KR20140091740A - 메타크릴산에스테르의 제조 방법 - Google Patents

메타크릴산에스테르의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

생체 촉매에 의한 메타크릴산에스테르의 제조 방법으로서, 알코올 아실 트랜스페라아제의 존재 하, 메타크릴릴-CoA에 알코올 또는 페놀류를 작용시켜서, 메타크릴산에스테르를 합성하는 공정을 포함하는 메타크릴산에스테르의 제조 방법을 제공한다. 이 제조 방법에 의하면, 종래의 화학 제조 프로세스와 비교하여, 에너지, 자원, 환경에 대한 부하를 현저히 저감할 수 있고, 또한 효율적으로 메타크릴산에스테르를 제조하는 것이 가능해진다.

Description

메타크릴산에스테르의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING METHACRYLIC ACID ESTER}
본 발명은 생체 촉매를 사용한 메타크릴산에스테르의 제조 방법에 관한 것이다.
메타크릴산에스테르는, 주로 아크릴 수지의 원료로서 사용되고 있으며, 도료, 접착제, 수지 개질제 등의 분야의 공단량체로서도 많은 수요가 있다. 공업적인 제법으로서는 몇 가지의 방법이 있으며, 예를 들어 아세톤 및 시안화수소를 원료로 하는 ACH(아세톤시아노히드린)법, 이소부틸렌 및 tert-부틸알코올을 원료로 하는 직접 산화법이 알려져 있다. 이들 화학적인 제조 방법은, 화석 원료에 의존하고 있고, 또한 많은 에너지를 필요로 한다.
최근 들어, 지구 온난화 방지 및 환경보호의 관점에서, 종래의 화석 원료의 대체가 되는 탄소원으로서, 바이오매스로부터 다양한 화학 제품을 제조하는 기술이 주목받고 있다. 메타크릴산에스테르도 바이오매스 원료로부터의 제조가 기대되고 있지만, 생체 촉매를 사용한 바이오매스 원료로부터의 구체적인 제조예는 보고되어 있지 않다.
예를 들어, 천연에 존재하는 미생물을 이용하여, 당 등의 천연물로부터 메타크릴산의 전구체가 되는 2-히드록시이소부티르산 및 3-히드록시이소부티르산을 생산하는 방법이 제안되어 있다(특허문헌 1, 2 및 비특허문헌 1 참조). 그러나, 이들 방법은, 전구체를 탈수하여 메타크릴산을 생성하는 공정을 여전히 화학적인 방법에 의존하는 것이다.
또한, 복수의 효소 유전자를 도입한, 천연에 존재하지 않는 재조합 미생물을 사용하여 글루코오스로부터 메타크릴산을 생성하는 방법이 제안되어 있으나, 이들은 기지의 효소 반응 및 그것으로부터 유추되는 가상의 효소 반응을 조합한 것이며, 실증된 것이 아니다(특허문헌 3 내지 5 참조). 특히 특허문헌 5에는, 일반적인 에스테르 생성 활성을 갖는 다종의 생체 촉매(가수 분해 효소, 왁스 에스테르 합성 효소, 알코올 아세틸 트랜스페라아제)가 예시되고 있지만, 예시의 생체 촉매가 메타크릴산에스테르의 합성 활성을 가지는지 여부는 불분명하였다.
또한, 특허문헌 6에는, 아크릴릴-CoA와 알코올의 존재 하, 가수 분해 효소를 작용시켜서, 아크릴산에스테르를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 동 문헌에는 메타크릴산에스테르에 대해서도 마찬가지로 제조가 가능하다는 취지가 시사되어 있다. 그러나, 생체 촉매의 다양성, 기질 특이성을 고려하면, 일부의 가수 분해 효소로 아크릴산에스테르의 제조가 가능한 것을 나타낸 것에 지나지 않고, 구조가 상이한 메타크릴산에스테르가 마찬가지로 가수 분해 효소에 의해 제조 가능한지는 불분명하였다. 또한, 반응 기구가 상이한 다른 종류의 생체 촉매로 제조할 수 있는지 여부는 전혀 불분명하였다. 또한, 특허문헌 6에 기재된 가수 분해 효소에 의해 에스테르를 합성했을 경우, 생성된 에스테르가 애당초 가수 분해 활성으로 분해되어버릴 것이 예상되어, 효과적인 제조 방법이라고는 생각하기 어렵다.
한편, 알코올 아실 트랜스페라아제는, 프루티 플레이버 합성 효소로서 알려져 있다. 특허문헌 7에는, 특정한 과실 중에 포함되는 동 효소 유전자를 동정하여, 과실 플레이버인 각종 에스테르의 합성 방법을 제안하고 있다. 그러나, 메타크릴산에스테르가 이러한 효소로 합성 가능한지 여부는 보고되어 있지 않아 전혀 불분명하였다.
이상과 같이, 몇 가지의 제안 또는 검토가 이루어져 있지만, 실제로 미생물에 의해 메타크릴산 유도체를 제조한 예는 없어, 유효한 제조 방법의 확립이 요망되고 있었다.
국제 공개 제2007/110394호 팸플릿 국제 공개 제2008/145737호 팸플릿 국제 공개 제2009/135074호 팸플릿 국제 공개 제2011/031897호 팸플릿 국제 공개 제2012/135789호 팸플릿 국제 공개 제2007/039415호 팸플릿 국제 공개 제00/32789호 팸플릿 일본 특허 공개 제2011-200133호 공보 일본 특허 공개 평5-64589호 공보 일본 특허 공개 평10-337185호 일본 특허 공개 평10-24867호
Green Chemistry, 2012, 14, 1942-1948 Methods in Enzymology, 2000, 324, 73-79 Botanical Journal of the Linnean Society, 2009, 161, 105121 Microbiology, 1999, 145, 2323-2334
본 발명은 생체 촉매에 의한 메타크릴산에스테르의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
알코올 아실 트랜스페라아제가 메타크릴산에스테르를 합성할 수 있는 활성을 갖는 것을 알아내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 알코올 아실 트랜스페라아제의 존재 하, 메타크릴릴-CoA에 알코올 또는 페놀류를 작용시켜서, 메타크릴산에스테르를 합성하는 공정을 포함하는 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(2) 메타크릴산에스테르를 0.001mM 이상 축적시키는, (1)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(3) 이소부티릴-CoA 또는 3-히드록시이소부티릴-CoA로부터 메타크릴릴-CoA를 제조하는 공정을 더 포함하는, (1) 또는 (2)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(4) 이소부티릴-CoA가 2-옥소이소발레르산으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는, (3)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(5) 알코올 아실 트랜스페라아제가 식물 유래인, (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(6) 식물이, 생강(Zingiberales)목, 장미(Rosales)목, 철쭉(Ericales)목, 박(Cucurbitales)목, 유채(Brassicales)목 및 녹나무(Laurales)목으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 목에 속하는 것인, (5)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(7) 식물이, 파초(Musaceae)과, 장미(Rosaceae)과, 철쭉(Ericaceae)과, 다래나무(Actinidiaceae)과, 박(Cucurbitaceae)과, 파파야(Caricaceae)과 및 녹나무(Lauraceae)과로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 과에 속하는 것인, (5)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(8) 식물이, 파초(Musa)속, 네덜란드 딸기(Fragaria)속, 사과(Malus)속, 벚나무(Prunus)속, 배나무(Pyrus)속, 산앵도나무(Vaccinium)속, 다래나무(Actinidia)속, 오이(Cucumis)속, 파파야(Carica)속 및 페르세아(Persea)속으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 속에 속하는 것인, (5)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(9) 식물이, 파초속, 사과속, 벚꽃속, 배속, 산앵도나무속, 다래나무속, 오이속, 파파야속 및 페르세아속으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 속에 속하는 것인, (5)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(10) 식물이, 파초속, 사과속, 배속, 다래나무속, 오이속, 파파야속 및 페르세아속으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 속에 속하는 것인, (5)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(11) 식물이, 바나나, 딸기, 사과, 매실, 서양배, 블루베리, 키위, 멜론, 파파야 및 아보카도로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인, (5)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(12) 식물이, 바나나, 사과, 매실, 서양배, 블루베리, 키위, 멜론, 파파야 및 아보카도로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인, (5)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(13) 식물이, 바나나, 사과, 서양배, 키위, 멜론, 파파야 및 아보카도로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인, (5)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(14) 알코올 아실 트랜스페라아제를 발현하도록 유전자 도입된 유전자 재조합 미생물을 사용하는, (1) 내지 (13) 중 어느 한 항에 기재된 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
또한, 본 발명은 다른 일측면에서 이하와 같다.
(15) 로도코커스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물을 사용하여 메타크릴산에스테르를 제조하는 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(16) 로도코커스속에 속하고, 서열 번호 31에 나타내는 16SrDNA의 염기 서열에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 16SrDNA를 갖는 미생물을 사용하는, (15)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(17) 로도코커스속에 속하는 미생물이, 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis)인, (15) 또는 (16)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(18) 로도코커스속에 속하는 미생물로서, 당해 미생물의 유도주를 사용하는, (15) 또는 (16)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(19) 로도코커스속에 속하는 미생물이, 로도코커스 에리트로폴리스 PR-4주 또는 그 유도주인, (18)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(20) 유도주가, 이하에 나타낸 (a) 또는 (b) 중 적어도 한쪽의 개변을 갖는 유전자 개변주인, (18)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
(a) 분지쇄 케토산 탈수소 효소 유전자 및/또는 아실 CoA 데히드로게나제 유전자의 도입에 의한 개변.
(b) 에노일 CoA 히드라타제 유전자, 3-히드록시이소부티릴 CoA 히드로라제 유전자 및/또는 3-히드록시이소부티르산 데히드로게나제 유전자를 결손 또는 불활성화하는 개변.
(21) 유도주가, 알코올 아실 트랜스페라아제 및/또는 아실 CoA 데히드로게나제 발현용 플라스미드를 갖는, (19) 또는 (20)의 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
본 발명에 의해, 생체 촉매에 의한 메타크릴산에스테르의 제조가 가능하게 된다. 본 발명의 제조 방법과 생체내 대사를 조합함으로써, 메타크릴산에스테르의 발효 생산도 달성할 수 있다. 그 결과, 종래의 화학 제조 프로세스와 비교하여, 에너지, 자원, 환경에 대한 부하를 현저히 저감할 수 있고, 또한 효율적으로 메타크릴산에스테르를 제조하는 것이 가능해진다.
도 1은 3-히드록시이소부티릴-CoA로부터 메타크릴산에스테르로의 제조 공정을 도시하는 도면이다.
도 2는 2-옥소이소발레르산으로부터 메타크릴산에스테르로의 제조 공정을 도시하는 도면이다.
도 3은 LigD 호몰로그 유전자 결실용 플라스미드의 구조를 도시하는 도면이다.
도 4는 인 퓨전(In Fusion)법을 사용한 유전자 결실용 플라스미드의 제작 방법을 설명하는 도면이다.
도 5는 ACD-AAT 양쪽 발현용 플라스미드의 구조를 도시하는 도면이다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 적합한 형태에 대하여 도면을 참조하면서 설명한다. 또한, 이하에 설명하는 실시 형태는, 본 발명의 대표적인 실시 형태의 일례를 나타낸 것이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 좁게 해석되지는 않는다.
1. 알코올 아실 트랜스페라아제에 의한 메타크릴산에스테르의 제조 방법
[메타크릴산에스테르]
본 발명에서, 메타크릴산에스테르란, 식 1로 나타내는 화합물이다. 식 1에서, R은 직쇄 또는 분지의 탄소수 1 내지 20의 탄화수소기를 나타낸다. 탄화수소기는, 포화 또는 불포화의 비환식이어도 되고, 포화 또는 불포화의 환식이어도 된다. 바람직하게는 직쇄 또는 분지쇄의 탄소수 1 내지 10의 비치환 알킬기, 아르알킬기 또는 아릴기이다. 특히 바람직하게는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, n-펜틸기, 이소펜틸기, tert-펜틸기, n-헥실기, 이소헥실기, 2-헥실기, 디메틸부틸기, 에틸부틸기, 헵틸기, 옥틸기, 2-에틸헥실기의 탄소수 1 내지 8의 알킬기, 벤질기 또는 페닐기이다.
CH2=C(CH3)COO-R (식 1)
「메타크릴산」 (IUPAC명: 2-메틸-2-프로펜산)은, 하기식을 갖는 화합물을 의미하고, 그 임의의 염 또는 이온화한 형태도 포함한다. 메타크릴산의 염으로서는, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 및 마그네슘염 등을 들 수 있다.
CH2=C(CH3)COOH
[메타크릴릴-CoA]
본 발명에서, 메타크릴릴-CoA란, 이하의 화학식으로 표시되는 화합물이다. 메타크릴릴-CoA는, 생체 내에서는 발린의 대사 중간체로서 알려져 있다. 본 발명에서 사용하는 메타크릴릴-CoA는 공지 또는 신규의 방법으로 제조한 것으로도 할 수 있다. 그 합성 방법으로서는 무수 메타크릴산과 조효소 A를 유기 화학적으로 합성하는 방법(Methods in Enzymology. 324, 73-79(2000)) 또는 효소 반응을 사용한 합성 방법이 알려져 있다.
Figure pct00001
본 발명에서는, 이들 중에서도, 이소부티릴-CoA를 원료로 아실 CoA 데히드로게나제(EC 1.3.99.3)(이하, ACD라고 함)의 작용에 의해 변환된 메타크릴릴-CoA(도 2 참조) 또는 3-히드록시이소부티릴-CoA로부터 에노일 CoA 히드라타제(EC 4.2.1.17)(이하, ECH라고 함)의 작용에 의해 변환되는 메타크릴릴-CoA(도 1 참조)을 적절하게 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은, 이소부티릴-CoA 또는 3-히드록시이소부티릴-CoA로부터 메타크릴릴-CoA를 제조하는 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다. 효소에 의한 연속 반응에 의해, 수율 향상 및 불순물 억제로 이어짐과 함께, 생체에 대하여 독성이 높은 메타크릴산을 경유 또는 부생하지 않고 메타크릴산에스테르를 직접 합성하는 것이 가능하게 된다. 상기 방법에 의해, 환경 부하가 낮은 생체내 연속 반응(대사 발효)에서의 메타크릴산에스테르의 제조를 달성할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 이소부티릴-CoA는, 2-옥소이소발레르산으로부터 제조된 것을 사용할 수 있다(도 2 참조). 즉, 본 발명의 방법은, 2-옥소이소발레르산으로부터 이소부티릴-CoA를 제조하는 공정을 더 포함하고 있어도 된다.
[알코올·페놀류]
본 발명에서의 메타크릴산에스테르의 제조 원료가 되는 알코올 또는 페놀류는 이하의 식 2로 나타내는 화합물이다. 알코올 또는 페놀류의 구조는, 메타크릴산에스테르에 대응하므로, 그 구조는, 상기 식 1의 R과 동일한 정의이며, 직쇄 또는 분지의 탄소수 1 내지 20의 탄화수소기를 나타낸다. 탄화수소기는, 포화 또는 불포화의 비환식이어도 되고, 포화 또는 불포화의 환식이어도 된다. 바람직하게는 직쇄 또는 분지의 탄소수 1 내지 10의 비치환 알코올, 아르알킬알코올 또는 페놀류이며, 특히 바람직하게는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, sec-부탄올, tert-부탄올, n-펜틸알코올, 이소펜틸알코올, tert-펜틸알코올, n-헥실알코올, 이소헥실알코올, 2-헥실알코올, 디메틸부틸알코올, 에틸부틸알코올, 헵틸알코올, 옥틸알코올, 2-에틸헥실알코올의 탄소수 1 내지 8의 알킬알코올, 벤질알코올 또는 페놀이다.
R-OH (식 2)
[알코올 아실 트랜스페라아제]
본 발명의 알코올 아실 트랜스페라아제(이하, AAT라고 함)는, 알코올 또는 페놀류에 아실-CoA의 아실기를 전이시켜서 에스테르를 합성하는 촉매 작용을 갖는 효소이다. AAT는, 다양한 과일에서의 에스테르의 생성에 관여하고 있다고 알려져 있다. AAT는 생강목(바나나), 장미목(딸기, 사과, 배, 복숭아), 박목(멜론), 철쭉목(키위), 꿀풀목(올리브), 가지목(토마토), 무환자나무목(레몬, 망고) 등의 식물에 존재하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용하는 AAT는, 메타크릴릴-CoA와 알코올 또는 페놀류를 원료로, 메타크릴산에스테르를 제조하는 능력을 갖는 생체 유래의 촉매라면, 특별히 한정되지 않고 그 종류 및 기원을 묻지 않는다. 효소원으로서는 식물 유래의 것이 바람직하고, 그 중에서도 피자 식물로 분류되는 것이 바람직하다.
