌属(Runella)的微生物，特别优选飘软古字状菌(Runella slithyformis)；作为分类在奇异球菌属(Deinococcus)的微生物，特别优选耐放射奇异球菌(Deinococcusradiodurans)、热泉奇异球菌(Deinococcus geothermalis)、沙漠奇异球菌(Deinococcus deserti)、马里科帕部落奇异球菌(Deinococcus maricopensis)、解蛋白奇异球菌(Deinococcus proteolyticus)及戈壁奇异球菌(Deinococcusgobiensis)；作为分类在栖热菌属(Thermus)的微生物，特别优选嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)及水管致黑栖热菌(Thermus scotoductus)；作为分类在稍栖热菌属(Meiothermus)的微生物，特别优选红色稍栖热菌(Meiothermus ruber)及席氏稍栖热菌(Meiothermus silvanus)；作为分类在大洋栖热菌属(Oceanithermus)的微生物，特别优选深层大洋栖热菌(Oceanithermus profundus)；作为分类在海栖热菌属(Marinithermus)的微生物，特别优选热液口海栖热菌(Marinithermus hydrothermalis)；作为分类在芽单胞菌属(Gemmatimonas)的微生物，特别优选橙色芽单胞菌(Gemmatimonas aurantiaca)；作为分类在梭杆菌属(Fusobacterium)的微生物，特别优选具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)；作为分类在泥杆菌属(Ilyobacter)的微生物，特别优选多养型泥杆菌(Ilyobacter polytropus)；作为分类在玫瑰弯菌属(Roseiflexus)的微生物，特别优选卡氏玫瑰弯菌(Roseiflexus castenholzii)；作为分类在滑柱菌属(Herpetosiphon)的微生物，特别优选橙色滑柱菌(Herpetosiphon aurantiacus)；作为分类在热微菌属(Thermomicrobium)的微生物，特别优选玫瑰色热微菌(Thermomicrobiumroseum)；作为分类在栖热袍菌属(Thermotoga)的微生物，特别优选莱庭栖热袍菌(Thermotoga lettingae)；作为分类在栖热腔菌属(Thermosipho)的微生物，特别优选美拉尼西亚栖热腔菌(Thermosipho melanesiensis)及非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)；作为分类在闪烁杆菌属(Fervidobacterium)的微生物，特别优选多节闪烁杆菌(Fervidobacterium nodosum)；作为分类在脱铁杆菌属(Deferribacter)的微生物，特别优选脱硫脱铁杆菌(Deferribacterdesulfuricans)；作为分类在热土弧菌属(Calditerrivibrio)的微生物，特别优选硝酸盐还原热土弧菌(Calditerrivibrio nitroreducens)；作为分类在曲揉杆菌属(Flexistipes)的微生物，特别优选红海曲揉杆菌(Flexistipes sinusarabici)；作为分类在生金球菌属(Metallosphaera)的微生物，特别优选勤奋生金球菌(Metallosphaera sedula)；作为分类在气火菌属(Aeropyrum)的微生物，特别优选敏捷气火菌(Aeropyrum pernix)；作为分类在热棒菌属(Pyrobaculum)的微生物，特别优选需氧热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)、岛屿热棒菌(Pyrobaculum islandicum)、热泉热棒菌(Pyrobaculum calidifontis)及中性热棒菌(Pyrobaculum neutrophilum)；作为分类在热杆菌属(Caldivirga)的微生物，特别优选马基灵山热杆菌(Caldivirga maquilingensis)；作为分类在火山热泉杆菌属(Vulcanisaeta)的微生物，特别优选散布火山热泉杆菌(Vulcanisaeta distributa)；作为分类在酸叶菌属(Acidilobus)的微生物，特别优选噬糖酸叶菌(Acidilobus saccharovorans)；作为分类在盐盒菌属(Haloarcula)的微生物，特别优选死海盐盒菌(Haloarcula marismortui)；作为分类在盐方形菌属(Haloquadratum)的微生物，特别优选瓦氏盐方形菌(Haloquadratum walsbyi)；作为分类在嗜盐碱单孢菌属(Natronomonas)的微生物，特别优选法老嗜盐碱单孢菌(Natronomonas pharaonis)；作为分类在盐红菌属(Halorubrum)的微生物，特别优选湖渊盐红菌(Halorubrumlacusprofundi)；作为分类在盐土生古菌属(Haloterrigena)的微生物，特别优选土库曼盐土生古菌(Haloterrigena turkmenica)；作为分类在无色需碱菌属(Natrialba)的微生物，特别优选马加蒂湖无色需碱菌(Natrialba magadii)；作为分类在盐碱球菌属(Halalkalicoccus)的微生物，特别优选咸海鲜盐碱球菌(Halalkalicoccus jeotgali)；作为分类在盐几何形菌属(Halogeometricum)的微生物，特别优选波多黎各盐几何形菌(Halogeometricum borinquense)；作为分类在热原体属(Thermoplasma)的微生物，特别优选嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)及火山热原体(Thermoplasma volcanium)；作为分类在嗜酸古菌属(Picrophilus)的微生物，特别优选干热嗜酸古菌(Picrophilus torridus)；作为分类在铁原体属(Ferroplasma)的微生物，特别优选阿氏铁原体(Ferroplasma acidarmanus)；作为分类在古生球菌属(Archaeoglobus)的微生物，特别优选闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)及混毒古生球菌(Archaeoglobus veneficus)；作为分类在铁球菌属(Ferroglobus)的微生物，特别优选琥珀铁球菌(Ferroglobus placidus)；作为分类在多形菌属(Polymorphum)的微生物，特别优选浅黄多形菌(Polymorphum gilvum)；作为分类在云母弧菌属(Micavibrio)的微生物，特别优选食铜绿云母弧菌(Micavibrio aeruginosavorus)；作为分类在多贺氏菌属(Simiduia)的微生物，特别优选食藻多贺氏菌属(Simiduia agarivorans)；作为分类在纤发菌属(Leptothrix)的微生物，特别优选霍氏纤发菌(Leptothrix cholodnii)；作为分类在硫单胞菌属(Thiomonas)的微生物，特别优选中间硫单胞菌(Thiomonasintermedia)；作为分类在红长命菌属(Rubrivivax)的微生物，特别优选胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)；作为分类在甲基养菌属(Methylibium)的微生物，特别优选喜石甲基养菌(Methylibium petroleiphilum)；作为分类在厌氧球菌属(Anaerococcus)的微生物，特别优选普氏厌氧球菌(Anaerococcusprevotii)。

这里示出的微生物，可以从美国菌种保藏中心(ATCC)、独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术本部生物遗传资源部门(NBRC)、独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(FERM)等获得。

[甲基丙烯酸酯的合成工序]

甲基丙烯酸酯的制造可以按照以下的方法进行。在溶剂中添加甲基丙烯酰辅酶A及式2表示的醇或酚类制备溶液，使其溶解或悬浮。然后，使AAT与该溶液或悬浊液接触，在控制温度等条件的同时使甲基丙烯酰辅酶A与醇或酚类反应。通过上述反应，将甲基丙烯酰辅酶A的甲基丙烯酰基转移给式2的醇或酚类，从而生成甲基丙烯酸酯。

含有甲基丙烯酰辅酶A及式2表示的醇或酚类的溶液，通常用缓冲液等水性介质来制备。这里，为了使反应顺利进行，可以用渗透压调节剂等对摩尔渗透压浓度和/或离子强度进行控制。作为渗透压调节剂，只要是出于调节为相对于细胞内部等的溶液的渗透压为等渗或高渗的目的而添加的水溶性物质即可，例如为盐或糖类，优选为盐。作为盐，优选为金属盐，更优选为碱金属盐，进一步优选为碱金属卤化物，可以列举例如氯化钠、氯化钾。作为糖类，优选为单糖类或寡糖类，更优选为单糖类或二糖类，可以列举例如葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等。渗透压调节剂优选以1mM以上的浓度进行添加，特别优选调节为与所使用的生物细胞内的溶液相比为等渗或高渗。

此外，出于将生成的甲基丙烯酸酯分离的目的，还可以预先添加有机溶剂，以2相体系进行反应。作为有机溶剂，可以单独使用例如直链状、支链状或环状的、饱和或不饱和的脂肪族烃、饱和或不饱和的芳香族烃等中的一种，或将2种以上混合后使用。具体而言，可以列举例如烃系溶剂(例如戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯、二甲苯等)、卤化烃系溶剂(例如二氯甲烷、氯仿等)、醚系溶剂(例如乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、叔丁基甲基醚、二甲氧基乙烷等)、酯系溶剂(例如甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸甲酯)等。通过预先添加这些有机溶剂，生成的甲基丙烯酸酯进入有机相，有时反应能够高效进行。

反应液中的甲基丙烯酰辅酶A及式2表示的醇或酚类的摩尔比、浓度是任意的，没有特别限定。此外，AAT的使用量或反应条件可以根据使用的原料适当确定。通常，关于各原料的浓度，为甲基丙烯酰辅酶A时，设定为0.0000001～10质量％的范围，醇或酚类则按照相对于所使用的甲基丙烯酰辅酶A为0.1～1000倍摩尔、优选为0.5～50倍摩尔的浓度进行添加。

此外的反应温度或反应时间等各种条件可以根据所使用的原料、酶的活性等适当确定，没有特别限定，通常在5～80℃下使其反应1小时～1周即可。优选为在10～70℃下反应1～120小时，更优选为3小时以上，进一步优选为4小时以上。优选在这样的条件下对反应结束的条件进行选择。关于反应液的pH，只要反应高效地进行就没有特别限定，例如为pH4～10的范围，优选为pH5.5～8.5。

