BR112015000069B1 - Método para produzir éster de ácido metacrílico - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR ÉSTER DE ÁCIDO METACRÍLICO. A presente invenção refere-se a um método para produzir um éster de ácido metacrílico usando um biocatalisador, o dito método compreendendo uma etapa para tratar a metacrilil-CoA com um álcool ou fenol, na presença de uma álcool aciltransferase, para sintetizar o éster de ácido metacrílico. De acordo com este método de produção, um éster de ácido metacrílico pode ser eficientemente produzido, ao mesmo tempo reduzindo amplamente a energia, o recurso e a carga ambiental, em comparação com os processos de produção químicos convencionais.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a um método para produzir éster de ácido metacrílico usando um biocatalisador.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[002] Os ésteres de ácidos metacrílicos são principalmente usados como matéria-prima em resinas acrílicas, e existem muitas demandas também como um monômero em campos tais como tintas, adesivos, e modificadores de resinas. Existem alguns métodos como métodos de fabricação industrial e, por exemplo, conhecem-se o método de ACH (acetona ciano hidrina), que utiliza acetona e cianeto de hidrogênio como matérias-primas, e o método de oxidação direta, que utiliza isobutileno e álcool terc-butílico como matérias-primas. Estes métodos de produção químicos dependem de matérias-primas fósseis, e requerem muita energia.

[003] Nos anos recentes, as tecnologias para produzir diversas substâncias químicas a partir de biomassa como uma fonte de carbono, substituindo as matérias-primas fósseis convencionais, têm recebido atenção a partir dos pontos de vista de prevenção de aquecimento global e proteção ambiental. Embora esteja também sendo esperada a produção a partir de matéria-prima de biomassa para os ésteres de ácidos metacrílicos, não tinha sido descrito um exemplo de produção específico a partir de matérias-primas de biomassa, usando um bioca- talisador.

[004] Por exemplo, foram propostos métodos que utilizam microorganismos existentes na natureza para produzir o ácido 2-hidróxi- isobutírico e o ácido 3-hidróxi-isobutírico servindo de precursores do ácido metacrílico a partir de uma fonte natural, tal como o açúcar (referir-se aos Documentos de Patentes 1 e 2, e ao Documento de não Pa- tente 1). Entretanto, nestes métodos, os processos para desidratar o precursor e formar o ácido metacrílico ainda dependem de técnicas químicas.

[005] Além disso, embora tenham sido propostos métodos de formar o ácido metacrílico a partir de glicose, usando microorganismos recombinantes que não existem na natureza e são produzidos por introdução de uma pluralidade de genes de enzimas, estes combinam uma reação de enzima já conhecida e uma reação de enzima teórica que emprega analogia a partir desta e, desse modo, não foram provados (referir-se aos Documentos de Patentes 3 a 5). Em particular, o Documento de Patente 5 exemplifica diversos biocatalisa- dores (hidrolase, sintetase de éster de cera, álcool acetiltransferase) tendo atividade de formação de éster geral; entretanto, não está claro se os biocatalisadores exemplificados têm atividade sintética para éster de ácido metacrílico.

[006] Além disso, o Documento de Patente 6 divulga um método para produzir éster de ácido acrílico fazendo com que a hidrolase atue sob a presença de acrilil-CoA e álcool. O mesmo documento sugere que a produção é similarmente possível também para os ésteres de ácidos metacrílicos. Entretanto, quando se considera a diversidade e a especificidade dos biocatalisadores pelos substratos, ele meramente ilustra que a produção de uma parte de ésteres de ácidos acrílicos é possível com a hidrolase, e não está claro se os ésteres de ácidos me- tacrílicos tendo uma estrutura diferente são similarmente produzíveis pela hidrolase. Ademais, está completamente confuso se é possível produzir com outros tipos de biocatalisadores tendo diferentes mecanismos de reação. Além disso, no caso de sintetizar ésteres pela hi- drolase descrita no Documento de Patente 6, assume-se que o éster formado será decomposto pela atividade de hidrólise logo de início e, desse modo, é bem pouco promissor como um método de produção efetivo.

[007] Por outro lado, a álcool acetiltransferase é conhecida como uma sintetase de aroma de fruta. Identificando os mesmos genes de enzimas contidos em frutas específicas, o Documento de Patente 7 propõe métodos de síntese de diversos ésteres que sejam essências de frutas. Entretanto, não foi descrito se os ésteres de ácidos metacrí- licos são sintetizáveis com estas enzimas, e não está completamente claro.

[008] Conforme estabelecido acima, embora tenham sido feitas algumas propostas ou estudos, não existe nenhum exemplo de realmente produzir derivados de ácido metacrílico por meio de microorganismos e, desse modo, tem-se desejado o estabelecimento de um método de produção efetivo.

[009] [Documento de Patente 1] Folheto da Publicação Internacional PCT No. WO2007/110394

[0010] [Documento de Patente 2] Folheto da Publicação Internacional PCT No. WO2008/145737

[0011] [Documento de Patente 3] Folheto da Publicação Internacional PCT No. WO2009/135074

[0012] [Documento de Patente 4] Folheto da Publicação Internacional PCT No. WO2011/031897

[0013] [Documento de Patente 5] Folheto da Publicação Internacional PCT No. WO2012/135789

[0014] [Documento de Patente 6] Folheto da Publicação Internacional PCT No. WO2007/039415

[0015] [Documento de Patente 7] Folheto da Publicação Internacional PCT No. WO2000/32789

[0016] [Documento de Patente 8] Pedido de Patente Não Examinado Japonês, Publicação No. 2011-200133

[0017] [Documento de Patente 9] Pedido de Patente Não Exami- nado Japonês, Publicação No. H05-64589

[0018] [Documento de Patente 10] Pedido de Patente Não Examinado Japonês, Publicação No. H10-337185

[0019] [Documento de Patente 11] Pedido de Patente Não Examinado Japonês, Publicação No. H10-24867

[0020] [Documento de não Patente 1] Green Chemistry, 2012, 14, 1942-1948

[0021] [Documento de não Patente 2] Methods in Enzymology, 2000, 324, 73-79

[0022] [Documento de não Patente 3] Botanical Journal of the Lin- nean Society, 2009, 161, 105-121

[0023] [Documento de não Patente 4] Microbiology, 1999, 145, 2323-2334

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Problemas a serem Resolvidos pela Invenção

[0024] A presente invenção tem um objetivo de proporcionar um método para produzir éster de ácido metacrílico por meio de um bioca- talisador.

Meios para Resolver os Problemas

[0025] Verificou-se que a álcool aciltransferase tem atividade para sintetizar os ésteres de ácidos metacrílicos, com isso chegando à conclusão da presente invenção. Mais especificamente, a presente invenção é como se segue.

[0026] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, um método para produzir éster de ácido metacrílico inclui uma etapa de sintetizar o éster de ácido metacrílico fazendo com que um álcool ou fenol atue sobre a metacrilil-CoA, sob a presença de uma álcool aciltransfe- rase.

[0027] De acordo com um segundo aspecto da invenção, no método para produzir o éster de ácido metacrílico como descrito no pri- meiro aspecto, o éster de ácido metacrílico é acumulado em pelo menos 0,001 mM.

[0028] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, o método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito no primeiro ou no segundo aspecto adicionalmente inclui uma etapa de produzir a metacrilil-CoA a partir da isobutiril-CoA ou da 3-hidróxi-isobutiril-CoA.

[0029] De acordo com um quarto aspecto da invenção, no método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito no terceiro aspecto, a isobutiril-CoA é produzida a partir do ácido 2-oxoisovalérico.

[0030] De acordo com um quinto aspecto da invenção, no método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito em qualquer um do primeiro até o quarto aspectos, a álcool aciltransferase é de origem de planta.

[0031] De acordo com um sexto aspecto da invenção, no método para produzir o éster de ácido metacrílico como descrito no quinto aspecto, a planta pertence a qualquer ordem selecionada a partir do grupo que consiste em Zingiberales, Rosales, Ericales, Cucurbitales, Brassicales e Laurales.

[0032] De acordo com um sétimo aspecto da invenção, no método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito no quinto aspecto, a planta pertence a qualquer família selecionada a partir do grupo que consiste em Musaceae, Rosaceae, Ericaceae, Actinidiacea- e, Cucurbitaceae, Caricaceae e Lauraceae.

[0033] De acordo com um oitavo aspecto da invenção, no método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito no quinto aspecto, a planta pertence a qualquer gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Musa, Fragaria, Malus, Prunus, Pyrus, Vaccini- um, Actinidia, Cucumis, Carica e Persea.

[0034] De acordo com um nono aspecto da invenção, no método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito no quinto as- pecto, a planta é qualquer gênero selecionado a partir de Musa, Malus, Prunus, Pyrus, Vaccinium, Actinidia, Cucumis, Carica e Persea.

[0035] De acordo com um décimo aspecto da invenção, no método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito no quinto aspecto, a planta é qualquer gênero selecionado a partir de Musa, Malus, Pyrus, Actinidia, Cucumis, Carica e Persea.

[0036] De acordo com um décimo primeiro aspecto da invenção, no método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito no quinto aspecto, a planta é qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste em banana, morango, maçã, Prunus mume, Pyrus communis, mirtilo, kiwi, melão, mamão e abacate.

[0037] De acordo com um décimo segundo aspecto da invenção, no método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito no quinto aspecto, a planta é qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste em banana, maçã, Prunus mume, Pyrus communis, mirti- lo, kiwi, melão, mamão e abacate.

[0038] De acordo com um décimo terceiro aspecto da invenção, no método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito no quinto aspecto, a planta é qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste em banana, maçã, Pyrus communis, kiwi, melão, mamão e abacate.

[0039] De acordo com um décimo quarto aspecto da invenção, o método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito em quaisquer do primeiro até o décimo terceiro aspectos utiliza um microorganismo geneticamente modificado que tenha sido transferido no gene de modo a expressar a álcool aciltransferase.

[0040] Além disso, a presente invenção é como se segue em outro aspecto.

[0041] De acordo com um décimo quinto aspecto da invenção, um método para produzir éster de ácido metacrílico produz o éster de áci- do metacrílico usando um micro-organismo que pertence ao gênero Rhodococcus.

[0042] De acordo com um décimo sexto aspecto da invenção, o método para produzir o éster de ácido metacrílico como descrito no décimo quinto aspecto utiliza um micro-organismo que pertence ao gênero Rhodococcus tendo 16SrDNA que inclui uma sequência de nu- cleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de nucleotídeos de 16SrDNA mostrada na SEQ ID NO. 31.

[0043] De acordo com um décimo sétimo aspecto da invenção, no método para produzir o éster de ácido metacrílico como descrito no décimo quinto ou no décimo sexto aspecto, o micro-organismo que pertence ao gênero Rhodococcus é o Rhodococcus erythropolis.

[0044] De acordo com um décimo oitavo aspecto da invenção, o método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito no décimo quinto ou no décimo sexto aspecto utiliza uma cepa derivada do micro-organismo como o micro-organismo que pertence ao gênero Rhodococcus.

[0045] De acordo com um décimo nono aspecto da invenção, no método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito no décimo oitavo aspecto, o micro-organismo que pertence ao gênero Rho- dococcus é a cepa PR-4 de Rhodococcus erythropolis ou uma cepa derivada dela.

[0046] De acordo com um vigésimo aspecto da invenção, no método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito no décimo oitavo aspecto, a cepa derivada é uma cepa geneticamente modificada tendo uma modificação de pelo menos uma de (a) ou (b) mostrado abaixo. (a) Modificação por introdução de gene para cetoácido desi- drogenase ramificada e/ou gene para acil-CoA desidrogenase (b) Modificação de remoção ou inativação do gene para enoil- CoA hidratase, gene para 3-hidróxi-isobutiril-CoA e/ou gene para ácido 3-hidróxi-isobutírico desidrogenase.

[0047] De acordo com um vigésimo primeiro aspecto da invenção, no método para produzir éster de ácido metacrílico como descrito no décimo nono ou no vigésimo aspecto, a cepa derivada tem um plasmí- dio para a expressão de álcool aciltransferase e/ou acil-CoA desidro- genase.

Efeitos da Invenção

[0048] Por meio da presente invenção, a produção de éster de ácido metacrílico por meio de um biocatalisador torna-se possível. Por combinação do método de produção da presente invenção com o metabolismo in vivo, a produção fermentativa de éster de ácido metacríli- co pode também ser obtida. Como seu resultado, a energia, os recursos e a carga sobre o ambiente podem ser extraordinariamente reduzidos, comparados ao processo de produção química convencional, e torna-se possível produzir eficientemente o éster de ácido metacrílico.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0049] A FIG. 1 é uma vista mostrando as etapas de produção a partir da 3-hidróxi-isobutiril-CoA até o éster de ácido metacrílico;

[0050] a FIG. 2 é uma vista mostrando as etapas de produção a partir do ácido 2-oxoisovalérico até o éster de ácido metacrílico;

[0051] a FIG. 3 é uma vista mostrando a estrutura de um plasmídio para a remoção do gene homólogo LigD;

[0052] a FIG. 4 é uma vista ilustrando um método de preparação para o plasmídio para a remoção do gene usando o método de In Fusion; e

[0053] a FIG. 5 é uma vista mostrando as estruturas dos plasmí- dios para a coexpressão de ACD-AAT.

MODALIDADES PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[0054] A seguir, os modos preferidos para realizar a presente in- venção serão explicados, ao mesmo tempo fazendo referência aos desenhos. Deve ser observado que as modalidades explicadas no que se segue são atingidas expressando os exemplos das modalidades representativas da presente invenção, e o escopo da presente invenção não é para ser limitadamente interpretado a partir delas.

Método de produção de éster de ácido metacrílico a partir da álcool aciltransferase Éster de ácido metacrílico

[0055] Na presente invenção, o éster de ácido metacrílico é um composto expresso pela Fórmula 1. Na Fórmula 1, R representa um grupo hidrocarboneto de C1-20, linear ou ramificado. O grupo hidro- carboneto pode ser do tipo não cíclico, saturado ou insaturado, ou pode ser do tipo cíclico, saturado ou insaturado. Ele é preferivelmente um grupo C1-10 alquila não substituído linear ou ramificado, grupo aralqui- la ou grupo arila. Ele é mais preferivelmente um grupo C1-8 alquila, tal como um grupo metila, grupo etila, grupo n-propila, grupo isopropila, grupo n-butila, grupo isobutila, grupo sec-butila, grupo terc-butila, grupo n-pentila, grupo isopentila, grupo terc-pentila, grupo n-hexila, grupo iso-hexila, grupo 2-hexila, grupo dimetilbutila, grupo etilbutila, grupo heptila, grupo octila, grupo 2-etil-hexila; um grupo benzila ou um grupo fenila. CH2=C(CH3)COO-R (Fórmula 1)

[0056] O "ácido metacrílico" (nome da IUPAC: ácido 2-metil-2- propenóico) indica um composto tendo a fórmula abaixo, e também inclui quaisquer sais ou formas ionizadas deles. Como sais de ácido metacrílico, por exemplo, os sais de sódio, os sais de potássio, os sais de cálcio, os sais de magnésio, etc., podem ser exemplificados. CH2=C(CH3)COOH

Metacrilil-CoA

[0057] Na presente invenção, a metacrilil-CoA é um composto ex- presso pela fórmula estrutural abaixo. A metacrilil-CoA é conhecida como um intermediário metabólico da valina dentro dos organismos. A metacrilil-CoA usada na presente invenção pode ser aquela produzida por um método conhecido ou novo. Como o seu método de síntese, conhece-se o método de sintetizar organoquimicamente a coenzima A com o anidrido metacrílico (Methods in Enzymology, 324, 73-79 (2000)) ou um método de síntese usando uma reação de enzima. [Quím 1]

[0058] Na presente invenção, entre estas, pode ser favoravelmente usada a metacrilil-CoA (referir-se à FIG. 2) transformada pela ação da acil-CoA desidrogenase (EC 1.3.99.3) (a seguir, referida como ACD) com a isobutiril-CoA como uma matéria-prima ou a metacrilil- CoA (referir-se à FIG. 1) transformada pela ação da enoil-CoA hidrata- se (EC 4.2.1.17) (a seguir referida como ECH) a partir da 3-hidróxi- isobutiril-CoA. Em outras palavras, o método da presente invenção preferível e adicionalmente inclui uma etapa de produzir a metacrilil- CoA a partir de isobutiril-CoA ou 3-hidróxi-isobutiril-CoA. A partir da reação contínua pela enzima, juntamente com estar se ligando a uma melhora no rendimento, bem como a supressão de matéria estranha, a síntese direta de éster de ácido metacrílico torna-se possível, sem passar pelo ácido metacrílico tendo alta toxicidade para os organismos, ou formando subprodutos. De acordo com o método, é possível obter a produção de éster de ácido metacrílico por uma reação contínua in vivo (fermentação metabólica) com baixo peso ambiental.

[0059] Para a isobutiril-CoA usada na presente invenção, pode ser usada uma produzida a partir do ácido 2-oxoisovalérico (referir-se à FIG. 2). Em outras palavras, o método da presente invenção pode adi-cionalmente incluir uma etapa de produzir a isobutiril-CoA a partir do ácido 2-oxoisovalérico.

Álcoois e Fenóis

[0060] Os álcoois ou os fenóis que servem como matérias-primas na produção do éster de ácido metacrílico na presente invenção são os compostos expressos pela fórmula 2 abaixo. A estrutura do álcool ou dos fenóis corresponde ao éster de ácido metacrílico; portanto, a sua estrutura é definida do mesmo modo como R na Fórmula 1, e representa um grupo hidrocarboneto de C1-20 linear ou ramificado. O grupo hidrocarboneto pode ser do tipo não cíclico, saturado ou insatu- rado, ou pode ser do tipo cíclico, saturado ou insaturado. Ele é preferivelmente um álcool de C1-10 não substituído, linear ou ramificado, álcool aralquílico ou fenol, e particular e preferivelmente um álcool alquí- lico de C1-8, tal como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n- butanol, isobutanol, sec-butanol, terc-butanol, álcool n-pentílico, álcool isopentílico, álcool terc-pentílico, álcool n-hexílico, álcool iso-hexílico, álcool 2-hexílico, álcool dimetilbutílico, álcool etilbutílico, álcool heptíli- co, álcool octílico, álcool 2-etil-hexílico; um álcool benzílico ou um fe- nol. R-OH (Fórmula 2)

Álcool Aciltransferase

[0061] A álcool aciltransferase da presente invenção (a seguir referida como AAT) é uma enzima tendo uma ação catalítica para sintetizar o éster, fazendo com que o grupo acila da acil-CoA transfira-se para o álcool ou o fenol. A AAT é considerada participar na formação de ésteres em diversas frutas. Sabe-se que a AAT está presente nas plantas, tais como Zingiberales (banana), Rosales (morango, maçã, pera, pêssego), Cucurbitales (melão), Ericales (kiwi), Lamiales (azeitona), Solanales (tomate), e Sapindales (limão, manga).

[0062] A AAT usada na presente invenção não está particularmente limitada, desde que seja um catalisador de origem biológica tendo uma capacidade de produzir éster de ácido metacrílico com a metacri- lil-CoA e o álcool ou o fenol como matérias-primas, e o seu tipo e origem não são de preocupação. Uma de origem de planta é preferível como a fonte de enzima, e entre elas, uma categorizada como uma angiosperma é preferível.

[0063] A AAT adequada para a presente invenção pode ser facilmente selecionada a partir das plantas pelo método a seguir. Uma parte apropriada do tecido é adquirida cortando-se conforme necessário. Uma solução contendo metacrilil-CoA e um álcool ou fenol representado pela Fórmula 2 são adicionados a esta parte cortada, agitados, e deixados reagir por certo tempo. É possível confirmar a atividade sintética confirmando-se a presença do éster de ácido metacrílico nesta solução de reação por GC (cromatografia gasosa). Mais especificamente, por exemplo, o sarcocarpo ou o pericarpo é cortado, uma solução contendo 1 a 10 mM de metacrilil-CoA, 0,35 de KCl e 5 a 50 vezes a quantidade molar de n-butanol é adicionada a ele, e agitados por 1 a 10 horas, a 30°C. Após o término da reação, uma AAT aplicável à presente invenção pode ser selecionada confirmando-se a presença de éster de ácido metacrílico por meio de GC.

[0064] A fonte de enzima de AAT adequada para a presente invenção, por exemplo, é uma que pertença a qualquer ordem selecionada a partir do grupo que consiste em Zingiberales, Rosales, Erica- les, Cucurbitales, Brassicales, Laurales, Poales, Arecales, Asparaga- les, Saxifragales, Caryophyllales, Vitales, Malpighiales, Oxalidales, Fabales, Sapindales, Malvales, Myrtales, Ranunculales, Solanales, Lamiales, Gentianales e Asterales. Entre elas, ela é preferivelmente uma que pertence a qualquer ordem selecionada a partir do grupo que consiste em Zingiberales, Rosales, Ericales, Cucurbitales, Brassicales e Laurales.