본 발명에 적합한 AAT는 이하의 방법에 의해, 상기 식물에서 용이하게 선택하는 것이 가능하다. 조직의 적당한 부위를 필요에 따라서 재단함으로써 취득한다. 그 재단 부위에 메타크릴릴-CoA와 식 2로 표현되는 알코올 또는 페놀류를 포함하는 용액을 첨가하여 진탕하고, 일정 시간 반응시킨다. 그 반응액 내의 메타크릴산에스테르의 유무를 GC(가스 크로마토그래피)에 의해 확인함으로써, 합성 활성을 확인 가능하다. 구체적으로는, 예를 들어 과육 또는 과피를 재단하고, 거기에 1 내지 10mM의 메타크릴릴-CoA, 0.35M KCl 및 5 내지 50배 몰량의 n-부탄올을 포함하는 용액을 첨가하여, 30℃에서 1 내지 10시간 진탕한다. 반응 종료 후, GC에 의해 메타크릴산에스테르의 유무를 확인함으로써, 본 발명에 응용 가능한 AAT를 선택할 수 있다.
본 발명에 적합한 AAT의 효소원으로서는, 예를 들어 생강목(Zingiberales), 장미목(Rosales), 철쭉목(Ericales), 박목(Cucurbitales), 유채목(Brassicales), 녹나무목(Laurales), 벼목(Poales), 야자목(Arecales), 아스파라거스목(Asparagales), 범의귀목(Saxifragales), 석죽목(Caryophyllales), 포도목(Vitales), 말피기목(Malpighiales), 괭이밥목(Oxalidales), 콩목(Fabales), 무환자나무목(Sapindales), 아욱목(Malvales), 도금양목(Myrtales), 미나리아재비목(Ranunculales), 가지목(Solanales), 꿀풀목(Lamiales), 용담목(Gentianales) 및 국화목(Asterales)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 목에 속하는 것이다. 이들 중에서, 바람직하게는 생강목(Zingiberales), 장미목(Rosales), 철쭉목(Ericales), 박목(Cucurbitales), 유채목(Brassicales) 및 녹나무목(Laurales)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 목에 속하는 것이다.
생강목에 속하는 것으로서는 파초과(Musaceae) 및 생강과(Zingiberaceae), 장미목에 속하는 것으로서는 장미과(Rosaceae) 및 뽕나무과(Moraceae), 철쭉목에 속하는 것으로서는 철쭉과(Ericaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 감나무과(Ebenaceae) 및 동백과(Theaceae), 박목에 속하는 것으로서는 박과(Cucurbitaceae), 유채목에 속하는 것으로서는 파파야과(Caricaceae) 및 유채과(Brassicaceae), 녹나무목에 속하는 것으로서는 녹나무과(Lauraceae), 벼목에 속하는 것으로서는 파인애플과(Bromeliaceae) 및 벼과(Poaceae), 야자목에 속하는 것으로서는 야자과(Arecaceae), 아스파라거스목에 속하는 것으로서는 난초과(Orchidaceae) 및 붓꽃과(Iridaceae), 범의귀목에 속하는 것으로서는 까치밥나무과(Grossulariaceae), 석죽목에 속하는 것으로서는 석죽과(Caryophyllaceae), 포도목에 속하는 것으로서는 포도과(Vitaceae), 말피기아목에 속하는 것으로서는 말피기아과(Malpighiaceae), 시계꽃과(Passifloraceae), 대극과(Euphorbiaceae) 및 버드나무과(Salicaceae), 괭이밥목에 속하는 것으로서는 괭이밥과(Oxalidaceae), 콩목에 속하는 것으로서는 콩과(Fabaceae), 무환자나무목에 속하는 것으로서는 운향과(Rutaceae), 무환자나무과(Sapindaceae) 및 옻나무과(Anacardiaceae), 아욱목에 속하는 것으로서는 아욱과(Malvaceae), 도금양목에 속하는 것으로서는 부처꽃과(Lythraceae), 바늘꽃과(Onagraceae) 및 도금양과(Myrtaceae), 미나리아재비목에 속하는 것으로서는 미나리아재비과(Ranunculaceae) 및 양귀비과(Papaveraceae), 가지목에 속하는 것으로서는 가지과(Solanaceae), 꿀풀목에 속하는 것으로서는 물푸레나무과(Oleaceae), 마편초과(Verbenaceae) 및 꿀풀과(Lamiaceae), 용담목에 속하는 것으로서는 협죽도과(Apocynaceae), 국화목(Asterales)에 속하는 것으로서는 국화과(Asteraceae)의 식물이 바람직하다. 상기 식물의 근연종도 이용할 수 있다. 이들 중에서 더욱 바람직하게는, 파초과(Musaceae), 장미과(Rosaceae), 철쭉과(Ericaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 박과(Cucurbitaceae), 파파야과(Caricaceae) 및 녹나무과(Lauraceae)에 속하는 식물이다.
구체적으로는 파초과에 속하는 것으로서는 파초(Musa)속, 생강과(Zingiberaceae)에 속하는 것으로서는 생강속(Zingiber), 장미과에 속하는 것으로서는 네덜란드 딸기(Fragaria)속, 사과(Malus)속, 벚나무(Prunus)속, 배나무(Pyrus)속, 비파(Eriobotrya)속, 명자나무(Chaenomeles)속, 산딸기(Rubus)속 및 장미(Rosa)속, 뽕나무과(Moraceae)에 속하는 것으로서는 무화과나무(Ficus)속, 철쭉과에 속하는 것으로서는 산앵도나무(Vaccinium)속, 다래나무과에 속하는 것으로서는 다래나무(Actinidia)속, 감나무과에 속하는 것으로서는 감나무(Diospyros)속, 동백과에 속하는 것으로서는 동백나무(Camellia)속, 박과에 속하는 것으로서는 오이(Cucumis)속 및 수박(Citrullus)속, 파파야과에 속하는 것으로서는 파파야(Carica)속 및 바스콘셀레아(Vasconcellea)속, 유채과에 속하는 것으로서는 애기장대(Arabidopsis)속, 녹나무과에 속하는 것으로서는 페르세아(Persea)속, 파인애플과에 속하는 것으로서는 아나나스속(Ananas), 벼과에 속하는 것으로서는 벼(Oryza)속, 소맥(Triticum)속, 대맥(Hordeum)속, 옥수수(Zea)속, 수수(Sorghum)속 및 숲개밀(Brachypodium)속, 야자과에 속하는 것으로서는 코코스(Cocos)속, 난초과에 속하는 것으로서는 반다(Vanda)속, 붓꽃과에 속하는 것으로서는 붓꽃(Iris)속, 까치밥나무과에 속하는 것으로서는 까치밥나무(Ribes)속, 패랭이꽃과에 속하는 것으로서는 안개꽃속(Gypsophila), 포도과에 속하는 것으로서는 포도(Vitis)속, 말피기아과에 속하는 것으로서는 말피기아(Malpighia)속, 시계꽃과에 속하는 것으로서는 꽃시계덩굴(Passiflora)속, 대극과에 속하는 것으로서는 아주까리(Ricinus)속, 버드나무과에 속하는 것으로서는 사시나무(Populus)속, 괭이밥과에 속하는 것으로서는 괭이밥(Averrhoa)속, 콩과에 속하는 것으로서는 개자리(Medicago)속, 루피너스(Lupinus)속, 대두(Glycine)속 및 클리토리아(Clitoria)속, 운향과에 속하는 것으로서는 귤(Citrus)속 및 아에글레(Aegle)속, 무환자나무과에 속하는 것으로서는 여지(Litchi)속, 옻나무과에 속하는 것으로서는 망고(Mangifera)속, 아욱과에 속하는 것으로서는 두리안(Durio)속 및 카카오(Theobroma)속, 부처꽃과에 속하는 것으로서는 석류나무(Punica)속, 바늘꽃과에 속하는 것으로서는 클라키아(Clarkia)속, 도금양과에 속하는 것으로서는 프시디움(Psidium)속, 미나리아재비과에 속하는 것으로서는 노루삼(Actaea)속, 양귀비과에 속하는 것으로서는 양귀비(Papaver)속, 가지과에 속하는 것으로서는 가지(Solanum)속, 고추(Capsicum)속, 담배(Nicotiana)속 및 페튜니아(Petunia)속, 물푸레나무과에 속하는 것으로서는 올리브(Olea)속, 마편초과에 속하는 것으로서는 글란듈라리아(Glandularia)속, 꿀풀과에 속하는 것으로서는 배암차즈기(Salvia)속, 협죽도과에 속하는 것으로서는 라우볼피아(Rauvolfia)속 및 카타란투스(Catharanthus)속, 국화과에 속하는 것으로서는 카마에멜룸(Chamaemelum)속의 식물이 바람직하다. 그 중에서도, 파초속, 네덜란드 딸기속, 사과속, 벚꽃속, 배속, 산앵도나무속, 다래나무속, 오이속, 파파야속 또는 페르세아속에 속하는 식물이 보다 바람직하다.
또한 그중에서도, 파초속, 사과속, 배속, 다래나무속, 오이속, 파파야속 또는 페르세아 속에 속하는 식물이 특히 바람직하다.
또한, 구체적으로는 파초속에 속하는 것으로서는 바나나(Musax paradisiaca), 파초(Musabasjoo), 꽃바나나(Musacoccinea) 및 바나나(Musaacuminata), 생강속에 속하는 것으로서는 생강(Zingiberofficinale), 네덜란드 딸기속에 속하는 것으로서는 딸기(Fragariaxananassa), 버지니아 딸기(Fragariavirginiana), 칠레딸기(Fragariachiloensis) 및 야생딸기(Fragariavesca), 사과속에 속하는 것으로서는 사과(Maluspumila, Malusdomestica, Malusbaccata), 할리아나 꽃사과(Malushalliana), 꽃아그배나무(Malusfloribunda) 및 꽃사과(Malusprunifolia), 벚꽃속에 속하는 것으로서는 매실(Prunusmume), 단양앵두(Prunusavium), 복숭아(Prunuspersica), 살구(Prunusarmeniaca), 아몬드(Prunusdulcis), 자두(Prunussalicina) 및 서양자두(Prunusdomestica), 배속에 속하는 것으로서는 서양배(Pyruscommunis), 배(Pyruspyrifolia), 콩배나무(Pyruscalleryana) 및 야생 서양배(Pyruspyraster), 비파속에 속하는 것으로서는 비파(Eriobotryajaponica), 명자나무속에 속하는 것으로서는 모과나무(Chaenomelessinensis), 산딸기속에 속하는 것으로서는 래즈베리(Rubusidaeus) 및 블랙 래즈베리(Rubusfruticosus), 장미속에 속하는 것으로서는 해당화(Rosarugosa), 무화과나무속에 속하는 것으로서는 무화과나무(Ficuscarica), 산앵도나무속에 속하는 것으로서는 블루 베리(Vacciniumcorymbosum, Vacciniumangustifolium), 빌 베리(Vacciniummyrtillus), 월귤(Vacciniumvitis-idaea) 및 애기월귤(Vacciniumoxycoccos), 다래나무속에 속하는 것으로서는 키위(Actinidiachinensis, Actinidiadeliciosa), 다래나무(Actinidiaarguta), 섬다래나무(Actinidiarufa) 및 다래나무(Actinidiapolygama), 감나무속에 속하는 것으로서는 감나무(Diospyroskaki), 동백속에 속하는 것으로서는 차나무(Camelliasinensis), 오이속에 속하는 것으로서는 오이(Cucumissativus), 멜론(Cucumismelo), 게르킨(Cucumisanguria) 및 뿔참외(Cucumismetulifer), 수박속에 속하는 것으로서는 수박(Citrulluslanatus), 파파야속에 속하는 것으로서는 파파야(Caricapapaya), 바스콘셀레아속에 속하는 것으로서는 마운틴 파파야(Vasconcelleacundinamarcensis), 애기장대속에 속하는 것으로서는 애기장대(Arabidopsisthaliana) 및 묏장대(Arabidopsislyrata), 페르세아속에 속하는 것으로서는 아보카도(Perseaamericana), 아나나스속에 속하는 것으로서는 파인애플(Ananascomosus), 벼속에 속하는 것으로서는 벼(Oryzasativa), 소맥속에 속하는 것으로서는 소맥(Triticumaestivum), 대맥속에 속하는 것으로서는 대맥(Hordeumvulgare), 옥수수속에 속하는 것으로서는 옥수수(Zeamays), 수수속에 속하는 것으로서는 수수(Sorghumbicolor), 숲개밀속에 속하는 것으로서는 야생잔디(Brachypodiumdistachyon), 야자나무속에 속하는 것으로서는 코코넛(Cocosnucifera), 반다속에 속하는 것으로서는 반다(Vandahybridcultivar), 붓꽃속에 속하는 것으로서는 네덜란드 붓꽃(Irisxhollandica), 까치밥나무속에 속하는 것으로서는 블랙커런트(카시스)(Ribesnigrum), 안개꽃속에 속하는 것으로서는 안개꽃(Gypsophilapaniculata, Gypsophilaelegans), 포도속에 속하는 것으로서는 포도(Vitisvinifera, Vitislabrusca), 말피기아속에 속하는 것으로서는 아세롤라(Malpighiaglabra), 시계풀속에 속하는 것으로서는 패션프루츠(Passifloraedulis), 아주까리속에 속하는 것으로서는 아주까리(Ricinuscommunis), 사시나무속에 속하는 것으로서는 포퓰러(Populustrichocarpa), 괭이밥속에 속하는 것으로서는 스타 프루츠(Averrhoacarambola), 개자리속에 속하는 것으로서는 알팔파(Medicagotruncatula), 루피너스속에 속하는 것으로서는 루피너스(흰꽃 루피너스)(Lupinusalbus), 대두속에 속하는 것으로서는 대두(Glycinemax), 클리토리아속에 속하는 것으로서는 클리토리아(Clitoriaternatea), 귤속에 속하는 것으로서는 레몬(Citruslimon), 영귤(Citrussudachi), 카보스(Citrussphaerocarpa), 자몽(Citrusxparadisi), 유자(Citrusjunos), 라임(Citrusaurantifolia), 온주 밀감(Citrusunshiu) 및 오렌지(Citrussinensis), 아에글레속에 속하는 것으로서는 아에글레 마르멜로스(Aeglemarmelos), 여지속에 속하는 것으로서는 리치(Litchichinensis), 망고속에 속하는 것으로서는 망고(Mangiferaindica), 두리안속에 속하는 것으로서는 두리안(Duriozibethinus), 카카오속에 속하는 것으로서는 카카오(Theobromacacao), 석류나무속에 속하는 것으로서는 석류나무(Punicagranatum), 클라키아속에 속하는 것으로서는 페어리 팬(fairyfans)(Clarkiabreweri) 및 레드 리본(Redribbons)(Clarkiaconcinna), 프시디움속에 속하는 것으로서는 구아바(Psidiumguajava), 노루삼속에 속하는 것으로서는 액태아 라세모사(Actaearacemosa), 양귀비속에 속하는 것으로서는 양귀비(Papaversomniferum), 오리엔탈 양귀비(Papaverorientale) 및 포엽 도깨비 양귀비(Papaverbracteatum), 가지속에 속하는 것으로서는 토마토(Solanumlycopersicum), 고추속에 속하는 것으로서는 피망(Capsicumannuum) 및 하바네로(Capsicumchinense), 담배속에 속하는 것으로서는 담배(Nicotianatabacum, Nicotianaattenuata), 페튜니아속에 속하는 것으로서는 페튜니아(Petuniaxhybrida), 올리브속에 속하는 것으로서는 올리브(Oleaeuropaea), 글란듈라리아속에 속하는 것으로서는 글란듈라리아 하이브리다(Glandulariaxhybrida), 배암차즈기속에 속하는 것으로서는 샐비아(Salviasplendens), 라우볼피아속에 속하는 것으로서는 인도사목(Rauvolfiaserpentina), 카타란투스속에 속하는 것으로서는 카타란투스(Catharanthusroseus), 카마에멜룸 속에 속하는 것으로서는 로먼 카모마일(Chamaemelumnobile)이 특히 바람직하다. 그 중에서도, 바나나, 딸기, 사과, 매실, 서양배, 블루 베리, 키위, 멜론, 파파야 및 아보카도가 바람직하다. 또한, 그 중에서도 바나나, 사과, 서양배, 키위, 멜론, 파파야 및 아보카도가 특히 바람직하다.