作为用于使甲基丙烯酸酯累积0.001mM以上的优选条件，在pH5.5～7.5的条件下，将甲基丙烯酰辅酶A的浓度直接或间接地调整为0.000001～1质量％的范围，将醇或酚类的浓度调整为相对于所使用的甲基丙烯酰辅酶A为1～50倍摩尔。然后，将温度调整至20～40℃的范围，使其反应3小时以上。关于这些原料(底物)，还可以按照成为上述范围的方式连续地供给，这样可以提高生成物的累积浓度。

在减压下或通气条件下实施本反应也是有效的。这是由于在上述条件下，可以连续地将生成的甲基丙烯酸酯分离，其结果是，有时反应能够高效进行。

在使用以异丁酰辅酶A为原料通过ACD的作用转变成的甲基丙烯酰辅酶A、或由3-羟基异丁酰辅酶A通过ECH的作用转变成的甲基丙烯酰辅酶A来制造甲基丙烯酸酯时，也优选调整至上述条件的范围而实施。另外，通过ACD或ECH合成甲基丙烯酰辅酶A的反应可以根据公知的方法来实施(例如，作为ACD的反应条件，可以是Microbiology(1999),145,2323-2334记载的条件)。进而，通过与其他生物反应组合，可以实现甲基丙烯酸酯在生物体内的连续反应(发酵生产)。

通过本发明的方法生成的甲基丙烯酸酯可以根据需要通过气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)等进行测定或定量分析。

从反应液中分离甲基丙烯酸酯可以单独利用蒸馏、薄膜蒸馏、溶剂萃取、柱分离等公知的纯化方法中的一种来实施，或将这些方法组合来实施。此外，获得的甲基丙烯酸酯可以通过通常的方法进行聚合并毫不逊色地用于以往的用途。

这样获得的甲基丙烯酸酯及其聚合物可以显著减少对能源、资源、环境产生的负荷，这与以石油制品为起始原料的现有的化学制造品相比，作为环境低负荷材料具有非常大的社会价值。

2.利用基因重组微生物由前体制造甲基丙烯酸酯的方法

[具有由前体生成甲基丙烯酸酯的能力的重组体微生物]

如前所述，在本发明中，也可以根据需要，对导入有AAT基因的微生物导入ACD基因、ECH基因、BCKAD基因等，由异丁酰辅酶A、3-羟基异丁酰辅酶A或2-氧代异戊酸等前体来合成甲基丙烯酸酯。

“前体”是指可以衍生出甲基丙烯酰辅酶A的化合物，表示异丁酰辅酶A或3-羟基异丁酰辅酶A、以及可以衍生出这2种化合物的物质。

作为可以衍生出2种化合物的物质，可以列举例如2-氧代异戊酸、异丁酸、3-羟基异丁酸、乙酸、丙酮酸、乳酸、乙酰乙酸、丁酸、丙酸、苹果酸、富马酸、柠檬酸以及琥珀酸等酸，缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸以及谷氨酸等氨基酸类，葡萄糖、果糖以及木糖等糖类等。

为了由这些前体生成甲基丙烯酸酯，也可以直接利用宿主微生物本来具有的各种代谢体系。也可以根据需要导入基因或使基因缺损。

(1)宿主微生物

作为宿主微生物，只要是具有用于由上述前体生成甲基丙烯酰辅酶A的酶组以及AAT表达能力的宿主就没有特别限定，细菌中可以列举红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)等，酵母中可以列举酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、裂殖酵母属(Shizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)，丝状菌中可以列举曲霉菌属(Aspergillus)等。

作为宿主，优选红球菌属微生物。作为其理由，根据的是下述见解：在本发明的过程中，通过实验确认了红球菌属微生物具有缬氨酸同化能力，发现通过利用该功能，可以用于基于图2所示途径的甲基丙烯酸酯的生成。

例如，可以单独使用选自以下的微生物中的1种或将2种以上组合使用。作为分类在红球菌属(Rhodococcus sp.)的微生物，可以列举例如玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、马红球菌(Rhodococcus equi)、椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)、珊瑚红球菌(Rhodococcus corallinus)、深红红球菌(Rhodococcus rubropertinctus)、嗜粪红球菌(Rhodococcus coprophilus)、圆红球菌(Rhodococcus globerulus)、氯酚红球菌(Rhodococcus chlorophenolicus)、藤黄红球菌(Rhodococcus luteus)、爱知红球菌(Rhodococcus aichiensis)、楚布红球菌(Rhodococcus chubuensis)、海水红球菌(Rhodococcus maris)以及成束红球菌(Rhodococcus fascines)等。

作为优选的例子，可以列举红串红球菌。作为更优选的株，可以列举红串红球菌PR-4株、红串红球菌KA2-5-1株、红串红球菌IGTS8株、红串红球菌D-1株、红串红球菌H-2株、红串红球菌N1-36株、红串红球菌I-19株、红串红球菌ECRD-1株、红串红球菌B1株、红串红球菌SY-1株、红串红球菌UM3株、红串红球菌UM9株或Rhodococcus sp.T09株等，特别优选列举红串红球菌PR-4株。进一步还包括这些株的衍生株。

作为衍生株，包括通过培养条件(例如培养基组成、温度等)的变化、化学或物理处理(例如γ射线照射等)对具有甲基丙烯酰辅酶A生成能力的微生物诱发基因变异而获得的变异株、如下述那样使活性增强或使活性缺失或下降的基因改变株。

活性增强是指在由菌体外向微生物内导入的基因的作用下，该微生物中的酶基因(不论来源如何)的表达量增大，除了将编码酶的基因由微生物的菌体外导入菌体内以外，还包括：使微生物的基因组上保有的酶基因的启动子活性增强、或通过置换为其它启动子从而使酶基因增强表达的方式，或者使该酶基因的阻遏物的活性下降或失活从而使该酶的活性增强的方式。

基因改变株也可以是进行了使阻碍甲基丙烯酰辅酶A合成反应的酶的活性缺失或降低的基因改变而获得的改变株。活性的“缺失”或“降低”是指该微生物中的该酶基因的表达完全消失或者减少，除了该酶基因发生置换、缺失或插入以外，还包括：使微生物的基因组上保有的酶基因的启动子活性降低、或通过置换为其它启动子从而抑制酶基因的表达的方式，或者使该酶基因的阻遏物的活性增强或活化从而使该酶的活性降低的方式。另外，这些基因改变可以通过常规方法进行。

作为实施通过图2所示的途径制造甲基丙烯酸酯时优选的改变株，可以列举具有以下所示的(a)或(b)中至少一种特征的改变株。

(a)通过导入BCKAD基因和/或ACD基因，增强甲基丙烯酰辅酶A的生成活性。

(b)通过使ECH基因、3-羟基异丁酰辅酶A水合酶基因和/或3-羟基异丁酸脱氢酶基因缺损或失活，增强甲基丙烯酰辅酶A的生成活性。缺损或失活通过对基因的全部或碱基序列的一部分进行置换、缺失或插入来进行。

(2)插入基因

根据需要将用于由上述前体生成甲基丙烯酰辅酶A的酶组的各基因以及AAT基因导入到宿主中是必要的。也可以直接利用宿主微生物本来具有的各种酶。或者，还可以根据需要，通过导入基因来增强活性。

用于由上述前体生成甲基丙烯酰辅酶A的酶根据宿主以及合成途径进行适当选择或优化，没有特别限定，以下，对使用红球菌属微生物作为宿主，基于图2所示途径生成甲基丙烯酸酯的必要的相关酶基因进行详细阐述。

(2-1)醇酰基转移酶(AAT)

本发明中使用的AAT，只要是具有以甲基丙烯酰辅酶A和醇或酚类为原料制造甲基丙烯酸酯的能力的酶就没有特别限定，无论其种类及起源如何。优选来源于植物的AAT，作为代表性的AAT，可以列举来源于属于选自由上述的姜目、蔷薇目、杜鹃花目、葫芦目、十字花目以及樟目组成的组中的任意目的植物的AAT。

(2-2)酰基辅酶A脱氢酶(ACD)

本发明中使用的ACD，只要是具有由酰基辅酶A生成甲基丙烯酰辅酶A的能力的酶就没有特别限定，无论其来源及种类如何。优选来源于微生物的ACD，作为代表性的微生物，如前所述。

更优选为来源于红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)的物质，作为优选株，可以列举红串红球菌PR-4株、红串红球菌KA2-5-1株、红串红球菌IGTS8株、红串红球菌D-1株、红串红球菌H-2株、红串红球菌N1-36株、红串红球菌I-19株、红串红球菌ECRD-1株、红串红球菌B1株、红串红球菌SY-1株、红串红球菌UM3株、红串红球菌UM9株或Rhodococcus sp.T09株等，特别优选列举红串红球菌PR-4株。

来源于红串红球菌PR-4株的ACD基因的碱基序列如序列号33所示，该碱基序列编码的氨基酸序列如序列号32所示。另外，本发明的ACD基因还包括编码如下蛋白质的基因，所述蛋白质包含在序列号32所示的氨基酸序列中置换、缺失或附加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列，且具有由酰基辅酶A生成甲基丙烯酰辅酶A的活性。此外，本发明的ACD基因还包括编码如下蛋白质的基因，所述蛋白质与由序列号32所示的氨基酸序列构成的蛋白质显示90％以上、优选95％以上、更优选99.5％以上、进一步优选99.9％以上的同一性，且具有由酰基辅酶A生成甲基丙烯酰辅酶A的活性。