[0065] As plantas de Musaceae e Zingiberaceaeare são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Zingiberales; as plantas de Ro- saceae e Moraceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Rosales; as plantas de Ericaceae, Actinidiaceae, Ebenaceae e Theaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Erica- les; as plantas de Cucurbitaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Cucurbitales; as plantas de Caricaceae e Brassi- caceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Brassi- cales; as plantas de Lauraceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Laurales; as plantas de Bromeliaceae e Poaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Poales; as plantas de Arecaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Arecales; as plantas de Orchidaceae e Iridaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Asparagales; as plantas de Grossula- riaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Saxifra- gales; as plantas de Caryophyllaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Caryophyllales; as plantas de Vitaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Vitales; as plantas de Malpighiaceae, Passifloraceae, Euphorbiaceae e Salicaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Malpighiales; as plantas de Oxalidaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Oxalidales; as plantas de Fabaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Fabales; as plantas de Rutaceae, Sapin- daceae e Anacardiaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Sapindales; as plantas de Malvaceaeare são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Malvales; as plantas de Lythraceae, Onagraceae e Myrtaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Myrtales; as plantas de Ranunculaceae e Papaveraceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Ranunculales; as plantas de Solanaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Solanales; as plantas de Oleaceae, Verbenaceae e Lamiaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Lamiales; as plantas de Apocynaceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Gentianales; e as plantas de Asteraceae são preferíveis como aquelas que pertencem à ordem Asterales. Pode também ser empregada uma espécie relacionada das plantas acima mencionadas. Entre elas, ela é mais preferivelmente uma planta que pertence à Musacea, Rosaceae, Ericeae, Actinidiaceae, Cucurbitaceae, Caricaceae ou Lau- raceae.

[0066] Mais especificamente, as plantas de Musa são preferíveis como aquelas que pertencem à família Musaceae; as plantas de Zingiber são preferíveis como aquelas que pertencem à família Zingibera- ceae; as plantas de Fragaria, Malus, Prunus, Pyrus, Eriobotrya, Chae- nomeles, Rubus e Rosa são preferíveis como aquelas que pertencem à família Rosaceae; as plantas de Ficus são preferíveis como aquelas que pertencem à família Moraceae; as plantas de Vaccinium são preferíveis como aquelas que pertencem à família Ericaceae; as plantas de Actinidia são preferíveis como aquelas que pertencem à família Ac- tinidiaceae; as plantas de Diospyros são preferíveis como aquelas que pertencem à família Ebenaceae; as plantas de Camellia são preferíveis como aquelas que pertencem à família Theaceae; as plantas de Cucumis e Citrullus são preferíveis como aquelas que pertencem à família Cucurbitaceae; as plantas de Carica e Vasconcellea são preferíveis como aquelas que pertencem à família Caricaceae; as plantas de Arabidopsis são preferíveis como aquelas que pertencem à família Brassicaceae; as plantas de Persea são preferíveis como aquelas que pertencem à família Lauraceae; as plantas de Ananas são preferíveis como aquelas que pertencem à família Bromeliaceae; as plantas de Oryza, Triticum, Hordeum, Zea, Sorghum e Brachypodium são preferí- veis como aquelas que pertencem à família Poaceae; as plantas de Cocus são preferíveis como aquelas que pertencem à família Areca- ceae; as plantas de Vanda são preferíveis como aquelas que pertencem à família Orchidaceae; as plantas de Iris são preferíveis como aquelas que pertencem à família Iridaceae; as plantas de Ribes são preferíveis como aquelas que pertencem à família Grossulariaceae; as plantas de Gypsophila são preferíveis como aquelas que pertencem à família Caryophyllaceae; as plantas de Vitis são preferíveis como aquelas que pertencem à família Vitaceae; as plantas de Malpighia são preferíveis como aquelas que pertencem à família Malpighiaceae; as plantas de Passiflora são preferíveis como aquelas que pertencem à família Passifloraceae; as plantas de Ricinus são preferíveis como aquelas que pertencem à família Euphorbiaceae; as plantas de Populus são preferíveis como aquelas que pertencem à família Salicaceae; as plantas de Averrhoa são preferíveis como aquelas que pertencem à família Oxalidaceae; as plantas de Medicago, Lupinus, Glycine e Clito- ria são preferíveis como aquelas que pertencem à família Fabaceae; as plantas de Citrus e Aegle são preferíveis como aquelas que pertencem à família Rutaceae; as plantas de Litchi são preferíveis como aquelas que pertencem à família Sapindaceae; as plantas de Mangifera são preferíveis como aquelas que pertencem à família Anacardiaceae; as plantas de Durioand Theobroma são preferíveis como aquelas que pertencem à família Malvaceae; as plantas de Punica são preferíveis como aquelas que pertencem à família Lythraceae; as plantas de Clar- kia são preferíveis como aquelas que pertencem à família Onagracea- e; as plantas de Psidium são preferíveis como aquelas que pertencem à família Myrtaceae; as plantas de Actaea são preferíveis como aquelas que pertencem à família Ranunculaceae; as plantas de Papaver são preferíveis como aquelas que pertencem à família Papaveraceae; as plantas de Solanum, Capsicum, Nicotiana e Petunia são preferíveis como aquelas que pertencem à família Solanaceae; as plantas de Olea são preferíveis como aquelas que pertencem à família Oleaceae; as plantas de Glandularia são preferíveis como aquelas que pertencem à família Verbenaceae; as plantas de Salvia são preferíveis como aquelas que pertencem à família Lamiaceae; as plantas de Rauvolfia e Catharanthus são preferíveis como aquelas que pertencem à família Apocynaceae; e as plantas de Chamaemelum são preferíveis como aquelas que pertencem à família Asteraceae. Entre elas, são mais preferíveis as plantas que pertencem à Musa, Fragaria, Malus, PRunus, Pyrus, Vaccinium, Actinidia, Cucumis, Carica ou Persea. Além disso, entre elas, são particularmente preferíveis as plantas que pertencem à Musa, Malus, Pyrus, Actinidia, Cucumis, Carica ou Persea.

[0067] Além disso, mais especificamente, as plantas de Musaxpa- radisiaca, Musabasjoo, Musacoccinea e Musaacuminata são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Musa; as plantas de Zingiberofficinale são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Zingiber; as plantas de Fragariaxa- nanassa, Fragariavirginiana, Fragariachiloensis e Fragariavesca são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Fragaria; as plantas de Maluspumila, Malusdomestica, Malusbaccata, Malushalliana, Malusfloribunda e Malusprunifolia são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Malus; as plantas de Prunusmume, Prunusavium, Prunuspersica, Prunusarmeniaca, Prunusdulcis, Prunussalicina e Prunusdomestica são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Prunus; as plantas de Pyruscommunis, Pyruspyrifolia, Pyruscalleryana e Pyruspyraster são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Pyrus; as plantas de Eriobotryajaponica são particularmente preferí-veis como aquelas que pertencem ao gênero Eriobotrya; as plantas de Chaenomelessinensis são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Chaenomeles; as plantas de Rubusidaeus e Rubusfruticosus são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Rubus; as plantas de Rosarugosa são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Rosa; as plantas de Ficuscarica são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Ficus; as plantas de Vacciniumcorymbosum, Vacciniumangustifolium, Vacciniummyrtillus, Vacciniumvitis-idaea e Vacciniumoxycoccos são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Vaccinium; as plantas de Actinidiachinensis, Actinidiadeliciosa, Actinidiaarguta, Actinidiarufa e Actinidiapolygama são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Actinidia; as plantas de Diospyroskaki são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Diospyros; as plantas de Camelliasinensis são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Camellia; as plantas de Cucumissativus, Cucu- mismelo, Cucumisanguria e Cucumismetulifer são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Cucumis; as plantas de Citrulluslanatus são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Citrullus; as plantas de Caricapapaya são parti-cularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Cari- caceae; as plantas de Vasconcelleacundinamarcensis são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Vasconcel- lea; as plantas de Arabidopsisthaliana e Arabidopsislyrata são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Arabi- dopsis; as plantas de Perseaamericana são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Persea; as plantas de Ana- nascomosus são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Ananas; as plantas de Oryzasativa são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Oryza; as plantas de Triticumaestivum são particularmente preferíveis como a- quelas que pertencem ao gênero Triticum; as plantas de Hordeumvul- gare são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Hordeum; as plantas de Zeamays são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Zea; as plantas de Sor- ghumbicolor são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Sorghum; as plantas de Brachypodiumdistachyon são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Brachypodium; as plantas de Cocosnucifera são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Cocos; as plantas de Vandahybridcultivar são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Vanda; as plantas de Irisxhollandica são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Iris; as plantas de Ribesnigrum são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Ribes; as plantas de Gypsophilapaniculata e Gypsophilaelegans são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Gypsophila; as plantas de Vitisvinifera e Vitisla- brusca são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Vitis; as plantas de Malpighiaglabra são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Malpighia; as plantas de Passifloraedulis são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Passiflora; as plantas de Ricinuscommunis são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Ricinus; as plantas de Populustrichocarpa são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Populus; as plantas de Averrhoacarambola são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Averrhoa; as plantas de Medicagotruncatula são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Medicago; as plantas de Lupinusalbus são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Lupinus; as plantas de Glycinemax são particularmente preferíveis como aquelas que perten- cem ao gênero Glycine; as plantas de Clitoriaternatea são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Clitoria; as plantas de Citruslimon, Citrussudachi, Citrussphaerocarpa, Citrusxpa- radisi, Citrusjunos, Citrusaurantifolia, Citrusunshiu e Citrussinensis são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Citrus; as plantas de Aeglemarmelos são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Aegle; as plantas de Litchi- chinensi são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Litchi; as plantas de Mangiferaindica são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Mangifera; as plantas de Duriozibethinus são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Durio; as plantas de Theobromacacao são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Theobroma; as plantas de Punicagranatum são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Punica; as plantas de Clarkiabreweri e Clarkiaconcinna são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Clarkia; as plantas de Psidiumgua- java são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Psidium; as plantas de Actaearacemosa são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Actaea; as plantas de Papaversomniferum, Papaverorientale e Papaverbracteatum são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Papaver; as plantas de Solanumlycopersicum são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Solanum; as plantas de Capsicumannuum e Capsicumchinense são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Capsicum; as plantas de Nicotianatabacum e Nicotianaattenuata são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Nicotiana; as plantas de Petuniaxhybrida são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Petunia; as plantas de Oleaeuropaea são parti- cularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Olea; as plantas de Glandulariaxhybrida são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Glandularia; as plantas de Sal- viasplendens são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Salvia; as plantas de Rauvolfiaserpentina são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Rau- volfia; as plantas de Catharanthusroseus são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Catharanthus; e as plantas de Chamaemelumnobile são particularmente preferíveis como aquelas que pertencem ao gênero Chamaemelum. Entre elas, é mais preferível a banana, o morango, a maçã, o umezeiro, a pera, o mirtilo, o kiwi, o melão, o mamão ou o abacate. Ademais, entre elas, é particu-larmente preferível a banana, a maçã, a pera, o kiwi, o melão, o mamão ou o abacate.

[0068] Deve ser observado que, no caso de se efetuar a reação sintética usando uma planta no estado em que se encontra como a fonte de enzima, em particular, é mais preferível usar as plantas que pertencem ao Malus, Carica e Persea, quando se define um álcool de C1-2 como o substrato. Isto é devido a ter uma eficiência de geração maior do que as plantas que pertencem a outro gênero.

[0069] Na presente invenção, as classificações das plantas são definidas seguindo o Botanical Journal of the Linnean Society, 2009, 161, 105121.

[0070] Na presente invenção, ao fornecer a AAT para a reação, o modo de uso não está particularmente limitado, desde que exiba a atividade catalítica acima mencionada, e é possível usar o tecido biológico ou o seu produto processado no estado em que se encontra. Como tal tecido biológico, podem ser usadas as plantas inteiras, os órgãos das plantas (p.ex., fruta, folhas, pétalas, tronco, semente, etc.), ou o tecido da planta (p.ex., casca da fruta, sarcocarpo, etc.). Como o seu produto processado, pode ser exemplificado o líquido de enzima bruta a partir da extração da AAT destes tecidos biológicos, a enzima purificada ou similar.

Micro-organismo Recombinante de Expressão da Atividade da AAT

[0071] Além disso, ao fornecer a AAT para a reação, o gene para a AAT é isolado, por exemplo, introduzido em um sistema de vetor hospedeiro geral, e o micro-organismo transformado por este sistema de vetor pode ser usado. Como o hospedeiro, concernente à bactéria, podem ser exemplificados E. coli, Rhodococcus, Pseudomonas, Cory- nebacterium, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, etc.; concernente à levedura, Saccharomyces, Candida, Shizosaccharomyces e Pichia; e concernente ao fungo filamentoso, podem ser exemplificados Aspergillus, etc.. Entre estes, é particularmente fácil de usar a bactéria, e é também preferível na eficiência.

[0072] Diversos genes para AAT foram publicados (por exemplo, referir-se ao Documento de Patente 7). Uma sonda de DNA é preparada com base nesta publicação e, por exemplo, um primer usado na PCR é preparado, e este gene pode ser isolado efetuando-se a PCR. Além disso, também é possível sintetizar completamente a sequência de nucleotídeos do gene para AAT por um método comum. Pode ser similarmente confirmado pelo método se estas AAT para as quais a informação genética é conhecida têm atividade sintética para éster do ácido metacrílico. Por outro lado, para a AAT tendo informação genética incerta, a AAT pode ser purificada, e a informação genética pode ser obtida por um método de engenharia genética de acordo com as suas proteínas.

[0073] Como um gene para AAT preferido na presente invenção, ele não está particularmente limitado, desde que o seu produto traduzido tenha uma capacidade de produzir o éster de ácido metacrílico, e seja apropriadamente selecionado dentre as fontes de enzimas de AAT. Particular e preferivelmente, o gene para AAT derivado da maçã (SEQ ID NO: 2), o gene para AAT derivado de morango (SEQ ID NO: 4) e o gene para AAT derivado de morango (SEQ ID NO: 6) podem ser exemplificados.

[0074] Deve ser observado que os genes codificando proteínas tendo atividade para produzir o éster de ácido metacrílico a partir da metacrilil-CoA e do álcool incluindo uma sequência de aminoácidos na qual um ou uma pluralidade de aminoácidos foram substituídos, removidos ou adicionados a uma sequência de aminoácidos do tipo selvagem estão também incluídos nos genes para AAT da presente invenção.

[0075] Neste documento, o termo "pluralidade" refere-se a 1 a 40, preferivelmente 1 a 20, e mais preferivelmente não mais do que 10. Para introduzir a mutação no gene, é possível usar um kit para introdução de mutação usando um método de mutagênese sítio- direcionada, por exemplo, o Kit de Mutagênese Sítio-Direcionada QuikChange® (Stratagene), o Sistema de Mutagênese Sítio- Direcionada GeneTailor® (Invitrogen), o Sistema de Mutagênese Sítio- Direcionada TaKaRa (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.: Takara Bio), etc., por um método conhecido, tal como o método de Kunkel ou o método de duplex com espaço. Alternativamente, o gene inteiro tendo uma sequência incluindo mutação pode ser artificialmente sintetizado.

[0076] Na presente invenção, a confirmação da sequência de nu- cleotídeos do DNA pode ser efetuada por determinação da sequência por um método comum. Por exemplo, com base no método de Sanger, é possível confirmar a sequência usando um sequenciador de DNA apropriado.

[0077] Além disso, no gene para AAT da presente invenção, estão também incluídos os genes que codificam proteínas tendo atividade para produzir o éster de ácido metacrílico a partir de metacrilil-CoA e álcool expressando pelo menos 90% de identidade com a proteína consistindo na sequência de aminoácidos do tipo selvagem, preferivelmente 95%, mais preferivelmente 99,5%, e ainda mais preferivelmente 99,9%.

[0078] Ademais, no gene para AAT da presente invenção, estão também incluídos os genes que hibridizam sob condições severas para um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos do tipo selvagem, e que codificam uma proteína tendo atividade para produzir o éster de ácido metacríli- co a partir de metacrilil-CoA e álcool. Como as condições severas, por exemplo, é possível exemplificar as condições de efetuar a hibridiza- ção mantendo-se uma membrana de náilon que fixa o DNA na mesma temperatura, ao mesmo tempo sondando a 65°C por 20 horas em uma solução contendo 6 x SSC (1 x SSC é preparado dissolvendo 8,76 g de cloreto de sódio e 4,41 g de citrato de sódio em 1 litro de água), 1% de SDS, 100 μg/ml de DNA de espermatozóide de salmão, 0,1% de soro albumina bovina, 0,1% de polivinilpirrolidona e 0,1% de ficoll. Para alguém versado na técnica, é possível considerar outros termos e condições, tais como a concentração da sonda, o comprimento da sonda, e o tempo de reação, além de tais condições como a concentração do sal, a temperatura do tampão, etc., de modo a ajustar as condições de hibridização. Como as condições de secagem após a hibridização, por exemplo, podem ser exemplificadas "2 x SSC, 0,1% de SDS, 42°C" e "1 x SSC, 0,1% de SDS, 37°C", e como as condições mais severas, por exemplo, as condições tais como "1 x SSC, 0,1% de SDS, 65°C" e "0,5 x SSC, 0,1% de SDS, 50°C".

[0079] Com relação à sequência detalhada do método de hibridi- zação, é possível referir-se à Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons (1987-1997)), ou similar.

[0080] Além disso, no gene para AAT da presente invenção, quando se calcula usando a sequência de nucleotídeos do tipo selvagem, BLAST, etc. (p.ex., default, i.e., ajuste inicial, parâmetros), estão também incluídos os genes que codificam uma proteína tendo atividade para produzir o éster de ácido metacrílico a partir de metacrilil-CoA e álcool, consistindo em uma sequência de nucleotídeos tendo identidade de pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e mais preferivelmente ainda pelo menos 95%. Ademais, os códons dos genes para AAT acima mencionados podem ser alterados de acordo com a frequência de uso dos códons no hospedeiro de microorganismo usado na transformação genética.

[0081] Neste documento, a "identidade" da sequência, quando o caso de uma sequência de nucleotídeos, é obtida alinhando-se ambas as sequências de nucleotídeos, de modo que as bases das duas sequências de nucleotídeos a serem comparadas se correspondam tanto quanto possível, e então se expressando um valor obtido subtraindose o número de bases que se correspondem do número total de bases, como uma porcentagem. No alinhamento acima mencionado, espaços apropriados são inseridos em uma ou em ambas as sequências comparadas, conforme necessário. Tal alinhamento de sequências pode ser efetuado usando um programa conhecido, tal como BLAST, FASTA, e CLUSTAL, por exemplo. No caso dos espaços serem inseridos, o número total de bases acima mencionado torna-se o número de bases obtido contando-se um espaço como uma base. No caso do número total de bases obtido por contagem neste modo diferir entre as duas sequências comparadas, a identidade (%) é calculada subtraindo-se o número de bases que se correspondem do número total de bases na sequência mais longa. Isto se aplica similarmente também para a identidade das sequências de aminoácidos.

[0082] Na reação de síntese do éster de ácido metacrílico, é possível usar o caldo obtido cultivando-se estes micro-organismos recom- binantes no estado em que se encontram, ou usar a célula bacteriana obtida por uma operação de coleta, tal como a centrifugação deste caldo, um seu produto processado, ou similar. Como o produto processado da célula bacteriana, pode ser exemplificada uma célula bac- teriana tratada com acetona, tolueno ou similar, as células bacterianas liofilizadas, as células bacterianas rompidas, ou o extrato não celular de células bacterianas rompidas, a enzima bruta extraída destas enzimas ou a enzima purificada, etc..

[0083] O éster de ácido metacrílico pode também ser sintetizado com a isobutiril-CoA ou a 3-hiidróxi-isobutiril-CoA como uma matéria- prima introduzindo-se simultaneamente o gene paa ACD ou o gene para ECH com o gene para AAT (referir-se à FIG. 1 e à FIG. 2). Além disso, por combinação e introdução do gene para ácido 2- oxoisovalérico desidrogenase (a seguir, referida como BCKAD), também é possível sintetizar o ácido de ácido metacrílico a partir do ácido 2-oxoisovalérico.

[0084] Embora não haja nenhuma limitação particular nas origens de ACD, ECH e BCKAD na presente invenção, os micro-organismos listados abaixo podem ser exemplificados.