또한, 효소원으로서 식물을 그대로 사용하여 합성 반응을 행한 경우에 있어서, 탄소수 1 내지 2의 알코올을 기질로 하는 경우, 특히 사과속, 파파야속 및 페르세아속에 속하는 식물을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 다른 속에 속하는 식물보다 생성 효율이 높아지기 때문이다.
본 발명에서, 식물의 분류는 APG 식물 분류 체계 제3판(Botanical Journal of the Linnean Society, 2009, 161, 105121)에 따르는 것으로 한다.
본 발명에서, AAT를 반응에 제공할 때에는, 상기한 촉매 활성을 나타내는 한 그 사용 형태는 특별히 한정되지 않고 생체 조직 또는 그 처리물을 그대로 사용하는 것도 가능하다. 이러한 생체 조직으로서 식물체 전체, 식물 기관(예를 들어 과실, 잎, 꽃잎, 줄기, 종자 등), 식물 조직(예를 들어 과실 표피, 과육 등)을 사용할 수 있다. 그 처리물로서는 이들 생체 조직으로부터 AAT를 추출한 조 효소액 또는 정제 효소 등을 들 수 있다.
[AAT 활성 발현용 재조합 미생물]
또한, AAT를 반응에 제공할 때에는, 상기 AAT의 유전자를 단리하고, 예를 들어 일반적인 숙주 벡터계에 도입하여, 해당 벡터계에서 형질 전환한 미생물을 이용하는 것도 가능하다. 숙주로서는, 세균에서는 대장균, 로도코커스(Rhodococcus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 바실러스(Bacillus)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속 등을 들 수 있고, 효모에서는 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속, 시조사카로마이세스(Shizosaccharomyces)속, 피치아(Pichia)속, 사상균에서는 아스퍼질러스(Aspergillus)속 등을 들 수 있다. 이들 중에서 특히 대장균을 사용하는 것이 간편하고, 효율도 좋아 바람직하다.
AAT 유전자는 몇 가지 공표되어 있는 것이 있다(예를 들어, 특허문헌 7 참조). 해당 정보에 기초하여 DNA 프로브를 제작하고, 예를 들어 PCR에 사용하는 프라이머를 제작하여, PCR을 행함으로써 해당 유전자를 단리할 수도 있다. 또한, AAT 유전자의 염기 서열을 통상의 방법으로 전체 합성하는 것도 가능하다. 이들 유전자 정보가 공지인 AAT가 메타크릴산에스테르의 합성 활성을 가지는지 여부에 대해서는, 상기한 방법으로 마찬가지로 확인할 수 있다. 한편, 유전자 정보가 불분명한 AAT에 대해서는, AAT를 정제하고, 그 단백질을 바탕으로 유전자 공학적인 방법에 의해 유전자 정보를 얻을 수 있다.
본 발명에서, 바람직한 AAT 유전자로서는, 그 번역 산물이 메타크릴산에스테르를 제조하는 능력을 갖고 있으면, 특별히 한정되지 않고, 상기 AAT 효소원 중에서 적절히 선택된다. 특히 바람직하게는, AAT 사과 유래 AAT 유전자(서열 번호 2), 딸기 유래 AAT 유전자(서열 번호 4), 딸기 유래 AAT 유전자(서열 번호 6)를 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 AAT 유전자에는, 야생형의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 메타크릴릴-CoA와 알코올로부터 메타크릴산에스테르를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자도 포함된다.
여기서 용어 「수개」란, 1 내지 40개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 10개 이하를 말한다. 유전자에 변이를 도입하기 위해서는, 쿤켈(Kunkel)법이나 갭드 듀플레스(Gapped duplex)법 등의 공지 방법에 의해, 부위 특이적 돌연 변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 퀵체인지(QuikChange)TM 부위 지정 돌연변이유발 키트(Site-Directed Mutagenesis Kit)(스트라테이진사), 진테일러(GeneTailor)TM 부위 지정 돌연변이유발 시스템(Site-Directed Mutagenesis System)(인비트로젠사), 다카라 부위 지정 돌연변이유발 시스템(TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System)(뮤탄(Mutan)-K, 뮤탄-수퍼 익스프레스(Mutan-Super Express) Km 등: 다카라 바이오사) 등을 사용할 수 있다. 또는, 변이를 포함하는 서열을 갖는 유전자 전체를 인공 합성해도 된다.
본 발명에서, DNA의 염기 서열의 확인은, 관용의 방법에 의해 서열 결정함으로써 행할 수 있다. 예를 들어, 생거법에 기초하여, 적당한 DNA 시퀀서를 이용해서 서열을 확인하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명에서 AAT 유전자에는, 야생형의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 99.5% 이상, 더욱 바람직하게는 99.9% 이상의 동일성을 나타내고, 메타크릴릴-CoA와 알코올로부터 메타크릴산에스테르를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자도 포함된다.
또한, 본 발명에서 AAT 유전자에는, 야생형의 염기 서열에 대한 상보적인 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격한 조건에서 혼성화하여, 메타크릴릴-CoA와 알코올로부터 메타크릴산에스테르를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자도 포함된다. 상기한 엄격한 조건으로서는, 예를 들어 DNA를 고정한 나일론 막을, 6×SSC(1×SSC는 염화나트륨 8.76g, 시트르산나트륨 4.41g을 1리터의 물에 녹인 것), 1% SDS, 100μg/ml 연어 정자 DNA, 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 피콜을 포함하는 용액 중에서 65℃에서 20시간 프로브와 함께 보온하여 혼성화를 행하는 조건을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 당업자라면 이러한 버퍼의 염 농도, 온도 등의 조건 외에도, 기타의 프로브 농도, 프로브의 길이, 반응 시간 등의 여러 조건을 가미하여, 혼성화의 조건을 설정할 수 있다. 혼성화 후의 세정 조건으로서, 예를 들어 「2×SSC, 0.1% SDS, 42℃」, 「1×SSC, 0.1% SDS, 37℃」, 보다 엄격한 조건으로서는, 예를 들어 「1×SSC, 0.1% SDS, 65℃」, 「0.5×SSC, 0.1% SDS, 50℃」 등의 조건을 들 수 있다.
혼성화법의 상세한 수순에 대해서는, 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))], [Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons(1987-1997))] 등을 참조할 수 있다.
또한, 본 발명에서 AAT 유전자에는, 야생형의 염기 서열과 BLAST 등(예를 들어, 디폴트, 즉 초기 설정의 파라미터)을 사용하여 계산했을 때에, 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하고, 메타크릴릴-CoA와 알코올로부터 메타크릴산에스테르를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자도 포함된다. 또한, 상기 AAT 유전자의 코돈은 형질 전환에 사용하는 미생물 숙주의 코돈 사용 빈도에 맞춰서 변환된 것이어도 된다.
여기서, 서열의 「동일성」이란, 염기 서열의 경우라면, 비교해야 할 2개의 염기 서열의 염기가 가능한 한 많이 일치하도록 양쪽 염기 서열을 정렬시켜, 일치한 염기 수를, 전체 염기 수로 나눈 것을 백분율로 나타낸 것이다. 상기 정렬 시에는, 필요에 따라, 비교하는 2개의 서열의 한쪽 또는 양쪽에 적절히 갭을 삽입한다. 이러한 서열의 정렬화는, 예를 들어 BLAST, FASTA, CLUSTALW 등의 주지의 프로그램을 사용하여 행할 수 있다. 갭이 삽입되는 경우, 상기 전체 염기수는, 1개의 갭을 1개의 염기로서 센 염기 수가 된다. 이와 같이 하여 센 전체 염기 수가, 비교하는 2개의 서열간에서 상이한 경우에는, 동일성(%)은 긴 것의 서열의 전체 염기 수로, 일치한 염기 수를 나누어 산출된다. 아미노산 서열의 동일성에 대해서도 마찬가지이다.
메타크릴산에스테르 합성 반응에는 이러한 재조합 미생물을 배양하여 얻어지는 배양액을 그대로 사용하거나, 또는, 해당 배양액으로부터 원심 분리 등의 집균 조작에 의해 얻어지는 균체 또는 그 처리물 등을 사용할 수 있다. 균체 처리물로서는, 아세톤, 톨루엔 등으로 처리한 균체, 동결 건조 균체, 균체 파쇄물, 균체를 파쇄한 무세포 추출물, 이들로부터 효소를 추출한 조 효소 또는 정제 효소 등을 들 수 있다.
AAT 유전자와 ACD 유전자 또는 ECH 유전자를 동시에 도입하고, 이소부티릴-CoA 또는 3-히드록시이소부티릴-CoA를 원료로 하여, 메타크릴산에스테르를 합성하는 것도 가능하다(도 1 및 도 2 참조). 또한, 2-옥소이소발레르산 탈수소 효소 유전자(이하, BCKAD라고 함)를 조합하여 도입함으로써, 2-옥소이소발레르산으로부터 메타크릴산에스테르를 합성하는 것도 가능하다.
본 발명에서의 ACD, ECH 및 BCKAD의 유래에 특별히 제한은 없지만, 이하에 나타내는 미생물을 들 수 있다.
마그네토스피릴룸(Magnetospirillum)속, 로도스피릴룸(Rhodospirillum)속, 아조스피릴룸(Azospirillum)속, 티스트렐라(Tistrella)속, 아시디필리움(Acidiphilium)속, 로도박터(Rhodobacter)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 루에게리아(Ruegeria)속, 잔나스키아(Jannaschia)속, 로세오박터(Roseobacter)속, 디노로세오박터(Dinoroseobacter)속, 슈도비브리오(Pseudovibrio)속, 패오박터(Phaeobacter)속, 옥타데카박터(Octadecabacter)속, 하이포모나스(Hyphomonas)속, 마리카울리스(Maricaulis)속, 히르스키아(Hirschia)속, 스핑고모나스(Sphingomonas)속, 노보스핑고비움(Novosphingobium)속, 스핑고픽시스(Sphingopyxis)속, 스핑고비움(Sphingobium)속, 에리트로박터(Erythrobacter)속, 브레분디모나스(Brevundimonas)속, 카울로박터(Caulobacter)속, 페닐로박테리움(Phenylobacterium)속, 아스티카카울리스(Asticcacaulis)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 리조비움(Rhizobium)속, 시노리조비움(Sinorhizobium)속, 크산토박터(Xanthobacter)속, 아조리조비움(Azorhizobium)속, 브루셀라(Brucella)속, 오크로박트럼(Ochrobactrum)속, 메소리조비움(Mesorhizobium)속, 켈라티보란스(Chelativorans)속, 아우란티모나스(Aurantimonas)속, 브라디리조비움(Bradyrhizobium)속, 아그로모나스(Agromonas)속, 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas)속, 니트로박터(Nitrobacter)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속, 로도미크로비움(Rhodomicrobium)속, 펠라기박테리움(Pelagibacterium)속, 파르비바쿨럼(Parvibaculum)속, 메틸로시스티스(Methylocystis)속, 파르불라르쿨라(Parvularcula)속, 버크홀데리아(Burkholderia)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 쿠프리아비두스(Cupriavidus)속, 폴리뉴클레오박터(Polynucleobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 보르데텔라(Bordetella)속, 테일로렐라(Taylorella)속, 푸실리모나스(Pusillimonas)속, 코마모나스(Comamonas)속, 알리시클리필러스(Alicycliphilus)속, 델프티아(Delftia)속, 람리박터(Ramlibacter)속, 로도페락스(Rhodoferax)속, 바리오보락스(Variovorax)속, 폴라로모나스(Polaromonas)속, 아시도보락스(Acidovorax)속, 베르미네프로박터(Verminephrobacter)속, 헤르미니이모나스(Herminiimonas)속, 헤르바스피릴룸(Herbaspirillum)속, 콜리모나스(Collimonas)속, 크로모박테리움(Chromobacterium)속, 라리박터(Laribacter)속, 슈도굴벵키아니아(Pseudogulbenkiania)속, 니트로소모나스(Nitrosomonas)속, 니트로소스피라(Nitrosospira)속, 아로마톨레움(Aromatoleum)속, 아조아르커스(Azoarcus)속, 데클로로모나스(Dechloromonas)속, 타우레라(Thauera)속, 아조스피라(Azospira)(데클로로소마(Dechlorosoma))속, 레인헤이메라(Rheinheimera)속, 니트로소코서스(Nitrosococcus)속, 할로로도스피라(Halorhodospira)속, 크산토모나스(Xanthomonas)속, 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas)속, 슈도크산토모나스(Pseudoxanthomonas)속, 로다노박터(Rhodanobacter)속, 프란시셀라(Francisella)속, 사이클로클라스티커스(Cycloclasticus)속, 오세아노스피릴룸(Oceanospirillum)속, 하헬라(Hahella)속, 할로모나스(Halomonas)속, 알카니보락스(Alcanivorax)속, 캉기엘라(Kangiella)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 아조토박터(Azotobacter)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 시크로박터(Psychrobacter)속, 알리쉐와넬라(Alishewanella)속, 알테로모나스(Alteromonas)속, 글라시에콜라(Glaciecola)속, 마리노박터(Marinobacter)속, 마리노박테리움(Marinobacterium)속, 사카로파거스(Saccharophagus)속, 쉐와넬라(Shewanella)속, 페리모나스(Ferrimonas)속, 이디오마리나(Idiomarina)속, 코웰리아(Colwellia)속, 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas)속, 리스토넬라(Listonella)속, 비브리오(Vibrio)속, 포토박테리움(Photobacterium)속, 애로모나스(Aeromonas)속, 오세아니모나스(Oceanimonas)속, 살리니스패라(Salinisphaera)속, 레지오넬라(Legionella)속, 콕시엘라(Coxiella)속, 데술포코커스(Desulfococcus)속, 데술포박테리움(Desulfobacterium)속, 데술파티바실리움(Desulfatibacillum)속, 데술포불버스(Desulfobulbus)속, 데술파르쿨러스(Desulfarculus)속, 지오박터(Geobacter)속, 신트로포박터(Syntrophobacter)속, 신트로퍼스(Syntrophus)속, 데술포모닐레(Desulfomonile)속, 델로비브리오(Bdellovibrio)속, 박테리오보락스(Bacteriovorax)속, 스티그마텔라(Stigmatella)속, 믹소코커스(Myxococcus)속, 아내로믹소박터(Anaeromyxobacter)속, 소랑기움(Sorangium)속, 할리앙기움(Haliangium)속, 아시도박테리움(Acidobacterium)속, 그라눌리셀라(Granulicella)속, 일루마토박터(Ilumatobacter)속, 스트렙토스포랑기움(Streptosporangium)속, 노카르디옵시스(Nocardiopsis)속, 써모비피다(Thermobifida)속, 써모모노스포라(Thermomonospora)속, 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속, 아미콜라톱시스(Amycolatopsis)속, 사카로모노스포라(Saccharomonospora)속, 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora)속, 써모비스포라(Thermobispora)속, 악티노신네마(Actinosynnema)속, 미크로모노스포라(Micromonospora)속, 살리니스포라(Salinispora)속, 베루코시스포라(Verrucosispora)속, 노카르디오이데스(Nocardioides)속, 크리벨라(Kribbella)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 노카르디아(Nocardia)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 고르도니아(Gordonia)속, 디에치아(Dietzia)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 아미콜리시코커스(Amycolicicoccus)속, 츠카무렐라(Tsukamurella)속, 세그닐리파러스(Segniliparus)속, 미크로박테리움(Microbacterium)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 아르트로박터(Arthrobacter)속, 시트리코커스(Citricoccus)속, 레니박테리움(Renibacterium)속, 코쿠리아(Kocuria)속, 키토코커스(Kytococcus)속, 셀룰로모나스(Cellulomonas)속, 인트라스포랑기움(Intrasporangium)속, 세리니코커스(Serinicoccus)속, 프랑키아(Frankia)속, 아시도써무스(Acidothermus)속, 나카무렐라(Nakamurella)속, 지오데르마토필러스(Geodermatophilus)속, 스타케브란드티아(Stackebrandtia)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 카테눌리스포라(Catenulispora)속, 루브로박터(Rubrobacter)속, 코넥시박터(Conexibacter)속, 바실러스(Bacillus)속, 지오바실러스(Geobacillus)속, 오세아노바실러스(Oceanobacillus)속, 리시니바실러스(Lysinibacillus)속, 할로바실러스(Halobacillus)속, 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus)속, 키르피디아(Kyrpidia)속, 패니바실러스(Paenibacillus)속, 락토바실러스(Lactobacillus)속, 카르노박테리움(Carnobacterium)속, 클로스트리듐(Clostridium)속, 알칼리필러스(Alkaliphilus)속, 신트로포모나스(Syntrophomonas)속, 신트로포써무스(Syntrophothermus)속, 유박테리움(Eubacterium)속, 데술피토박테리움(Desulfitobacterium)속, 데술포토마쿨럼(Desulfotomaculum)속, 펠로토마쿨럼(Pelotomaculum)속, 부티리비브리오(Butyrivibrio)속, 로세부리아(Roseburia)속, 오실리박터(Oscillibacter)속, 써모아내로박터(Thermoanaerobacter)속, 카르복시도써무스(Carboxydothermus)속, 나트라내로비우스(Natranaerobius)속, 스핑고박테리움(Sphingobacterium)속, 페도박터(Pedobacter)속, 할리스코메노박터(Haliscomenobacter)속, 포르피로모나스(Porphyromonas)속, 오도리박터(Odoribacter)속, 스피로소마(Spirosoma)속, 루넬라(Runella)속, 마리박터(Maribacter)속, 데이노코커스(Deinococcus)속, 써무스(Thermus)속, 메이오써무스(Meiothermus)속, 오세아니써무스(Oceanithermus)속, 마리니써무스(Marinithermus)속, 겜마티모나스(Gemmatimonas)속, 푸소박테리움(Fusobacterium)속, 일리오박터(Ilyobacter)속, 로세이플렉서스(Roseiflexus)속, 헤르페토시폰(Herpetosiphon)속, 써모미크로비움(Thermomicrobium)속, 써모토가(Thermotoga)속, 써모시포(Thermosipho)속, 페르비도박테리움(Fervidobacterium)속, 데페리박터(Deferribacter)속, 칼디테리비브리오(Calditerrivibrio)속, 플렉시스티페스(Flexistipes)속, 메탈로스패라(Metallosphaera)속, 애로피럼(Aeropyrum)속, 피로바쿨럼(Pyrobaculum)속, 칼디비르가(Caldivirga)속, 불카니새타(Vulcanisaeta)속, 아시딜로버스(Acidilobus)속, 할로아르쿨라(Haloarcula)속, 할로쿠아드라텀(Haloquadratum)속, 나트로노모나스(Natronomonas)속, 할로루브럼(Halorubrum)속, 할로테리게나(Haloterrigena)속, 나트리알바(Natrialba)속, 할랄칼리코커스(Halalkalicoccus)속, 할로게오메트리컴(Halogeometricum)속, 써모플라즈마(Thermoplasma)속, 피크로필러스(Picrophilus)속, 페로플라즈마(Ferroplasma)속, 아르캐오글로버스(Archaeoglobus)속, 페로글로버스(Ferroglobus)속, 폴리모르품(Polymorphum)속, 미카비브리오(Micavibrio)속, 시미두이아(Simiduia)속, 렙토트릭스(Leptothrix)속, 티오모나스(Thiomonas)속, 루브리비박스(Rubrivivax)속, 메틸리비움(Methylibium)속, 엑시구오박테리움(Exiguobacterium)속 및 아내로코커스(Anaerococcus) 속에 속하는 미생물이다.