进而，本发明的ACD基因还包括如下基因，所述基因与具有与序列号33所示的碱基序列互补的碱基序列的多聚核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有由酰基辅酶A生成甲基丙烯酰辅酶A的活性的蛋白质。进而，本发明的ACD基因还包括如下基因，所述基因由使用BLAST等(例如默认值，即初始设定的参数)计算时与序列号33所示的碱基序列具有80％以上、更优选90％以上、最优选95％以上的同一性的碱基序列构成，且编码具有由酰基辅酶A生成甲基丙烯酰辅酶A的活性的蛋白质。此外，上述ACD基因的密码子可以根据转化中使用的微生物的密码子的使用频率进行变换。

将编码上述AAT基因和/或ACD基因的DNA导入到属于红球菌属(Rhodococcus sp.)的微生物中，在该微生物中转录并翻译为蛋白质而进行使用。该导入到微生物中的DNA优选处于重组到载体中的形态。

(3)重组体微生物的制作

将编码上述AAT基因和/或ACD基因的DNA导入到宿主微生物中，在该微生物中转录并翻译为蛋白质而进行使用。该导入到微生物中的DNA优选处于重组到载体中的形态。即，将各基因重组到能够在上述宿主细胞中表达的表达载体中，将其导入宿主细胞。

上述载体只要能够在宿主微生物中独立复制、保持了AAT基因和/或ACD基因就没有特别限定，可以使用适合于各种微生物的载体。作为用于将DNA导入属于红球菌属(Rhodococcus sp.)的微生物中的载体，可以使用例如pK1、pK2、pK3和pK4、以及pSJ034(参照日本特开平10-337185号)、pSJ023以及pSJ002(参照日本特开平10-24867号)、pSJ201以及pLK005等(并不限定于这些)公知的载体。pSJ023作为转化子玫瑰红红球菌ATCC12674/pSJ023(FERM BP-6232)保藏在产业综合技术研究所专利生物保藏中心。

上述AAT基因和/或ACD基因向载体的插入可以使用本领域技术人员已知的基因重组技术来进行。例如，可以利用使用限制酶酶切和连接试剂盒的方法、使用拓朴异构酶的方法、In Fusion试剂盒(宝生物)等。插入载体中的基因可以连接、插入至能够在宿主生物中调节各基因编码的蛋白质的转录翻译的启动子的下游。此外，插入时，如有需要，可以附加适当的接头。此外，还可以根据需要连接能够在欲进行基因导入的宿主微生物中利用的终止子序列、增强子序列、剪接信号序列、poly(A)添加信号序列、SD序列或Kozak序列等核糖体结合序列、选择标记基因等。作为选择标记基因的例子，可以列举氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等耐药基因、以及氨基酸、核酸等营养素的细胞内生物合成相关基因、或编码荧光素酶等荧光蛋白的基因等。也可以随着插入而对DNA编码的氨基酸序列的一部分进行置换。

从上述观点出发，本发明中，作为载体，特别优选使用对pK4进行变异处理而获得的pLK005。可以构建按照配置在pLK005启动子的3’下游的方式连接、插入AAT基因或ACD基因、在启动子控制下表达AAT基因和/或ACD基因的表达质粒载体。

载体中可以插入选自AAT基因群或ACD基因群中的任1个基因，也可以插入多个基因。在用于插入到载体中的基因时，“多个”是指能够插入2～5个、2～4个、优选2～3个基因。此外，在一个载体中插入多个基因时，优选这些基因形成操纵子。这里，“操纵子”是指在同一启动子控制下转录的1个或1个以上基因所构成的核酸序列单元。

上述基因、优选处于载体形态的基因可以利用本领域技术人员已知的方法导入到宿主微生物中。作为向宿主微生物中导入重组载体的方法，只要是适合于宿主微生物的方法就没有特别限定，可以列举例如电穿孔法、原生质法、醋酸锂法、磷酸钙法、脂质体转染法、接合转导法等。

[甲基丙烯酸酯的制造方法]

使导入有AAT基因和/或ACD基因等必要基因的重组微生物与上述前体接触，制造甲基丙烯酸酯。这里，“接触”是指将微生物与物质(前体)进行一定时间的暴露处理。具体而言，是指将微生物在含有前体(原料)等的水性介质中进行培养，或在含有原料的水性介质中添加微生物的培养物并悬浮混合，在水性介质中和/或气相中获得甲基丙烯酸酯。此时，即使存在微生物增殖也无妨。在该工序中，可以获得含有重组微生物和甲基丙烯酸酯的混合物。

“水性介质”是指水或以水为主要成分的水溶液，也包括分散有未溶解的液体、固体的情况。“气相”是指培养槽(培养微生物的容器)或反应槽(进行反应的容器)中除了液体(培养基等)所占部分以外的气体、水蒸汽等所占的部分。“培养物”是指菌体、培养液、无细胞提取液、细胞膜等通过培养获得的物质。

(1)通过培养制造甲基丙烯酸酯

本发明中，甲基丙烯酸酯的制造如下进行：通过在含有上述前体的水性介质中对导入有AAT基因的基因重组微生物进行培养，使甲基丙烯酸酯在培养菌体或培养物中生成并累积，从该培养菌体或培养物或培养容器的气相部分回收甲基丙烯酸酯。

微生物培养中使用的培养基为微生物能够增殖的、包含至少一种碳源的含有充分的营养素的固体培养基或液体培养基。在前体能够作为碳源使用时，也可以将其作为碳源来使用。

培养基中碳源或前体的浓度只要能够生产甲基丙烯酸酯就没有特别限定。浓度设定为例如0.05～20(w/v)％，优选设定为0.1～15(w/v)％，更优选设定为0.2～10(w/v)％。以0.2(w/v)％以上使用是由于能够提升微生物的甲基丙烯酸生成能力，设定为10(w/v)％以下是由于即使添加更多也观察不到效果的飞跃性提升。

通过培养来制造甲基丙烯酸酯时，根据目标甲基丙烯酸酯添加醇或苯酚。使用的醇或苯酚优选为式2所示的物质。

醇或苯酚在培养基中的浓度只要能够生产甲基丙烯酸酯就没有特别限定。浓度设定为例如0.01～20(w/v)％，优选设定为0.05～10(w/v)％，更优选设定为0.1～5(w/v)％。此外，也可以预先将这些物质添加到培养基中，还可以在进行培养的同时连续地或分为2次以上间歇性地添加。

培养基中也可以添加无机氮源或无机金属盐类等。作为无机氮源，可以使用例如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐等。

氮源在培养基中的浓度只要能够生产甲基丙烯酸酯就没有特别限定。浓度设定为例如0.01～10(w/v)％，优选设定为0.05～8(w/v)％，更优选设定为0.1～4(w/v)％。

作为无机金属盐，可以使用例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。

无机盐类在培养基中的浓度只要能够生产甲基丙烯酸酯就没有特别限定。浓度设定为例如0.001～1.6(w/v)％，优选设定为0.005～1.3(w/v)％，更优设定选为0.01～1(w/v)％。以0.01(w/v)％以上使用是由于可以提升微生物的甲基丙烯酸酯的产生能力，设定为1(w/v)％以下是由于即使添加更多也观察不到效果的飞跃性提升。

此外，也可以根据需要在培养基中添加微量金属、维生素等。此外，还可以根据需要在培养基中追加添加微生物繁殖所必需的各种有机物、无机物、表面活性剂或常用的消泡剂等。

基因重组微生物向培养基中的接种可以通过现有公知的方法进行。对培养方法也没有特别限定，可以使用振荡培养、通气搅拌培养及静置培养等公知方法。

关于培养条件，只要基因重组微生物可繁殖且生成甲基丙烯酸酯就没有特别限定。培养既可以在好氧条件下进行，也可以在厌氧条件下进行。

关于pH、温度及培养时间，只要是基因重组微生物可繁殖且生成甲基丙烯酸酯的条件就没有特别限定。pH优选设定为3～10，更优选设定为4～9，进一步优选设定为5～8。温度优选设定为10～45℃，更优选设定为15～40℃，进一步优选设定为20～35℃。培养时间优选设定为10～1000小时，更优选设定为15～480小时，进一步优选设定为20～240小时。

可以按照使甲基丙烯酸酯的产生量与碳源或前体的利用量的比率达到最大的方式，对各菌株适当选择这些培养条件或使这些培养条件优化。另外，通过适当调整碳源的量及培养条件，还可以调整甲基丙烯酸酯的产生量。

作为用于累积0.001mM以上的甲基丙烯酸酯的优选条件，在pH5.5～7.5的条件下，使培养基中碳源或前体的浓度直接或间接地维持在0.1％以上，且使醇或酚类的浓度直接或间接地维持在0.1％以上，将温度调整至20～40℃的范围，使其反应3小时以上。进而，关于培养液中的微生物的浓度，在培养液的环境不会变得不适合微生物或培养细胞的增殖从而死亡的比率升高的范围内，维持高浓度状态可以获得高效率的生产率，故而优选，例如，通过作为干燥重量维持在2g/L以上，可以获得良好的生产效率，可以提高生成物的累积浓度。