[0085] Ele é um micro-organismo que pertence ao gênero Magnetospirillum, Rhodospirillum, Azospirillum, Tistrella, Acidiphilium, Rho- dobacter, Paracoccus, Ruegeria, Jannaschia, Roseobacter, Dinorose- obacter, Pseudovibrio, Phaeobacter, Octadecabacter, Hyphomonas, Maricaulis, Hirschia, Sphingomonas, Novosphingobium, Sphingopyxis, Sphingobium, Erythrobacter, Brevundimonas, Caulobacter, Phenylo- bacterium, Asticcacaulis, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Xanthobacter, Azorhizobium, Brucella, Ochrobactrum, Mesorhizobium, Chelativorans, Aurantimonas, Bradyrhizobium, Agromonas, Rhodop- seudomonas, Nitrobacter, Methylobacterium, Rhodomicrobium, Pela- gibacterium, Parvibaculum, Methylocystis, Parvularcula, Burkholderia, Ralstonia, Cupriavidus, Polynucleobacter, Achromobacter, Bordetella, Taylorella, Pusillimonas, Comamonas, Alicycliphilus, Delftia, Ramlibac- ter, Rhodoferax, Variovorax, Polaromonas, Acidovorax, Verminephro- bacter, Herminiimonas, Herbaspirillum, Collimonas, Chromobacterium, Laribacter, Pseudogulbenkiania, Nitrosomonas, Nitrosospira, Aromato- leum, Azoarcus, Dechloromonas, Thauera, Azospira (Dechlorosoma), Rheinheimera, Nitrosococcus, Halorhodospira, Xanthomonas, Steno- trophomonas, Pseudoxanthomonas, Rhodanobacter, Francisella, Cy- cloclasticus, Oceanospirillum, Hahella, Halomonas, Alcanivorax, Kan- giella, Pseudomonas, Azotobacter, Acinetobacter, Psychrobacter, Ali- shewanella, Alteromonas, Glaciecola, Marinobacter, Marinobacterium, Saccharophagus, Shewanella, Ferrimonas, Idiomarina, Colwellia, Pseudoalteromonas, Listonella, Vibrio, Photobacterium, Aeromonas, Oceanimonas, Salinisphaera, Legionella, Coxiella, Desulfococcus, Desulfobacterium, Desulfatibacillum, Desulfobulbus, Desulfarculus, Geo- bacter, Syntrophobacter, Syntrophus, Desulfomonile, Bdellovibrio, Bac- teriovorax, Stigmatella, Myxococcus, Anaeromyxobacter, Sorangium, Haliangium, Acidobacterium, Granulicella, Ilumatobacter, Streptospo- rangium, Nocardiopsis, Thermobifida, Thermomonospora, Pseudonocardia, Amycolatopsis, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Thermobispora, Actinosynnema, Micromonospora, Salinispora, Verru- cosispora, Nocardioides, Kribbella, Corynebacterium, Nocardia, Rho- dococcus, Gordonia, Dietzia, Mycobacterium, Amycolicicoccus, Tsu- kamurella, Segniliparus, Microbacterium, Micrococcus, Arthrobacter, Citricoccus, Renibacterium, Kocuria, Kytococcus, Cellulomonas, In-trasporangium, Serinicoccus, Frankia, Acidothermus, Nakamurella, Geodermatophilus, Stackebrandtia, Streptomyces, Catenulispora, Ru- brobacter, Conexibacter, Bacillus, Geobacillus, Oceanobacillus, Lysini- bacillus, Halobacillus, Alicyclobacillus, Kyrpidia, Paenibacillus, Lactobacillus, Carnobacterium, Clostridium, Alkaliphilus, Syntrophomonas, Syntrophothermus, Eubacterium, Desulfitobacterium, Desulfotomacu- lum, Pelotomaculum, Butyrivibrio, Roseburia, Oscillibacter, Thermoa- naerobacter, Carboxydothermus, Natranaerobius, Sphingobacterium, Pedobacter, Haliscomenobacter, Porphyromonas, Odoribacter, Spirosoma, Runella, Maribacter, Deinococcus, Thermus, Meiothermus, O- ceanithermus, Marinithermus, Gemmatimonas, Fusobacterium, Ilyo- bacter, Roseiflexus, Herpetosiphon, Thermomicrobium, Thermotoga, Thermosipho, Fervidobacterium, Deferribacter, Calditerrivibrio, Flexis- tipes, Metallosphaera, Aeropyrum, Pyrobaculum, Caldivirga, Vulcani- saeta, Acidilobus, Haloarcula, Haloquadratum, Natronomonas, Halorubrum, Haloterrigena, Natrialba, Halalkalicoccus, Halogeometricum, Thermoplasma, Picrophilus, Ferroplasma, Archaeoglobus, Ferroglo- bus, Polymorphum, Micavibrio, Simiduia, Leptothrix, Thiomonas, Ru- brivivax, Methylibium, Exiguobacterium e Anaerococcus.

[0086] Além disso, Magnetospirillum magneticum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Magnetospirillum; Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum centenum e Rhodospiril- lum photometricum são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Rhodospirillum; Azospirillum lipoferum e Azospirillum brasilense são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Azospirillum; Tistrella mobilis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Tistrel- la; Acidiphilium cryptum e Acidiphilium multivorum são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Acidiphilium; Rhodobacter sphaeroides e Rhodobacter capsulatus são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Rhodo- bacter; Paracoccus denitrificans e Paracoccus aminophilus são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Pa racoccus; Ruegeria pomeroyi é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Ruegeria; Roseobacter denitrificans e Roseobacter litoralis são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Roseobacter; Dinoroseobacter shibae é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Dinoroseobacter; Phaeobacter gallaeciensis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Phaeobacter; Octade- cabacter antarcticus e Octadecabacter arcticus são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Octadecabac- ter; Hyphomonas neptunium é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Hyphomonas; Maricaulis maris é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Ma- ricaulis; Hirschia baltica é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Hirschia; Sphingomonas paucimobilis e Sphingomonas wittichii são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Sphingomonas; Novosphingobium aro- maticivorans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Novosphingobium; Sphingopyxis alaskensis é parti-cularmente preferível como o micro-organismo classificado como S- phingopyxis; Sphingobium japonicum e Sphingobium chlorophenolicum são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Sphingobium; Erythrobacter litoralis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Erythrobacter; Brevundi- monas diminuta, Brevundimonas subvibrioides e Brevundimonas vesi- cularis são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Brevundimonas; Caulobacter crescentus e Caulobacter segnis são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Caulobacter; Phenylobacterium zucineum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Phenylo- bacterium; Asticcacaulis excentricus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Asticcacaulis; Agrobacterium tu- mefaciens, Agrobacterium radiobacter e Agrobacterium luteum são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Agrobacterium; Rhizobium leguminosarum, Rhizobium etli e Rhizobium tropici são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Rhizobium; Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium medi- cae e Sinorhizobium fredii são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Sinorhizobium; Xanthobacter agilis, Xanthobacter aminoxidans, Xanthobacter autotrophicus, Xanthobacter flavus, Xanthobacter tagetidis e Xanthobacter viscosus são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Xantho- bacter; Azorhizobium caulinodans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Azorhizobium; Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella ovis, Brucella canis, Brucella microti, Brucella pinnipedialis e Brucella ceti são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Brucella; Ochrobac- trum anthropi, Ochrobactrum cytisi, Ochrobactrum daejeonense, Oc- hrobactrum gallinifaecis, Ochrobactrum grignonense, Ochrobactrum haemophilum, Ochrobactrum intermedium, Ochrobactrum lupini, Oc- hrobactrum oryzae, Ochrobactrum pseudintermedium, Ochrobactrum pseudogrignonense, Ochrobactrum thiophenivorans e Ochrobactrum tritici são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Ochrobactrum; Mesorhizobium alhagi, Mesorhizobium albi- ziae, Mesorhizobium amorphae, Mesorhizobium australicum, Mesorhi- zobium caraganae, Mesorhizobium chacoense, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium gobiense, Mesorhizobium loti, Mesorhizobium mediter- raneum, Mesorhizobium metallidurans, Mesorhizobium opportunistum, Mesorhizobium plurifarium, Mesorhizobium huakuii, Mesorhizobium septentrionale, Mesorhizobium shangrilense, Mesorhizobium tarimen- se, Mesorhizobium temperatum, Mesorhizobium thiogangeticu e Meso- rhizobium tianshanense são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Mesorhizobium; Aurantimonas manga- noxydans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Aurantimonas; Bradyrhizobium japonicum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Bradyrhi- zobium; Agromonas oligotrophica é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Agromonas; Rhodopseudomonas palustris é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Rhodopseudomonas; Nitrobacter winogradskyi e Nitrobac- ter hamburgensis são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Nitrobacter; Methylobacterium extor- quens, Methylobacterium radiotolerans e Methylobacterium nodulans são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Methylobacterium; Rhodomicrobium vannielii é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Rhodomicrobi- um; Pelagibacterium halotolerans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Pelagibacterium; Parvibaculum la- vamentivorans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Parvibaculum; Parvularcula bermudensis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Parvu- larcula; Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia thailandensis, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia ambifaria, Burkholderia multivorans, Burkholderia cepacia, Burkholderia xenovorans, Burkholderia phymatum, Burkholderia phytofirmans, Burkholderia glumae, Burkholderia rhizoxinica, Burkhol- deria gladioli, Burkholderia phenoliruptrix e Burkholderia oklahomensis são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Burkholderia; Ralstonia solanacearum, Ralstonia pickettii e Rals- tonia eutropha são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Ralstonia; Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus taiwanensis e Cupriavidus necator são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Cupriavidus; Polynucleobacter necessarius é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Polynucleobacter; Achromobacter arsenitoxydans, Achromobacter cholinophagum, Achromobacter cyclo- clastes, Achromobacter denitrificans, Achromobacter fischeri, Achro- mobacter hartlebii, Achromobacter immobilis, Achromobacter insolitus, Achromobacter lactolyticus, Achromobacter lyticus, Achromobacter methanolophila, Achromobacter pestifer, Achromobacter piechaudii, Achromobacter ruhlandii, Achromobacter spanios, Achromobacter viscosus, Achromobacter xerosis e Achromobacter xylosoxidans são par-ticularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Achromobacter; Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Borde- tella petrii e Bordetella avium são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Bordetella; Taylorella equigenitalis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Taylorella; Comamonas acidovorans, Comamonas aquatica, Co- mamonas badia, Comamonas composti, Comamonas denitrificans, Comamonas granuli, Comamonas kerstersii, Comamonas koreensis, Comamonas nitrativorans, Comamonas odontotermites, Comamonas terrae, Comamonas terrigena, Comamonas testosteroni, Comamonas thiooxydans e Comamonas zonglianii são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Comamonas; Alicycliphilus denitrificans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Alicycliphilus; Delftia acidovorans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Delftia; Ramli- bacter tataouinensis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Ramlibacter; Rhodoferax ferrireducens é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Rhodoferax; Variovorax paradoxus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Variovorax; Polaromonas naphtha- lenivorans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Polaromonas; Acidovorax citrulli, Acidovorax ebreus e A- cidovorax avenae são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Acidovorax; Verminephrobacter eiseniae é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Verminephrobacter; Herminiimonas arsenicoxydans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Herminii- monas; Herbaspirillum seropedicae é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Herbaspirillum; Collimonas fungi- vorans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Collimonas; Chromobacterium violaceum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Chromobacterium; Laribacter hongkongensis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Laribacter; Pseudogulbenkiania fer- rooxidans é particularmente preferível como o micro-organismo classi-ficado como Pseudogulbenkiania; Nitrosomonas europaea é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Nitrosomonas; Nitrosospira multiformis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Nitrosospira; Aromatoleum aroma- ticum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Aromatoleum; Dechloromonas aromatica é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Dechloromonas; Azospira oryzae(Dechlorosoma suillum) é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Azospira (Dechlorosoma); Rheinheimera nanhaiensis é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Rheinheimera; Nitrosococcus oceani é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Nitrosococcus; Halorhodospira halophila é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Halorhodospira; Xantho- monas campestris, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas oryzae, Xanthomonas albilineans e Xanthomonas citri são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Xanthomonas; Stenotrophomonas maltophilia é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Stenotrophomonas; Pseudoxantho- monas suwonensis e Pseudoxanthomonas spadix são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Pseudoxan- thomonas; Francisella tularensis e Francisella novicida são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Franci- sella; Cycloclasticus zancles é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Cycloclasticus; Hahella chejuensis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Hahella; Halomonas elongata é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Halomonas; Alcanivorax borkumensis e Alcanivorax dieselolei são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Alcanivorax; Kangiella koreensis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Kan- giella; Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas agarici, Pseudomonas syringae, Pseudomonas amygdale e Pseudomonas stutzeri, por exemplo, são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Pseudomonas; Azotobacter vinelandii é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Azotobacter; Acinetobacter bau- mannii, Acinetobacter aylyi, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter gyllenbergii, Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacter johnsonii, Aci- netobacter junii, Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter oleivorans e Aci- netobacter parvus são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Acinetobacter; Psychrobacter arcticus e Psychrobacter cryohalolentis são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Psychrobacter; Alishewanella jeot- gali é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Alishewanella; Alteromonas macleodii é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Alteromonas; Glacieco- la nitratireducens, Glaciecola psychrophila e Glaciecola punicea são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Glaciecola; Marinobacter aquaeolei, Marinobacter hydrocarbonoclasti- cus, Marinobacter adhaerens, Marinobacter algicola e Marinobacter manganoxydans são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Marinobacter; Marinobacterium stanieri é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Marinobacterium; Saccharophagus degradans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Saccharophagus; Shewanella piezotolerans, Shewanella abyssi, Shewanella affinis, Shewanella algae, Shewanella algidipiscicola, Shewanella amazonen- sis, Shewanella aquimarina, Shewanella arctica, Shewanella atlantica, Shewanella baltica, Shewanella basaltis, Shewanella benthica, She- wanella candadensis, Shewanella chilikensis, Shewanella colwelliana, Shewanella corallii, Shewanella decolorationis, Shewanella denitrifi- cans, Shewanella donghaensis, Shewanella fidelis, Shewanella fodi- nae, Shewanella frigidimarina, Shewanella gaetbuli, Shewanella geli- dimarina, Shewanella glacialipiscicola, Shewanella gopherii, Shewanel- la hafniensis, Shewanella halifaxensis, Shewanella haliotis, Shewanel- la hanedai, Shewanella japonica, Shewanella kaireitica, Shewanella ivingstonensis, Shewanella loihica, Shewanella marina, Shewanella marinintestina, Shewanella marisflavi, Shewanella morhuae, Shewa- nella olleyana, Shewanella oneidensis, Shewanella pacifica, Shewanel- la pealeana, Shewanella pneumatophori, Shewanella profunda, She- wanella putrefaciens, Shewanella sairae, Shewanella schlegeliana, Shewanella sediminis, Shewanella surugensis, Shewanella vesiculosa, Shewanella violacea, Shewanella waksmanii, Shewanella woodyi e Shewanella xiamenensis são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Shewanella; Ferrimonas balearica é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Ferrimonas; Idiomarina loihiensis e Idiomarina baltica são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Idiomari- na; Colwellia psychrerythraea é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Colwellia; Pseudoalteromonas halo- planktis, Pseudoalteromonas atlantica e Pseudoalteromonas tunicata são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Pseudoalteromonas; Listonella anguillara, Listonella anguillarum e Listonella pelagia são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Listonella; Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio harveyi, Vibrio furnissii, Vibrio tubiashii, Vibrio si- naloensis, Vibrio rotiferianus, Vibrio orientalis, Vibrio harveyi, Vibrio co- ralliilyticus, Vibrio caribbenthicus, Vibrio brasiliensis e Vibrio alginolyti- cus são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Vibrio; Photobacterium profundum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Photobacterium; Ae- romonas hydrophila, Aeromonas salmonicida e Aeromonas veronii são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Aeromonas; Salinisphaera shabanensis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Salinisphaera; Legionella pneumophila e Legionella longbeachae são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Legionella; Coxiella burnetii é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Coxiella; Desulfococcus oleovorans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Desulfococcus; Desulfobacterium autotrophicum é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Desulfobacterium; Desulfatibacillum al- kenivorans é particularmente preferível como o micro-organismo clas- sificado como Desulfatibacillum; Desulfobulbus propionicus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Desul- fobulbus; Desulfarculus baarsii é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Desulfarculus; Geobacter metallire- ducens, Geobacter uraniireducens e Geobacter bemidjiensis são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Ge- obacter; Syntrophobacter fumaroxidans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Syntrophobacter; Syntro- phus aciditrophicus é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Syntrophus; Desulfomonile tiedjei é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como De- sulfomonile; Bdellovibrio bacteriovorus e Bdellovibrio exovorus são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Bdellovibrio; Bacteriovorax marinus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Bacteriovorax; Stigmatella auran- tiaca é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Stigmatella; Myxococcus xanthus e Myxococcus fulvus são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Myxococcus; Anaeromyxobacter dehalogenans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Anaeromyxobacter; Sorangium cellulosum é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Sorangium; Haliangium ochraceum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Haliangium; Acidobacterium capsulatum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Acidobacterium; Granuli- cella tundricola é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Granulicella; Ilumatobacter coccineum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Ilumato- bacter; Streptosporangium roseum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Streptosporangium; Nocardiopsis dassonvillei é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Nocardiopsis; Thermobifida fusca é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Thermobifida; Thermomonospora curvata é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Thermomonospora; Pseudonocardia dio- xanivorans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Pseudonocardia; Amycolatopsis mediterranei é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Amyco- latopsis; Saccharomonospora viridis e Saccharomonospora xinjian- gensis são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Saccharomonospora; Saccharopolyspora erythraea e Saccharopolyspora spinosa são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Saccharopolyspora; Thermobispo- ra bispora é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Thermobispora; Actinosynnema mirum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Actinosynnema; Micromonospora aurantiaca é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Micromonospora; Salinispora tropica e Salinispora arenicola são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Salinispora; Verrucosispora maris é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Ver- rucosispora; Kribbella flavida é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Kribbella; Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium urealyticum e Corynebacterium kroppenstedtii são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Corynebacterium; Nocardia farcinica, Nocardia brasiliensis e Nocardia cyriacigeorgica são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Nocardia; Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus equi, Rhodococcus rhodnii, Rhodococcus corallinus, Rhodococcus rubropertinctus, Rhodococcus coprophilus, Rhodococcus globerulus, Rhodococcus chlorophenolicus, Rhodococcus luteus, Rhodococcus aichiensis, Rhodococcus chubuen- sis, Rhodococcus maris e Rhodococcus fascines são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Rhodococcus; Gordonia bronchialis, Gordonia neofelifaecis e Gordonia terrae são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Gordonia; Dietzia cinnamea é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Dietzia; Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium avium, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium vanbaalenii, Mycobacterium gilvum, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium marinu, Mycobacterium massiliense, Mycobacterium phlei, Mycobacterium thermoresistibile, Mycobacterium tusciae, Mycobacterium xenopi e Mycobacterium rhodesiae são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Mycobacterium; Amy- colicicoccus subflavus é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Amycolicicoccus; Tsukamurella paurome- tabola é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Tsukamurella; Segniliparus rotundus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Segniliparus; Micro-bacterium testaceum é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Microbacterium; Micrococcus luteus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Micrococcus; Arthrobacter arilaitensis, Arthrobacter chlorophenolicus, Arthrobacter globiformis e Arthrobacter phenanthrenivorans são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Art- hrobacter; Renibacterium salmoninarum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Renibacterium; Kocuria rhizophila é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Kocuria; Kytococcus sedentarius é particularmente prefe- rível como o micro-organismo classificado como Kytococcus; Cellulo- monas fimi é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Cellulomonas; Intrasporangium calvum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Intrasporangium; Serinicoccus profundi é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Serinicoccus; Frankia alni é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Frankia; Acidothermus cellulolyticus é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Acidothermus; Nakamurella multipartita é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Nakamurella; Geodermatophilus obscurus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Geodermatophilus; Stac- kebrandtia nassauensis é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Stackebrandtia; Streptomyces albus, S- treptomyces avermitilis, Streptomyces bingchenggensis, Streptomyces chartreusis, Streptomyces clavuligerus, Streptomyces coelicoflavus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces ghanaensis, Streptomyces gri- seus, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces lividans, Streptomy- ces roseosporus, Streptomyces scabiei, Streptomyces sviceus, Strep- tomyces venezuelae, Streptomyces violaceusniger e Streptomyces vi- ridochromogenes são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Streptomyces; Catenulispora acidiphila é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Catenulispora; Rubrobacter xylanophilus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Rubrobacter; Conexibacter woesei é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Conexibacter; Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Bacillus pseudofirmus, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Bacillus; Geobacillus caldoproteolyticus, Geobacillus caldoxylosilyticus, Geobacillus debilis, Geobacillus galac- tosidasius, Geobacillus gargensis, Geobacillus jurassicus, Geobacillus kaustophilus, Geobacillus lituanicus, Geobacillus pallidus, Geobacillus stearothermophilus, Geobacillus stromboliensis, Geobacillus subterra- neus, Geobacillus tepidamans, Geobacillus thermocatenulatus, Geobacillus thermodenitrificans, Geobacillus thermoglucosidasius, Geobacillus thermoleovorans, Geobacillus toebii, Geobacillus uzensis, Geobacillus vulcani e Geobacillus zalihae são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Geobacillus; Oceanobacil- lus iheyensis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Oceanobacillus; Lysinibacillus sphaericus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Lysini- bacillus; Halobacillus halophilus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Halobacillus; Alicyclobacillus aci- docaldarius é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Alicyclobacillus; Kyrpidia tusci é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Kyrpidia; Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus mucilaginosus e Paenibacillus terrae são par-ticularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Paenibacillus; Lactobacillus buchneri é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Lactobacillus; Clostridium aceto- butylicum, Clostridium perfringens, Clostridium kluyveri, Clostridium cellulovorans, Clostridium difficile e Clostridium sticklandii são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Clostridium; Alkaliphilus metalliredigens e Alkaliphilus oremlandii são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Al- kaliphilus; Syntrophomonas wolfei é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Syntrophomonas; Syntrophother- mus lipocalidus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Syntrophothermus; Eubacterium rectale e Eubacte- rium limosum são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Eubacterium; Desulfitobacterium hafniense é parti-cularmente preferível como o micro-organismo classificado como De- sulfitobacterium; Desulfotomaculum reducens é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Desulfotomaculum; Pelotomaculum thermopropionicum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Pelotomaculum; Butyrivibrio pro- teoclasticus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Butyrivibrio; Roseburia hominis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Roseburia; Oscillibac- ter valericigenes é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Oscillibacter; Thermoanaerobacter tengcongensis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Thermoanaerobacter; Carboxydothermus hydrogenoformans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Car- boxydothermus; Natranaerobius thermophilus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Natranaerobius; S- phingobacterium multivorum, Sphingobacterium spiritivorum, Sphingo- bacterium alimentarium, Sphingobacterium anhuiense, Sphingobacte- rium antarcticum, Sphingobacterium bambusae, Sphingobacterium canadense, Sphingobacterium composti, Sphingobacterium daejeonen- se, Sphingobacterium faecium, Sphingobacterium heparinum, Sphin- gobacterium kitahiroshimense, Sphingobacterium lactis, Sphingobacte- rium mizutaii, Sphingobacterium nematocida, Sphingobacterium pisci- um, Sphingobacterium shayense, Sphingobacterium siyangense, S- phingobacterium thalpophilum e Sphingobacterium wenxiniae são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Sphingobacterium; Pedobacter steynii, Pedobacter duraquae, Pedo- bacter metabolipauper, Pedobacter hartonius, Pedobacter heparinus Pedobacter africanus, Pedobacter agri, Pedobacter alluvius e Pedo- bacter saltans são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Pedobacter; Haliscomenobacter hydrossis é particu-larmente preferível como o micro-organismo classificado como Halis- comenobacter; Porphyromonas gingivalis e Porphyromonas asaccha- rolytica são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Porphyromonas; Odoribacter splanchnicus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Odoribac- ter; Spirosoma linguale é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Spirosoma; Runella slithyformis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Runel- la; Deinococcus radiodurans, Deinococcus geothermalis, Deinococcus deserti, Deinococcus maricopensis, Deinococcus proteolyticus e Dei- nococcus gobiensis são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Deinococcus; Thermus thermophilus e Thermus scotoductus é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Thermus; Meiothermus ruber e Meio- thermus silvanus são particularmente preferíveis como o microorganismo classificado como Meiothermus; Oceanithermus profundus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Oceanithermus; Marinithermus hydrothermalis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Marinithermus; Gemmatimonas aurantiaca é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Gemmatimonas; Fusobacterium nuclea- tum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Fusobacterium; Ilyobacter polytropus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Ilyobacter; Roseiflexus castenholzii é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Roseiflexus; Herpetosiphon aurantiacus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Herpetosi- phon; Thermomicrobium roseum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Thermomicrobium; Thermotoga lettingae é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Thermotoga; Thermosipho melanesiensis e Thermosipho africanus são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Thermosipho; Fervidobacterium nodosum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Fervi- dobacterium; Deferribacter desulfuricans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Deferribacter; Calditerrivi- brio nitroreducens é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Calditerrivibrio; Flexistipes sinusarabici é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Flexistipes; Metallosphaera sedula é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Metallosphaera; Aeropyrum pernix é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Aeropyrum; Pyrobaculum aerophilum, Pyrobaculum islandicum, Pyrobaculum calidifontis e Pyrobaculum neutrophilum são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Pyrobaculum; Caldivirga maquilingensis é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Caldivirga; Vulcanisaeta distributa é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Vulcanisaeta; Acidilobus saccharovorans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Acidilobus; Haloarcula marismortui é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Haloarcula; Haloquadratum walsbyi é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Haloquadratum; Natronomonas pharaonis é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Natronomonas; Halorubrum lacusprofun- di é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Halorubrum; Haloterrigena turkmenica é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Haloterrigena; Natrialba magadii é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Natrialba; Halalkalicoccus jeotgali é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Halalkalicoccus; Ha- logeometricum borinquense é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Halogeometricum; Thermoplasma acidophilum e Thermoplasma volcanium são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Thermoplasma; Picrophilus torridus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Picrophilus; Ferroplasma acidarmanus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Ferroplasma; Archaeoglobus fulgidus e Archaeoglobus veneficus são particularmente preferíveis como o micro-organismo classificado como Archaeoglo- bus; Ferroglobus placidus é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Ferroglobus; Polymorphum gilvum é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Polymorphum; Micavibrio aeruginosavorus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Micavibrio; Simiduia agari- vorans é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Simiduia; Leptothrix cholodnii é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Leptothrix; Thiomonas intermedia é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Thiomonas; Rubrivivax gelatinosus é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Rubrivivax; Methylibi- um petroleiphilum é particularmente preferível como o microorganismo classificado como Methylibium; e Anaerococcus prevotii é particularmente preferível como o micro-organismo classificado como Anaerococcus.