또한, 마그네토스피릴룸(Magnetospirillum)속으로 분류되는 미생물로서는 마그네토스피릴룸 마그네티컴(Magnetospirillum magneticum), 로도스피릴룸(Rhodospirillum)속으로 분류되는 미생물로서는 로도스피릴룸 루브럼(Rhodospirillum rubrum), 로도스피릴룸 센테눔(Rhodospirillum centenum) 및 로도스피릴룸 포토메트리컴(Rhodospirillum photometricum), 아조스피릴룸(Azospirillum)속으로 분류되는 미생물로서는, 아조스피릴룸 리포페룸(Azospirillum lipoferum) 및 아조스피릴룸 브라질렌스(Azospirillum brasilense), 티스트렐라(Tistrella)속으로 분류되는 미생물로서는 티스트렐라 모빌리스(Tistrella mobilis), 아시디필리움(Acidiphilium)속으로 분류되는 미생물로서는 아시디필리움 크립텀(Acidiphilium cryptum) 및 아시디필리움 멀티보럼(Acidiphilium multivorum), 로도박터(Rhodobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 및 로도박터 캅술라터스(Rhodobacter capsulatus), 파라코커스(Paracoccus)속으로 분류되는 미생물로서는 파라코커스 데니트피피칸스(Paracoccus denitrificans), 파라코커스 아미노필러스(Paracoccus aminophilus), 루에게리아(Ruegeria)속으로 분류되는 미생물로서는 루에게리아 포메로이(Ruegeria pomeroyi), 로세오박터(Roseobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 로세오박터 데니트리피칸스(Roseobacter denitrificans) 및 로세오박터 리토랄리스(Roseobacter litoralis), 디노로세오박터(Dinoroseobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 디노로세오박터 시바에(Dinoroseobacter shibae), 패오박터(Phaeobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 패오박터 갈래시엔시스(Phaeobacter gallaeciensis), 옥타데카박터(Octadecabacter)속으로 분류되는 미생물로서는 옥타테카박터 안타르크티커스(Octadecabacter antarcticus) 및 옥타데카박터 아르크티커스(Octadecabacter arcticus), 히포모나스(Hyphomonas)속으로 분류되는 미생물로서는 히포모나스 네프투니움(Hyphomonas neptunium), 마리카울리스(Maricaulis)속으로 분류되는 미생물로서는 마리카울리스 마리스(Maricaulis maris), 히르스키아(Hirschia)속으로 분류되는 미생물로서는 히르스키아 발티카(Hirschia baltica), 스핑고모나스(Sphingomonas)속으로 분류되는 미생물로서는 스핑고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas paucimobilis) 및 스핑고모나스 위티치이(Sphingomonas wittichii), 노보스핑고비움(Novosphingobium)속으로 분류되는 미생물로서는 노보스핑고비움 아로마티시보란스(Novosphingobium aromaticivorans), 스핑고픽시스(Sphingopyxis)속으로 분류되는 미생물로서는 스핑고픽시스 알라스켄시스(Sphingopyxis alaskensis), 스핑고비움(Sphingobium)속으로 분류되는 미생물로서는 스핑고비움 자포니쿰(Sphingobium japonicum) 및 스핑고비움 클로로페놀리컴(Sphingobium chlorophenolicum), 에리트로박터(Erythrobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 에리트로박터 리토랄리스(Erythrobacter litoralis), 브레분디모나스(Brevundimonas)속으로 분류되는 미생물로서는 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta), 브레분디모나스 서브비브리오이데스(Brevundimonas subvibrioides) 및 브레분디모나스 베시쿨라리스(Brevundimonas vesicularis), 카울로박터(Caulobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 카울로박터 크레스켄터스(Caulobacter crescentus) 및 카울로박터 세그니스(Caulobacter segnis), 페닐로박테리움(Phenylobacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 페닐로박테리움 주시네움(Phenylobacterium zucineum), 아스티카카울리스(Asticcacaulis)속으로 분류되는 미생물로서는 아스티카카울리스 에크센트리커스(Asticcacaulis excentricus), 아그로박테리움(Agrobacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) 및 아그로박테리움 루테움(Agrobacterium luteum), 리조비움(Rhizobium)속으로 분류되는 미생물로서는 리조비움 레구미노사럼(Rhizobium leguminosarum), 리도비움 에틀리(Rhizobium etli) 및 리조비움 트로피시(Rhizobium tropici), 시노리조비움(Sinorhizobium)속으로 분류되는 미생물로서는 시노리조비움 멜릴로티(Sinorhizobium meliloti), 시노리조비움 메디카에(Sinorhizobium medicae) 및 시노리조비움 프레디이(Sinorhizobium fredii), 크산토박터(Xanthobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 크산토박터 아길리스(Xanthobacter agilis), 크산토박터 아미녹시단스(Xanthobacter aminoxidans), 크산토박터 아우토트로피커스(Xanthobacter autotrophicus), 크산토박터 플라버스(Xanthobacter flavus), 크산토박터 타게티디스(Xanthobacter tagetidis), 크산토박터 비스코서스(Xanthobacter viscosus), 아조리조비움(Azorhizobium)속으로 분류되는 미생물로서는 아조리조비움 카울리노단스(Azorhizobium caulinodans), 브루셀라(Brucella)속으로 분류되는 미생물로서는 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 아보르터스(Brucella abortus), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 브루셀라 오비스(Brucella ovis), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 브루셀라 미크로티(Brucella microti), 브루셀라 피니페디알리스(Brucella pinnipedialis) 및 브루셀라 세티(Brucella ceti), 오크로박트럼(Ochrobactrum)속으로 분류되는 미생물로서는 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi), 오크로박트럼 시티시(Ochrobactrum cytisi), 오크로박트럼 대전엔스(Ochrobactrum daejeonense), 오크로박트럼 갈리니패시스(Ochrobactrum gallinifaecis), 오크로박트럼 그리그노넨스(Ochrobactrum grignonense), 오크로박트럼 해모필럼(Ochrobactrum haemophilum), 오크로박트럼 인터메디움(Ochrobactrum intermedium), 오크로박트럼 루피니(Ochrobactrum lupini), 오크로박트럼 오리제(Ochrobactrum oryzae), 오크로박트럼 슈딘테르메디움(Ochrobactrum pseudintermedium), 오크로박트럼 슈도그리그노넨스(Ochrobactrum pseudogrignonense), 오크로박트럼 티오페니보란스(Ochrobactrum thiophenivorans) 및 오크로박트럼 트리티시(Ochrobactrum tritici), 메소리조비움(Mesorhizobium)속으로 분류되는 미생물로서는 메소리조비움 알하기(Mesorhizobium alhagi), 메소리조비움 알비지아에(Mesorhizobium albiziae), 메소리조비움 아모르파에(Mesorhizobium amorphae), 메소리조비움 아우스트랄리컴(Mesorhizobium australicum), 메소리조비움 카라가나에(Mesorhizobium caraganae), 메소리조비움 챠코엔스(Mesorhizobium chacoense), 메소리조비움 시세리(Mesorhizobium ciceri), 메소리조비움 고비엔스(Mesorhizobium gobiense), 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 메소리조비움 메디테라네움(Mesorhizobium mediterraneum), 메소리조비움 메탈리두란스(Mesorhizobium metallidurans), 메소리조비움 오포르투니스텀(Mesorhizobium opportunistum), 메소리조비움 플루리파리움(Mesorhizobium plurifarium), 메소리조비움 후아쿠이이(Mesorhizobium huakuii), 메소리조비움 셉텐트리오날레(Mesorhizobium septentrionale), 메소리조비움 샹그릴렌스(Mesorhizobium shangrilense), 메소리조비움 타리멘스(Mesorhizobium tarimense), 메소리조비움 템페라텀(Mesorhizobium temperatum), 메소리조비움 티오강게티쿠(Mesorhizobium thiogangeticu) 및 메소리조비움 티안샤넨스(Mesorhizobium tianshanense), 아우란티모나스(Aurantimonas)속으로 분류되는 미생물로서는 아우란티모나스 망가녹시단스(Aurantimonas manganoxydans), 브라디리조비움(Bradyrhizobium)속으로 분류되는 미생물로서는 브라디리조비움 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum), 아그로모나스(Agromonas)속으로 분류되는 미생물로서는 아그로모나스 올리고트로피카(Agromonas oligotrophica), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas)속으로 분류되는 미생물로서는 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 니트로박터(Nitrobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 니트로박터 위노그라드스키이(Nitrobacter winogradskyi) 및 니트로박터 함부르겐시스(Nitrobacter hamburgensis), 메틸로박테리움(Methylobacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스(Methylobacterium extorquens), 메틸로박테리움 라디오톨레란스(Methylobacterium radiotolerans) 및 메틸로박테리움 노둘란스(Methylobacterium nodulans), 로도미크로비움(Rhodomicrobium)속으로 분류되는 미생물로서는 로도미크로비움 바니엘리이(Rhodomicrobium vannielii), 펠라기박테리움(Pelagibacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 펠라기박테리움 할로톨레란스(Pelagibacterium halotolerans), 파르비바쿨럼(Parvibaculum)속으로 분류되는 미생물로서는 파르비바쿨럼 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 파르불라르쿨라(Parvularcula)속으로 분류되는 미생물로서는 파르불라르쿨라 베르무덴시스(Parvularcula bermudensis), 브르크홀데리아(Burkholderia)속으로 분류되는 미생물로서는 버크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei), 버크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 버크홀데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis), 버크홀데리아 비에트나미엔시스(Burkholderia vietnamiensis), 버크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia), 버크홀데리아 암비파리아(Burkholderia ambifaria), 버크홀데리아 멀티보란스(Burkholderia multivorans), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 버크홀데리아 크세노보란스(Burkholderia xenovorans), 버크홀데리아 피마텀(Burkholderia phymatum), 버크홀데리아 피토피르만스(Burkholderia phytofirmans), 버크홀데리아 글루마에(Burkholderia glumae), 버크홀데리아 리족시니카(Burkholderia rhizoxinica), 버크홀데리아 글라디올리(Burkholderia gladioli), 버크홀데리아 페놀리루프트릭스(Burkholderia phenoliruptrix) 및 버크홀데리아 오클라호멘시스(Burkholderia oklahomensis), 랄스토니아(Ralstonia)속으로 분류되는 미생물로서는 랄스토니아 솔라나세아럼(Ralstonia solanacearum), 랄스토니아 피케티이(Ralstonia pickettii) 및 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 쿠프리아비두스(Cupriavidus)속으로 분류되는 미생물로서는 쿠프리아비두스 메탈리두란스(Cupriavidus metallidurans), 쿠프리아비두스 타이완엔시스(Cupriavidus taiwanensis) 및 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 폴리뉴클레오박터(Polynucleobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 폴리뉴클레오박터 네세사리우스(Polynucleobacter necessarius), 아크로모박터(Achromobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 아크로모박터 아르세니톡시단스(Achromobacter arsenitoxydans), 아크로모박터 콜리노파굼(Achromobacter cholinophagum), 아크로모박터 사이클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes), 아크로모박터 데니트리피칸스(Achromobacter denitrificans), 아크로모박터 피스케리(Achromobacter fischeri), 아크로모박터 하르틀레비이(Achromobacter hartlebii), 아크로모박터 임모빌리스(Achromobacter immobilis), 아크로모박터 인솔리터스(Achromobacter insolitus), 아크로모박터 락톨리티커스(Achromobacter lactolyticus), 아크로모박터 리티커스(Achromobacter lyticus), 아크로모박터 메타놀로필라(Achromobacter methanolophila), 아크로모박터 페스티퍼(Achromobacter pestifer), 아크로모박터 피에카우디이(Achromobacter piechaudii), 아크로모박터 루흘란디이(Achromobacter ruhlandii), 아크로모박터 스파니오스(Achromobacter spanios), 아크로모박터 비스코서스(Achromobacter viscosus), 아크로모박터 크세로시스(Achromobacter xerosis) 및 아크로모박터 크실로속시단스(Achromobacter xylosoxidans), 보르데텔라(Bordetella)속으로 분류되는 미생물로서는 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis), 보르데텔라 페트리이(Bordetella petrii) 및 보르데텔라 아비움(Bordetella avium), 테일로렐라(Taylorella)속으로 분류되는 미생물로서는 테일로렐라 에퀴게니탈리스(Taylorella equigenitalis), 코마모나스(Comamonas)속으로 분류되는 미생물로서는 코마모나스 아시도보란스(Comamonas acidovorans), 코마모나스 아쿠아티카(Comamonas aquatica), 코마모나스 바디아(Comamonas badia), 코마모나스 콤포스티(Comamonas composti), 코마모나스 데니트리피칸스(Comamonas denitrificans), 코마모나스 그라눌리(Comamonas granuli), 코마모나스 케르스테르시이(Comamonas kerstersii), 코마모나스 코리엔시스(Comamonas koreensis), 코마모나스 니트라티보란스(Comamonas nitrativorans), 코마모나스 오돈토테르미테스(Comamonas odontotermites), 코마모나스 테라에(Comamonas terrae), 코마모나스 테리게나(Comamonas terrigena), 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni), 코마모나스 티오옥시단스(Comamonas thiooxydans) 및 코마모나스 종글리아니이(Comamonas zonglianii), 알리시클리필러스(Alicycliphilus)속으로 분류되는 미생물로서는 알리시클리필러스 데니트리피칸스(Alicycliphilus denitrificans), 델프티아(Delftia)속으로 분류되는 미생물로서는 델프티아 아시도보란스(Delftia acidovorans), 람리박터(Ramlibacter)속으로 분류되는 미생물로서는 람리박터 타타오우이넨시스(Ramlibacter tataouinensis), 로도페락스(Rhodoferax)속으로 분류되는 미생물로서는 로도페락스 페리레두센스(Rhodoferax ferrireducens), 바리오보락스(Variovorax)속으로 분류되는 미생물로서는 바리오보락스 파라독서스(Variovorax paradoxus), 폴라로모나스(Polaromonas)속으로 분류되는 미생물로서는 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 아시도보락스(Acidovorax)속으로 분류되는 미생물로서는 아시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli), 아시도보락스 에브레우스(Acidovorax ebreus) 및 아시도보락스 아베나에(Acidovorax avenae), 