(2)通过静止菌体反应制造甲基丙烯酸酯

在本发明的甲基丙烯酸酯的制造方法中，除了如上述那样通过培养基因重组微生物的方法以外，还可以采用以下方法。无论基因重组微生物是否具有增殖能力，都可以使预先培养的培养物与含有前体的水性介质相接触，通过实质上未伴随增殖的静止菌体反应来产生甲基丙烯酸酯。

用于静止菌体反应的上述前体的浓度可以与上述的通过培养来制造甲基丙烯酸酯的情况相同。用于静止菌体反应的醇或苯酚及其浓度可以与上述的通过培养来制造甲基丙烯酸酯的情况相同。

反应液中也可以添加无机金属盐类等。作为无机金属盐，可以使用例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。

无机盐类在反应液中的浓度只要能够生产甲基丙烯酸酯就没有特别限定。浓度设定为例如0.0001～2(w/v)％，优选设定为0.0003～1.3(w/v)％，更优选设定为0.001～1(w/v)％。

此外，也可以根据需要在反应液中添加微量金属、维生素等。此外，还可以根据需要在反应液中追加添加反应所必需的各种有机物、无机物、表面活性剂或常用的消泡剂等。

在静止菌体反应中，可以直接使用预先培养的基因重组微生物的培养液，或使用通过过滤或离心分离等回收的菌体。回收的培养物可以再次悬浮到适当的缓冲液等中，以任意的菌浓度来使用。缓冲液等可以使用生理盐水、磷酸钾缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液及硼酸-氢氧化钠缓冲液等。

此外，在静止菌体反应中还可以使用回收的培养物的处理物(例如破碎物、粗酶或纯化酶等)。进而，还可以通过公知的方法固定在合适的载体上，在反应中使用该固定化物。

关于反应条件，只要可以生成甲基丙烯酸酯就没有特别限定。反应既可以在好氧条件下进行，也可以在厌氧条件下进行。反应方法也没有特别限定，可以使用振荡反应、通气搅拌反应及静置反应等公知方法。

pH、温度及反应时间只要是能够生成甲基丙烯酸酯的条件就没有特别限定。pH优选设定为3～10，更优选设定为4～9，进一步优选设定为5～8。温度优选设定为10～45℃，更优选设定为15～40℃，进一步优选设定为20～35℃。反应时间优选设定为5～180小时，更优选设定为10～150小时，进一步优选设定为15～120小时。

可以按照使甲基丙烯酸酯的产生量的比率达到最大的方式，对各菌株适当地选择这些反应条件或使这些反应条件优化。另外，通过适当调整反应条件，还可以调整甲基丙烯酸酯的产生量。

作为用于累积0.001mM以上的甲基丙烯酸酯的优选条件，在pH5.5～7.5的条件下，使培养基中的碳源或前体的浓度直接或间接地维持在0.1％以上，且使醇或酚类的浓度直接或间接地维持在0.1％以上，将温度调整至20～40℃的范围，使其反应3小时以上。进而，反应液中的微生物的浓度维持高浓度状态可以获得高效率的生产率，故而优选，例如，通过作为干燥重量维持在2g/L以上，可以获得良好的生产效率，可以提高生成物的累积浓度。

在本发明的甲基丙烯酸酯的制造方法中，还可以适当组合进行上述通过培养进行的甲基丙烯酸酯的制造和通过静止菌体反应进行的甲基丙烯酸酯的制造。通过将2种方法组合，可以更高效地生产甲基丙烯酸酯。

(3)甲基丙烯酸酯的回收

培养基中或反应液中生成的甲基丙烯酸酯及其生成量可以使用高效液相色谱法及LC-MS等通常的方法进行检测、测定。此外，挥发到培养容器或反应容器的气相部分(顶部空间部分)的甲基丙烯酸酯及其生成量可以使用气相色谱法等通常的方法进行检测、测定。

通过根据需要适当组合使用过滤、离心分离、真空浓缩、离子交换或吸附色谱法、溶剂提取、蒸馏及结晶化等公知的操作，可以从培养基或反应液中分离、纯化出甲基丙烯酸酯。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但是，本发明的范围不受这些实施例的范围的限定。

[实施例1：甲基丙烯酸异丁酯的合成]

将香蕉去皮，用刀将果肉切成约1毫米厚的片，进而将其分成4份。在100ml烧瓶中依次加入已经切片的香蕉2g、含有2.3mM甲基丙烯酰辅酶A和0.35M KCl的溶液2ml以及5μl异丁醇。密闭，使其在30℃下进行反应。从100ml烧瓶的顶部空间采集反应1、2或3小时后的含有生成的甲基丙烯酸异丁酯的反应混合物150μl，按照以下的GC条件进行分析。将其结果示于表1。

[表1]

甲基丙烯酸异丁酯的生成量

时间	甲基丙烯酸异丁酯的生成量(mM)
		1	0.19
2	0.38
		3	0.45

GC分析条件

柱：DB-WAX，30m×0.32mm

柱温度：50℃，5分钟→5℃/分钟→100℃(合计15分钟)

载气：He

进样：200℃不分流(进样时间1分钟)

检测：250℃ FID注入量：150μl

另外，首先调制浓度已知的水溶液，在100ml烧瓶中装入该水溶液2ml，在30℃下保温30分钟后，按照同样的方法从顶部空间采样并进行GC分析，制作标准曲线，从而算出甲基丙烯酸酯的浓度。

[实施例2：甲基丙烯酸丁酯的合成]

除了使用正丁醇代替异丁醇以外，与实施例1同样地实施。将其结果示于表2。

[表2]

甲基丙烯酸丁酯的生成量

时间	甲基丙烯酸丁酯的生成量(mM)
		2	0.20
5.5	0.30

[实施例3：甲基丙烯酸丁酯的合成2]

在100ml烧瓶中依次加入表3所示的植物片2g、含有2.3mM甲基丙烯酰辅酶A和0.35M KCl的溶液2ml以及10μl正丁醇。密闭，使其在30℃下进行反应。甲基丙烯酸酯的分析与实施例1同样实施。将其结果示于表3。

[表3]

甲基丙烯酸丁酯的生成量

[实施例4：甲基丙烯酸乙酯的合成]

在100ml烧瓶中依次加入表4所示的植物片2g、含有2.3mM甲基丙烯酰辅酶A和0.35M KCl的溶液2ml以及6.4μl乙醇。密闭，使其在30℃下进行反应。甲基丙烯酸酯的分析与实施例1同样实施。将其结果示于表4。

[表4]

甲基丙烯酸乙酯的生成量

[实施例5：甲基丙烯酸甲酯的合成]

在100ml烧瓶中依次加入表5所示的植物片2g、含有2.3mM甲基丙烯酰辅酶A和0.35M KCl的溶液2ml以及4.4μl甲醇。密闭，使其在30℃下进行反应。甲基丙烯酸酯的分析与实施例1同样实施。将其结果示于表5。

[表5]

甲基丙烯酸甲酯的生成量

[参考例1：感受态细胞的制作]

将大肠杆菌JM109株接种到LB培养基(1％Bacto胰蛋白胨、0.5％Bacto酵母提取物、0.5％NaCl)1mL中，在37℃下好氧预培养5小时，再将该培养物0.4mL加入到SOB培养基40mL(2％Bacto胰蛋白胨、0.5％Bacto酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、1mM MgSO₄、1mM MgCl₂)中，在18℃下培养20小时。将该培养物通过离心分离收集菌体后，加入冷却的TF溶液(20mM PIPES-KOH(pH6.0)、200mM KCl、10mM CaCl₂、40mM MnCl₂)13mL，在0℃下放置10分钟。然后，再次进行离心并去除上清后，将沉淀的大肠杆菌悬浮在冷TF溶液3.2mL中，加入0.22mL的二甲基亚矾，在0℃下放置10分钟，制成感受态细胞。

[实施例6：制作导入有来源于植物的AAT基因的大肠杆菌重组体]

委托宝生物株式会社合成序列号2、4及6所示的来源于植物的AAT基因。

苹果AAT(MpAAT1)：氨基酸序列(序列号1)、碱基序列(序列号2)

草莓AAT(SAAT)：氨基酸序列(序列号3)、碱基序列(序列号4)

草莓AAT(VAAT)：氨基酸序列(序列号5)、碱基序列(序列号6)

这些合成的基因片段被插入到载体pMD19中，分别命名为pAAT001～003。将(表6)这些pAAT001～003作为模板，按照成为附加有能够容易地导入到表达载体的限制酶识别位点的形式设计寡核苷酸，并通过PCR法制备含有AAT基因的DNA片段。

寡核苷酸引物

MMA-044：5’-GTTTGCACGCCTGCCGTTCGACG-3’(序列号11)

MMA-045：5’-CGGTACGCGCGGATCTTCCAGAG-3’(序列号12)

反应液组成

温度循环

将98℃10秒、55℃15秒及72℃150秒的反应进行30个循环

通过QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)对获得的扩增产物的条带进行纯化。用限制酶PagI(正向引物中包含切割识别位点)和Sse8387I(反向引物中包含切割识别位点)对所纯化的各DNA进行切断。通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，从凝胶中切出目标条带，进行纯化。纯化中使用Gel/PCR PurificationKit(FAVORGEN公司制)，溶解到30μL的灭菌水中。

将纯化的DNA(5μL)、预先用NcoI和Sse8387I进行了消化的载体pTrc99A(1μL)、蒸馏水(4μL)以及solution I(DNA Ligation Kit ver.2(宝生物株式会社))(10μL)混合，通过在16℃下保温12小时使PCR扩增产物与载体连接。