[0087] Os micro-organismos exemplificados neste documento são obteníveis da American Type Culture Collection (ATCC), National Institute of Technology and Evaluation, Biotechnology Division, Biological Resource Center (NBRC), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depository (FERM), ou similar.

Processo de Síntese do Éster de Ácido Metacrílico

[0088] A produção de éster de ácido metacrílico pode ser efetuada pelo método a seguir. Uma solução foi preparada adicionando-se álcool ou fenol representado pela Fórmula 2 e metacrilil-CoA a um solvente, e então deixando-se dissolver ou suspender. Então, a AAT é colocada em contato com esta solução ou suspensão, e a metacrilil- CoA e o álcool ou o fenol são deixados reagir, ao mesmo tempo controlando-se as condições, tais como a temperatura. Por meio da reação, um grupo metacrílico da metacrilil-CoA é transferido para o álcool ou o fenol de Fórmula 2, com isso fazendo com que o éster de ácido metacrílico seja formado.

[0089] A solução contendo a metacrilil-CoA e o álcool ou o fenol representado pela Fórmula 2 é normalmente preparada em um meio aquoso, tal como uma solução de tampão. Neste documento, para fazer com que a reação progrida suavemente, é possível controlar a concentração osmolar e/ou a concentração iônica por meio de um regulador da pressão osmótica ou similar. Como o regulador da pressão osmótica, é suficiente se uma substância solúvel em água adicionada com o objetivo de ajustar a pressão osmótica da solução, tal como o lado de dentro da célula, de modo a tornar isotônica ou hipertônica e, por exemplo, é um sal ou sacarídeo, e preferivelmente um sal. O sal é preferivelmente um sal metálico, mais preferivelmente um sal de metal alcalino, ainda mais preferivelmente um halogeneto de metal alcalino e, por exemplo, podem ser exemplificados o cloreto de sódio e o cloreto de potássio. O sacarídeo é preferivelmente um monossacarídeo ou oligossacarídeo, mais preferivelmente um monossacarídeo ou dissaca- rídeo e, por exemplo, podem ser exemplificados a glicose, a sacarose, o manitol e similar. O regulador da pressão osmótica é preferivelmente adicionado em uma concentração de pelo menos 1 mM, e é particularmente preferível regular de modo a tornar isotônica ou hipertônica em comparação com uma solução dentro da célula biológica usada.

[0090] Além disso, com o objetivo de separar o éster de ácido me- tacrílico assim formado, pode ser adicionado um solvente orgânico antecipadamente para fazer reagir em um sistema de duas fases. Como o solvente orgânico, por exemplo, podem ser usados, individualmente ou por mistura de dois ou mais tipos, um hidrocarboneto alifático saturado ou insaturado, linear, ramificado ou cíclico, um hidrocarboneto aromático saturado ou insaturado, ou similar. Mais especificamente, por exemplo, podem ser exemplificados solventes de hidrocarbonetos (p.ex., pentano, hexano, ciclo-hexano, benzeno, tolueno, xileno, etc.), solventes de hidrocarbonetos halogenados (p.ex., cloreto de metileno, clorofórmio, etc.), solventes de éteres (p.ex., éter dietílico, éter dipropí- lico, éter dibutílico, éter terc-butilmetílico, dimetoxietano, etc.), solven-tes de ésteres (p.ex., formato de metila, acetato de metila, acetato de etila, acetato de butila, propionato de metila), e similares. Por adição destes solventes orgânicos, o éster de ácido metacrílico formado migrará para a fase orgânica, e a reação pode progredir eficientemente.

[0091] As razões e as concentrações molares da metacrilil-CoA e do álcool ou fenol representado pela Fórmula 2 na solução de reação são arbitrárias, e não estão particularmente limitadas. Além disso, a quantidade de AAT usada ou as condições de reação são determinadas conforme apropriado, de acordo com as matérias-primas usadas. Normalmente, a concentração de cada matéria-prima é ajustada para a faixa de 0,0000001 a 10% em massa no caso da metacrilil-CoA, e o álcool ou o fenol é adicionado em uma concentração de 0,1 a 1000 vezes por moles, preferivelmente 0,5 a 50 vezes por moles, em relação à metacrilil-CoA usada.

[0092] As diversas outras condições, tais como a temperatura de reação ou o tempo de reação, são determinadas conforme apropriado, de acordo com as matérias-primas usadas, a atividade da enzima, etc., e não estão particularmente limitadas; entretanto, é suficiente normalmente se deixado reagir a 5 a 80°C por 1 hora a 1 semana. A 10 a 70°C, é preferivelmente por 1 a 120 horas, mai s preferivelmente pelo menos 3 horas, e 4 ou mais horas é ainda mais preferível. É preferível selecionar as condições pelas quais a reação se completa em tais condições. O pH da solução de reação não está particularmente limitado, desde que a reação eficientemente progrida; entretanto, por exemplo, ele é uma faixa de pH 4 a 10, e preferivelmente pH 5,5 a 8,5.

[0093] Como condições ideais para fazer com que o éster de ácido metacrílico colete em pelo menos 0,001 mM, preparar de modo que a concentração de metacrilil-CoA sob a condição de pH 5,5 a 7,5 esteja na faixa de 0,000001 a 1% em massa direta ou indiretamente, e o álcool ou o fenol seja ajustado para uma concentração de modo a ser 1 a 50 vezes por moles em relação à metacrilil-CoA usada. Então, a temperatura é ajustada para a faixa de 20 a 40°C, e a reação é deixada por pelo menos 3 horas. É também possível suprir continuamente estas matérias-primas (substrato) de modo a estar nas faixas anteriormente mencionadas, e a concentração de acúmulo de produto pode ser aumentada fazendo isso.

[0094] A condução da presente reação sob condições de pressão reduzida ou aeração é também efetiva. É porque, sob estas condições, o éster de ácido metacrílico assim formado pode ser continuamente separado, cujo resultado é que a reação pode progredir eficientemente.

[0095] No caso de produzir o éster de ácido metacrílico usando a metacrilil-CoA transformada por ação da ACD com a isobutiril-CoA como a matéria-prima ou a metacrilil-CoA transformada por ação da ECH a partir da 3-hidróxi-isobutiril-CoA, é preferível implementar ajustando-se de modo a estar na faixa destas condições. Deve ser observado que a reação de síntese da metacrilil-CoA a partir da ACD ou da ECH pode ser conduzida por um método conhecido (por exemplo, como as condições de reação para a ACD, as condições descritas em Microbiology (1999), 145, págs. 2323-2334). Por combinação com também outra reação biológica, torna-se possível a reação contínua (produção fermentativa) dentro de um organismo para o éster de ácido metacrílico.

[0096] O éster de ácido metacrílico formado pelo método da presente invenção pode ser qualitativa ou quantitativamente analisado por meio de cromatografia gasosa (GC), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), ou similar, conforme necessário.

[0097] O isolamento do éster de ácido metacrílico da solução de reação pode ser efetuado por um método de purificação conhecido individual ou uma combinação de métodos de purificação conhecidos, tais como destilação, destilação em filme fino, extração com solvente e separação por coluna. Além disso, o éster de ácido metacrílico obtido pode polimerizar por um método típico, e usado sem inferioridade nos usos convencionais.

[0098] O éster de ácido metacrílico obtido neste modo ou o seu polímero pode reduzir extraordinariamente a energia, os recursos e a carga sobre o ambiente, e tem um valor social extremamente grande como um material de carga ambiental baixa, comparado às substâncias químicas convencionais com produtos de petróleo como materiais de partida.

2. Método para Produzir o Éster de Ácido Metacrílico a partir de Precursor por Micro-organismo Geneticamente Modificado

[0099] Micro-organismo recombinante tendo capacidade de formar o éster de ácido metacrílico a partir de precursor

[00100] Conforme mencionado no precedente, com a presente invenção, também é possível sintetizar o éster de ácido metacrílico a partir de um precursor, tal como a isobutiril-CoA, a 3-hidróxi-isobutiril- CoA ou o ácido 2-isovalérico, por introdução do gene para ACD, do gene para ECH, do gene para BCKAD ou similar, conforme necessário, em um micro-organismo no qual o gene para AAT tenha sido introduzido.

[00101] O "precursor" indica um composto que é induzível para me- tacrilil-CoA, e indica a isobutiril-CoA ou a 3-hidróxi-isobutiril-CoA e, além disso, a matéria de uma substância induzível para estes dois compostos. Como a substância induzível para dois compostos, por exemplo, podem ser exemplificados os ácidos, tais como o ácido 2- oxoisovalérico, o ácido isobutírico, o ácido 3-hidróxi isobutírico, o ácido acético, o ácido pirúvico, o ácido láctico, o ácido acetoacético, o ácido butírico, o ácido propiônico, o ácido málico, o ácido fumárico, o ácido cítrico e o ácido succínico; os aminoácidos, tais como a valina, a alani- na, a leucina, a lisina e o ácido glutâmico; e os sacarídeos, tais como a glicose, a frutose e a xilose.

[00102] Para fazer com que o éster de ácido metacrílico se forme a partir destes precursores, também é possível utilizar diversas vias metabólicas naturalmente possuídas pelo micro-organismo hospedeiro. Os genes podem ser introduzidos ou tornados deficientes, conforme necessário.

(1) Micro-organismo Hospedeiro

[00103] Como o micro-organismo hospedeiro, ele não está particularmente limitado, desde que seja um hospedeiro tendo enzimas para formar a metacrilil-CoA a partir do precursor e capacidade de expressão da AAT; entretanto, concernente à bactéria, podem ser exemplificados Rhodococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, etc., concernente à levedura, Saccharomy- ces, Candida, Shizosaccharomyces e Pichia, e concernente ao fungo filamentoso, pode ser exemplificado Aspergillus, etc..

[00104] Um micro-organismo do gênero Rhodococcus é preferível como o hospedeiro. A razão disso é por causa das informações obtidas confirmando-se experimentalmente no curso da presente invenção que um micro-organismo do gênero Rhodococcus tem semelhança à valina, e verificando-se que, por utilização desta função, é possível aplicar a formação do éster de ácido metacrílico pela rota mostrada na FIG. 2.

[00105] Por exemplo, um tipo selecionado a partir dos microorganismos que se seguem pode ser usado individualmente, ou por combinação de dois ou mais tipos. Como micro-organismos classificados como Rhodococcus sp., por exemplo, podem ser exemplificados Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus equi, Rhodococcus rhodnii, Rhodococcus corallinus, Rhodococcus ru- bropertinctus, Rhodococcus coprophilus, Rhodococcus globerulus, Rhodococcus chlorophenolicus, Rhodococcus luteus, Rhodococcus aichiensis, Rhodococcus chubuensis, Rhodococcus maris, Rhodococ- cus fascines e similares.

[00106] Como um exemplo preferido, pode ser exemplificado o Rhodococcus erythropolis. Como cepas mais preferidas, pode ser exemplificada a cepa de Rhodococcus erythropolis PR-4, a cepa de Rhodococcus erythropolis KA2-5-1, a cepa de Rhodococcus erythropo- lis IGTS8, a cepa de Rhodococcus erythropolis D-1, a cepa de Rhodo- coccus erythropolis H-2, a cepa de Rhodococcus erythropolis N1-36, a cepa de Rhodococcus erythropolis I-19, a cepa de Rhodococcus eryt- hropolis ECRD-1, a cepa de Rhodococcus erythropolis B1, a cepa de Rhodococcus erythropolis SY-1, a cepa de Rhodococcus erythropolis UM3, a cepa de Rhodococcus erythropolis UM9, a cepa de Rhodococ- cus equi T09, ou similar, e particular e preferivelmente, pode ser e- xemplificada a cepa de Rhodococcus erythropolis PR-4. Além disso, os derivados destas cepas estão incluídos.

[00107] Como derivados, estão incluídas as cepas variantes obtidas por indução da mutação do gene em um micro-organismo que tenha a capacidade de formação de metacrilil-CoA, por meio de uma alteração nas condições de cultura (p.ex., composição do meio, temperatura, etc.), tratamento químico ou físico (p.ex., radiação y, etc.), cepas geneticamente modificadas para as quais a atividade tenha sido aumentada no modo a seguir, ou a atividade tenha sido tornada deficiente ou reduzida.

[00108] O aumento da atividade indica o nível de expressão do gene para a enzima (independente da origem) que aumenta no microorganismo com base no gene introduzido do lado de fora da célula bacteriana no micro-organismo e, além da introdução dos genes que codificam enzimas a partir do lado de fora da célula bacteriana do micro-organismo até o lado de dentro da célula bacteriana, inclui aumentar a atividade da enzima como resultado de fazer com que o gene para a enzima seja altamente expresso por aumento da atividade do promotor do gene para a enzima retido sobre o genoma pelo micro-organismo, ou substituir com outro promotor, ou alternativamente, reduzir ou inativar a atividade de repressor do gene para a enzima.

[00109] A cepa geneticamente modificada pode ser uma cepa modificada obtida efetuando-se modificação genética que faz com que a atividade da enzima que inibe a reação de síntese da metacrilil-CoA seja nocauteada ou diminuída. A atividade "deficiente" ou "diminuída" indica a expressão do gene para a enzima sendo inteiramente perdida ou reduzida neste micro-organismo e, além da substituição, remoção ou inserção que ocorre para este gene para a enzima, inclui diminuir a atividade da enzima como resultado de suprimir a expressão do gene para a enzima por diminuição da atividade do promotor de um gene para a enzima retido sobre o genoma pelo micro-organismo ou substituição por outro promotor, ou alternativamente, aumento ou ativação da atividade de repressor deste gene para a enzima. Deve ser observado que estas modificações genéticas podem ser efetuadas seguindo um método convencional.

[00110] Como uma cepa modificada preferida no caso de conduzir a produção do éster de ácido metacrílico pela rota mostrada na FIG. 2, pode ser exemplificada uma cepa modificada tendo pelo menos uma característica de (a) ou (b) mostrada abaixo. (a) A atividade de formação da metacrilil-CoA está sendo aumentada pelo gene para BCKAD e/ou gene para ACD que é introduzido. (b) A atividade de formação da metacrilil-CoA está sendo aumentada por nocaute ou inativação do gene para ECH, do gene para 3-hidróxi isobutiril-CoA e/ou do gene para ácido 3-hidróxi isobutírico desidrogenase. O nocaute ou a desativação é efetuada substituindo, removendo ou inserindo uma totalidade do gene ou parte da sequência de nucleotídeos.

(2) Gene Inserido

[00111] Torna-se necessário introduzir genes respectivos de enzimas para a formação da metacrilil-CoA a partir do precursor e do gene para AAT, conforme necessário para o hospedeiro. Diversas enzimas naturalmente possuídas pelo micro-organismo hospedeiro podem ser utilizadas no estado em que se encontram. Alternativamente, também é possível aumentar a atividade por meio de introdução do gene, conforme necessário.

[00112] De acordo com o hospedeiro e a rota de síntese, a enzima para formar a metacrilil-CoA a partir do precursor é selecionada conforme apropriado ou otimizado, e não está particularmente limitada; entretanto, a seguir, os genes para as enzimas necessários para a formação do éster de ácido metacrílico pela rota mostrada na FIG. 2 serão descritos em detalhe, usando um micro-organismo do gênero Rhodococcus como o hospedeiro.

(2-1) Álcool Aciltransferase (AAT)

[00113] A AAT usada na presente invenção não está particularmente limitada, desde que tenha a capacidade de produzir o éster de ácido metacrílico com a metacrilil-CoA e o álcool ou o fenol como matérias- primas, e o seu tipo e origem não são de preocupação. Uma de origem de planta é preferível como a fonte de enzima, e como suas fontes representativas, podem ser exemplificadas aquelas que se originam de qualquer ordem selecionada a partir do grupo que consiste em Zingiberales, Rosales, Ericales, Cucurbitales, Brassicales e Laurales anteriormente mencionadas.

(2-2) Acil-CoA Desidrogenase (ACD)

[00114] A ACD usada na presente invenção não está particularmente limitada, desde que tenha a capacidade de formar a metacrilil-CoA a partir da acil-CoA, e a sua fonte e tipo não são de preocupação. Aquelas derivadas de micro-organismo são preferíveis, e as representativas são como mostradas antes.