베르미네프로박터(Verminephrobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 베르미네프로박터 에이세니아에(Verminephrobacter eiseniae), 헤르미니이모나스(Herminiimonas)속으로 분류되는 미생물로서는 헤르미니이모나스 아르세니콕시단스(Herminiimonas arsenicoxydans), 헤르바스피릴룸(Herbaspirillum)속으로 분류되는 미생물로서는 헤르바스피릴룸 세로페디카에(Herbaspirillum seropedicae), 콜리모나스(Collimonas)속으로 분류되는 미생물로서는 콜리모나스 펑기보란스(Collimonas fungivorans), 크로모박테리움(Chromobacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum), 라리박터(Laribacter)속으로 분류되는 미생물로서는 라리박터 홍콩엔시스(Laribacter hongkongensis), 슈도굴벵키아니아(Pseudogulbenkiania)속으로 분류되는 미생물로서는 슈도굴벵키아니아 페로옥시단스(Pseudogulbenkiania ferrooxidans), 니트로소모나스(Nitrosomonas)속으로 분류되는 미생물로서는 니트로소모나스 유로파에아(Nitrosomonas europaea), 니트로소스피라(Nitrosospira)속으로 분류되는 미생물로서는 니트로소스피라 멀티포르미스(Nitrosospira multiformis), 아로마톨레움(Aromatoleum)속으로 분류되는 미생물로서는 아로마톨레움 아로마티컴(Aromatoleum aromaticum), 데클로로모나스(Dechloromonas)속으로 분류되는 미생물로서는 데클로로모나스 아로마티카(Dechloromonas aromatica), 아조스피라(Azospira)(데클로로소마(Dechlorosoma))속으로 분류되는 미생물로서는 아조스피라 오리제(Azospira oryzae)(데클로로소마 수일룸(Dechlorosoma suillum)), 레인헤이메라(Rheinheimera)속으로 분류되는 미생물로서는 레인헤이메라 난하이엔시스(Rheinheimera nanhaiensis), 니트로소코커스(Nitrosococcus)속으로 분류되는 미생물로서는 니트로소코커스 오세아니(Nitrosococcus oceani), 할로로도스피라(Halorhodospira)속으로 분류되는 미생물로서는 할로로도스피라 할로필라(Halorhodospira halophila), 크산토모나스(Xanthomonas)속으로 분류되는 미생물로서는 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 크산토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis), 크산토모나스 오리제(Xanthomonas oryzae), 크산토모나스 알빌리네안스(Xanthomonas albilineans) 및 크산토모나스 시트리(Xanthomonas citri), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas)속으로 분류되는 미생물로서는 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 슈도크산토모나스(Pseudoxanthomonas)속으로 분류되는 미생물로서는 슈도크산토모나스 수원엔시스(Pseudoxanthomonas suwonensis) 및 슈도크산토모나스 스파딕스(Pseudoxanthomonas spadix), 프란시셀라(Francisella)속으로 분류되는 미생물로서는 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) 및 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 사이클로클라스티커스(Cycloclasticus)속으로 분류되는 미생물로서는 사이클로클라스티커스 잔클레스(Cycloclasticus zancles), 하헬라(Hahella)속으로 분류되는 미생물로서는 하헬라 제주엔시스(Hahella chejuensis), 할로모나스(Halomonas)속으로 분류되는 미생물로서는 할로모나스 엘롱가타(Halomonas elongata), 알카니보락스(Alcanivorax)속으로 분류되는 미생물로서는 알카니보락스 보르쿠멘시스(Alcanivorax borkumensis) 및 알카니보락스 디에셀롤레이(Alcanivorax dieselolei), 캉기엘라(Kangiella)속으로 분류되는 미생물로서는 캉기엘라 코리엔시스(Kangiella koreensis), 슈도모나스(Pseudomonas)속으로 분류되는 미생물로서는, 예를 들어 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 아가리시(Pseudomonas agarici), 슈도모나스 시링가에(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 아미그달레(Pseudomonas amygdale) 및 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri), 아조토박터(Azotobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii), 아시네토박터(Acinetobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 아일리이(Acinetobacter aylyi), 아시네토박터 칼코아세티커스(Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 길렌베르기이(Acinetobacter gyllenbergii), 아시네토박터 해몰리티커스(Acinetobacter haemolyticus), 아시네토박터 존소니이(Acinetobacter johnsonii), 아시네토박터 주니이(Acinetobacter junii), 아시네토박터 르우피이(Acinetobacter lwoffii), 아시네토박터 올레이보란스(Acinetobacter oleivorans), 아시네토박터 파르버스(Acinetobacter parvus), 시크로박터(Psychrobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 시크로박터 아르크티커스(Psychrobacter arcticus) 및 시크로박터 크리오할롤렌티스(Psychrobacter cryohalolentis), 알리쉐와넬라(Alishewanella)속으로 분류되는 미생물로서는 알리쉐와넬라 제오트갈리(Alishewanella jeotgali), 알테로모나스(Alteromonas)속으로 분류되는 미생물로서는 알테로모나스 마클레오디이(Alteromonas macleodii), 글라시에콜라(Glaciecola)속으로 분류되는 미생물로서는 글라시에콜라 니트라티레두센스(Glaciecola nitratireducens), 글라시에콜라 시크로필라(Glaciecola psychrophila) 및 글리시에콜라 푸니케아(Glaciecola punicea), 마리노박터(Marinobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 마리노박터 아쿠아에올레이(Marinobacter aquaeolei), 마리노박터 히드로카르보노클라스티커스(Marinobacter hydrocarbonoclasticus), 마리노박터 아드해렌스(Marinobacter adhaerens), 마리노박터 알기콜라((Marinobacter algicola) 및 마리노박터 망가녹시단스(Marinobacter manganoxydans), 마리노박테리움(Marinobacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 마리노박테리움 스타니에리(Marinobacterium stanieri), 사카로파거스(Saccharophagus)속으로 분류되는 미생물로서는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans), 쉐와넬라(Shewanella)속으로 분류되는 미생물로서는 쉐와넬라 피에조톨레란스(Shewanella piezotolerans), 쉐와넬라 아비시(Shewanella abyssi), 쉐와넬라 아피니스(Shewanella affinis), 쉐와넬라 알가에(Shewanella algae), 쉐와넬라 알기디피스키콜라(Shewanella algidipiscicola), 쉐와넬라 아마조넨시스(Shewanella amazonensis), 쉐와넬라 아퀴마리나(Shewanella aquimarina), 쉐와넬라 아르크티카(Shewanella arctica), 쉐와넬라 아틀란티카(Shewanella atlantica), 쉐와넬라 발티카(Shewanella baltica), 쉐와넬라 바살티스(Shewanella basaltis), 쉐와넬라 벤티카(Shewanella benthica), 쉐와넬라 칸다덴시스(Shewanella candadensis), 쉐와넬라 킬리켄시스(Shewanella chilikensis), 쉐와넬라 콜웰리아나(Shewanella colwelliana), 쉐와넬라 코랄리이(Shewanella corallii), 쉐와넬라 데콜로라티오니스(Shewanella decolorationis), 쉐와넬라 데니트리피칸스(Shewanella denitrificans), 쉐와넬라 동해엔시스(Shewanella donghaensis), 쉐와넬라 피델리스(Shewanella fidelis), 쉐와넬라 포디나에(Shewanella fodinae), 쉐와넬라 프리기디마리나(Shewanella frigidimarina), 쉐와넬라 개트불리(Shewanella gaetbuli), 쉐와넬라 겔리디마리나(Shewanella gelidimarina), 쉐와넬라 글라시알리피스키콜라(Shewanella glacialipiscicola), 쉐와넬라 고페리이(Shewanella gopherii), 쉐와넬라 하프니엔시스(Shewanella hafniensis), 쉐와넬라 힐라팍센시스(Shewanella halifaxensis), 쉐와넬라 할리오티스(Shewanella haliotis), 쉐와넬라 하네다이(Shewanella hanedai), 쉐와넬라 자포니카(Shewanella japonica), 쉐와넬라 카이레이티카(Shewanella kaireitica), 쉐와넬라 이빙스토넨시스(Shewanella ivingstonensis), 쉐와넬라 로이히카(Shewanella loihica), 쉐와넬라 마리나(Shewanella marina), 쉐와넬라 마리닌테스티나(Shewanella marinintestina), 쉐와넬라 마리스플라비(Shewanella marisflavi), 쉐와넬라 모르후아에(Shewanella morhuae), 쉐와넬라 올레야나(Shewanella olleyana), 쉐와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis), 쉐와넬라 파시피카(Shewanella pacifica), 쉐와넬라 페알레아나(Shewanella pealeana), 쉐와넬라 뉴마토포리(Shewanella pneumatophori), 쉐와넬라 프로푼다(Shewanella profunda), 쉐와넬라 푸트레파시엔스(Shewanella putrefaciens), 쉐와넬라 사이라에(Shewanella sairae), 쉐와넬라 스클레겔리아나(Shewanella schlegeliana), 쉐와넬라 세디미니스(Shewanella sediminis), 쉐와넬라 수루겐시스(Shewanella surugensis), 쉐와넬라 베시쿨로사(Shewanella vesiculosa), 쉐와넬라 비올라세아(Shewanella violacea), 쉐와넬라 왁스마니이(Shewanella waksmanii), 쉐와넬라 우디이(Shewanella woodyi) 및 쉐와넬라 크시아메넨시스(Shewanella xiamenensis), 페리모나스(Ferrimonas)속으로 분류되는 미생물로서는 페리모나스 발레아리카(Ferrimonas balearica), 이디오마리나(Idiomarina)속으로 분류되는 미생물로서는 이디오마리나 로이히엔시스(Idiomarina loihiensis) 및 이디오마리나 발티카(Idiomarina baltica), 콜웰리아(Colwellia)속으로 분류되는 미생물로서는 콜웰리아 시크레리트라에아(Colwellia psychrerythraea), 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas)속으로 분류되는 미생물로서는 슈도알테로모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 슈도알테로모나스 아틀란티카(Pseudoalteromonas atlantica) 및 슈도알테로모나스 투니카타(Pseudoalteromonas tunicata), 리스토넬라(Listonella)속으로 분류되는 미생물로서는 리스토넬라 앙귈라라(Listonella anguillara), 리스토넬라 앙귈라럼(Listonella anguillarum) 및 리스토넬라 펠라기아(Listonella pelagia), 비브리오(Vibrio)속으로 분류되는 미생물로서는 비브리오 파라해몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피커스(Vibrio vulnificus), 비브리오 하르베이이(Vibrio harveyi), 비브리오 푸르니시이(Vibrio furnissii), 비브리오 투비아쉬이(Vibrio tubiashii), 비브리오 시날로엔시스(Vibrio sinaloensis), 비브리오 로티페리아누스(Vibrio rotiferianus), 비브리오 오리엔탈리스(Vibrio orientalis), 비브리오 하르베이이(Vibrio harveyi), 비브리오 코랄리일리티커스(Vibrio coralliilyticus), 비브리오 카리벤티커스(Vibrio caribbenthicus), 비브리오 브라질리엔시스(Vibrio brasiliensis) 및 비브리오 알기놀리티커스(Vibrio alginolyticus), 포토박테리움(Photobacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 포토박테리움 프로푼덤(Photobacterium profundum), 애로모나스(Aeromonas)속으로 분류되는 미생물로서는 애로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 애로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida) 및 애로모나스 베로니이(Aeromonas veronii), 살리니스패라(Salinisphaera)속으로 분류되는 미생물로서는 살리니스패라 샤바넨시스(Salinisphaera shabanensis), 레지오넬라(Legionella)속으로 분류되는 미생물로서는 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 및 레지오넬라 롱베아카에(Legionella longbeachae), 콕시엘라(Coxiella)속으로 분류되는 미생물로서는 콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii), 데술포코커스(Desulfococcus)속으로 분류되는 미생물로서는 데술포코커스 올레오보란스(Desulfococcus oleovorans), 데술포박테리움(Desulfobacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 데술포박테리움 아우토트로피컴(Desulfobacterium autotrophicum), 데술파티바실룸(Desulfatibacillum)속으로 분류되는 미생물로서는 데술파티바실룸 알케니보란스(Desulfatibacillum alkenivorans), 데술포불버스(Desulfobulbus)속으로 분류되는 미생물로서는 데술포불버스 프로피오니커스(Desulfobulbus propionicus), 데술파르쿨러스(Desulfarculus)속으로 분류되는 미생물로서는 데술파르쿨러스 바아르시이(Desulfarculus baarsii), 지오박터(Geobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 지오박터 메탈리레두센스(Geobacter metallireducens), 지오박터 우라니이레두센스(Geobacter uraniireducens) 및 지오박터 베미드지엔시스(Geobacter bemidjiensis), 신트로포박터(Syntrophobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 신트로포박터 푸마록시단스(Syntrophobacter fumaroxidans), 신트로퍼스(Syntrophus)속으로 분류되는 미생물로서는 신트로퍼스 아시디트로피커스(Syntrophus aciditrophicus), 데술포모닐레(Desulfomonile)속으로 분류되는 미생물로서는 데술포모닐레 티에드제이(Desulfomonile tiedjei), 델로비브리오(Bdellovibrio)속으로 분류되는 미생물로서는 델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus) 및 델로비브리오 엑소보러스(Bdellovibrio exovorus), 박테리오보락스(Bacteriovorax)속으로 분류되는 미생물로서는 박테리오보락스 마리너스(Bacteriovorax marinus), 스티그마텔라(Stigmatella)속으로 분류되는 미생물로서는 스티그마텔라 아우란티아카(Stigmatella aurantiaca), 믹소코커스(Myxococcus)속으로 분류되는 미생물로서는 믹소소커스 크산투스(Myxococcus xanthus) 및 믹소코커스 풀버스(Myxococcus fulvus), 아내로믹소박터(Anaeromyxobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 아내로믹소박터 데할로게난스(Anaeromyxobacter dehalogenans), 소랑기움(Sorangium)속으로 분류되는 미생물로서는 소랑기움 셀룰로섬(Sorangium cellulosum), 할리앙기움(Haliangium)속으로 분류되는 미생물로서는 할리앙기움 오크라세움(Haliangium ochraceum), 아시도박테리움(Acidobacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 아시도박테리움 캅술라텀(Acidobacterium capsulatum), 그라눌리셀라(Granulicella)속으로 분류되는 미생물로서는 그라눌리셀라 툰드리콜라(Granulicella tundricola), 일루마토박터(Ilumatobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 일루마토박터 코시네움(Ilumatobacter coccineum), 스트렙토스포랑기움(Streptosporangium)속으로 분류되는 미생물로서는 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 노카르디옵시스(Nocardiopsis)속으로 분류되는 미생물로서는 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 써모비피다(Thermobifida)속으로 분류되는 미생물로서는 써모비피다 푸스카(Thermobifida fusca), 