在按照参考例1的方法制作的感受态细胞200μL中加入上述连接溶液10μL，在0℃下放置30分钟后，在42℃下进行30秒热激，然后在0℃下冷却2分钟后，添加SOC培养基(20mM葡萄糖、2％Bacto胰蛋白胨、0.5％Bacto酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、1mM MgSO₄、1mM MgCl₂)1mL，在37℃下振荡培养1小时。

培养后，各将100μL涂布到LBAmp琼脂培养基(含有氨苄青霉素100mg/L、1.5％琼脂的LB培养基)上，进而在37℃下进行培养。将琼脂培养基上长出的多个转化子菌落用1.5mL的LBAmp培养基(含有氨苄青霉素100mg/L的LB培养基)在37℃下培养一夜，收集菌体后使用QIAprep SpinMiniprep kit(QIAGEN公司)制备质粒DNA。

对于获得的重组的各质粒DNA，使用CEQ DTCS Quick Start Kit以及荧光测序仪CEQ 2000XL DNA Analysis(均为BECKMAN COULTER，美国)确认其碱基序列，并命名为质粒pAAT101～pAAT103(表6)。

对于pET16b载体也通过同样的操作插入AAT基因，将获得的质粒命名为pAAT201～pAAT203(表6)。但是，pET16b上没有Sse8387I位点，因此，预先制作在pET16b的BamHI位点插入有包含Sse8387I切断序列的接头的载体，并将其作为载体来使用。

将质粒pAAT101～pAAT103导入到JM109株中，获得重组体JM109/pAAT101～pAAT103。将质粒pAAT201～pAAT203导入到BL21(DE3)株中，获得重组体BL21(DE3)/pAAT201～pAAT203。

[表6]

来源于植物的AAT基因表达用质粒

[实施例7：由表达AAT基因的大肠杆菌重组体制备细胞提取液]

(1)使用pTrc99A作为载体的大肠杆菌重组体的培养

将实施例6中获得的大肠杆菌重组体JM109/pAAT101～pAAT103接种到1ml的含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃下进行7小时预培养。取培养液0.1ml，加入到100ml的同一培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素、1mM IPTG)中，在37℃下振荡培养15小时。通过离心分离(3,700×g、10分钟、4℃)从获得的培养液中回收菌体，用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤后，悬浮到同一缓冲液中。使用JM109/pTrc99A作为对照株。

(2)使用pET16b作为载体的大肠杆菌重组体的培养

将实施例6中获得的大肠杆菌重组体BL21(DE3)/pAAT201～pAAT203接种到1ml的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃下进行14小时预培养。取培养液0.1mL，加入到100ml的同一培养基(100μg/mL氨苄青霉素)中，在37℃下振荡培养直到OD变为0.3后，按照终浓度成为1mM的方式添加IPTG，进一步振荡培养数小时。通过离心分离(3,700×g、10分钟、4℃)从获得的培养液中回收菌体，用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤后，悬浮到同一缓冲液中使其成为OD6(630nm)。使用BL21(DE3)/pET16b作为对照株。

(3)细胞提取液的制备

由获得的菌体悬浮液制备细胞提取液。使用超声波破碎机VP-15S(TAITEC、日本)，在输出控制4、DUTY CYCLE 40％、PULS、TIMER＝B模式10s的条件下，将菌体悬浮液在冰置冷却的同时破碎1分钟。然后进行离心分离(10,000×g、5分钟、4℃)，采集获得的上清(细胞提取液)1ml。

[实施例8：使用AAT基因重组体细胞提取液的甲基丙烯酸丁酯的合成]

使用按照实施例7记载的方法制备的细胞提取液，进行以下的反应。在10ml容量的带隔垫样品瓶(GC用)中，按照使反应液的终浓度为7mM甲基丙烯酰辅酶A和40.5mM正丁醇的方式加入了甲基丙烯酰辅酶A和醇的溶液0.8ml，通过在该样品瓶中添加0.2ml的细胞提取液来开始反应。使带隔垫样品瓶在30℃下保温1～5小时来进行反应。

与实施例1同样地对带隔垫样品瓶的顶部空间气体进行分析。将其结果示于表7所。

[表7]

使用AAT基因重组体的甲基丙烯酸丁酯的生成

[实施例9A：使用AAT基因重组体细胞提取液的甲基丙烯酸酯的合成]

使用甲醇、乙醇或正丁醇作为醇，细胞提取液使用来源于BL21(DE3)/pAAT201(苹果)的细胞提取液，与实施例8同样地进行反应。表8表示5小时后的生成物的分析结果。

[表8]

使用AAT基因重组体的甲基丙烯酸酯的生成

[实施例9B：使用AAT基因重组体细胞提取液的甲基丙烯酸酯的合成2]

使用异丁醇、苯酚、苯甲醇或2-乙基己醇作为醇，用实施例7中获得的BL21(DE3)/pAAT201(苹果)的细胞提取液进行以下的反应。

在10ml容量的带隔垫样品瓶(GC用)中，按照使反应液的终浓度为1mM甲基丙烯酰辅酶A和40mM的醇的方式加入了含有甲基丙烯酰辅酶A和醇的溶液0.8ml，通过在该样品瓶中添加0.2ml的细胞提取液来开始反应。

使带隔垫样品瓶在30℃下保温1～5小时来进行反应。反应结束后，在带隔垫样品瓶中的反应液中添加1mL的乙腈，充分混合。然后，用注射器式滤器DISMIC/孔径0.45μm(ADVANTEC公司制)过滤后，供于HPLC分析。表9表示5小时后的生成物的分析结果。

使用AAT基因重组体的甲基丙烯酸酯(甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸苯酯、甲基丙烯酸苄基酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯)的合成

[表9]

HPLC分析条件

装置：Waters 2695

柱：Shiseido CAPCELL PAK C18UG1205μm

流动相：65％甲醇，0.2％磷酸

流量：0.25ml/分钟

柱温度：35℃

检测：UV 210nm

注入量：10μL

[实施例10：导入有ACD基因的大肠杆菌重组体的制作]

来源于绿脓杆菌PAO1的ACD同源基因的克隆和高表达重组体的制作

(1)从绿脓杆菌PAO1制备基因组DNA

将在LB琼脂培养基(1％Bacto胰蛋白胨、0.5％Bacto酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％琼脂)上生长的绿脓杆菌PAO1株(NBRC106052)接种到10ml的LB液体培养基(1％Bacto胰蛋白胨、0.5％Bacto酵母提取物、0.5％NaCl)中，在37℃下进行15小时振荡培养。培养结束后，通过离心分离从2ml的培养液中回收菌体，使用Wizard Genomic DNA Purification Kit(普洛麦格株式会社)，获得基因组DNA 100μl。

(2)向表达载体的克隆

以获得的基因组DNA作为模板，通过PCR法，按照成为附加有能够容易地导入到表达载体的限制酶识别位点的方式，制备含有推定编码ACD的基因的DNA片段。

寡核苷酸引物

MMA-003：5’-GACCCATGGATTTCGACCTCACCGAAGAAC-3’(序列号13)

MMA-004：5’-GCCCTGCAGGATGCGATGGTTCGCGGCGTTC-3’(序列号14)

反应液组成

温度循环

将98℃10秒、55℃15秒及72℃150秒的反应进行30个循环

利用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)对获得的约1.2kb的扩增产物的条带进行纯化。用限制酶NcoI(寡核苷酸MMA-003中含有切割识别位点)和Sse8387I(寡核苷酸MMA-004中含有切割识别位点)对纯化的DNA进行消化，通过苯酚抽提-氯仿抽提-乙醇沉淀来进行纯化。将纯化的DNA(5μl)、预先用NcoI和Sse8387I进行了消化的载体pTrc99A(1μl)、蒸馏水(4μl)以及solution I(DNA Ligation Kit ver.2(宝生物株式会社))(10μl)混合，在16℃下保温12小时，使PCR扩增产物与载体连接。

在按照参考例1的方法制作的感受态细胞200μL中加入上述连接溶液10μL，在0℃下放置30分钟后，在42℃下进行30秒热激，在0℃下冷却2分钟后，添加SOC培养基(20mM葡萄糖、2％Bacto胰蛋白胨、0.5％Bacto酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、1mM MgSO₄、1mM MgCl₂)1mL，在37℃下振荡培养1小时。

培养后，各将200μl涂布到LBAmp琼脂培养基(含有氨苄青霉素100mg/L、1.5％琼脂的LB培养基)上，进而在37℃下培养。将琼脂培养基上长出的多个转化子菌落在1.5mL的LBAmp培养基(含有氨苄青霉素100mg/L的LB培养基)中在37℃下培养一夜，收集菌体后，用Flexi Prep(Amersham Biosciences公司制)回收质粒DNA。

(3)转化

对于获得的重组质粒DNA，使用CEQ DTCS Quick Start Kit和荧光测序仪CEQ 2000XL DNA Analysis(均为BECKMAN COULTER，美国)确认其碱基序列，并命名为质粒pMMA002。用质粒pMMA002转化大肠杆菌JM109株，制作导入有ACD基因(序列号8)的重组体。氨基酸序列如序列号7所示。

[实施例11：由表达ACD基因的大肠杆菌重组体制备细胞提取液]