[00115] Mais preferivelmente, ela é derivada de Rhodococcus eryt- hropolis, e como cepas preferidas, pode ser exemplificada a cepa de Rhodococcus erythropolis PR-4, a cepa de Rhodococcus erythropolis KA2-5-1, a cepa de Rhodococcus erythropolis IGTS8, a cepa de Rho- dococcus erythropolis D-1, a cepa de Rhodococcus erythropolis H-2, a cepa de Rhodococcus erythropolis N1-36, a cepa de Rhodococcus erythropolis I-19, a cepa de Rhodococcus erythropolis ECRD-1, a cepa de Rhodococcus erythropolis B1, a cepa de Rhodococcus erythropolis SY-1, a cepa de Rhodococcus erythropolis UM3, a cepa de Rhodococ- cus erythropolis UM9, a cepa de Rhodococcus equi T09, ou similar, e particular e preferivelmente, pode ser exemplificada a cepa de Rhodo- coccus erythropolis PR-4.

[00116] A sequência de nucleotídeos do gene para ACD derivado da cepa de Rhodococcus erythropolis PR-4 é mostrada na SEQ ID NO. 33, e a sequência de aminoácidos codificada por esta sequência de nucleotídeos é mostrada na SEQ ID NO. 32. Deve ser observado que estão incluídas as sequências de aminoácidos nas quais tenha sido substituído, removido ou adicionado um ou uma pluralidade ami- noácidos na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 32, e os genes que codificam as proteínas tendo atividade para formar a metacrilil-CoA a partir da acil-CoA também estão incluídos no gene para ACD da presente invenção. Além disso, no gene para ACD da presente invenção, estão também incluídos os genes que codificam as proteínas tendo atividade para produzir o éster de ácido metacrílico a partir da acil-CoA expressando pelo menos 90% de identidade com a proteína que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO. 32, preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99,5%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 99,9%.

[00117] Ademais, no gene para ACD da presente invenção, estão também incluídos os genes que hibridizam sob condições severas para um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO. 33, e que codificam as proteínas tendo atividade para formar o éster de ácido metacrílico a partir da acil-CoA. Além disso, no gene para ACD da presente invenção, quando se calcula usando a sequência de nucleotí- deos mostrada na SEQ ID NO. 33, BLAST, etc. (p.ex., default, i.e., ajuste inicial, parâmetros), estão também incluídos os genes que codificam proteínas tendo atividade para formar o éster de ácido metacrílico a partir de acil-CoA e álcool, consistindo em uma sequência de nucleo- tídeos tendo identidade de pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e mais preferivelmente ainda pelo menos 95%. Ademais, os códons dos genes para ACD acima mencionados podem ser alterados de acordo com a frequência de uso dos códons no microorganismo usado na transformação.

[00118] O DNA que codifica o gene para AAT e/ou o gene para ACD acima mencionados é introduzido em um micro-organismo que pertence à Rhodococcus sp., e usado para efetuar a transcri- ção/tradução nas proteínas neste micro-organismo. O DNA introduzido neste micro-organismo está preferivelmente na forma incorporada em um vetor.

(3) Preparação do Micro-organismo Recombinante

[00119] O DNA que codifica o gene para AAT e/ou o gene para ACD acima mencionados é introduzido no micro-organismo hospedeiro, e usado para efetuar a transcrição/tradução nas proteínas neste micro-organismo. O DNA introduzido neste micro-organismo está preferivelmente na forma incorporada em um vetor. Em outras palavras, cada gene é incorporado em um vetor de expressão que pode ser expresso pela célula hospedeira, e este é introduzido na célula hospedeira.

[00120] O vetor não está particularmente limitado, desde que seja replicável autonomamente na célula hospedeira, e retenha o gene para AAT e/ou o gene para ACD, e é possível usar vetores adequados para os respectivos micro-organismos. Como o vetor para introduzir o DNA no micro-organismo que pertence à Rhodococcus sp., por exemplo, é possível usar vetores bastante conhecidos, tais como pK1, pK2, pK3 e pK4, bem como pSJ034 (referir-se ao Pedido de Patente Não Examinado Japonês, Publicação No. H10-337185), pSJ023 e pSJ002 (referir-se ao Pedido de Patente Não Examinado Japonês, Publicação No. H10-24867), e pSJ201 e pLK005 (não limitados a estes). O pSJ023 está depositado no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depository, como o trans- formante Rhodococcus rhodochrous ATCC12674/pSJ023 (FERMBP- 6232).

[00121] A inserção do gene para AAT e/ou do gene para ACD acima mencionados no vetor pode ser realizada usando a tecnologia de recombinação de gene, conhecida para aqueles versados na técnica. Por exemplo, é possível utilizar um método que use a clivagem e a ligação com enzimas de restrição, um método que use a topoisomerase, um Kit In Fusion (Takara Bio), e similar. O gene inserido no vetor é inserido sucessivamente à jusante de um promotor capaz de regular a transcrição/tradução das proteínas codificadas pelos respectivos genes no organismo hospedeiro. Além disso, se necessário, pode ser adicionado um ligador apropriado com a inserção. Ademais, conforme necessário, pode ser ligada uma sequência terminadora, uma sequência reforçadora, uma sequência de sinal de remoção, uma sequência de sinal de adição de poliA, uma sequência de ligação ao ribossomo, tal como a sequência SD ou a sequência Kozak, um gene marcador de seleção, etc., utilizáveis no organismo hospedeiro no qual os genes estão tentando ser introduzidos. Como um exemplo do gene marcador de seleção, além dos genes resistentes a fármacos, tais como o gene resistente à ampicilina, o gene resistente à tetraciclina, o gene resistente à neomicina, o gene resistente à canamicina e o gene resistente ao cloranfenicol, podem ser exemplificados os genes que conferem a biossíntese intracelular de nutrientes, tais como os aminoácidos e os ácidos nucleicos, ou os genes que codificam proteínas fluorescentes, tais como a luciferase. Acompanhando a inserção, pode ser substituída uma parte da sequência de aminoácidos codificada pelo DNA.

[00122] A partir do ponto acima mencionado, é particularmente preferível usar o pLK005 obtido efetuando-se um tratamento de variação sobre o pK4 como o vetor. O gene para AAT ou o gene para ACD é ligado/inserido de modo a estar disposto à jusante de 3' do promotor de pLK005, e um vetor de plasmídio de expressão que expressa o gene para AAT e/ou o gene para ACD pode ser construído pelo promotor.

[00123] No vetor, pode ser inserido qualquer gene selecionado a partir do aglomerado de genes para AAT ou do aglomerado de genes para ACD, e pode ser inserida uma pluralidade de genes. No caso de um gene inserido em um vetor sendo usado, a "pluralidade pode ser inserir 2 a 5, 2 a 4, e preferivelmente 2 ou 3 genes. Além disso, no caso de uma pluralidade de genes sendo inseridos em um vetor, estes genes preferivelmente formam um operon. Neste documento, o "ope- ron" é uma unidade de sequência de ácidos nucleicos constituída de um ou mais genes transcritos sob o controle do mesmo promotor.

[00124] Os genes acima mencionados, e preferivelmente os genes na forma de um vetor, são inseridos no micro-organismo hospedeiro por um método conhecido para aqueles versados na técnica. O método de introdução do vetor recombinante no organismo hospedeiro não está particularmente limitado, desde que seja um método adequado para o micro-organismo hospedeiro e, por exemplo, podem ser exemplificados o método de eletroporação, o método de esferoplasto, o método de acetato de lítio, o método de fosfato de cálcio, o método de lipofecção, o método de transferência por conjugação e similares.

Método para produzir o éster de ácido metacrílico

[00125] O micro-organismo recombinante no qual os genes requeridos, tais como o gene para AAT e/ou o gene para ACD, são introduzidos é colocado em contato com o precursor, para produzir o éster de ácido metacrílico. Neste documento, o "contato" indica tratar por exposição durante um tempo fixo o micro-organismo e uma substância (precursor). Mais especificamente, o micro-organismo é cultivado em um meio aquoso contendo o precursor (matéria-prima), etc., ou uma cultura do micro-organismo é adicionada ao meio aquoso contendo a matéria-prima, e suspenso/misturado, para obter o éster de ácido me- tacrílico no meio aquoso e/ou na fase de gás. Ao fazer desse modo, não é de nenhuma preocupação se houver proliferação do microorganismo. Neste processo, é obtida uma mistura contendo o microorganismo recombinante, e o éster de ácido metacrílico.

[00126] O "meio aquoso" indica a água ou uma solução aquosa com a água como o componente determinante, e também inclui aqueles nos quais líquido/sólido não dissolvidos estão dispersos. A "fase de gás" refere-se a uma parte ocupada por gás, vapor d'água, etc., excluindo uma parte ocupada por líquido (meio de cultura, etc.) no tanque de cultura (vaso que cultiva o micro-organismo) ou no reator (vaso que efetua a reação). A "cultura" indica aquilo obtido por meio de um cultivo de células bacterianas, caldo, extrato não celular, membrana celular, ou similar.

(1) Produção de éster de ácido metacrílico a partir do cultivo

[00127] Na presente invenção, a produção do éster de ácido meta- crílico é efetuada fazendo com que o éster de ácido metacrílico seja formado e se acumule nas células bacterianas de cultivo ou na cultura por cultivo do micro-organismo com gene no qual o gene para AAT tenha sido introduzido em um meio aquoso contendo o precursor, e recuperando o éster de ácido metacrílico a partir da célula bacteriana de cultura, da cultura ou da fase de gás do vaso de cultura.

[00128] O meio de cultura usado no cultivo do micro-organismo é um meio sólido ou um meio líquido que permita a proliferação suficiente, que contém nutrientes pelo menos incluindo diversas fontes de carbono. No caso do precursor sendo utilizável como a fonte de carbono, ele pode ser usado como a fonte de carbono.

[00129] A concentração de fonte de carbono ou precursor no meio de cultura não está particularmente limitada, desde que permita a pro- dução do éster de ácido metacrílico. A concentração, por exemplo, é ajustada para 0,05 a 20 (p/v)%, preferivelmente 0,1 a 15 (p/v)%, e mais preferivelmente 0,2 a 10 (p/v)%. Pelo menos 0,2 (p/v)% é usado porque a produtividade de ácido metacrílico dos micro-organismos aumenta, e é ajustada para não mais do que 10 (p/v)% porque uma melhora expressiva no efeito não é reconhecida, mesmo se aumentar para mais do que isto.

[00130] Na produção do éster de ácido metacrílico por cultivo, o álcool ou o fenol é adicionado, dependendo do éster de ácido metacríli- co alvo. O álcool ou o fenol usado é preferivelmente um mostrado pela Fórmula 2.

[00131] A concentração de álcool ou fenol no meio de cultura não está particularmente limitada, desde que permita que o éster de ácido metacrílico seja produzido. A concentração, por exemplo, é ajustada para 0,01 a 20 (p/v)%, preferivelmente 0,05 a 10 (p/v)%, e mais preferivelmente 0,1 a 5 (p/v)%. Além disso, estes podem ser adicionados ao meio de cultura antecipadamente, ou podem ser adicionados contínua ou intermitentemente por divisão em duas ou mais ocorrências, ao mesmo tempo efetuando-se o cultivo.

[00132] No meio de cultura, podem ser adicionadas fontes de nitrogênio inorgânico, sais de metais inorgânicos ou similares. Como as fontes de nitrogênio inorgânico, por exemplo, podem ser usados os ácidos inorgânicos ou os ácidos orgânicos de sais de amônio, tais como o cloreto de amônio, o sulfato de amônio, o acetato de amônio e o fosfato de amônio, e similares.

[00133] A concentração da fonte de nitrogênio no meio de cultura não está particularmente limitada, desde que permita que o éster de ácido metacrílico seja produzido. A concentração, por exemplo, é ajustada para 0,01 a 10 (p/v)%, preferivelmente 0,05 a 8 (p/v)%, e mais preferivelmente 0,1 a 4 (p/v)%.

[00134] Como sais de metais inorgânicos, podem ser usados o di- hidrogeno fosfato de potássio, o monofosfato de potássio, o fosfato de magnésio, o sulfato de magnésio, o cloreto de sódio, o sulfato ferroso, o sulfato de manganês, o sulfato de cobre, o carbonato de cálcio, etc..

[00135] A concentração dos sais inorgânicos no meio de cultura não está particularmente limitada, desde que permita que o éster de ácido metacrílico seja produzido. A concentração, por exemplo, é ajustada para 0,001 a 1,6 (p/v)%, preferivelmente 0,005 a 1,3 (p/v)%, e mais preferivelmente 0,01 a 1 (p/v)%. Pelo menos 0,1 (p/v)% é usado porque a produtividade de ácido metacrílico dos micro-organismos aumenta, e é ajustado para não mais do que 1 (p/v)% porque uma melhora expressiva no efeito não é reconhecida, mesmo se adicionar mais do que isto.

[00136] Adicionalmente, micrometais, vitaminas, etc. são adicionados, conforme necessários, ao meio de cultura. Além disso, diversas substâncias orgânicas, substâncias inorgânicas, tensoativo, agente desespumante comumente usado, etc., necessários na geração do micro-organismo, podem ser adicionalmente adicionados ao meio de cultura, conforme necessários.

[00137] A semeadura do micro-organismo geneticamente modificado no meio de cultura pode ser realizada por uma técnica conhecida, convencional. O método de cultura também não está particularmente limitado, e é possível usar uma técnica conhecida, tal como a cultura sob agitação, a cultura aerada e agitada, e a cultura estática.

[00138] As condições de cultivo não estão particularmente limitadas, desde que o organismo geneticamente modificado gere e forme o éster de ácido metacrílico. O cultivo pode ser efetuado sob condições aeróbicas ou pode ser realizado sob condições anaeróbicas.

[00139] O pH, a temperatura e o tempo de cultivo não estão particularmente limitados, desde que as condições permitam que o micro- organismo geneticamente modificado gere e forme o éster de ácido metacrílico. O pH é preferivelmente ajustado para 3 a 10, mais preferivelmente 4 a 9, e ainda mais preferivelmente 5 a 8. A temperatura é preferivelmente ajustada para 10 a 45°C, mais prefe rivelmente 15 a 40°C, e ainda mais preferivelmente 20 a 35°C. O tem po de cultivo é preferivelmente 10 a 1000 horas, mais preferivelmente 15 a 480 horas, e ainda mais preferivelmente 20 a 240 horas.

[00140] Estas condições de cultivo são apropriadamente selecionadas ou otimizadas para cada cepa, de modo a maximizar a razão do rendimento de éster de ácido metacrílico em relação à quantidade utilizada de fonte de carbono ou precursor. Deve ser observado que o rendimento de éster de ácido metacrílico pode ser ajustado ajustando- se apropriadamente a quantidade de fonte de carbono e as condições de cultivo.

[00141] Como condições ideais para fazer com que o éster de ácido metacrílico se acumule em pelo menos 0,001 mM, sob uma condição de pH de 5,5 a 7,5, a concentração de fonte de carbono ou precursor no meio de cultura é direta ou indiretamente mantida em pelo menos 0,1%, a concentração de álcool ou fenóis é direta ou indiretamente mantida em pelo menos 0,1%, a temperatura é ajustada para a faixa de 20 a 40°C, e se deixa reagir por pelo menos 3 ho ras. Ademais, é preferível para obter uma produtividade eficiente manter um estado no qual a concentração de micro-organismo na solução de cultura seja alta, em uma faixa na qual o meio da solução de cultura não se torne inapropriado para a proliferação do micro-organismo ou das células cultivadas e a razão de células que morrem não aumente e, por exemplo, mantendo-se em pelo menos 2 g/L como um peso seco, obtém-se uma eficiência de produção favorável, e a concentração de acúmulo de produção pode ser elevada.

(2) Produção de éster de ácido metacrílico a partir da reação do micro- organismo em repouso

[00142] Com o método para produzir éster de ácido metacrílico de acordo com a presente invenção, o método a seguir pode ser empregado, além do método por cultivo do micro-organismo geneticamente modificado, conforme descrito acima. O micro-organismo geneticamente modificado não necessita ter atividade reprodutiva, e uma cultura pré-cultivada pode ser colocada em contato com um meio aquoso contendo o precursor, para produzir o éster de ácido metacrílico, por reação do micro-organismo em repouso não acompanhada por proliferação substancial.

[00143] A concentração do precursor usado na reação do microorganismo em repouso pode ser a mesma que o caso acima mencionado de produção de éster de ácido metacrílico a partir do cultivo. O álcool ou o fenol usado na reação do micro-organismo em repouso e a sua concentração podem ser os mesmos como o caso acima mencionado de produção do éster de ácido metacrílico por cultivo.

[00144] Os sais de metais inorgânicos, etc. podem ser adicionados à solução de reação. Como sais de metais inorgânicos, por exemplo, podem ser usados o di-hidrogeno fosfato de potássio, o monofosfato de potássio, o fosfato de magnésio, o sulfato de magnésio, o cloreto de sódio, o sulfato ferroso, o sulfato de manganês, o sulfato de cobre, o carbonato de cálcio etc..

[00145] A concentração de sais inorgânicos na solução de reação não está particularmente limitada, desde que permita que o éster de ácido metacrílico seja produzido. A concentração, por exemplo, é ajustada para 0,0001 a 2 (p/v)%, preferivelmente 0,0003 a 1,3 (p/v)%, e mais preferivelmente 0,001 a 1 (p/v)%.

[00146] Adicionalmente, micrometais, vitaminas, etc. são adicionados, conforme necessários, à solução de reação. Além disso, diversas substâncias orgânicas, substâncias inorgânicas, tensoativo, agente desespumante comumente usado, etc., necessários na reação, podem ser adicionalmente adicionados à solução de reação, conforme necessários.

[00147] Na reação do micro-organismo em repouso, a solução de cultura do micro-organismo geneticamente modificado, pré-cultivado, é usada no estado em que se encontra, ou são usadas células bacteria- nas recuperadas por filtragem, centrifugação ou similar. A cultura recuperada é suspensa novamente em uma solução de tampão apropriada ou similar e pode ser usada por estabelecimento em qualquer concentração de bactéria. Para a solução de tampão ou similar, é usada uma solução de salina normal, solução de tampão de fosfato de potássio, solução de tampão de ácido tris-clorídrico, solução de tampão de glicina-hidróxido de sódio, solução de tampão de ácido bórico- hidróxido de sódio, ou similar.

[00148] Além disso, na reação do micro-organismo em repouso, o produto processado da cultura recuperada (p.ex., homogeneizado, enzima bruta, enzima purificada, etc.) pode também ser usado. Além disso, ele pode ser fixado em um veículo apropriado por um método conhecido, e este produto de fixação pode ser usado na reação.

[00149] As condições de reação não estão particularmente limitadas, desde que se forme o éster de ácido metacrílico. A reação pode ser realizada sob condições aeróbicas ou pode ser realizada sob condições anaeróbicas. O método de reação não está também particularmente limitado, e pode ser usada uma técnica bem conhecida, tal como a reação sob agitação, a reação aerada e agitada, e a reação estática.

[00150] O pH, a temperatura e o tempo de reação não estão particularmente limitados, desde que sejam condições que possam formar o éster de ácido metacrílico. O pH é preferivelmente ajustado em 3 a 10, mais preferivelmente 4 a 9, e ainda mais preferivelmente 5 a 8. A temperatura é preferivelmente ajustada em 10 a 45°C , mais preferivelmente 15 a 40°C, e ainda mais preferivelmente 20 a 35°C. O tempo de reação é preferivelmente 5 a 180 horas, mais preferivelmente 10 a 150 horas, e ainda mais preferivelmente 15 a 120 horas.

[00151] Estas condições de reação são apropriadamente selecionadas ou otimizadas para cada cepa, de modo a maximizar a razão de rendimento de éster de ácido metacrílico. Deve ser observado que o rendimento de éster de ácido metacrílico pode ser ajustado ajustando- se apropriadamente as condições de reação.

[00152] Como condições ideais para fazer com que o éster de ácido metacrílico se acumule em 0,001 mM, sob uma condição de pH de 5,5 a 7,5, a concentração de fonte de carbono ou precursor no meio de cultura é direta ou indiretamente mantida em pelo menos 0,1%, a concentração de álcool ou fenóis é direta ou indiretamente mantida em pelo menos 0,1%, a temperatura é ajustada para a faixa de 20 a 40°C, e deixa-se reagir por pelo menos 3 horas. Ademais, é preferível a manutenção de um estado no qual a concentração de micro-organismo na solução de reação seja alta, para obter uma produtividade eficiente e, por exemplo, mantendo-se em pelo menos 2 g/L como um peso seco, é obtida uma eficiência de produção favorável, e a concentração de acúmulo de produto pode ser aperfeiçoada.

[00153] No método para produzir o éster de ácido metacrílico de acordo com a presente invenção, a produção de de éster de ácido me- tacrílico a partir do cultivo e a produção de éster de ácido metacrílico a partir de reação de micro-organismo em repouso anteriormente mencionadas podem ser realizadas por combinação, conforme apropriado. Por combinação dos dois métodos, torna-se possível a produção mais eficiente do éster de ácido metacrílico.