써모모노스포라(Thermomonospora)속으로 분류되는 미생물로서는 써모모노스포라 쿠르바타(Thermomonospora curvata), 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속으로 분류되는 미생물로서는 슈도노카르디아 디옥사니보란스(Pseudonocardia dioxanivorans), 아미콜라톱시스(Amycolatopsis)속으로 분류되는 미생물로서는 아미콜라톱시스 메디테라네이(Amycolatopsis mediterranei), 사카로모노스포라(Saccharomonospora)속으로 분류되는 미생물로서는 사카로모노스포라 비리디스(Saccharomonospora viridis) 및 사카로모노스포라 크신지앙겐시스(Saccharomonospora xinjiangensis), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora)속으로 분류되는 미생물로서는 사카로폴리스포라 에리트라에아(Saccharopolyspora erythraea) 및 사카로폴리스포라 스피노사(Saccharopolyspora spinosa), 써모비스포라(Thermobispora)속으로 분류되는 미생물로서는 써모비스포라 비스포라(Thermobispora bispora), 악티노신네마(Actinosynnema)속으로 분류되는 미생물로서는 악티노신네마 미룸(Actinosynnema mirum), 미크로모노스포라(Micromonospora)속으로 분류되는 미생물로서는 미크로모노스포라 아우란티아카(Micromonospora aurantiaca), 살리니스포라(Salinispora)속으로 분류되는 미생물로서는 살리니스포라 트로피카(Salinispora tropica) 및 살리니스포라 아레니콜라(Salinispora arenicola), 베루코시스포라(Verrucosispora)속으로 분류되는 미생물로서는 베루코시스포라 마리스(Verrucosispora maris), 크리벨라(Kribbella)속으로 분류되는 미생물로서는 크리벨라 플라비다(Kribbella flavida), 코리네박테리움(Corynebacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 코리네박테리움 제이케이움(Corynebacterium jeikeium), 코리네박테리움 우레알리티컴(Corynebacterium urealyticum) 및 코리네박테리움 크롭펜스테드티이(Corynebacterium kroppenstedtii), 노카르디아(Nocardia)속으로 분류되는 미생물로서는 노카르디아 파르시니카(Nocardia farcinica), 노카르디아 브라질리엔시스(Nocardia brasiliensis) 및 노카르디아 시리아시게오르기카(Nocardia cyriacigeorgica), 로도코커스(Rhodococcus)속으로 분류되는 미생물로서는 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous), 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 로도코커스 에쿠이(Rhodococcus equi), 로도코커스 로드니이(Rhodococcus rhodnii), 로도코커스 코랄리누스(Rhodococcus corallinus), 로도코커스 루브로페르팅크터스(Rhodococcus rubropertinctus), 로도코커스 코프로필러스(Rhodococcus coprophilus), 로도코커스 글로베룰러스(Rhodococcus globerulus), 로도코커스 클로로페놀리커스(Rhodococcus chlorophenolicus), 로도코커스 루테우스(Rhodococcus luteus), 로도코커스 아이치엔시스(Rhodococcus aichiensis), 로도코커스 추부엔시스(Rhodococcus chubuensis), 로도코커스 마리스(Rhodococcus maris) 및 로도코커스 파시네스(Rhodococcus fascines), 고르도니아(Gordonia)속으로 분류되는 미생물로서는 고르도니아 브론키알리스(Gordonia bronchialis), 고르도니아 네오펠리패시스(Gordonia neofelifaecis) 및 고르도니아 테라에(Gordonia terrae), 디에치아(Dietzia)속으로 분류되는 미생물로서는 디에치아 신나메아(Dietzia cinnamea), 마이코박테리움(Mycobacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 마이코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans), 마이코박테리움 반바알레니이(Mycobacterium vanbaalenii), 마이코박테리움 길붐(Mycobacterium gilvum), 마이코박테리움 아브스케서스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 마리누(Mycobacterium marinu), 마이코박테리움 마실리엔스(Mycobacterium massiliense), 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei), 마이코박테리움 써모레시스티빌레(Mycobacterium thermoresistibile), 마이코박테리움 투시아에(Mycobacterium tusciae), 마이코박테리움 크세노피(Mycobacterium xenopi) 및 마이코박테리움 로데시아에(Mycobacterium rhodesiae), 아미콜리시코커스(Amycolicicoccus)속으로 분류되는 미생물로서는 아미콜리시코커스 서브플라버스(Amycolicicoccus subflavus), 츠카무렐라(Tsukamurella)속으로 분류되는 미생물로서는 츠카무렐라 파우로메타볼라(Tsukamurella paurometabola), 세그닐리파러스(Segniliparus)속으로 분류되는 미생물로서는 세그닐리파러스 로툰더스(Segniliparus rotundus), 미크로박테리움(Microbacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 미크로박테리움 테스타세움(Microbacterium testaceum), 미크로코커스(Micrococcus)속으로 분류되는 미생물로서는 미크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 아르트로박터(Arthrobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 아르트로박터 아릴라이텐시스(Arthrobacter arilaitensis), 아르트로박터 클로로페놀리커스(Arthrobacter chlorophenolicus), 아르트로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) 및 아르트로박터 페난트레니보란스(Arthrobacter phenanthrenivorans), 레니박테리움(Renibacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 레니박테리움 살모니나럼(Renibacterium salmoninarum), 코쿠리아(Kocuria)속으로 분류되는 미생물로서는 코쿠리아 리조필라(Kocuria rhizophila), 키토코커스(Kytococcus)속으로 분류되는 미생물로서는 키토코커스 세덴타리우스(Kytococcus sedentarius), 셀룰로모나스(Cellulomonas)속으로 분류되는 미생물로서는 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi), 인트라스포랑기움(Intrasporangium)속으로 분류되는 미생물로서는 인트라스포랑기움 칼붐(Intrasporangium calvum), 세리니코커스(Serinicoccus)속으로 분류되는 미생물로서는 세리니코커스 프로푼디(Serinicoccus profundi), 프랑키아(Frankia)속으로 분류되는 미생물로서는 프랑키아 알니(Frankia alni), 아시도써무스(Acidothermus)속으로 분류되는 미생물로서는 아시도써무스 셀룰롤리티커스(Acidothermus cellulolyticus), 나카무렐라(Nakamurella)속으로 분류되는 미생물로서는 나카무렐라 멀티파르티타(Nakamurella multipartita), 지오데르마토필러스(Geodermatophilus)속으로 분류되는 미생물로서는 지오데르마토필러스 오브스쿠러스(Geodermatophilus obscurus), 스타케브란드티아(Stackebrandtia)속으로 분류되는 미생물로서는 스타케브란드티아 나사우엔시스(Stackebrandtia nassauensis), 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로 분류되는 미생물로서는 스트렙토마이세스 알버스(Streptomyces albus), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 빙쳉겐시스(Streptomyces bingchenggensis), 스트렙토마이세스 차르트레우시스(Streptomyces chartreusis), 스트렙토마이세스 칼불리게루스(Streptomyces clavuligerus), 스트렙토마이세스 코엘리코플라버스(Streptomyces coelicoflavus), 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 그하낸시스(Streptomyces ghanaensis), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 로세오스포러스(Streptomyces roseosporus), 스트렙토마이세스 스카비에이(Streptomyces scabiei), 스트렙토마이세스 스비세우스(Streptomyces sviceus), 스트렙토마이세스 베네주엘라에(Streptomyces venezuelae), 스트렙토마이세스 비올라세우스니게르(Streptomyces violaceusniger) 및 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 카테눌리스포라(Catenulispora)속으로 분류되는 미생물로서는 카테눌리스포라 아시디필라(Catenulispora acidiphila), 루브로박터(Rubrobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 루브로박터 크실라노필러스(Rubrobacter xylanophilus), 코넥시박터(Conexibacter)속으로 분류되는 미생물로서는 코넥시박터 우에세이(Conexibacter woesei), 바실러스(Bacillus)에 분류되는 미생물로서는 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 슈도피르무스(Bacillus pseudofirmus), 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis), 지오바실러스(Geobacillus)속으로 분류되는 미생물로서는 지오바실러스 칼도프로테올리티커스(Geobacillus caldoproteolyticus), 지오바실러스 칼독실로실리티커스(Geobacillus caldoxylosilyticus), 지오바실러스 데빌리스(Geobacillus debilis), 지오바실러스 갈락토시다시우스(Geobacillus galactosidasius), 지오바실러스 가르겐시스(Geobacillus gargensis), 세오바실러스 주라시커스(Geobacillus jurassicus), 세오바실러스 카우스토필러스(Geobacillus kaustophilus), 지오바실러스 리투아니커스(Geobacillus lituanicus), 세오바실러스 팔리더스(Geobacillus pallidus), 세오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus), 세오바실러스 스트롬볼리엔시스(Geobacillus stromboliensis), 지오바실러스 서브테라네우스(Geobacillus subterraneus), 세오바실러스 테피다만스(Geobacillus tepidamans), 세오바실러스 써모카테눌라터스(Geobacillus thermocatenulatus), 세오바실러스 써모데니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans), 지오바실러스 써모글루코시다시우스(Geobacillus thermoglucosidasius), 지오바실러스 써몰레오보란스(Geobacillus thermoleovorans), 지오바실러스 토에비이(Geobacillus toebii), 지오바실러스 우젠시스(Geobacillus uzensis), 지오바실러스 불카니(Geobacillus vulcani), 지오바실러스 잘리하에(Geobacillus zalihae), 오세아노바실러스(Oceanobacillus)속으로 분류되는 미생물로서는 오세아노바실러스 이헤이엔시스(Oceanobacillus iheyensis), 리시니바실러스(Lysinibacillus)속으로 분류되는 미생물로서는 리시니바실러스 스패리커스(Lysinibacillus sphaericus), 할로바실러스(Halobacillus)속으로 분류되는 미생물로서는 할로바실러스 할로필러스(Halobacillus halophilus), 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus)속으로 분류되는 미생물로서는 알리사이클로바실러스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 키르피디아(Kyrpidia)속으로 분류되는 미생물로서는 키르피디아 투스키(Kyrpidia tusci), 패니바실러스(Paenibacillus)속으로 분류되는 미생물로서는 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 패니바실러스 무실라기노서스(Paenibacillus mucilaginosus) 및 패니바실러스 테라에(Paenibacillus terrae), 락토바실러스(Lactobacillus)속으로 분류되는 미생물로서는 락토바실러스 부치네리(Lactobacillus buchneri), 클로스트리듐(Clostridium)속으로 분류되는 미생물로서는 클로스트리듐 아세토부틸리컴(Clostridium acetobutylicum), 클로스티리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile) 및 클로스트리듐 스티클란디이(Clostridium sticklandii), 알칼리필러스(Alkaliphilus)속으로 분류되는 미생물로서는 알칼리필러스 메탈리레디겐스(Alkaliphilus metalliredigens) 및 알칼리필러스 오렘란디이(Alkaliphilus oremlandii), 신트로포모나스(Syntrophomonas)속으로 분류되는 미생물로서는 신트로포모나스 울페이(Syntrophomonas wolfei), 신트로포써무스(Syntrophothermus)속으로 분류되는 미생물로서는 신트로포써무스 리포칼리더스(Syntrophothermus lipocalidus), 유박테리움(Eubacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 유박테리움 렉탈레(Eubacterium rectale) 및 유박테리움 리모섬(Eubacterium limosum), 데술피토박테리움(Desulfitobacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 데술피토박테리움 하프니엔스(Desulfitobacterium hafniense), 데술포토마쿨럼(Desulfotomaculum)속으로 분류되는 미생물로서는 데술포토마쿨럼 레두센스(Desulfotomaculum reducens), 펠로토마쿨럼(Pelotomaculum)속으로 분류되는 미생물로서는 펠로토마쿨럼 써모프로피오니컴(Pelotomaculum thermopropionicum), 부티리비브리오(Butyrivibrio)속으로 분류되는 미생물로서는 부티로비브리오 프로테오클라스티커스(Butyrivibrio proteoclasticus), 로세부리아(Roseburia)속으로 분류되는 미생물로서는 로세부리아 호미니스(Roseburia hominis), 오실리박터(Oscillibacter)속으로 분류되는 미생물로서는 오실리박터 발레리시게네스(Oscillibacter valericigenes), 써모아내로박터(Thermoanaerobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 써모아내로박터 텡콩엔시스(Thermoanaerobacter tengcongensis), 카르복시도써무스(Carboxydothermus)속으로 분류되는 미생물로서는 카르복시도써무스 히드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans), 나트라내로비우스(Natranaerobius)속으로 분류되는 미생물로서는 나트라내로비우스 써모필러스(Natranaerobius thermophilus), 스핑고박테리움(Sphingobacterium)속으로 분류되는 미생물로서는, 스핑고박테리움 멀티보럼(Sphingobacterium multivorum), 스핑고박테리움 스피리티보럼(Sphingobacterium spiritivorum), 스핑고박테리움 알리멘타리움(Sphingobacterium alimentarium), 스핑고박테리움 안후이엔스(Sphingobacterium anhuiense), 스핑고박테리움 안타르크티컴(Sphingobacterium antarcticum), 스핑고박테리움 밤부사에(Sphingobacterium bambusae), 스핑고박테리움 카나덴스(Sphingobacterium canadense), 스핑고박테리움 콤포스티(Sphingobacterium composti), 스핑고박테리움 대전엔스(Sphingobacterium daejeonense), 스핑고박테리움 패시움(Sphingobacterium faecium), 스핑고박테리움 헤파리넘(Sphingobacterium heparinum), 스핑고박테리움 키타히로시멘스(Sphingobacterium kitahiroshimense), 스핑고박테리움 락티스(Sphingobacterium lactis), 스핑고박테리움 미주타이이(Sphingobacterium mizutaii), 스핑고박테리움 네마토시다(Sphingobacterium nematocida), 스핑고박테리움 피스키움(Sphingobacterium piscium), 스핑고박테리움 샤이엔스(Sphingobacterium shayense), 스핑고박테리움 시양겐스(Sphingobacterium siyangense), 스핑고박테리움 탈포필럼(Sphingobacterium thalpophilum) 및 스핑고박테리움 웬크시니아에(Sphingobacterium wenxiniae), 페도박터(Pedobacter)속으로 분류되는 미생물로서는, 페도박터 스테이니이(Pedobacter steynii), 페도박터 두라쿠아에(Pedobacter duraquae), 페도박터 메타볼리파우페르(Pedobacter metabolipauper), 페도박터 하르토니우스(Pedobacter hartonius), 페도박터 헤파리너스(Pedobacter heparinus) 페도박터 아프리카너스(Pedobacter