将实施例10中获得的导入有ACD基因(序列号8)的大肠杆菌重组体JM109/pMMA002接种到1ml的含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃下进行7小时预培养。取培养液0.1ml，加入到100ml的同一培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素、1mM IPTG)中，在37℃下振荡培养15小时。通过离心分离(3,700×g、10分钟、4℃)从获得的培养液中回收菌体，用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤后，悬浮到同一缓冲液中使其达到OD6(630nm)。使用JM109/pTrc99A作为对照株。

如下所述地由获得的菌体悬浮液制备细胞提取液1ml。使用超声波破碎机VP-15S(TAITEC、日本)，在输出控制4、DUTY CYCLE 40％、PULS、TIMER＝B模式10s的条件下，在冰置冷却的同时破碎1分钟。然后进行离心分离(10,000×g、5分钟、4℃)，采集获得的上清作为细胞提取液。

[实施例12：使用ACD基因重组体细胞提取液和植物片，由异丁酰辅酶A合成甲基丙烯酸丁酯]

(1)利用ACD基因重组体细胞提取液、以异丁酰辅酶A为底物的甲基丙烯酰辅酶A合成反应：

在下述溶液1.84ml中加入实施例10中获得的具有ACD活性的细胞提取液0.16ml从而调制反应液2ml，所述溶液是在100mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中含有6mM的1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐、0.4mM的黄素腺嘌呤二核苷酸以及1mM的异丁酰辅酶A。在37℃下反应30分钟，以以下所示的HPLC条件进行分析。其结果是，异丁酰辅酶A的峰消失，确认到甲基丙烯酰辅酶A的生成。

HPLC分析条件

柱：Inertsil ODS-3V，4.6mm×250mm

流动相：30％甲醇，50mM H3PO4，pH5.7

流量：1.0ml/分钟柱温度：35℃检测：UV 254nm

注入量10μl用流动相将反应溶液稀释10倍后进行测定。

(2)通过向甲基丙烯酰辅酶A合成反应液中添加正丁醇和植物片来合成甲基丙烯酸丁酯

将香蕉去皮，用刀将果肉切成约1毫米厚的片，进而将其分成4份。在50ml烧瓶中加入已经切片的香蕉1g、上述甲基丙烯酰辅酶A合成反应液0.9ml、3.5M KCl溶液0.1ml以及5μl的正丁醇，密闭，使其在30℃下反应2小时。与实施例1同样地实施甲基丙烯酸酯的分析，结果生成0.015mM的甲基丙烯酸丁酯。

[实施例13：导入有ECH基因的大肠杆菌重组体的制作]

(1)从红球菌属细菌制备基因组DNA

将在LB琼脂培养基上生长的红串红球菌PR4株(NBRC100887)接种到10mL的LB液体培养基中，在30℃下进行36小时振荡培养。培养结束后，通过离心从2mL的培养液中回收菌体，与实施例10同样地操作，获得基因组DNA 100μL。

(2)向表达载体的克隆

以获得的基因组DNA作为模板，通过PCR法，按照成为附加有能够容易地导入到表达载体的限制酶识别位点的方式，制备含有推定编码ECH的碱基序列的DNA片段。

寡核苷酸引物：

MMA-031：5’-GGTCATGACCGACTTCAACACCATCATCCTC-3’(序列号15)

MMA-032：5’-GGCCTGCAGGTTCAGCTGTTCGAAAGTTCAGCGC-3’(序列号16)

与实施例10同样地进行PCR，用限制酶BspHI(寡核苷酸MMA-031中包含切断识别位点)和Sse8387I(寡核苷酸MMA-032中包含切断识别位点)对获得的DNA进行切断。切断后，与实施例6同样地操作，获得重组有ECH基因(序列号10)的目标质粒DNA，命名为质粒pMMA011。氨基酸序列如序列号9所示。

(3)转化

使用质粒pMMA011转化大肠杆菌JM109株，制作表达ECH基因的大肠杆菌重组体。

[实施例14：使用ECH基因表达大肠杆菌重组体细胞提取液和AAT基因重组体细胞提取液由3-羟基异丁酰辅酶A合成甲基丙烯酸丁酯]

(1)具有ECH活性的细胞破碎液的制备

将实施例13中获得的导入有ECH基因的大肠杆菌重组体JM109/pMMA011接种到2ml的含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃下进行24小时预培养。取培养液0.1ml，加入到100ml的同一培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素、1mM IPTG)中，在37℃下振荡培养24小时。通过离心分离(3,700×g、10分钟、4℃)从获得的培养液中回收菌体，用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤2次后，在该缓冲液中稀释至达到OD6(630nm)。

如下所述地从获得的菌体悬浮液制备细胞破碎液1ml。使用超声波破碎机Sonifier 250D(必能信、美国)，在振幅(amplitude)：15％/On：1秒、off：1秒的条件下，在冰置冷却的同时破碎5分钟。

(2)使用ECH基因表达大肠杆菌重组体细胞破碎液的甲基丙烯酰辅酶A合成反应

在混合有0.5M的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)0.2ml、1.2mM的3-羟基异丁酰辅酶A水溶液0.4ml以及1.2ml的水的混合液中，添加如上所述获得的具有烯酰辅酶A水合酶活性的细胞破碎液0.2ml，调制反应液2ml。使其在37℃下反应30分钟，通过实施例12所示的HPLC条件进行分析。其结果是，确认到甲基丙烯酰辅酶A的生成。

(3)使用AAT基因重组体细胞提取液的甲基丙烯酸丁酯的合成

在容量10ml的样品瓶中添加上述甲基丙烯酰辅酶A合成反应液0.4ml、10mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)0.1ml以及0.2ml的水，进一步添加0.4M正丁醇溶液0.1ml以及与实施例7同样制备的苹果AAT(MpAAT)细胞破碎液0.2ml，密闭，使其在30℃下反应3小时。与实施例1同样地实施甲基丙烯酸酯的分析，结果生成0.001mM的甲基丙烯酸丁酯。

[实施例15：BCKAD基因的克隆和高表达重组体的制作、细胞提取液的制备、及蛋白质的表达解析]

基因的克隆和表达质粒的制作以及重组体的制作与实施例10同样地进行。以绿脓杆菌PAO1株的基因组DNA为模板，使用以下所示的引物通过PCR法制备包含编码BCKAD复合体基因的完整基因操纵子的DNA片段。用限制酶BspHI和Sse8387I对获得的片段进行消化，与实施例10同样地操作，插入到载体pTrc99A中获得重组质粒(pWA108)。

寡核苷酸引物：

MAA-15：5’-GGCCTGTCATGAGTGATTACGAGCCG-3’(序列号17)

MAA-16：5’-CGGCCCTGCAGGTTCGCGGGAATCAGATGTGC-3’(序列号18)

将如上述那样获得的大肠杆菌重组体JM109/pWA108与实施例10同样地进行培养。但是，在本重组体的情况下，从预研究结果来看，即使不进行IPTG添加也能确认到高蛋白质表达，因此未进行IPTG添加地实施。细胞提取液的制备与实施例11同样地实施。

[实施例16：BCKAD基因高表达重组体的细胞提取液的活性测定]

关于BCKAD活性，如下所述地通过以2-氧代异戊酸为底物的异丁酰辅酶A的生成来进行测定。

在下述溶液0.7mL中添加实施例15中获得的细胞提取液0.2mL，调制成0.9mL，所述溶液是在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中含有终浓度为1mM的MgCl₂、终浓度为0.2mM的焦磷酸硫胺素、终浓度为1mM的CoA-SH及终浓度为2mM的DTT。在其中加入2-氧代异戊酸钙盐0.1mL(终浓度4mM)并在37℃下反应30分钟后，使用Centricut UltraminiW-10(仓敷纺织株式会社)进行超滤。通过去除蛋白质使反应停止，按照以下的条件通过HPLC进行分析。其结果是，在JM109/pWA108中确认到0.83mM的异丁酰辅酶A的生成。

HPLC分析条件

柱：Inertsil ODS-3V，4.6mm×250mm

流动相：35％甲醇，50mM H3PO4，pH5.7

流量：1.0ml/分钟柱温度：35℃检测：UV254nm(210nm)

注入量：10μl(用流动相将反应溶液稀释10倍后进行测定)

[实施例17：利用来源于BCKAD基因高表达重组体和表达ACD基因的重组体的细胞提取液混合物由2-氧代异戊酸合成甲基丙烯酰辅酶A(图1)]

在下述溶液0.6mL中添加通过实施例11及实施例15的方法获得的细胞提取液(JM109/pMMA002及JM109/pWA108)各0.1mL，调制成0.8mL，所述溶液是在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中含有终浓度为1mM的MgCl₂、终浓度为0.2mM的焦磷酸硫胺素、终浓度为1mM的CoA-SH、终浓度为2mM的DTT、终浓度为2mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、终浓度为0.04mM的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、终浓度为2mM的缬氨酸。在其中添加2-氧代异戊酸钙盐0.1mL(终浓度4mM)并在37℃下反应30分钟后，通过HPLC确认异丁酰辅酶A的生成，并添加0.1mL的1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(终浓度6mM)，使其进一步反应3小时。反应后，使用Centricut UltraminiW-10(仓敷纺织株式会社)进行超滤。通过去除蛋白质使反应停止，通过HPLC进行分析。其结果是，确认到0.2mM的甲基丙烯酰辅酶A的生成。

[参考例2：接合转导用受体菌PR4KS的制作]