(3) Recuperação do éster de ácido metacrílico

[00154] O éster de ácido metacrílico formado no meio de cultura ou na solução de reação e a sua quantidade formada podem ser detectados e medidos usando um método comum, tal como de cromatografia líquida de alto desempenho e LC-MS. Além disso, o éster de ácido metacrílico volatilizado na fase de gás do recipiente de cultura ou do recipiente de reação (parte do espaço vazio) e a sua quantidade formada podem ser detectados e medidos usando um método comum, tal como a cromatografia gasosa.

[00155] O éster de ácido metacrílico pode ser separado e purificado do meio de cultura ou da solução de reação usando uma combinação apropriada, conforme necessária, de operações bastante conhecidas, tais como filtração, centrifugação, concentração a vácuo, cromatogra- fia de troca iônica ou adsorção, extração com solvente, destilação e cristalização.

EXEMPLOS

[00156] A seguir, a presente invenção seja especificamente explicada por meio de Exemplos; entretanto, o escopo da presente invenção não é para estar limitado ao escopo destes exemplos.

Exemplo 1: Síntese do Metacrilato de isobutila

[00157] A casca de uma banana foi removida, o sarcocarpo foi cortado em torno de 1 milímetro de espessura com um cortador, e esta foi adicionalmente dividida em quatro. Dois gramas da banana cortada, 2 ml de uma solução contendo 2,3 mM de metacrilil-CoA e 0,35 M de KCl e 5 μl de álcool isobutílico foram adicionados em ordem a um frasco de 100 ml. Ele foi vedado e deixado reagir a 30°C. A mistura de reação contendo o Metacrilato de isobutila formado após 1, 2 ou 3 horas foi coletada em um frasco de 100 ml com 150 μl de espaço vazio, e a análise foi efetuada com as condições de GC abaixo. Os seus resultados são mostrados na Tabela 1. [Tabela 1] Quantidade gerada de metacrilato de isobutila

Condições da análise por GC coluna: DB-WAX, 30 m x 0,32 mm temperatura da coluna: 50°C ■ 5 min -> 5°C/min -> 100°C (total de 15 min) gás veículo: He injetar: 200°C sem separação (tempo de amostragem 1 min) detectar: 250°C FID volume de injeção: 150 l

[00158] Deve ser observado que a concentração de éster de ácido metacrílico foi calculada ajustando-se uma solução aquosa de uma concentração inicial conhecida, colocando-se 2 ml da mesma solução aquosa em um frasco de 100 ml, e depois incubando-se por 30 min a 30°C, coletando-se o espaço vazio pelo mesmo método , submetendo- se à análise por GC, e preparando-se uma curva de calibração.

Exemplo 2: Síntese do metacrilato de butila

[00159] Exceto por utilizar o álcool n-butílico no lugar do álcool iso- butílico, ela foi conduzida similarmente ao Exemplo 1. Os seus resultados são mostrados na Tabela 2. [Tabela 2] Quantidade gerada de metacrilato de butila

Exemplo 3: Síntese 2 do metacrilato de butila

[00160] Dois gramas de um pedado de planta mostrado na Tabela 3, 2 ml de uma solução contendo 2,3 mM de metacrilil-CoA e 0,35 M de KCl e 10 μl de álcool n-butílico foram adicionados em ordem a um frasco de 100 ml. Ele foi vedado e deixado reagir a 30°C. A análise do éster de ácido metacrílico foi conduzida similarmente ao Exemplo 1. Os seus resultados são mostrados na Tabela 3. [Tabela 3] Quantidade gerada de metacrilato de butila

Exemplo 4: Síntese do Metacrilato de etila

[00161] Dois gramas do pedado de planta mostrado na Tabela 4, 2 ml de uma solução contendo 2,3 mM de metacrilil-CoA e 0,35 M de KCl e 6,4 μl de álcool etílico foram adicionados em ordem a um frasco de 100 ml. Ele foi vedado e deixado reagir a 30°C. A análise do éster de ácido metacrílico foi conduzida similarmente ao Exemplo 1. Os seus resultados são mostrados na Tabela 4. [Tabela 4] Quantidade gerada de metacrilato de etila

Exemplo 5: Síntese de Metacrilato de etila

[00162] Dois gramas de um pedado de planta mostrado na Tabela 5, 2 ml de uma solução contendo 2,3 mM de metacrilil-CoA e 0,35 M de KCl e 4,4 μl de álcool metílico foram adicionados em ordem a um frasco de 100 ml. Ele foi vedado e deixado reagir a 30°C. A análise do éster de ácido metacrílico foi conduzida similarmente ao Exemplo 1. Os seus resultados são mostrados na Tabela 5. [Tabela 5] Quantidade gerada de metacrilato de metila

Exemplo de Referência 1: Preparação da célula competente

[00163] A E. coli JM109 foi inoculada em 1 mL de meio LB (1% de triptona Bacto, 0,5% de extrato de levedura Bacto, 0,5% de NaCl), pré- cultivada de modo aeróbico a 37°C por 5 horas, 0,4 mL da cultura foi adicionado a 40 mL de meio SOB (2% de triptona Bacto, 0,5% de extrato de levedura Bacto, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1 mM de MgSO4, 1 mM de MgCl2), e foi cultivada a 18°C por 20 horas. Após co- letar esta cultura por centrifugação, 13 mL de uma solução de TF esfriada (20 mM de PIPES-KOH (pH 6,0), 200 mM de KCl, 10 mM de CaCl2, 40 mM de MnCl2) foram adicionados, e deixados em repouso por 10 minutos a 0°C. Subsequentemente, após a cent rifugação novamente para remover o sobrenadante, a E. coli precipitada foi suspensa em 3,2 mL de solução de TF fria, 0,22 mL de sulfóxido de dime- tila foi adicionado a ela, e deixada em repouso por 10 minutos, a 0°C, para preparar uma célula competente.

Exemplo 6: Preparação de E. coli Recombinante introduzida no gene para AAT derivado de planta

[00164] Os genes para AAT derivados de plantas mostrados nas SEQ ID NOS: 2, 4 e 6 foram confiados para a síntese pela Takara Bio Inc.

[00165] AAT de Maçã (MpAAT1): sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1), sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 2)

[00166] AAT de Morango (SAAT): sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 3), sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 4)

[00167] AAT de Morango (VAAT): sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 5), sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 6)

[00168] Estes segmentos de genes sintetizados foram inseridos no vetor pMD19, e respectivamente denominados pAAT001 até 003. (Tabela 6) Com estes pAAT001 até 003 como moldes, os fragmentos de DNA que codificam o gene para AAT foram preparados por meio do método da PCR, projetando um oligonucleotídeo de modo a ser uma forma na qual fosse adicionado um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição que permitisse a introdução fácil em um vetor de expressão.

Primer de Oligonucleotídeo

[00169] MMA-044: 5’-GTTTGCACGCCTGCCGTTCGACG-3’ (SEQ ID NO. 11)

[00170] MMA-045: 5’-CGGTACGCGCGGATCTTCCAGAG-3’ (SEQ ID NO. 12)

Composição da Solução de Reação

[00171] Água esterilizada 22 L

[00172] 2 x PrimeSTAR (fabricado pela Takara Bio) 25 L

[00173] Primer forward 1 L

[00174] Primer reverse 1 L

[00175] DNA Genômico 1 L

[00176] Quantidade total 50 L

[00177] Ciclo de temperatura

[00178] 30 ciclos de reação a 98°C 10 segundos, 55° C 15 segun dos e 72°C 150 segundos

[00179] Uma banda de produto de amplificação obtido foi purificada por um Kit de Extração em Gel QIAquick (QIAGEN). O DNA purificado respectivo foi digerido com a enzima de restrição PagI (sítio de reconhecimento de clivagem incluído no Primer Forward) e Sse8387I (sítio de reconhecimento de clivagem incluído no Primer Reverse). A separação foi efetuada por eletroforese em gel de agarose, a banda alvo foi excisada do gel, e a purificação foi efetuada. Na purificação, usando um Kit de Purificação por Gel/PCR (fabricado por FAVORGEN), ele foi eluído para 30 μL de água estéril.

[00180] O DNA purificado (5 μL), o vetor pTrc99A digerido com NcoI e Sse8387I (1 μL), a água destilada (4 μL) e a solução I (Kit de Ligação de DNA ver. 2 (Takara Bio) (10 μL) foram misturados, e o vetor foi ligado com o produto de amplificação de PCR por incubação por 12 horas a 16°C.

[00181] A 200 μL da célula competente preparada pelo método do Exemplo de Referência 1, 10 μL da solução de ligação acima mencionada foram adicionados e deixados em repouso a 0°C por 30 minutos, seguido por conferindo um choque térmico a 42°C por 30 segundos e esfriamento até 0°C por 2 minutos, após o que 1 mL de meio de cultura SOC (20 mM de glicose, 2% de triptona Bacto, 0,5% de extrato de levedura Bacto, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1 mM de MgSO4, 1 mM de MgCl2) foi adicionado e cultivado com agitação a 37°C po r 1 hora.

[00182] Após o cultivo, 100 μL de meio de cultura foram inoculados em ágar nutriente LBAmp (meio de cultura LB contendo 100 mg/L de ampicilina, 1,5% de ágar), e adicionalmente cultivados a 37°C. Uma pluralidade de colônias transformantes desenvolvidas sobre o ágar nutriente foi cultivada durante a noite, a 37°C, em 1 ,5 mL de meio de cultura LBAmp (meio de cultura LB contendo 100 mg/L de ampicilina), e após a coleta, o DNA de plasmídio foi preparado usando um Kit QIA- prep Spin Miniprep (QIAGEN).

[00183] Para o DNA de plasmídio respectivo recombinante obtido, a sua sequência de nucleotídeos foi confirmada usando um Kit CEQ DTCS Quick Start e um analisador de DNA de sequenciador fluorescente CEQ 2000XL (ambos Beckman Coulter, EUA), e foram denominados plasmídio pAAT101 até pAAT103 (Tabela 6).

[00184] Para os vetores pET16b, o gene para AAT foi introduzido por operações similares, e os plasmídios obtidos foram denominados pAAT201 até pAAT203 (Tabela 6). Entretanto, visto que não há nenhum sítio de Sse8387I em pET16b, este foi preparado antecipadamente, no qual um ligador incluindo a sequência de clivagem de Sse8387I tinha sido inserido no sítio de BamHI de pET16b, e este foi usado como um vetor.

[00185] Os plasmídios pAAT101 até pAAT103 foram introduzidos na cepa JM109 para obter JM109/pAAT101 até pAAT103 recombinan- tes. Os plasmídios pAAT201 até pAAT203 foram introduzidos na cepa BL21 (DE3) para obter BL21(DE3)/pAAT201 até pAAT203 recombi- nantes. [Tabela 6] Plasmídio para a expressão do gene para AAT derivado de planta

Exemplo 7: Preparação de extrato sem célula a partir de E. coli Recombinante expressando o gene para AAT (1) Cultivo da E. coli Recombinante usando pTrc99A como vetor

[00186] Os JM109/pAAT101 até pAAT103 de E. coli Recombinante obtidos no Exemplo 6 foram inoculados em 1 ml de um meio de cultura LB contendo 100 μg/ml de ampicilina, e o pré-cultivo foi efetuado a 37°C por 7 horas. O caldo foi obtido em 0,1 ml, adi cionado a 100 ml do mesmo meio de cultura (100 μg/ml de ampicilina, 1 m de MIPTG contido), e cultivado com agitação a 37°C por 15 horas. A célula bacteriana foi recuperada por meio de centrifugação (3.700 x g, 10 min, 4°C) a partir do caldo obtido, e após lavagem com uma solução de tampão de fosfato de sódio a 10 mM (pH 7,0), foi suspensa na mesma solução de tampão. O JM109/pTrc99A foi usado como uma cepa de referência.

(2) Cultivo de E. coli recombinante usando pET16b como vetor

[00187] Os BL21(DE3)/pAAT201 até pAAT203 de E. coli recombi- nante obtidos no Exemplo 6 foram inoculados em 1 ml de um meio de cultura LB contendo 100 μg/ml de ampicilina, e o pré-cultivo foi efetuado a 37°C por 14 horas. O caldo foi obtido em 0,1 m l, adicionado a 100 ml do mesmo meio de cultura (100 μg/ml de ampicilina) e, após ser cultivado com agitação a 37°C até a DO tornar-se 0, 3, o IPTG foi adicionado de modo que a concentração final se tornasse 1 mM e foi adicionalmente cultivado com agitação por diversas horas. A célula bacte- riana foi recuperada por meio de centrifugação (3.700 x g, 10 min, 4°C) a partir do caldo obtido, e após lavagem com uma solução de tampão de fosfato de sódio a 10 mM (pH 7,0), foi suspensa de modo a ser DO = 6 (630 nm) na mesma solução de tampão. O BL21(DE3)/pET16b foi usado como uma cepa de referência.

(3) Preparação do extrato sem célula

[00188] O extrato sem célula foi preparado a partir da suspensão de células bacterianas obtida. Usando um homogeneizador ultrassônico VP-15S (Taitec, Japão), a homogeneização foi efetuada por 1 minuto, ao mesmo tempo mantendo a suspensão de células bacterianas sobre gelo, nas condições de controle de saída 4, CICLO DE TRABALHO 40%, PULS, TEMPORIZADOR = modo B 10 s. A seguir, a centrifugação foi efetuada (10.000 x g, 5 minutos, 4°C), e 1 ml do sobrenadante obtido (extrato sem célula) foi coletado.

Exemplo 8: Síntese do metacrilato de butila usando o extrato sem célula recombinante do gene para AAT

[00189] A reação a seguir foi efetuada usando o extrato sem célula preparado pelo método descrito no Exemplo 7. A reação foi iniciada por adição de 0,2 ml de extrato sem célula a um frasco de amostra de 10 ml com uma divisão (para GC), no qual 0,8 ml de uma solução de metacrilil-CoA e álcool foi colocado, de modo que a concentração final da solução de reação fosse 7 mM de metacrilil-CoA e 40,5 mM de n- butanol. O frasco de amostra com uma divisão foi incubado a 30°C por 1 a 5 horas para causar a reação.

[00190] O gás no espaço vazio do frasco de amostra com uma divisão foi analisado similarmente ao Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 7. [Tabela 7] Formação de metacrilato de butila usando o gene para AAT recombi- nante

Exemplo 9A: Síntese do éster de ácido metacrílico usando o extrato sem célula recombinante do gene para AAT

[00191] A reação foi efetuada similarmente ao Exemplo 8, usando metanol, etanol ou n-butanol como o álcool, e usando aquilo derivado de BL21(DE3)/pAAT201 (maçã) no extrato sem célula. Os resultados da análise do produto após 5 horas são mostrados na Tabela 8. [Tabela 8] Geração de éster de ácido metacrílico usando o gene para AAT re- combinante

Exemplo 9B: Síntese 2 do éster de ácido metacrílico usando o extrato sem célula recombinante do gene para AAT

[00192] Usando isobutanol, butanol, álcool benzílico ou álcool 2-etil- hexílico, a reação a seguir foi realizada com o extrato sem célula de BL21(DE3)/pAAT201 (maçã) obtido no Exemplo 7.

[00193] A reação foi iniciada por adição de 0,2 ml de extrato sem célula a um frasco de amostra de 10 ml com uma divisão (para a GC), no qual foi colocado 0,8 ml de uma solução contendo metacrilil-CoA e álcool, de modo que a concentração final da solução de reação fosse 1 mM de metacrilil-CoA e 40 mM de n-butanol.

[00194] O frasco de amostra com uma divisão foi incubado a 30°C por 1 a 5 horas para causar a reação. Após o término da reação, 1 mL de acetonitrila foi adicionado e misturado à solução de reação no frasco de amostra com uma divisão. Subsequentemente, após filtração usando um filtro de seringa DISMIC/tamanho de poro 0,45 μm (fabricado pela ADVANTEC), ele foi proporcionado para a análise por H- PLC. Os resultados da análise do produto após 5 horas são mostrados na Tabela 9.

[00195] Síntese dos ésteres de ácido metacrílico (metacrilato de isobutila, metacrilato de fenila, metacrilato de benzila, metacrilato de 2- etil-hexila) usando o gene para AAT recombinante [Tabela 9]

[00196] Condições da Análise por HPLC

[00197] Dispositivo: Waters 2695

[00198] Coluna: Shiseido CAPCELL PAK C18 UG120 5 μm

[00199] Fase móvel: 65% de MeOH, 0,2% de ácido fosfórico

[00200] Vazão: 0,25 ml/min

[00201] Temperatura da coluna: 35°C

[00202] Detecção: UV 210 nm

[00203] Volume de injeção: 10 μL

Exemplo 10: Preparação de E. coli recombinante introduzida com o gene para ACD

[00204] Preparação de recombinante de alta expressão com clonagem do gene homólogo para ACD a partir de Pseudomonas aeruginosa PAO1

(1) Preparação do DNA genômico a partir de Pseudomonas aeruginosa PAO1

[00205] A cepa de Pseudomonas aeruginosa PAO1 (NBRC106052) desenvolvida sobre ágar nutriente LB (1% de triptona Bacto, 0,5% de extrato de levedura Bacto, 0,5% de NaCl, 1,5% de ágar) foi inoculada em 10 ml de meio de cultura líquido LB (1% de triptona Bacto, 0,5% de extrato de levedura Bacto, 0,5% de NaCl), e o cultivo com agitação foi efetuado a 37°C por 15 horas. Após o término do cul tivo, a célula bac- teriana foi recuperado por meio de centrífuga a partir de 2 ml do caldo, e 10 μl de DNA genômico foram preparados usando um Kit de Purifi-cação de DNA Genômico Wizard (Promega, KK).

(2) Clonagem do Vetor de Expressão

[00206] O DNA genômico obtido foi tornado um molde, e um fragmento de DNA incluindo um gene suposto codificar a ACD foi preparado por meio do método da PCR, de modo a ser uma forma na qual fosse adicionado um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição que permitisse a introdução fácil em um vetor de expressão.

Primer de Oligonucleotídeo

[00207] MMA-003: 5’- GACCCATGGATTTCGACCTCACCGAAGA- AC -3’ (SEQ ID NO. 13)

[00208] MMA-004: 5’- GCCCTGCAGGATGC- GATGGTTCGCGGCGTTC -3’(SEQ ID NO. 14)

[00209] Composição da Solução de Reação

[00210] Água esterilizada 22 μl

[00211] 2 x PrimeSTAR (fabricado pela Takara Bio) 25 μl

[00212] MMA-003 (SEQ ID NO. 13) 1 μl

[00213] MMA-004 (SEQ ID NO. 14) 1 μl

[00214] DNA Genômico 1 μl

[00215] Quantidade total 50 μl

[00216] Ciclo de Temperatura

[00217] 30 ciclos de reação a 98°C 10 segundos, 55° C 15 segun dos e 72°C 150 segundos

[00218] Uma banda de cerca de 1,2 kb do produto de amplificação obtido foi purificada por um Kit de Extração em Gel QIAquick (QIAGEN). O DNA purificado respectivo foi digerido com a enzima de restrição NcoI (sítio de reconhecimento de clivagem incluído no oligonu- cleotidoe MMA-003) e Sse8387I (sítio de reconhecimento de clivagem incluído no oligonucleotídeo MMA-004), e purificado por meio de extração com fenol/extração com clorofórmio/precipitação com etanol. O DNA purificado (5 μL), o vetor pTrc99A digerido com NcoI e Sse8387I (1 μL), a água destilada (4 μL) e a solução I (Kit de Ligação de DNA ver. 2 (Takara Bio) (10 μL) foram misturados, e o vetor foi ligado com o produto de amplificação de PCR por incubação por 12 horas a 16°C.

[00219] A 200 μL da célula competente preparada pelo método do Exemplo de Referência 1, 10 μL da solução de ligação acima mencionada foram adicionados e deixados em repouso a 0°C por 30 minutos, seguido por conferindo um choque térmico a 42°C por 30 segundos e esfriamento até 0°C por 2 minutos, após o que 1 mL de meio de cultura SOC (20 mM de glicose, 2% de triptona Bacto, 0,5% de extrato de levedura Bacto, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1 mM de MgSO4, 1 mM de MgCl2) foi adicionado e cultivado com agitação a 37°C po r 1 hora.

[00220] Após o cultivo, 200 μL de meio de cultura foram inoculados em ágar nutriente LBAmp (meio de cultura LB contendo 100 mg/L de ampicilina, 1,5% de ágar), e adicionalmente cultivados a 37°C. Uma pluralidade de colônias de organismos transgênicos cultivadas sobre o ágar nutriente foi cultivada durante a noite, a 37°C, em 1,5 mL de meio de cultura LBAmp (meio de cultura LB contendo 100 mg/L de ampicili- na), e após a coleta, o DNA de plasmídio foi recuperado usando um Flexi Prep (fabricado pela Amersham Biosciences).