africanus), 페도박터 아그리(Pedobacter agri), 페도박터 알루비우스(Pedobacter alluvius) 및 페도박터 살탄스(Pedobacter saltans), 할리스코메노박터(Haliscomenobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 할리스코메노박터 히드로시스(Haliscomenobacter hydrossis), 포르피로모나스(Porphyromonas)속으로 분류되는 미생물로서는 포르피로모나스 깅기발리스(Porphyromonas gingivalis) 및 포르피로모나스 아사카롤리티카(Porphyromonas asaccharolytica), 오도리박터(Odoribacter)속으로 분류되는 미생물로서는 오도리박터 스플란치니커스(Odoribacter splanchnicus), 스피로소마(Spirosoma)속으로 분류되는 미생물로서는 스피로소마 링구알레(Spirosoma linguale), 루넬라(Runella)속으로 분류되는 미생물로서는 루넬라 슬리티포르미스(Runella slithyformis), 데이노코커스(Deinococcus)속으로 분류되는 미생물로서는 데이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans), 데이노코커스 게오테르말리스(Deinococcus geothermalis), 데이노코커스 데세르티(Deinococcus deserti), 데이노코커스 마리코펜시스(Deinococcus maricopensis), 데이노코커스 프로테올리티커스(Deinococcus proteolyticus) 및 데이노코커스 고비엔시스(Deinococcus gobiensis), 써무스(Thermus)속으로 분류되는 미생물로서는 써무스 써모필러스(Thermus thermophilus) 및 써무스 스코토둑터스(Thermus scotoductus), 메이오써무스(Meiothermus)속으로 분류되는 미생물로서는 메이오써무스 루베르(Meiothermus ruber) 및 메이오써무스 실바너스(Meiothermus silvanus), 오세아니써무스(Oceanithermus)속으로 분류되는 미생물로서는 오세아니써무스 프로푼더스(Oceanithermus profundus), 마리니써무스(Marinithermus)속으로 분류되는 미생물로서는 마리니써무스 히드로테르말리스(Marinithermus hydrothermalis), 겜마티모나스(Gemmatimonas)속으로 분류되는 미생물로서는 겜마티모나스 아우란티아카(Gemmatimonas aurantiaca), 푸소박테리움(Fusobacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 푸소박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium nucleatum), 일리오박터(Ilyobacter)속으로 분류되는 미생물로서는 일리오박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus), 로세이플렉서스(Roseiflexus)속으로 분류되는 미생물로서는 로세이플렉서스 카스텐홀지이(Roseiflexus castenholzii), 헤르페토시폰(Herpetosiphon)속으로 분류되는 미생물로서는 헤르페토시폰 아우란티아커스(Herpetosiphon aurantiacus), 써모미크로비움(Thermomicrobium)속으로 분류되는 미생물로서는 써모미크로비움 로세움(Thermomicrobium roseum), 써모토가(Thermotoga)속으로 분류되는 미생물로서는 써모토가 레팅가에(Thermotoga lettingae), 써모시포(Thermosipho)속으로 분류되는 미생물로서는 써모시포 멜라네시엔시스(Thermosipho melanesiensis) 및 써모시포 아프리카너스(Thermosipho africanus), 페르비도박테리움(Fervidobacterium)속으로 분류되는 미생물로서는 페르비도박테리움 노도섬(Fervidobacterium nodosum), 데페리박터(Deferribacter)속으로 분류되는 미생물로서는 데페리박터 데술푸리칸스(Deferribacter desulfuricans), 칼디테리비브리오(Calditerrivibrio)속으로 분류되는 미생물로서는 칼디테리비브리오 니트로레두센스(Calditerrivibrio nitroreducens), 플렉시스티페스(Flexistipes)속으로 분류되는 미생물로서는 플렉시스티페스 시누사라비시(Flexistipes sinusarabici), 메탈로스패라(Metallosphaera)속으로 분류되는 미생물로서는 메탈로스패라 세둘라(Metallosphaera sedula), 애로피럼(Aeropyrum)속으로 분류되는 미생물로서는 애로피럼 페르닉스(Aeropyrum pernix), 피로바쿨럼(Pyrobaculum)속으로 분류되는 미생물로서는 피로바쿨럼 애로필럼(Pyrobaculum aerophilum), 피로바쿨럼 이슬란디컴(Pyrobaculum islandicum), 피로바쿨럼 칼리디폰티스(Pyrobaculum calidifontis) 및 피로바쿨럼 뉴트로필럼(Pyrobaculum neutrophilum), 칼디비르가(Caldivirga)속으로 분류되는 미생물로서는 칼디비르가 메퀼링겐시스(Caldivirga maquilingensis), 불카니새타(Vulcanisaeta)속으로 분류되는 미생물로서는 불카니새타 디스트리부타(Vulcanisaeta distributa), 아시딜로버스(Acidilobus)속으로 분류되는 미생물로서는 아시딜로버스 사카로보란스(Acidilobus saccharovorans), 할로아르쿨라(Haloarcula)속으로 분류되는 미생물로서는 할로아르쿨라 마리스모르투이(Haloarcula marismortui), 할로쿠아드라텀(Haloquadratum)속으로 분류되는 미생물로서는 할로쿠아드라텀 왈스비이(Haloquadratum walsbyi), 나트로노모나스(Natronomonas)속으로 분류되는 미생물로서는 나트로노모나스 파라오니스(Natronomonas pharaonis), 할로루브럼(Halorubrum)속으로 분류되는 미생물로서는 할로루브럼 라쿠스프로푼디(Halorubrum lacusprofundi), 할로테리게나(Haloterrigena)속으로 분류되는 미생물로서는 할로테리게나 투르크메니카(Haloterrigena turkmenica), 나트리알바(Natrialba)속으로 분류되는 미생물로서는 나트리알바 마가디이(Natrialba magadii), 할랄칼리코커스(Halalkalicoccus)속으로 분류되는 미생물로서는 할랄칼리코커스 제오트갈리(Halalkalicoccus jeotgali), 할로게오메트리컴(Halogeometricum)속으로 분류되는 미생물로서는 할로게오메트리컴 보링쿠엔스(Halogeometricum borinquense), 써모플라즈마(Thermoplasma)속으로 분류되는 미생물로서는 써모플라즈마 아시도필럼(Thermoplasma acidophilum) 및 써모플라즈마 볼카니움(Thermoplasma volcanium), 피크로필러스(Picrophilus)속으로 분류되는 미생물로서는 피크로필러스 토리더스(Picrophilus torridus), 페로플라즈마(Ferroplasma)속으로 분류되는 미생물로서는 페로플라즈마 아시다르마너스(Ferroplasma acidarmanus), 아르캐오글로버스(Archaeoglobus)속으로 분류되는 미생물로서는 아르캐오글로버스 풀기더스(Archaeoglobus fulgidus) 및 아르캐오글로버스 베네피커스(Archaeoglobus veneficus), 페로글로버스(Ferroglobus)속으로 분류되는 미생물로서는 페로글로버스 플라시더스(Ferroglobus placidus), 폴리모르품(Polymorphum)속으로 분류되는 미생물로서는 폴리모르품 길붐(Polymorphum gilvum), 미카비브리오(Micavibrio)속으로 분류되는 미생물로서는 미카비브리오 애루기노사보러스(Micavibrio aeruginosavorus), 시미두이아(Simiduia)속으로 분류되는 미생물로서는 시미두이아 아가리보란스(Simiduia agarivorans), 렙토트릭스(Leptothrix)속으로 분류되는 미생물로서는 렙토트릭스 콜론드니이(Leptothrix cholodnii), 티아모나스(Thiomonas)속으로 분류되는 미생물로서는 티아모나스 인터메디아(Thiomonas intermedia), 루브리비박스(Rubrivivax)속으로 분류되는 미생물로서는 루브리비박스 겔라티노서스(Rubrivivax gelatinosus), 메틸리비움(Methylibium)속으로 분류되는 미생물로서는 메틸리비움 페트롤레이필럼(Methylibium petroleiphilum), 아내로코커스(Anaerococcus)속으로 분류되는 미생물로서는 아내로코커스 프레보티이(Anaerococcus prevotii)가 특히 바람직하다.
여기에서 예시한 미생물은, 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(ATCC)이나, 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 바이오테크놀로지 본부 생물 유전 자원 부문(NBRC)이나, 독립 행정법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(FERM) 등으로부터 입수 가능하다.
[메타크릴산에스테르의 합성 공정]
메타크릴산에스테르의 제조는, 이하의 방법으로 행할 수 있다. 용매에 메타크릴릴-CoA 및 식 2로 표현되는 알코올 또는 페놀류를 첨가하여 용액을 제조하여, 용해 또는 현탁시킨다. 그리고, 이 용액 또는 현탁액에 AAT를 접촉시켜, 온도 등의 조건을 제어하면서 메타크릴릴-CoA와 알코올 또는 페놀류를 반응시킨다. 상기 반응에 의해, 메타크릴릴-CoA의 메타크릴기를 식 2의 알코올 또는 페놀류에 전이시켜서, 메타크릴산에스테르를 생성시킨다.
메타크릴릴-CoA 및 식 2로 표현되는 알코올 또는 페놀류를 포함하는 용액은, 통상, 완충액 등의 수성 매체에서 제조한다. 여기서, 반응을 원활하게 진행시키기 위해, 침투압 조정제 등에 의해 몰 침투압 농도 및/또는 이온 강도를 제어하는 것이 가능하다. 침투압 조정제로서는, 세포 내부 등의 용액의 침투압에 대하여 등장 또는 고장이 되도록 조절할 목적으로 가해지는 수용성 물질이면 좋고, 예를 들어 염 또는 당류이며, 바람직하게는 염이다. 염은, 바람직하게는 금속염, 보다 바람직하게는 알칼리 금속염, 보다 바람직하게는 할로겐화알칼리 금속이며, 예를 들어 염화나트륨이나 염화칼륨을 들 수 있다. 당류는, 바람직하게는 단당류 또는 올리고당류, 보다 바람직하게는 단당류 또는 이당류이며, 예를 들어 글루코오스, 수크로오스, 만니톨 등을 들 수 있다. 침투압 조정제는 1mM 이상의 농도로 첨가하는 것이 바람직하고, 사용하는 생체 세포 내의 용액에 비해 등장 또는 고장이 되도록 조절하는 것이 특히 바람직하다.
또한, 생성한 메타크릴산에스테르를 분리할 목적으로, 미리, 유기 용매를 첨가하여, 2상계에서 반응시키는 것도 가능하다. 유기 용매로서는, 예를 들어 직쇄상, 분지상 또는 환상의, 포화 또는 불포화 지방족 탄화수소, 포화 또는 불포화 방향족 탄화수소 등을 단독으로 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 탄화수소계 용매(예를 들어 펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등), 할로겐화 탄화수소계 용매(예를 들어 염화메틸렌, 클로로포름 등), 에테르계 용매(예를 들어 디에틸에테르, 디프로필에테르, 디이소프로필에테르, 디부틸에테르, tert-부틸메틸에테르, 디메톡시에탄 등), 에스테르계 용매(예를 들어 포름산메틸, 아세트산메틸, 아세트산에틸, 아세트산부틸, 프로피온산메틸) 등을 들 수 있다. 이러한 유기 용매를 첨가해 둠으로써, 생성된 메타크릴산에스테르가 유기상으로 이행하여, 효율적으로 반응이 진행되는 경우가 있다.
반응액 내의 메타크릴릴-CoA 및 식 2로 표현되는 알코올 또는 페놀류의 몰비, 농도는 임의이며, 특별히 제한은 없다. 또한, AAT의 사용량 또는 반응 조건은, 사용하는 원료에 따라서 적절히 결정된다. 통상, 각 원료의 농도는, 메타크릴릴-CoA의 경우에는 0.0000001 내지 10질량%의 범위로 설정하고, 알코올 또는 페놀류는 사용하는 메타크릴릴-CoA에 대하여 0.1 내지 1000배 몰, 바람직하게는 0.5 내지 50배 몰의 농도로 첨가한다.
기타의 반응 온도 또는 반응 시간 등의 각종 조건은 사용하는 원료, 효소의 활성 등에 따라 적절히 결정되는 것으로, 특별히 제한은 없지만, 통상 5 내지 80℃에서, 1시간 내지 1주일 반응시키면 된다. 바람직하게는, 10 내지 70℃에서, 1 내지 120시간이며, 3시간 이상이 보다 바람직하고, 4시간 이상이 더욱 바람직하다. 이러한 조건에서 반응이 종료하는 조건을 선택하는 것이 바람직하다. 반응액의 pH에 대해서도 반응이 효율적으로 진행되면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 pH4 내지 10의 범위, 바람직하게는 pH5.5 내지 8.5이다.
메타크릴산에스테르를 0.001mM 이상 축적시키기 위한 적합한 조건으로서는, pH5.5 내지 7.5의 조건 하, 메타크릴릴-CoA의 농도가 직접 또는 간접적으로 0.000001 내지 1질량%의 범위가 되도록 조정하고, 알코올 또는 페놀류는 사용하는 메타크릴릴-CoA에 대하여 1 내지 50배 몰이 되도록 농도를 조정한다. 그리고, 온도를 20 내지 40℃의 범위로 조정하여, 3시간 이상 반응시킨다. 이 원료(기질)에 대해서는 상술한 범위가 되도록 연속적으로 공급하는 것도 가능하고, 그렇게 함으로써 생성물의 축적 농도를 향상시킬 수 있다.
감압 하 또는 통기 조건 하에서 본 반응을 실시하는 것도 유효하다. 상기 조건 하에서, 생성된 메타크릴산에스테르를 연속적으로 분리할 수 있고, 그 결과, 효율적으로 반응이 진행되는 경우가 있기 때문이다.
이소부티릴-CoA를 원료로 ACD의 작용에 의해 변환된 메타크릴릴-CoA 또는 3-히드록시이소부티릴-CoA로부터 ECH의 작용에 의해 변환된 메타크릴릴-CoA를 사용하여 메타크릴산에스테르를 제조하는 경우에도, 상기 조건의 범위가 되도록 조정하여 실시하는 것이 바람직하다. 또한, ACD 또는 ECH에 의한 메타크릴릴-CoA 합성 반응은 공지된 방법에 의해 실시 가능하다(예를 들어, ACD의 반응 조건으로서 문헌 [Microbiology(1999), 145, 2323-2334] 기재의 조건). 또한 다른 생체 반응과 조합함으로써, 메타크릴산에스테르의 생체 내에서의 연속 반응(발효 생산)이 가능하게 된다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 메타크릴산에스테르는, 필요에 따라, 가스 크로마토그래피(GC), 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 등에 의해 측정 또는 정량 분석할 수 있다.
반응액으로부터의 메타크릴산에스테르의 단리는, 증류, 박막 증류, 용제 추출, 칼럼 분리 등 공지된 정제법의 단독 또는 조합에 의해 행할 수 있다. 또한, 얻어진 메타크릴산에스테르는 통상의 방법에 의해 중합하여, 종래의 용도에 손색없이 사용하는 것이 가능하다.
이와 같이 하여 얻어진 메타크릴산에스테르 및 그의 중합물은 에너지, 자원, 환경에 대한 부하를 현저히 저감할 수 있고, 석유 제품을 출발 원료로 한 종래의 화학 제조품과 비교하여 환경 저부하 재료로서 매우 큰 사회적 가치를 갖는 것이다.
2. 유전자 재조합 미생물에 의해 전구체로부터 메타크릴산에스테르를 제조하는 방법
[전구체로부터의 메타크릴산에스테르 생성 능력을 갖는 재조합체 미생물]
상술한 바와 같이 본 발명에서는, AAT 유전자를 도입한 미생물에 필요에 따라서 ACD 유전자, ECH 유전자, BCKAD 유전자 등을 도입하여, 이소부티릴-CoA, 3-히드록시이소부티릴-CoA 또는 2-옥소이소발레르산 등의 전구체로부터 메타크릴산에스테르를 합성하는 것도 가능하다.
「전구체」란, 메타크릴릴-CoA에 유도 가능한 화합물을 의미하며, 이소부티릴-CoA 또는 3-히드록시이소부티릴-CoA, 나아가 이들 2 화합물에 유도 가능한 물질을 나타낸다.
2 화합물에 유도 가능한 물질이란 예를 들어, 2-옥소이소발레르산, 이소부티르산, 3-히드록시이소부티르산, 아세트산, 피루브산, 락트산, 아세토아세트산, 부티르산, 프로피온산, 말산, 푸마르산, 시트르산 및 숙신산 등의 산, 발린, 알라닌, 류신, 리신 및 글루탐산 등의 아미노산류, 글루코오스, 프룩토오스 및 크실로오스 등의 당류 등을 들 수 있다.
이들 전구체로부터 메타크릴산에스테르를 생성시키기 위해서는 숙주 미생물이 원래 갖는 각종 대사계를 그대로 이용하는 것도 가능하다. 필요에 따라 유전자를 도입 또는 결손시킬 수도 있다.
(1) 숙주 미생물
숙주 미생물로서는, 상기 전구체로부터의 메타크릴릴-CoA를 생성시키기 위한 효소군 및 AAT의 발현 능력을 갖는 숙주라면 특별히 제한은 없지만, 세균에서는, 로도코커스(Rhodococcus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 바실러스(Bacillus)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속 등을 들 수 있고, 효모에서는 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속, 시조사카로마이세스(Shizosaccharomyces)속, 피치아(Pichia)속, 사상균에서는 아스퍼질러스(Aspergillus)속 등을 들 수 있다.
숙주로서 로도코커스속 미생물이 바람직하다. 그 이유로서는, 본 발명의 과정에서, 로도코커스속 미생물이 발린 자화 능력을 갖는다는 것을 실험적으로 확인하고, 그 기능을 이용함으로써, 도 2에서 나타내는 루트에 의한 메타크릴산에스테르 생성에 응용할 수 있음을 발견한 지식에 의한 것이다.
예를 들어 이하의 미생물에서 선택되는 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 로도코커스속(Rhodococcus sp.)으로 분류되는 미생물로서는, 예를 들어 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous), 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 로도코커스 에쿠이(Rhodococcus equi), 로도코커스 로드니이(Rhodococcus rhodnii), 로도코커스 코랄리누스(Rhodococcus corallinus), 로도코커스 루브로페르팅크터스(Rhodococcus rubropertinctus), 로도코커스 코프로필러스(Rhodococcus coprophilus), 로도코커스 글로베룰러스(Rhodococcus globerulus), 로도코커스 클로로페놀리커스(Rhodococcus chlorophenolicus), 로도코커스 루테우스(Rhodococcus luteus), 로도코커스 아이치엔시스(Rhodococcus aichiensis), 로도코커스 추부엔시스(Rhodococcus chubuensis), 로도코커스 마리스(Rhodococcus maris) 및 로도코커스 파시엔스(Rhodococcus fascines) 등을 들 수 있다.