通过日本特开2011-200133号公报中记载的方法改变红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)PR4(制品评价技术基础机构生物遗传资源部门；保藏号：NBRC 100887)，制作对120mg/L的氯霉素表现出耐性且缺失卡那霉素抗性基因的衍生株，命名为PR4KS株。

具体而言，为了增强氯霉素耐性，通过将MYK培养基(0.5％polypeptone、0.3％bact yeast extract、0.3％malt extract、0.2％KH₂PO₄、0.2％K₂HPO₄)中的氯霉素浓度从10mg/mL开始分阶段逐渐提高到120mg/mL并对PR4株进行继代培养诱发自然变异，获得对120mg/mL的氯霉素具有耐性的衍生株RhCmSR-09株。

接下来，将上述RhCmSR-09株与日本特开2011‐200133号公报记载的保有卡那霉素抗性基因缺失变异导入用质粒pKM043的大肠杆菌株按照1:1的比例进行混合并培养，通过接合转导将pKM043导入RhCmSR-09株内后，通过用含有卡那霉素硫酸盐200mg/L及氯霉素50mg/L的MYK琼脂培养基(0.5％polypeptone、0.3％bact yeast extract、0.3％malt extract、0.2％KH₂PO₄、0.2％K₂HPO₄、1.5％琼脂)进行培养，获得pKM043插入到RhCmSR-09株基因组内的同源重组株。将上述同源重组株用含有10％蔗糖的MYK琼脂培养基进行培养，从得到的菌落中获得变成卡那霉素敏感性株的衍生株、即卡那霉素抗性基因缺失变异衍生株PR4KS株。

[参考例3：LigD同源基因的克隆和基因缺失用质粒的制作]

将PR4KS株的LigD同源基因(登录号：YP_002767969)作为靶基因。通过PCR扩增包括LigD同源基因周边序列的约5.4kb的DNA后，克隆到日本特开2011-200133号公报记载的、将sacB基因导入到卡那霉素抗性基因的下游且该sacB基因与该卡那霉素抗性基因沿着相同方向导入的质粒载体pK19mobsacB1，从而获得质粒pTJ001。PCR条件如下所述。

引物

GB-138：5’-GGCCTGCAGGTACCGATCATCACCATCGGTGTC-3’(序列号19)

GB-139：5’-GGTCTAGACTGAGCAGTGTTCCAATGCG-3’(序列号20)

反应液组成：

温度循环

将98℃10秒、55℃10秒及72℃120秒的反应进行35个循环

使pTJ001内部的LigD同源基因全长(约2.3kb)缺失，且仅残留LigD同源基因的上游及下游序列，制作了LigD同源基因缺失用质粒pTJ002(参照图3)。pTJ002如下所述地获得：利用设计成包含作为靶LigD同源基因的起始密码子附近的序列和终止密码子附近序列两者、分别从起始密码子向上游方向延伸或从终止密码子向下游方向延伸的引物GB-140和GB-141，对pTJ001内部的序列进行扩增，利用由此获得的不含LigD同源基因的PCR产物对大肠杆菌JM109株进行转化，形成环状DNA。PCR的条件如下所述。

引物

GB-140：GAGGAAATGGTCACAGGGCGAGAATAGGTTG(序列号21)

GB-141：GCCCTGTGACCATTTCCTCATTGTGCTGG(序列号22)

反应液组成

温度循环

将98℃10秒、50℃10秒及72℃180秒的反应进行30个循环

PCR结束后，使用样品1μl，通过0.7％琼脂糖凝胶电泳对片段进行确认，结果确认到片段的扩增。在上述质粒pTJ002的制造步骤中，从PR4株提取基因组使用Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega公司制)，用限制酶切断的DNA片段及PCR产物的纯化使用Gel/PCR Purification Kit(FAVORGEN公司制)，DNA彼此连接使用DNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞(宝生物公司制)，质粒的提取使用QIAprep miniprep kit(QIAGEN公司制)。

[参考例4：PR4KS的LigD同源基因缺失衍生株的制作]

以用pTJ002转化大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1λpir获得的产物作为供体菌，将通过参考例2的方法获得的PR4KS作为受体菌，与日本特开2011-200133号公报记载的方法同样地进行接合转导，获得基于同源重组产生的13株LigD同源基因缺失衍生株。从上述缺失衍生株中选择1株，命名为PR4KSΔligD衍生株。

[参考例5：红球菌属细菌用质粒pLK005及使用它的腈水合酶表达用质粒pSJ201的制作]

(1)pLK005的获得和解析

使用pK4(参照日本特开平5-64589号公报)，通过上述电穿孔法对红球菌sp N775(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-961)进行转化。将获得的转化子接种到10ml的MYK培养基中，在30℃下培养1天。通过在超净工作台内进行紫外线照射来对其进行变异处理。将实施了变异处理的培养液涂布在含有50～400μg/ml的卡那霉素的MYK琼脂培养基上，在30℃下培养3天。

将琼脂培养基上出现的多个菌落分别用MYK培养基培养，由转化子回收质粒。使用回收的质粒再次对红球菌sp N775进行转化，调查转化子的卡那霉素抗性程度是否提高。其结果是，确认到多株卡那霉素抗性程度明显提高的转化子。

对确认到卡那霉素抗性程度提高的质粒的碱基序列进行调查，结果发现pK4的卡那霉素抗性基因的上游区域的序列发生了变化(8碱基序列GTTGTAGG的重复)。将该确认到卡那霉素抗性程度提高的质粒命名为pLK005。

(2)pSJ040的制作

质粒pSJ034是根据日本特开平10-337185号公报记载的方法由质粒pSJ023制作的。pSJ034中存在3个EcoRI限制酶位点，制作了将其中的一个位点变换为SpeI位点的质粒pSJ040。制作方法如下，用限制酶EcoRI将pSJ034部分分解，使用宝生物Blunting试剂盒进行切断位点的平滑化。在SpeI接头的存在下进行连接反应，使用反应液转化大肠杆菌JM109株。对转化子进行培养后，提取质粒，筛选插入了SpeI接头的质粒。将在pSJ034的3个EcoRI位点中存在于卡那霉素抗性基因的下游的EcoRI位点插入了SpeI接头的质粒命名为pSJ040。

(3)pSJ201的建构

用HindIII切断pLK005，制备约2.1kb的片段。另一方面，用HindIII切断pSJ040，制备约9.8kb的片段。使用这两个片段进行连接反应，用反应液转化大肠杆菌JM109株。对转化子进行培养后，提取质粒，确认其碱基序列，结果，将带有来源于pLK005的变异序列(GTTGTAGG的重复)、除此之外具有与pSJ040同样的序列的质粒命名为pSJ201。

[参考例6：PR4KSΔligD衍生株的RE_acd1/RE_echA/RE_hchA/RE_mmsB基因缺失衍生株的制作]

(1)使用In Fusion法的基因缺失用质粒的制作

以PR4KS株的RE_acd1/RE_echA/RE_hchA/RE_mmsB基因为靶基因，使用In-Fusion HD Cloning kit(宝生物公司制)进行基因缺失用质粒的制作(参照图4)。

通过PCR对靶基因的上游及下游序列的DNA进行扩增。PCR条件如下所述。

片段1用引物

MMA-061：CGACTCTAGAGGATCGCTCAGTACATCTACGAGAC(序列号23)

MMA-062：AGTGTGAGGAAAGTGTTCCGATCAGTTCAT(序列号24)

片段2用引物

MMA-063：CACTTTCCTCACACTCGTCGAGAGTATGAG(序列号25)

MMA-064：CGGTACCCGGGGATCAGCGCGACGAACAACGAGAC(序列号26)

反应液组成

温度循环

将98℃10秒、60℃10秒及72℃120秒的反应进行30个循环

PCR结束后，使用样品1μl，通过0.7％琼脂糖凝胶电泳对片段进行确认，结果确认到片段的扩增。使用Gel/PCR Purification Kit(FAVORGEN公司制)对PCR产物(片段1及片段2)进行缓冲液置换，用于以下所示的利用In-FusioonHD Cloning Kit进行的反应。

(2)利用In-Fusion HD Cloning Kit进行的载体与目标片段的连接及转化

使用In-Fusion HD Cloning Kit，进行上述片段和载体的连接。反应条件如下所述。

反应液组成

将上述反应液在50℃下保温15分钟后，在冰上冷却，用于大肠杆菌JM109株的转化。大肠杆菌转化子的筛选用含有卡那霉素硫酸盐50mg/L的LB琼脂培养基(以下称为LB Km50琼脂培养基)进行。使用Mini prep Kit(QIAGEN公司)由获得的转化子制备质粒，获得目标质粒。质粒的确认通过调查XbaI限制酶处理后的片段大小及插入片段与载体的连接区域的序列来进行。将目标质粒命名为pMMA302。

(3)PR4KSΔligD衍生株的同源重组衍生株及基因缺失衍生株的制作

在PR4KSΔligD株感受态细胞20μl中添加1μl的pMMA302，在冰上保温10分钟。将经过保温的上述溶液全部转移至经过冰置冷却的电穿孔杯中(0.1cm)中，施加1.5kV(200Ω)的高电压，立即加入600μl的LB液体培养基，在30℃下静置6小时。将200μl涂布到含有卡那霉素硫酸盐10mg/L的LB琼脂培养基(以下称为LB Km10琼脂培养基)上，在30℃下培养4天。将长出的菌落在LB Km10琼脂培养基上划线培养4天后，通过以下所示的条件进行菌落PCR，进行同源重组衍生株的确认。