(3) Transformação

[00221] Para o DNA de plasmídio recombinante obtido, a sua sequência de nucleotídeos foi confirmada usando um Kit CEQ DTCS Quick Start e um analisador de DNA de sequenciador fluorescente CEQ 2000XL (ambos Beckman Coulter, EUA), e foi denominado plas- mídio pMMA002. A cepa de E. coli JM109 foi transformada usando o plasmídio pMMA002 para preparar um recombinante ao qual o gene para ACD (SEQ ID NO. 8) tinha sido introduzido. A sequência de ami- noácidos é mostrada pela SEQ ID NO. 7.

Exemplo 11: Preparação do extrato sem célula a partir de E. coli recombinante expressando o gene para ACD

[00222] O JM109/pMMA002 de E. coli recombinante ao qual o gene para ACD (SEQ ID NO. 8) obtido no Exemplo 10 tinha sido introduzido, foi inoculado em 1 ml de um meio de cultura LB contendo 100 μg/ml de ampicilina, e o pré-cultivo foi efetuado a 37°C por 7 horas. O caldo foi obtido em 0,1 ml, adicionado a 100 ml do mesmo meio de cultura (100 μg/ml de ampicilina, 1 m de MIPTG contido), e cultivado com agitação a 37°C por 15 horas. A célula bacteriana foi recupe rada por meio de centrifugação (3.700 x g, 10 min, 4°C) a partir do caldo obtido, e após lavagem com uma solução de tampão de fosfato de sódio a 10 mM (pH 7,0), foi suspensa de modo a ser uma DO = 6 (630 nm) na mesma solução de tampão. O JM109/pTrc99A foi usado como uma cepa de referência.

[00223] A partir da suspensão de células bacterianas obtida, 1 ml de extrato sem célula foi preparado como se segue. Usando um ho- mogeneizador ultrassônico VP-15S (Taitec, Japão), a homogeneização foi efetuada por 1 minuto, ao mesmo tempo mantendo sobre gelo, nas condições de controle de saída 4, CICLO DE TRABALHO 40%, TEMPORIZADOR PULS = modo B 10 s. A seguir, a centrifugação foi efetuada (10.000 x g, 5 minutos, 4°C), e o sobrenad ante obtido foi coletado como extrato sem célula.

Exemplo 12: Preparação de Metacrilato de butila a partir de isobutiril- CoA usando fragmento de planta e extrato sem célula recombinante geneticamente modificado com ACD 1. Reação de síntese da metacrilil-CoA com a isobutiril-CoA como substrato por extrato sem célula recombinante geneticamente modificado com ACD

[00224] A 1,84 ml de uma solução contendo 6 mM de metilsulfato de 1-metóxi-5-metil fenazínio, 0,4 mM de dinucleotídeo de flavina ade- nina e 1 mM de isobutiril-CoA em uma solução de tampão de fosfato de sódio a 100 mM (pH 8,0) foi adicionado 0,16 ml de extrato sem célula tendo atividade de ACD obtido no Exemplo 10, para preparar 2 ml de solução de reação. Ela foi deixada reagir a 37°C por 30 minutos, e a análise foi efetuada nas condições de HPLC mostradas abaixo. Como seu resultado, o pico de isobutiril-CoA desapareceu, com isso confirmando a formação de metacrilil-CoA.

[00225] Condições da Análise por HPLC

[00226] Coluna: Inertsil ODS-3V, 4,6 mm x 250 mm

[00227] Fase móvel: 30% de MeOH, 50 mM de H3PO4, pH 5,7

[00228] Vazão: 1,0 ml/min

[00229] Temperatura da coluna: 35°C

[00230] Detecção: UV 254 nm

[00231] Volume de injeção: 10 μl

[00232] Solução de reação diluída 10 vezes com a fase móvel e medida.

(2) Síntese de metacrilato de butila por adição de álcool n-butílico e fragmento de planta à solução de reação de síntese de metacrilil-CoA

[00233] A casca de uma banana foi removida, o sarcocarpo foi cortado com um cortador até uma espessura de cerca de 1 milímetro, e esta foi adicionalmente dividida em quatro. A um frasco de 50 ml, 1 g da banana cortada, 0,9 ml da solução de reação de síntese de meta- crilil-CoA, 0,1 ml de 3,5 M de solução de KCl e 5 μl de álcool n-butílico foram adicionados, vedou-se, e então deixou-se reagir a 30°C por 2 horas. Ao conduzir a análise do éster de ácido metacrílico similarmente ao Exemplo 1, 0,015 mM de metacrilato de butila se formou.

Exemplo 13: Preparação da E. coli Recombinante introduzida com o gene para ECH (1) Preparação do DNA genômico a partir da bactéria rhodococcus

[00234] A cepa de Rhodococcus erythropolis PR4 (NBRC100887) desenvolvida sobre meio de cultura de ágar nutriente LB foi inoculada em 10 ml de meio de cultura líquido LB, e o cultivo com agitação foi efetuado a 30°C por 36 horas. Após o término do cul tivo, a célula bac- teriana foi recuperado por meio de centrífuga a partir de 2 ml do caldo, e 100 μl de DNA genômico foram obtidos similarmente ao Exemplo 10.

(2) Clonagem do Vetor de Expressão

[00235] O DNA genômico obtido foi tornado um molde, e um fragmento de DNA incluindo uma sequência de nucleotídeos suposta codificar o gene para ECH foi preparado por meio do método da PCR, de modo a ser uma forma na qual fosse adicionado um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição que permitisse a introdução fácil em um vetor de expressão.

Primer de Oligonucleotídeo

[00236] MMA-031: 5’- GGTCATGACCGACTTCAACACCATCATCCTC -3’ (SEQ ID NO. 15)

[00237] MMA-032: 5’- GGCCTGCAGGTTCAGCTGTTCGAAAGTTCAGCGC -3’(SEQ ID NO. 16)

[00238] A PCR foi efetuada similarmente ao Exemplo 10, e o DNA obtido foi digerido com a enzima de restrição BspHI (sítio de reconhecimento de clivagem incluído no oligonucleotídeo MMA-031) e Sse8387I (sítio de reconhecimento de clivagem incluído no oligonucle- otídeo MMa-032). Após a clivagem, as mesmas operações como o Exemplo 6 foram efetuadas para obter o DNA de plasmídio alvo, no qual o gene para ECH (SEQ ID NO. 10) foi incorporado, e então denominado plasmídio pMMA011. A sequência de aminoácidos é mostrada pela SEQ ID NO. 9.

(3) Transformação

[00239] A cepa de E. coli JM109 foi transformada usando o plasmí- dio pMMA011 para preparar a E. coli Recombinante de expressão no gene para ECH.

Exemplo 14: Síntese do metacrilato de butila a partir da 3-hidróxi- isobutiril-CoA usando o extrato sem célula de E. coli Recombinante de expressão do gene para ECH e o extrato sem célula recombinante de gene para AAT 1. Preparação do líquido com células rompidas tendo atividade de ECH

[00240] O JM109/pMA011 de E. coli Recombinante ao qual o gene para ECH obtido no Exemplo 13 tinha sido introduzido, foi inoculado em 1 ml de um meio de cultura LB contendo 2 ml de 100 μg/ml de am- picilina, e o pré-cultivo foi efetuado a 37°C por 2 4 horas. O caldo foi obtido em 0,1 ml, adicionado a 100 ml do mesmo meio de cultura (100 μg/ml de ampicilina, 1 m de MIPTG contido), e cultivado com agitação a 37°C por 15 horas. A célula bacteriana foi recupe rada por meio de centrifugação (3.700 x g, 10 min, 4°C) a partir do caldo obtido, e após lavagem duas vezes com uma solução de tampão de fosfato de sódio a 10 mM (pH 7,0), foi diluída de modo a ser uma DO = 6 (630 nm) na mesma solução de tampão.

[00241] A partir da suspensão de células bacterianas obtida, 1 ml de líquido com células rompidas foi preparado no seguinte modo. Usando um Sonificador homogeneizador ultrassônico 250D (Branson, EUA), ele foi homogeneizado por 5 minutos, ao mesmo tempo mantendo sobre gelo nas condições de amplitude: 15%/Ligado: 1 s, desligado: 1 s.

(2) Reação de síntese da metacrilil-CoA usando o líquido com células rompidas de E. coli Recombinante de expressão do gene para ECH

[00242] À mistura preparada misturando-se 0,2 ml de 0,5 M de solução de tampão de tris-HCl (pH 7,4), 0,4 ml de 1,2 mM de solução aquosa de 3-hidróxi-isobutiril-CoA e 1,2 ml de água foi adicionado 0,2 ml de líquido com células rompidas tendo atividade de enoil-CoA hidra- tase obtido no modo acima descrito, para preparar 2 ml de solução de reação. Ela foi deixada reagir a 37°C por 30 minuto s, e a análise foi efetuada nas condições de HPLC mostradas no Exemplo 12. Como seu resultado, a formação de metacrilil-CoA foi confirmada.

(3) Síntese de metacrilato de butila usando o extrato sem célula recombinante de gene para AAT

[00243] A um frasco de amostra de 10 ml, 0,4 ml da solução de reação de síntese da metacrilil-CoA, 0,1 ml de 10 mM de solução de tampão de fosfato de sódio (pH 7,5) e 0,2 ml de água foram adicionados, 0,1 ml de 0,4 M de solução de n-butanol e 0,2 ml de líquido com células rompidas de AAT de maçã (MpAAT) preparado similarmente ao Exemplo 7 foram adicionalmente adicionados, vedou-se, e então deixou-se reagir a 30°C por 3 horas. Ao conduzir a análise do éster de ácido metacrílico similarmente ao Exemplo 1, 0,001 mM de Metacrilato de butila se formou.

Exemplo 15: Preparação de recombinante de alta expressão com clonagem do gene para BCKAD, preparação do extrato sem célula, e análise da expressão da proteína

[00244] A preparação do plasmídio de expressão com clonagem do gene e a preparação do recombinante foram efetuadas similarmente ao Exemplo 10. O DNA genômico da cepa de Pseudomonas aeruginosa PAO1 foi tornado um molde, e um fragmento de DNA incluindo o operon inteiro do gene codificando o gene complexo para BCKAD foi preparado por meio do método da PCR, usando o primer mostrado abaixo. O fragmento obtido foi digerido pelas enzimas de restrição Bs- pHI e Sse8387I, e inserido no vetor pTrc99A similarmente ao Exemplo 10, para obter o plasmídio recombinante (pWA108).

Primers de Oligonucleotídeos:

[00245] MAA-15: 5’-GGCCTGTCATGAGTGATTACGAGCCG-3’ (SEQ ID NO. 17)

[00246] MAA-16: 5’- CGGCCCTGCAGGTTCGCGGGAATCAGATGTGC-3’ (SEQ ID NO. 18)

[00247] O JM109/pWA108 de E. coli Recombinante obtido no modo acima descrito foi cultivado similarmente ao Exemplo 10. Entretanto, no caso do presente recombinante, visto que foi reconhecida uma alta expressão da proteína, mesmo sem efetuar a adição do IPTG com base nos resultados preliminares, ela foi conduzida sem a adição de IPTG. A preparação do extrato sem célula foi conduzida similarmente ao Exemplo 11.

Exemplo 16: Medição da atividade do extrato sem célula de recombinante de alta expressão de gene para BCKAD

[00248] A atividade da BCKAD foi medida a partir da geração da isobutiril-CoA com o ácido 2-oxoisovalérico como o substrato no seguinte modo.

[00249] A 0,7 ml de uma solução contendo concentrações finais de 1 mM de MgCl2, 0,2 mM de pirofosfato de tiamina, 1 mM de CoA-Sh e 2 mM de DDT em uma solução de tampão de fosfato de sódio a 100 mM (pH 7,0) foi adicionado 0,2 ml do extrato sem célula obtido no Exemplo 15 para constituir 0,9 mL. Após adicionar 0,1 mL (concentração final de 4 mM) de sal cálcico de ácido 2-oxoisovalérico a esta e reagir a 37°C por 30 minutos, a ultrafiltração foi efetuada usando um Centricut Super Mini W-10 (Kurabo Industries Ltd.). A reação foi interrompida efetuando-se a desproteinização, e a análise foi efetuada por HPLC nas condições a seguir. Como seu resultado, a formação de 0,83 mM de isobutiril-CoA foi reconhecida com o JM109/pWA108.

[00250] Condições de análise por HPLC:

[00251] Coluna: Inertsil ODS-3V, 4,6 mm x 250 mm

[00252] Fase móvel: 35% de MeOH, 50 mM de H3PO4, pH 5,7

[00253] Vazão: 1,0 ml/min

[00254] Temperatura da coluna: 35°C

[00255] Detecção: UV254 nm (210 nm)

[00256] Volume de injeção: 10 μl (solução de reação diluída 10 vezes com a fase móvel e medida)

Exemplo 17: Síntese da metacrilil-Coa (FIG. 1) a partir do ácido 2- oxoisovalérico pela mistura de extratos sem células a partir de recombinante de alta expressão de gene para BCKAD e recombinante expressando o gene para ACD

[00257] A 0,6 ml de uma solução contendo concentrações finais de 1 mM de MgCl2, 0,2 mM de pirofosfato de tiamina, 1 mM de CoA-SH, 2 mM de DDT, 2 mM de dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NAD), 0,04 mM de dinucleotídeo de flavina adenina (FAD) e 2 mM de valina em uma solução de tampão de fosfato de sódio a 100 mM (pH 7,0) foi respectivamente adicionado 0,1 ml de cada um dos extratos sem células (JM109/pMMA002 e JM109/pWA108) obtidos pelos métodos do Exemplo 11 e do Exemplo 15, para constituir 0,8 mL. Após adicionar 0,1 mL de sal cálcico de ácido 2-oxoisovalérico (concentração final de 4 mM) a esta e reagir a 37°C por 30 minutos, a form ação de isobutiril- CoA foi confirmada por HPLC, e 0,1 ml de metilsulfato de 1-metóxi-5- metil fenazínio (concentração final de 6 mM) foi adicionado e deixou-se reagir adicionalmente por 3 horas. Após a reação, a ultrafiltração foi efetuada usando um Centricut Super Mini W-10 (Kurabo Industries Ltd.). A reação foi interrompida efetuando-se a desproteinização, e a análise foi efetuada por HPLC. Como seu resultado, a formação de 0,2 mM de metacrilil-CoA foi reconhecida.

Exemplo de Referência 2: Preparação de PR4KS receptora por transferência por conjugação

[00258] A Rhodococcus erthropolis PR4 (NITE Biological Resource Center; número do depósito: NBRC 100887) foi modificada pelo método descrito no Pedido de Patente Não Examinado Japonês, Publicação No. 2011-200133, para preparar um derivado exibindo resistência a 120 mg/L de cloranfenicol e não tendo gene resistente à canamicina, e foi denominada cepa PR4KS.

[00259] Mais especificamente, para aumentar a resistência ao clo- ranfenicol, a concentração de cloranfenicol em um meio de cultura MYK (0,5% de polipeptona, 0,3% de extrato de levedura bact., 0,3% de extrato de malte, 0,2% de KH2PO4, 0,2% de K2HPO4) foi gradualmente elevada em etapas, começando a partir de 10 mg/mL até 120 mg/mL, ao mesmo tempo induzindo a mutação espontânea por subcul- tivo da cepa PR4, com isso obtendo a cepa derivada RhCmSR-09 tendo resistência a 120 mg/mL de cloranfenicol.

[00260] A seguir, a cepa RhCmSR-09 acima mencionada foi misturada em uma razão de 1:1 com E. coli retendo o plasmídio pKM043 para a introdução da variação da deficiência do gene resistente à ca- namicina descrita no Pedido de Patente Não Examinado Japonês, Publicação No. 2011-200133, então cultivada, e após a introdução de pKM043 na cepa RhCmSR-09 através de transferência por conjugação, foi cultivada em ágar nutriente MYK contendo 20 mg/L de sulfato de canamicina e 50 mg/L de cloranfenicol (0,5% de polipeptona, 0,3% de extrato de levedura bact., 0,3% de extrato de malte, 0,2% de KH2PO4, 0,2% de K2HPO4, 1,5% de ágar), com isso obtendo uma cepa recombinante homóloga na qual o pKM043 tinha sido introduzido no genoma da cepa RhCmSR-09. A cepa recombinante homóloga foi cultivada em ágar nutriente MYK contendo sacarose a 10%, pelo que foi obtida uma cepa derivada surgindo como uma cepa sensível à cana- micina dentre as colônias obtidas, i.e., uma cepa derivada da variação da deficiência de gene resistente à canamicina PR4KS.

Exemplo de Referência 3: Preparação de plasmídio para deficiência do gene com clonagem do gene homólogo LigD

[00261] O gene homólogo LigD (No. de acesso: YP_002767969) da cepa PR4KS foi estabelecido como o gene-alvo. Após amplificação de cerca de 5,4 kb de DNA incluindo a sequência adjacente ao gene homólogo LigD por meio de PCR, ele foi clonado no vetor de plasmídio pK19mobsacB1 ao qual o gene para sacB tinha sido introduzido à jusante e na mesma orientação do gene resistente à canamicina, descrito no Pedido de Patente Não Examinado Japonês, Publicação No. 2011-200133, pelo que se obteve o plasmídio pTJ001. As condições da PCR foram como se segue.

Primers

[00262] GB-138: 5’- GGCCTGCAGGTACCGATCATCAC- CATCGGTGTC -3’ (SEQ ID NO. 19)

[00263] GB-139: 5’- GGTCTAGACTGAGCAGTGTTCCAATGCG -3’ (SEQ ID NO. 20)

[00264] Composição da Solução de Reação

[00265] Água esterilizada 22 l

[00266] 2 x PrimeSTAR (fabricado pela Takara Bio) 25 l

[00267] GB-138 (SEQ ID NO. 19) 1 l

[00268] GB-139 (SEQ ID NO. 20) 1 l

[00269] genoma de PR4KS (50 ng/μL) 1 μl

[00270] Quantidade total 50 l

[00271] Ciclo de temperatura

[00272] 35 ciclos de reação a 98°C 10 segundos, 55° C 15 segun dos e 72°C 120 segundos

[00273] O plasmídio para a deficiência do gene homólogo LigD pTJ002 foi preparado, no qual o comprimento inteiro da sequência homóloga de LigD dentro de pTJ001 (cerca de 2,3 kb) foi removido e somente as sequências à montante e à jusante do gene homólogo LigD foram deixadas permanecer (referir-se à FIG. 3). A sequência dentro de pTJ001 foi amplificada usando os primers GB-140 e GB-141, que incluem a sequência adjacente do códon de início e a sequência adjacente do códon de interrupção do gene homólogo LigD alvejado, respectivamente, e que foram projetadas para estender na direção à montante a partir do códon de iniciação e na direção à jusante do có- don de interrupção, respectivamente, para obter o produto da PCR que não inclui o gene homólogo LigD. A cepa de E. coli JM109 foi transformada pelo produto da PCR obtido para tornar o DNA circular como pTJ002. As condições da PCR são como se seguem.

Primers

[00274] GB-140: GAGGAAATGGTCACAGGGCGAGAATAGGTTG (SEQ ID NO. 21)

[00275] GB-141: GCCCTGTGACCATTTCCTCATTGTGCTGG (SEQ ID NO. 22)

[00276] Composição da Solução de Reação

[00277] Água esterilizada 22 μl

[00278] 2 x PrimeSTAR (fabricado pela Takara Bio) 25 μl

[00279] GB-140 (SEQ ID NO. 21) 1 μl

[00280] GB-141 (SEQ ID NO. 22) 1 μl

[00281] pTJ001 1 μl

[00282] Quantidade total 50 μl

[00283] Ciclo de Temperatura

[00284] 30 ciclos de reação a 98°C 10 segundos, 50° C 10 segun dos e 72°C 180 segundos

[00285] Após o término da PCR, ao efetuar a confirmação do fragmento por eletroforese em gel de agarose a 0,7% usando 1 μl de a- mostra, a amplificação do fragmento foi reconhecida. No procedimento de produção do plasmídio pTJ002 acima mencionado, um Kit de Purificação de DNA Genômico Wizard (fabricado pela Promega) foi usado na extração do genoma a partir da cepa PR4, um Kit de Purificação por Gel/PCR (fabricado pela FAVORGEN) foi usado na purificação do fragmento de DNA digerido com a enzima de restrição e o produto da PCR, um Kit de Ligação do DNA <Mighty Mix> (fabricado pela Takara Bio) foi usado na união do DNA, e um kit QIAprep miniprep (fabricado pela QIAGEN) foi usado na extração do plasmídio.

Exemplo de Referência 4: Preparação da cepa derivada PR4KS deficiente de gene homólogo LigD

[00286] Com o produto por transformação da E. coli (Escherichia coli) S17-1Àpir por meio do pTJ002 como o doador, e a PR4KS obtida pelo método do Exemplo de Referência 2 como o receptor, a transferência por conjugação foi efetuada similarmente ao método descrito no Pedido de Patente Não Examinado Japonês, Publicação No. 2011200133 para obter 13 cepas da cepa derivada deficiente de gene homólogo LigD, produzida pela recombinação homóloga. Uma cepa foi selecionada a partir das cepas derivadas deficientes, e denominada PR4KSligD.

Exemplo de Referência 5: Preparação do plasmídio pLK005 para a bactéria Rhodococcus e do plasmídio de expressão da nitrila hidratase pSJ201 usando este Aquisição e Análise do pLK005

[00287] Usando o pK4 (referir-se ao Pedido de Patente Não Examinado Japonês, Publicação No. H5-64589), o Rhodococcus sp N775 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depository, número do depósito FERM BP-961) foi transformado pelo método de eletroporação acima mencionado. O transformante obtido foi inoculado em 10 ml de meio de cultura MYK, e cultivado a 30°C por 1 dia. O tratamento de variaçã o foi efetuado expondo este à luz ultravioleta dentro de uma bancada limpa. O líquido de cultura no qual o tratamento de variação foi efetuado foi aplicado ao ágar nutriente MYK contendo 50 a 400 μg/ml de canamicina e cultivado a 30°C por 3 dias.

[00288] A pluralidade de colônias que surgiram sobre o ágar nutriente foi respectivamente cultivada no meio de cultura MYK, e os plas- mídios foram recuperados a partir dos transformantes. Usando o plasmídio recuperado, o rhodococcus sp N775 foi transformado novamente, e foi investigado se a resistência à canamicina do transforman- te melhoraria. Como seu resultado, foram reconhecidas diversas cepas de transformante para as quais a resistência à canamicina claramente melhorou.

[00289] Ao investigar as sequências de nucleotídeos dos plasmí- dios para os quais a resistência à canamicina foi reconhecida como melhorando, foi reconhecido que ocorre uma alteração na sequência na região à montante do gene resistente à canamicina de pK4 (sobreposição da sequência de 8 nucleotídeos GTTGTAGG). Este plasmídio para o qual esta resistência à canamicina foi reconhecida como melhorando foi denominado pLK005.

(2) Preparação de pSJ040

[00290] O plasmídio pSJ034 é um plasmídio preparado a partir do plasmídio pSJ023 pelo método descrito no Pedido de Patente Não Examinado Japonês, Publicação No. H10-337185. No pSJ034, embora estejam presentes três sítios de enzimas de restrição EcoRI, foi preparado o plasmídio pSJ040 no qual um destes foi transformado em um sítio SpeI. Especificamente, o pSJ034 foi parcialmente decomposto usando a enzima de restrição EcoRI. O sítio de clivagem foi convertido em uma extremidade rombuda usando o kit Takara Blunting e então a reação de ligação foi efetuada sob a presença do ligador de SpeI. A cepa de E. coli JM109 foi transformada usando a solução de reação. Após cultivar o transformante, o plasmídio foi extraído, e o plasmídio ao qual o ligador de SpeI tinha sido inserido foi separado. O plasmídio no qual o ligador de SpeI foi inserido, entre os três sítios EcoRI de pSJ034, o sítio EcoRI presente à jusante do gene resistente à canami- cina foi denominado pSJ040.

(3) Montagem do pSJ201

[00291] O pLK005 foi digerido com HindIII para preparar um fragmento de cerca de 2,1 kb. Por outro lado, o pSJ040 foi digerido com HindIII para preparar um fragmento de cerca de 9,8 kb. Usando estes dois fragmentos, a reação de ligação foi efetuada, e a cepa de E. coli JM109 foi transformada usando a solução de reação. Após cultivar o transformante, o plasmídio foi extraído e a sua sequência de nucleotí- deos foi confirmada, cujo resultado um plasmídio mantendo a sequência mutada (duplicação de GTTGTAGG) derivada de pLK005 e, por outro lado, tendo a mesma sequência que pSJ040, foi chamado pSJ201.

Exemplo de Referência 6: Preparação da cepa derivada deficiente de gene para RE acd1/RE echA/RE hchA/RE mmsB da cepa derivada PR4KSΔligD

[00292] Preparação do plasmídio para a deficiência do gene usando o método In Fusion

[00293] A preparação de um plasmídio para a deficiência do gene foi efetuada por meio de um kit de Clonagem de HD In Fusion (fabricado pela Takara Bio), no qual o gene para RE_acd1/RE_echA/RE_hchA/RE_mmsB da cepa PR4KS era o gene- alvo (referir-se à FIG. 4).

[00294] O DNA das sequências à montante e à jusante do gene- alvo foi amplificado por PCR. As condições da PCR eram como se seguem.

[00295] Primers para o fragmento 1

[00296] MMA-061: CGACTCTAGAGGATCGCTCAGTACATCTAC- GAGAC (SEQ ID NO. 23)

[00297] MMA-062: AGTGTGAGGAAAGTGTTCCGATCAGTTCAT (SEQ ID NO. 24)

[00298] Primers para o fragmento 2

[00299] MMA-063: CACTTTCCTCACACTCGTCGAGAGTATGAG (SEQ ID NO. 25)

[00300] MMA-064: CGGTACCCGGGGATCAGCGCGACGAACA- ACGAGAC (SEQ ID NO. 26)

[00301] Composição da Solução de Reação

[00302] Molde (DNA genômico do tipo selvage de PR4) 1 L

[00303] 2 x Pré-Mistura PrimeSTAR Max (fabricada pela Takara Bi o) 25 L

[00304] Primer Fw (20 M) 1 L

[00305] Primer Rv (20 M) 1 L

[00306] Á. D. 22 L

[00307] Quantidade total 50 L

[00308] Ciclo de Temperatura

[00309] 30 ciclos de reação a 98°C 10 segundos, 60° C 10 segun dos e 72°C 120 segundos

[00310] Após o término da PCR, ao efetuar a confirmação do fragmento por eletroforese em gel de agarose a 0,7% usando 1 μl da amostra, a amplificação do fragmento foi reconhecida. Usando um Kit de Purificação por Gel/PCR (fabricado pela FAVORGEN), a substituição do tampão foi efetuada sobre o produto da PCR (fragmento 1 e fragmento 2), e usada na reação pelo Kit de Clonagem HD In Fusion mostrado abaixo.

(2) Ligação do fragmento-alvo com o vetor pelo Kit de Clonagem HD In Fusioin e transformação

[00311] A ligação do fragmento acima mencionado e o vetor foi efetuada usando o Kit de Clonagem HD In Fusion. As condições de reação eram como se seguem.

[00312] Composição da Solução de Reação

[00313] 5x Pré-Mistura de Enzima HD In-Fusion 2 L

[00314] Fragmento do vetor 1,5 L

[00315] Fragmento de DNA 1 1 L

[00316] Fragmento de DNA 2 2 L

[00317] Á. D. 3.5 L

[00318] Quantidade total 10 L

[00319] Após incubar a solução de reação acima mencionada a 50°C por 15 minutos, ela foi esfriada sobre gelo, e usada na transformação da cepa de E. coli JM109. A seleção do transformante de E. coli foi efetuada com o ágar nutriente LB contendo 50 mg/L de sulfato de canamicina (a seguir, ágar nutriente LB Km 50). O plasmídio foi preparado a partir do transformante usando um Kit Mini prep. (QIAGEN) para obter o plasmídio-alvo. A confirmação do plasmídio foi efetuada por investigação do tamanho do fragmento após o tratamento com a enzima de restrição XbaI, e a sequência da região de ligação do fragmento e do vetor de inserção. O plasmídio-alvo foi denominado pMMA302.

(3) Preparação da cepa derivada recombinante homóloga da cepa derivada PR4KSΔligD e cepa derivada deficiente de gene

[00320] A 20 μl da célula competente da cepa PR4KSΔligD, 1 μl de pMMA302 foi adicionado, e incubou-se sobre gelo por 10 minutos. A quantidade inteira da solução incubada acima mencionada foi movida para uma cuveta de eletroporação esfriada com gelo (0,1 cm), uma alta voltagem de 1,5 kV (200 ) foi aplicada, 600 μl de meio de cultura de líquido LB foram imediatamente adicionados, e deixou-se em repouso a 30°C por 6 horas. Sobre o ágar nutriente LB contendo 10 mg/L de sulfato de canamicina (a seguir ágar nutriente LB Km 10), 200 μl foram espalhados e cultivados a 30°C por 4 dias. A colônia desenvolvida foi riscada sobre o ágar nutriente LB Km10, e após o cultivo por 4 dias, a PCR da colônia foi efetuada de acordo com as condições mostradas abaixo e a confirmação da cepa derivada recombinante homóloga foi efetuada.

Primers

[00321] MMA-069: GCGCATCTACAAGGAAGAGATC (SEQ ID NO. 27)

[00322] MMA-070: GCGACGCTCATCGAGATCTC (SEQ ID NO. 28)

[00323] Composição da Solução de Reação

[00324] Molde 4,0 μl

[00325] 2 x Tampão Mighty Amp (fabricado pela Takara) 5,0 μl

[00326] Primer Fw (20 μm) 0,25 μl

[00327] Primer Rv (20 μm) 0,25 μl

[00328] Á. D. 0,3 μl

[00329] DNA Polimerase Mighty Amp (fabricada pela Takara) 0,2 μl

[00330] Total 10,0 μl

[00331] Temperatura do Ciclo

[00332] 30 ciclos de reação a 98°C 10 segundos, e 6 8°C 180 se gundos

[00333] A colônia reconhecida como sendo uma cepa derivada re- combinante homóloga foi suspensa em 200 μl de meio de cultura LB, 100 μl foram espalhados sobre ágar nutriente LB + 10% de sacarose, e cultivados por 3 dias. A partir das colônias desenvolvidas, aquelas que vieram a ser sensíveis à canamicina foram selecionadas, e a deficiência do gene-alvo foi confirmada para estas por PCR das colônias. Como seu resultado, uma cepa na qual os quatro genes de RE_acd1, RE_echA, RE_hchA e RE_mmsB tinham sido removidos da cepa deri- vada de PR4K3SΔligD foi obtida, e denominada cepa DMA008.

[00334] Exemplo 18: Preparação do plasmídio para a coexpressão de ACD e AAT no micro-organismo pertencente ao gênero Rhodococ- cus

[00335] Foi preparado o plasmídio para expressar ACD e/ou AAT em micro-organismos pertencentes ao gênero Rhodococcus.

[00336] Um fragmento de "promotor de nitrilase + gene para MpA- At1" obtido por reação PCR com o plasmídio pAAT301 para a expressão do gene para MpAAT1 como o molde foi inserido à jusante do gene para RE_acd1 do plasmídio pMMa401 para a expressão do gene para RE_acd1.

[00337] A amplificação do fragmento de "promotor de nitrilase + gene para MpAAT1" foi efetuada como se segue.

Primers

[00338] MMA-133(Sse-ProFw): TGACCTGCAGGTG- CACTCCGCTGCGACATGTATCGA (SEQ ID NO. 29)

[00339] MMA-131(Sse-001Rv): ACTCTAGCCTGCAGGTCATTGACTAGTTGATCTAAGGTTGTTACA (SEQ ID NO. 30)

[00340] Composição da Reação PCR

[00341] Molde (pAAT301) 1 μl

[00342] 2 x Pré-Mistura PrimeSTAR Max (fabricada pela Takara) 10 μl

[00343] Primer Fw (10 μM) 0,6 μl

[00344] Primer Rv (10 μM) 0,6 μl

[00345] Á. D. 7,8 μl

[00346] Total 20 μl

[00347] Ciclo de Temperatura

[00348] 30 ciclos de reação a 98°C 5 segundos, 60°C 5 segundos e 72°C 45 segundos

[00349] O fragmento de "promotor de nitrilase + gene para MpA- AT1" obtido neste modo foi tratado com a enzima de restrição Sse8387I. Por outro lado, após o tratamento com Sse8387I, o tratamento com SAP foi efetuado também sobre pMMA401. Estes fragmentos de DNA foram purificados usando um Kit de Purificação por Gel/PCR (fabricado pela FAVORGEN) após efetuar a eletroforese em gel de agarose a 0,7%. As condições de reação do tratamento com as enzimas de restrição e as condições de reação de ligação foram como se seguem.

[00350] Composição da reação de tratamento com enzima de restrição (fragmento de AAT)

[00351] Fragmento de PCR amplificado 40 μl

[00352] 10xtampão M 5 μl

[00353] 0,1% de BSA 4 μl

[00354] Sse8387I (fabricado pela Takara) 1 μl

[00355] Total 50 μl

[00356] Composição da reação de tratamento com a enzima de restrição (fragmento de vetor)

[00357] pMMA401 (vetor) 3 μl

[00358] 10xtampão M 4 μl

[00359] 0,1% de BSA 4 μl

[00360] AP 1 μl

[00361] Sse8387I (fabricada pela Promega) 1 μl

[00362] Á. D. 27 μl

[00363] Total 40 μl

[00364] Composição da reação de ligação

[00365] pMMA401 1 μl

[00366] Fragmento de inserto 2 μl

[00367] Mistura de Ligação (fabricada pela Takara) 3 μl

[00368] Total 6 μl

[00369] A transformação da cepa de E. coli JM109 foi efetuada u- sando uma solução de reação de ligação misturada na composição acima mencionada. O plasmídio foi extraído do transformante obtido. Após o tratamento com a enzima de restrição Sse8387I, a eletroforese em agarose foi efetuada, e foi confirmado que um fragmento do tamanho-alvo está sendo inserido. Ele foi confirmado como sendo o plas- mídio-alvo a partir da análise da sequência de nucleotídeos da região de ligação do fragmento de inserto do plasmídio obtido, e o presente plasmídio foi denominado pACDAAT1.

[00370] Um total de seis plasmídios para a coexpressão de ACD e AAT de diferentes sequências (pACDAAT2, pACDAAT3, pACDAAT4, pACDAAT6 e pACDAAT8) foi preparado usando a mesma técnica que a técnica acima mencionada (referir-se à FIG. 5).

Exemplo 19: Produção do metacrilato de butila a partir de recombinante que coexpressa ACD e AAT

[00371] A cepa DMA008 obtida em (3) do Exemplo de Referência 6 foi transformada pelos plasmídios pACDAAT1, pACDAAT2, pACDA- AT3, pACDAAT4, pACDAAT6 e pACDAAT8, respectivamente. Utilizando os recombinantes obtidos (DMA008/pACDAAT1, DMA008/pACDAAT2, DMA008/pACDAAT3, DMA008/pACDAAT4, DMA008/pACDAAT6 e DMA008/pACDAAT8), a produção do éster de ácido metacrílico foi efetuada pela reação de micro-organismo em repouso. Além disso, o DMA008/pLK005 foi usado como um controle.

[00372] A 2 ml do meio de cultura líquido LB Km 10 (tubo de teste Wassermann), 1 anel de inoculação foi inoculado, e foi cultivado por 2 dias a 30°C com um agitador rotativo (180 rpm) sob condições aeróbi- cas (pré-cultura). A 100 mL de LB Km 10 (100 mL de meio de cultu- ra/frasco de três gargalos de 500 mL), 1 ml do pré-caldo foi inoculado, e o cultivo foi efetuado por 3 dias a 30°C em um ag itador rotativo (230 rpm) sob condições aeróbicas (cultura principal).

[00373] Após o cultivo principal, 40 mL do caldo principal foram transferidos para um tubo cônico de 50 mL, e centrifugados (12.000 rpm, 10 min), para obter a célula bacteriana. Usando esta célula bacte- riana, a reação abaixo foi efetuada. A um frasco de amostra de vidro de 10 ml, foi adicionado 1 ml da solução de reação para realizar a reação por 18 horas, a 30°C, em um agitador rotativo ( 180 rpm), sob condições aeróbicas.

Composição da Solução de Reação

[00374] DO630 = 10, célula bacteriana (concentração final)

[00375] 5,0 g/l ácido 2-oxoisovalérico (concentração final)

[00376] 40 mM de álcool (concentração final)

[00377] 50 mM de tampão de fosfato de sódio / pH 7,5 (concentra ção final)

[00378] O n-butanol foi usado como o álcool.

[00379] Após a reação, 1 mL de acetonitrila foi adicionado à solução de reação e bem misturado, seguido por filtragem usando um filtro de seringa DISMIC/tamanho de poro 0,45 μm (fabricado pela ADVAN- TEC), e então analisado com a análise por HPLC descrita no Exemplo 9B. Os resultados da análise do produto após 18 horas são mostrados na Tabela 10.

[00380] Formação do metacrilato de butila a partir de recombinante que coexpressa ACD e AAT [Tabela 10]

Exemplo 20: Produção de éster de ácido metacrílico a partir de recom-binante que coexpressa ACD e AAT

[00381] A cepa DMA008 obtida em (3) do Exemplo de Referência 6 foi transformada pelo plasmídio pACDAAT1, respectivamente. Usando o recombinante obtido (DMA008/pACDAAT1), a produção de éster de ácido metacrílico foi efetuada pela reação de micro-organismo em repouso. Além disso, o DMA008/pLK005 foi usado como um controle. Usando o método descrito no Exemplo 19, o cultivo do recombinante foi realizado para obter a célula bacteriana.

[00382] Composição da Solução de Reação

[00383] DO630 = 10, célula bacteriana (concentração final)

[00384] 5,0 g/l de ácido 2-oxoisovalérico (concentração final)

[00385] 40 mM de álcool (concentração final)

[00386] 50 mM de tampão de fosfato de sódio / pH 7,5 (concentra ção final)

[00387] O n-butanol, o isobutanol e o álcool 2-etil-hexílico foram usados como o álcool.

[00388] Após a reação, 1 mL de acetonitrila foi adicionado à solução de reação e bem misturado, seguido por filtragem usando um filtro de seringa DISMIC/tamanho de poro 0,45 μm (fabricado pela ADVAN- TEC), e então analisado com a análise por HPLC descrita no Exemplo 9B. Os resultados da análise do produto após 18 horas são mostrados na Tabela 11.

[00389] Formação de éster de ácido metacrílico a partir de recom- binante que coexpressa ACD e AAT [Tabela 11]

Exemplo Comparativo 1: Reação de síntese do éster de ácido metacrílico a partir de extrato sem célula recombinante do gene para AAT derivado de levedura

[00390] Os plasmídios que expressam o gene para AAT derivado de levedura foram preparados similarmente ao Exemplo 6 (Tabela 12), e a E. coli foi transformada usando estes para obter o recombinante que expressa AAT.

[00391] Plasmídio de expressão do gene para AAT derivado de levedura [Tabela 12]

[00392] O extrato sem célula foi preparado similarmente ao Exemplo 7, e a reação de síntese do metacrilato de butila foi efetuada com a metacrilil-CoA e o n-butanol como substrato, similarmente ao Exemplo 8. Como seu resultado, a formação de metacrilato de butila não foi reconhecida. Por outro lado, no caso de estabelecer a acetil-CoA e o n- butanol como substrato, a formação de acetato de butila foi reconhecida.

[00393] Formação do éster usando o recombinante com gene para AAT derivado de levedura [Tabela 13]

[00394] SEQ ID NO. 11: MMA-044

[00395] SEQ ID NO. 12: MMA-045

[00396] SEQ ID NO. 13: MMA-003

[00397] SEQ ID NO. 14: MMA-004

[00398] SEQ ID NO. 15: MMA-031

[00399] SEQ ID NO. 16: MMA-032

[00400] SEQ ID NO. 17: MAA-15

[00401] SEQ ID NO. 18: MAA-16

[00402] SEQ ID NO. 19: GB-138

[00403] SEQ ID NO. 20: GB-139

[00404] SEQ ID NO. 21: GB-140

[00405] SEQ ID NO. 22: GB-141

[00406] SEQ ID NO. 23: MMA-061

[00407] SEQ ID NO. 24: MMA-062

[00408] SEQ ID NO. 25: MMA-063

[00409] SEQ ID NO. 26: MMA-064

[00410] SEQ ID NO. 27: MMA-069

[00411] SEQ ID NO. 28: MMA-070

[00412] SEQ ID NO. 29: MMA-133

[00413] SEQ ID NO. 30: MMA-131

Claims (4)

1. Método para produzir éster de ácido metacrílico, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de produção de metacrilil-CoA a partir de isobutiril-CoA ou 3-hidróxi-isobutiril-CoA por ação da acil-CoA desidrogenase (ACD) ou enoil-CoA hidratase (ECH), e uma etapa de sintetizar o éster de ácido metacrílico fazendo com que um álcool ou fenol tendo a fórmula R-OH atue sobre a metacrilil-CoA sob a presença de uma álcool aciltransferase (AAT), em que R representa um grupo hidrocarboneto C1-20 linear ou ramificado de um tipo não cíclico saturado ou insaturado ou de um tipo cíclico saturado ou insaturado, em que a álcool aciltransferase é de origem de planta, em que a planta pertence a qualquer gênero selecionado do grupo que consiste em Musa e Malus.

2. Método para produzir éster de ácido metacrílico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta é qualquer uma selecionada do grupo que consiste em banana e maçã.

3. Método para produzir éster de ácido metacrílico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que se utiliza um micro-organismo geneticamente modificado que tenha sido transformado com o gene AAT.

4. Método para produzir éster de ácido metacrílico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que se utiliza um micro-organismo que pertence ao gênero Rhodococcus como o microorganismo geneticamente modificado que tenha sido transformado com o gene AAT.

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