引物

MMA-069：GCGCATCTACAAGGAAGAGATC(序列号27)

MMA-070：GCGACGCTCATCGAGATCTC(序列号28)

反应液组成

温度循环

将98℃10秒、68℃180秒的反应进行30个循环

将确认为同源重组衍生株的菌落悬浮于LB培养基200μl中，将100μl涂布到LB+10％蔗糖琼脂培养基上，培养3天。从长出的菌落中选择变为卡那霉素敏感性的菌落，对于这些菌落，通过菌落PCR对目标基因缺失进行确认。其结果是，获得由PR4KSΔligD衍生株缺失RE_acd1、RE_echA、RE_hchA、RE_mmsB这4个基因的菌株，命名为DMA008株。

[实施例18：属于红球菌属的微生物中的ACD和AAT双表达用质粒的制作]

制作用于在属于红球菌属的微生物中表达ACD和/或AAT的质粒。

在RE_acd1基因表达用质粒pMMA401的RE_acd1基因的下游，插入以MpAAT1基因表达用质粒pAAT301为模板通过PCR反应获得的“腈水解酶启动子+MpAAT1基因”片段。

“腈水解酶启动子+MpAAT1基因”的扩增如下进行。

引物

MMA-133(Sse-ProFw)：TGACCTGCAGGTGCACTCCGCTGCGACATGTATCGA(序列号29)

MMA-131(Sse-001Rv)：ACTCTAGCCTGCAGGTCATTGACTAGTTGATCTAAGGTTGTTACA(序列号30)

PCR反应组成

温度循环

将98℃5秒、60℃5秒及72℃45秒的反应进行30个循环

用限制酶Sse8387I对如上述那样获得的“腈水解酶启动子+MpAAT1基因”片段进行处理。另一方面，将pMMA401也用Sse8387I进行处理，然后进行SAP处理。将这些DNA片段进行0.7％琼脂糖凝胶电泳后，使用Gel/PCRPurification Kit(FAVORGEN公司制)进行纯化。限制酶处理反应条件及连接反应条件如下所示。

限制酶处理反应组成(AAT片段)

限制酶处理反应组成(载体片段)

连接反应组成

使用按照上述组成混合的连接反应液，进行大肠杆菌JM109株的转化。由获得的转化子提取质粒。经限制酶Sse8387I处理后进行琼脂糖电泳，确认到插入了目标大小的片段。通过对获得的质粒的插入片段的连接区域的碱基序列进行解析，确认其为目标质粒，将本质粒命名为pACDAAT1。

使用与上述方法相同的方法，总计制作了6种序列不同的ACD和AAT双表达用质粒(pACDAAT2、pACDAAT3、pACDAAT4、pACDAAT6、及pACDAAT8)(参照图5)。

[实施例19：利用ACD和AAT双表达重组体制造甲基丙烯酸丁酯]

用质粒pACDAAT1、pACDAAT2、pACDAAT3、pACDAAT4、pACDAAT6、及pACDAAT8分别对参考例6的(3)中获得的DMA008株进行转化。使用获得的重组体(DMA008/pACDAAT1、DMA008/pACDAAT2、DMA008/pACDAAT3、DMA008/pACDAAT4、DMA008/pACDAAT6及DMA008/pACDAAT8)，通过静止菌体反应进行甲基丙烯酸酯的制造。此外，使用DMA008/pLK005作为对照。

在2ml LB Km10液体培养基(瓦塞尔曼试管，ワッセルマン試験管)中接种1铂环菌，在30℃、旋转振荡器(180rpm)、好氧条件下进行2天培养(预培养)。在100ml LB Km10(培养基100mL/500mL容量三角瓶)中接种1ml预培养液，在30℃、旋转振荡器(230rpm)、好氧条件下进行3天培养(主培养)。

主培养后，将主培养液40mL转移到50mL容量的锥形管中进行离心分离(12000rpm、10分钟)，获得菌体。使用该菌体进行以下的反应。在10ml容量的玻璃样品瓶中加入1ml反应液，在30℃、旋转振荡器(180rpm)、好氧条件下进行18小时反应。

反应液组成

使用正丁醇作为醇。

反应后，在反应液中添加1mL的乙腈并充分混合后，用注射器式过滤器DISMIC/孔径0.45μm(ADVANTEC公司制)过滤，然后，通过实施例9B记载的HPLC分析进行分析。表10表示18小时后的生成物的分析结果。

利用ACD和AAT双表达重组体生成甲基丙烯酸丁酯

[表10]

重组体	甲基丙烯酸丁酯的生成量(μM)
		DMA008/pLK005	0
DMA008/pACDAAT1	7.51
		DMA008/pACDAAT2	2.06
DMA008/pACDAAT3	4.34
		DMA008/pACDAAT4	0.46
DMA008/pACDAAT6	2.18
		DMA008/pACDAAT8	0.52

[实施例20：利用ACD和AAT双表达重组体的甲基丙烯酸酯的制造]

利用质粒pACDAAT1对参考例6的(3)中获得的DMA008株分别进行转化。使用获得的重组体(DMA008/pACDAAT1)，通过静止菌体反应进行甲基丙烯酸酯的制造。此外，使用DMA008/pLK005作为对照。使用实施例19记载的方法进行重组体的培养从而获得菌体。

反应液组成

使用正丁醇、异丁醇、2-乙基己醇作为醇。

反应后，在反应液中添加1mL的乙腈并充分混合后，用注射器式过滤器DISMIC/孔径0.45μm(ADVANTEC公司制)过滤，然后，通过实施例9B记载的HPLC分析进行分析。表11表示18小时后的生成物的分析结果。

利用ACD和AAT双表达重组体生成甲基丙烯酸酯

[表11]

[比较例1：利用来源于酵母的AAT基因重组体细胞提取液进行的甲基丙烯酸酯合成反应]

与实施例6同样地操作，制作来源于酵母的AAT基因表达质粒(表12)，使用这些质粒转化大肠杆菌，获得AAT表达重组体。

来源于酵母的AAT基因表达用质粒

[表12]

与实施例7同样地操作，制备细胞提取液，与实施例8同样地以甲基丙烯酰辅酶A和正丁醇作为底物，进行甲基丙烯酸丁酯的合成反应。其结果是，没有确认到甲基丙烯酸丁酯的生成。另一方面，在以乙酰辅酶A和正丁醇为底物时，确认到乙酸丁酯的生成。

使用酵母AAT基因重组体生成酯

[表13]

序列表自由文本

序列号11：MMA-044

序列号12：MMA-045

序列号13：MMA-003

序列号14：MMA-004

序列号15：MMA-031

序列号16：MMA-032

序列号17：MAA-15

序列号18：MAA-16

序列号19：GB-138

序列号20：GB-139

序列号21：GB-140

序列号22：GB-141

序列号23：MMA-061

序列号24：MMA-062

序列号25：MMA-063

序列号26：MMA-064

序列号27：MMA-069

序列号28：MMA-070

序列号29：MMA-133

序列号30：MMA-131

Claims (11)

1.一种甲基丙烯酸酯的制造方法，其包含在醇酰基转移酶存在下使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A，从而合成甲基丙烯酸酯的工序。

2.根据权利要求1所述的甲基丙烯酸酯的制造方法，其使甲基丙烯酸酯累积0.001mM以上。

3.根据权利要求1或2所述的甲基丙烯酸酯的制造方法，其进一步包含由异丁酰辅酶A或3-羟基异丁酰辅酶A制造甲基丙烯酰辅酶A的工序。

4.根据权利要求3所述的甲基丙烯酸酯的制造方法，其特征在于，异丁酰辅酶A由2-氧代异戊酸制造。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的甲基丙烯酸酯的制造方法，其中，醇酰基转移酶来源于植物。

6.根据权利要求5所述的甲基丙烯酸酯的制造方法，其中，植物为属于选自由以下的目组成的组中的任意目的植物：姜(Zingiberales)目、蔷薇(Rosales)目、杜鹃花(Ericales)目、葫芦(Cucurbitales)目、十字花(Brassicales)目以及樟(Laurales)目。

7.根据权利要求5所述的甲基丙烯酸酯的制造方法，其中，植物为属于选自由以下的科组成的组中的任意科的植物：芭蕉(Musaceae)科、蔷薇(Rosaceae)科、杜鹃花(Ericaceae)科、猕猴桃(Actinidiaceae)科、葫芦(Cucurbitaceae)科、番木瓜(Caricaceae)科以及樟(Lauraceae)科。

8.根据权利要求5所述的甲基丙烯酸酯的制造方法，其中，植物为属于选自由以下的属组成的组中的任意属的植物：芭蕉(Musa)属、草莓(Fragaria)属、苹果(Malus)属、李(Prunus)属、梨(Pyrus)属、越桔(Vaccinium)属、猕猴桃(Actinidia)属、黄瓜(Cucumis)属、番木瓜(Carica)属以及鳄梨(Persea)属。

9.根据权利要求5所述的甲基丙烯酸酯的制造方法，其中，植物为选自由香蕉、草莓、苹果、梅子、西洋梨、蓝莓、猕猴桃、甜瓜、番木瓜以及鳄梨组成的组中的任意者。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的甲基丙烯酸酯的制造方法，其使用以表达醇酰基转移酶的方式导入有基因的基因重组微生物。

11.根据权利要求10所述的甲基丙烯酸酯的制造方法，其中，以表达醇酰基转移酶的方式导入有基因的基因重组微生物使用属于红球菌(Rhodococcus)属的微生物。