바람직한 예로서는, 로도코커스 에리트로폴리스를 들 수 있다. 더 바람직한 주로서는, 로도코커스 에리트로폴리스 PR-4주, 로도코커스 에리트로폴리스 KA2-5-1주, 로도코커스 에리트로폴리스 IGTS8주, 로도코커스 에리트로폴리스 D-1주, 로도코커스 에리트로폴리스 H-2주, 로도코커스 에리트로폴리스 N1-36주, 로도코커스 에리트로폴리스 I-19주, 로도코커스 에리트로폴리스 ECRD-1주, 로도코커스 에리트로폴리스 B1주, 로도코커스 에리트로폴리스 SY-1주, 로도코커스 에리트로폴리스 UM3주, 로도코커스 에리트로폴리스 UM9주 또는 로도코커스 SPT09주 등을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 로도코커스 에리트로폴리스 PR-4주를 들 수 있다. 또한 이들 주의 유도주가 포함된다.
유도주로서는, 배양 조건(예를 들어 배지 조성, 온도 등)의 변화나, 화학적 또는 물리적 처리(예를 들어 γ선 조사 등)에 의해, 메타크릴릴-CoA 생성 능력을 갖는 미생물에 유전자 변이를 유발하여 얻은 변이주나, 하기와 같이 하여 활성이 강화된, 또는 활성을 결손 또는 저하시킨 유전자 개변주가 포함된다.
활성의 강화란, 균체외로부터 미생물에 도입된 유전자에 기초하여 당해 미생물에서의 효소 유전자(유래에 상관없음)의 발현량이 증대하는 것을 의미하며, 효소를 코딩하는 유전자를 미생물의 균체외로부터 균체 내에 도입하는 것 외에, 미생물이 게놈상에 보유하는 효소 유전자의 프로모터 활성을 강화하는 것 또는 다른 프로모터와 치환함으로써 효소 유전자를 강 발현시킨 것, 또는 당해 효소 유전자의 리프레서 활성을 저감화 또는 불활성화하는 것의 결과로서 당해 효소 활성을 강화시키는 것을 포함한다.
유전자 개변주는, 메타크릴릴-CoA 합성 반응을 저해하는 효소의 활성을 결손 또는 저하시킨 유전자 개변을 행한 개변주이어도 된다. 활성의 「결손」 또는 「저하」란, 당해 미생물에서의 당해 효소 유전자의 발현이 완전히 없어지거나 감소하는 것을 의미하고, 당해 효소 유전자에 치환, 결실 또는 삽입이 일어나는 것 외에, 미생물이 게놈상에 보유하는 효소 유전자의 프로모터 활성을 저하시키는 것 또는 다른 프로모터와 치환함으로써 효소 유전자의 발현을 억제시킨 것, 또는 당해 효소 유전자의 리프레서 활성을 강화 또는 활성화하는 것의 결과로서 당해 효소 활성을 저감시키는 것을 포함한다. 또한, 이 유전자 개변은, 통상법에 따라서 행하면 된다.
도 2에서 나타내는 루트로 메타크릴산에스테르 제조를 실시하는 경우의 바람직한 개변주로서는, 이하에 나타낸 (a) 또는 (b) 중 적어도 한쪽의 특징을 갖는 개변주를 들 수 있다.
(a) BCKAD 유전자 및/또는 ACD 유전자가 도입됨으로써, 메타크릴릴-CoA 생성 활성이 강화되어 있다.
(b) ECH 유전자, 3-히드록시 이소부티릴 CoA 히드로라제 유전자 및/또는 3-히드록시이소부티르산 데히드로게나제 유전자의 결손 또는 불활성화에 의해, 메타크릴릴-CoA 생성 활성이 강화되어 있다. 결손 또는 불활성화는, 유전자 모두 또는 염기 서열의 일부에 치환, 결실 또는 삽입에 의해 행한다.
(2) 삽입 유전자
상기 전구체로부터 메타크릴릴-CoA를 생성시키기 위한 효소군의 각 유전자 및 AAT 유전자를 필요에 따라서 숙주에 도입하는 것이 필요해진다. 숙주 미생물이 원래 갖는 각종 효소는 그대로 이용하는 것도 가능하다. 또는 필요에 따라 유전자 도입에 의해 활성을 강화하는 것도 가능하다.
상기 전구체로부터 메타크릴릴-CoA를 생성시키기 위한 효소는 숙주 및 합성 루트에 의해 적절히 선택 또는 최적화되며, 특별히 한정되는 것은 아니나, 이하, 로도코커스속 미생물을 숙주에 사용하여, 도 2에서 나타내는 루트에 의한 메타크릴산에스테르 생성에 대해 필요한 효소 유전자에 대하여 상세하게 설명한다.
(2-1) 알코올 아실 트랜스페라아제(AAT)
본 발명에서 사용하는 AAT는, 메타크릴릴-CoA와 알코올 또는 페놀류를 원료로 메타크릴산에스테르를 제조하는 능력을 갖는 것이라면, 특별히 한정되지 않고 그 종류 및 기원을 묻지 않는다. 식물 유래의 것이 바람직하고, 대표적인 것으로서, 상술한 생강목, 장미목, 철쭉목, 박목, 유채목 및 녹나무목으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 목에 유래하는 것을 들 수 있다.
(2-2) 아실 CoA 데히드로게나제(ACD)
본 발명에서 사용하는 ACD는, 아실 CoA로부터 메타크릴릴-CoA를 생성하는 능력을 갖는 것이라면, 특별히 한정되지 않고 그 유래 및 종류를 불문한다. 미생물 유래의 것이 바람직하고, 대표적인 것으로서 상기에 나타내는 바와 같다.
보다 바람직하게는, 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis)에서 유래되는 것이며, 바람직한 주로서는, 로도코커스 에리트로폴리스 PR-4주, 로도코커스 에리트로폴리스 KA2-5-1주, 로도코커스 에리트로폴리스 IGTS8주, 로도코커스 에리트로폴리스 D-1주, 로도코커스 에리트로폴리스 H-2주, 로도코커스 에리트로폴리스 N1-36주, 로도코커스 에리트로폴리스 I-19주, 로도코커스 에리트로폴리스 ECRD-1주, 로도코커스 에리트로폴리스 B1주, 로도코커스 에리트로폴리스 SY-1주, 로도코커스 에리트로폴리스 UM3주, 로도코커스 에리트로폴리스 UM9주 또는 로도코커스 에스피 T09주 등을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 로도코커스 에리트로폴리스 PR-4주를 들 수 있다.
로도코커스 에리트로폴리스 PR-4주 유래 ACD 유전자의 염기 서열을 서열 번호 33에, 당해 염기 서열에 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 32에 나타내었다. 또한, 본 발명에서 ACD 유전자에는, 서열 번호 32에 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 아실 CoA로부터 메타크릴릴-CoA를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자도 포함된다. 또한, 본 발명에서 ACD 유전자에는, 서열 번호 32로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 99.5% 이상, 더욱 바람직하게는 99.9% 이상의 동일성을 나타내고, 아실 CoA로부터 메타크릴릴-CoA를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자도 포함된다.
또한, 본 발명에서 ACD 유전자에는, 서열 번호 33에 나타내는 염기 서열에 대한 상보적인 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격한 조건에서 혼성화하여, 아실 CoA로부터 메타크릴릴-CoA를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자도 포함된다. 또한, 본 발명에서 ACD 유전자에는, 서열 번호 33에 나타내는 염기 서열과 BLAST 등(예를 들어, 디폴트 즉, 초기 설정의 파라미터)을 사용하여 계산했을 때에, 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하고, 아실 CoA로부터 메타크릴릴-CoA를 생성하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자도 포함된다. 또한, 상기 ACD 유전자의 코돈은 형질 전환에 사용하는 미생물의 코돈 사용 빈도에 맞춰서 변환된 것이어도 된다.
상기 AAT 유전자 및/또는 ACD 유전자를 코딩하는 DNA를 로도코커스속(Rhodococcus sp.)에 속하는 미생물에 도입하고, 당해 미생물 내에서 단백질에 전사 번역시켜서 사용한다. 당해 미생물에 도입되는 DNA는, 벡터에 내장된 형태에 있는 것이 바람직하다.
(3) 재조합체 미생물의 제작
상기 AAT 유전자 및/또는 ACD 유전자를 코딩하는 DNA를 숙주 미생물에 도입하고, 당해 미생물 내에서 단백질에 전사 번역시켜서 사용한다. 당해 미생물에 도입되는 DNA는, 벡터에 내장된 형태에 있는 것이 바람직하다. 즉, 각 유전자를 상기 숙주 세포에서 발현 가능한 발현 벡터에 내장하고, 이것을 숙주 세포에 도입한다.
상기한 벡터는, 숙주 미생물 중에서 자립 복제 가능한 것이며, AAT 유전자 및/또는 ACD 유전자를 유지하는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 각각의 미생물에 적합한 벡터를 사용할 수 있다. DNA를 로도코커스속(Rhodococcus sp.)에 속하는 미생물에 도입하기 위한 벡터로서는, 예를 들어 pK1, pK2, pK3 및 pK4, 및 pSJ034(일본 특허 공개 평10-337185호 참조), pSJ023 및 pSJ002(일본 특허 공개 평10-24867호를 참조), pSJ201 및 pLK005 등(이들에 한정되지 않음), 공지된 벡터를 사용할 수 있다. pSJ023은 형질전환체 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) ATCC12674/pSJ023(FERM BP-6232)으로서 산업 종합 기술 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁되어 있다.
상기 AAT 유전자 및/또는 ACD 유전자의 벡터에 대한 삽입은, 당업자에게 알려진 유전자 재조합 기술을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 제한 효소 절단과 라이게이션 키트를 사용하는 방법, 토포이소머라아제를 사용하는 방법, 인 퓨전 키트(다카라 바이오) 등을 이용할 수 있다. 벡터에 삽입되는 유전자는, 숙주 생물 중에서 각 유전자에 코딩되는 단백질의 전사 번역을 조절하는 것이 가능한 프로모터의 하류에 연결하여 삽입된다. 또한, 삽입 시에 필요하다면, 적당한 링커를 부가해도 된다. 또한, 필요에 따라, 유전자를 도입하고자 하는 숙주 생물에서 이용 가능한 터미네이터 서열, 인핸서 서열, 스플라이싱 시그널 서열, 폴리 A 부가 시그널 서열, SD 서열이나 코작(Kozak) 서열 등의 리보솜 결합 서열, 선택 마커 유전자 등을 연결할 수 있다. 선택 마커 유전자의 예로서는, 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자 등의 약제 내성 유전자 외에, 아미노산이나 핵산 등의 영양소의 세포내 생합성에 관여하는 유전자, 또는 루시페라아제 등의 형광 단백질을 코딩하는 유전자 등을 들 수 있다. 삽입에 수반하여, DNA가 코딩하는 아미노산 서열의 일부를 치환해도 된다.
상기의 관점에서, 본 발명에서는, 벡터로서 pK4에 변이 처리를 행하여 취득한 pLK005를 사용하는 것이 특히 바람직하다. pLK005의 프로모터의 3' 하류에 배치되도록 AAT 유전자 또는 ACD 유전자를 연결 삽입하여, 프로모터에 의해 AAT 유전자 또는/및 ACD 유전자를 발현하는 발현 플라스미드 벡터를 구축할 수 있다.
벡터에는, AAT 유전자군 또는 ACD 유전자군에서 선택되는 임의의 1개의 유전자를 삽입해도 되고, 복수 개의 유전자를 삽입해도 된다. 벡터에 삽입되는 유전자에 대하여 사용되는 경우 「복수 개」란 2 내지 5개, 2 내지 4개, 바람직하게는 2 내지 3개의 유전자를 삽입하는 것이 가능하다. 또한, 하나의 벡터에 복수 개의 유전자가 삽입되는 경우, 이 유전자는 오페론을 형성하는 것이 바람직하다. 여기서 「오페론」이란, 동일한 프로모터의 제어하에 전사되는 하나 또는 그 이상의 유전자로 구성되는 핵산 서열 단위이다.
상기의 유전자, 바람직하게는 벡터의 형태에 있는 유전자는, 당업자에게 알려진 방법에 의해 숙주 미생물에 도입된다. 숙주 미생물에 대한 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 숙주 미생물에 적합한 방법이라면 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 일렉트로포레이션법, 스페로프라스트법, 아세트산 리튬법, 인산칼슘법, 리포펙션법, 접합 전달법 등을 들 수 있다.
[메타크릴산에스테르의 제조 방법]
AAT 유전자 및/또는 ACD 유전자 등의 필요한 유전자를 도입한 재조합 미생물을 상기 전구체와 접촉시켜 메타크릴산에스테르를 제조한다. 여기서, 「접촉」이란, 미생물과 물질(전구체)을 일정 시간 폭로 처리하는 것을 의미한다. 구체적으로는, 미생물을 전구체(원료) 등을 포함하는 수성 매체 중에서 배양하는 것, 또는 원료를 포함하는 수성 매체에 미생물의 배양물을 첨가하고, 현탁 혼합하여, 수성 매체 중 및/또는 기상 중에 메타크릴산에스테르를 얻는다. 그때, 미생물의 증식이 있어도 상관없다. 해당 공정에서는, 재조합 미생물과 메타크릴산에스테르를 함유하는 혼합물이 얻어진다.
「수성 매체」란, 물, 또는 물을 주성분으로 하는 수용액을 가리키고, 용해하지 않은 액체 고체가 분산된 것도 포함한다. 「기상」이란 배양조(미생물을 배양하는 용기) 또는 반응조(반응을 행하는 용기)에 있어서 액체(배지 등)가 차지하는 부분을 제외한 기체나 수증기 등이 차지하는 부분을 말한다. 「배양물」이란, 균체, 배양액, 무세포 추출액, 세포막 등의 배양에 의해 얻어지는 것을 의미한다.
(1) 배양에 의한 메타크릴산에스테르의 제조
본 발명에서, 메타크릴산에스테르의 제조는, AAT 유전자가 도입된 유전자 재조합 미생물을, 상기 전구체를 포함하는 수성 매체 중에서 배양함으로써 배양 균체 또는 배양물 중에 메타크릴산에스테르를 생성 축적시켜, 해당 배양 균체 또는 배양물 또는 배양 용기 기상부에서 메타크릴산에스테르를 회수함으로써 행하여진다.
미생물의 배양에 사용되는 배지는, 증식 가능한, 적어도 1종류의 탄소원을 포함하는 충분한 영양소를 포함하는 고형 배지 또는 액체 배지이다. 전구체가 탄소원으로서 사용 가능한 경우에는 탄소원으로서 사용하는 것도 가능하다.
배지 중의 탄소원 또는 전구체의 농도는, 메타크릴산에스테르를 생산할 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. 농도는, 예를 들어 0.05 내지 20(w/v)%, 바람직하게는 0.1 내지 15(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.2 내지 10(w/v)%가 된다. 0.2(w/v)% 이상 사용하는 것은 미생물의 메타크릴산 생산 능력이 상승되기 때문이며, 10(w/v)% 이하가 하는 것은 그 이상 첨가해도 비약적인 효과의 상승이 나타나지 않기 때문이다.
배양에 의한 메타크릴산에스테르의 제조에는, 원하는 메타크릴산에스테르에 따라, 알코올 또는 페놀을 첨가한다. 사용하는 알코올 또는 페놀은 식 2에 나타내는 것이 바람직하다.
알코올 또는 페놀의 배지 중에서의 농도는, 메타크릴산에스테르를 생산할 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. 농도는, 예를 들어 0.01 내지 20(w/v)%, 바람직하게는 0.05 내지 10(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 5(w/v)%가 된다. 또한, 이들은 미리 배지에 첨가해 둘 수도 있고, 배양을 행하면서 연속적으로 또는 2회 이상으로 나누어서 간헐적으로 첨가할 수도 있다.
배지에는, 무기 질소원 또는 무기 금속염류 등을 첨가해도 된다. 무기 질소원으로서는, 예를 들어 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염 등이 사용된다.
질소원의 배지 중에서의 농도는, 메타크릴산에스테르를 생산할 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. 농도는, 예를 들어 0.01 내지 10(w/v)%, 바람직하게는 0.05 내지 8(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 4(w/v)%가 된다.
무기 금속염으로서는, 예를 들어 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등이 사용된다.
무기 염류의 배지 중에서의 농도는, 메타크릴산에스테르를 생산할 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. 농도는, 예를 들어 0.001 내지 1.6(w/v)%, 바람직하게는 0.005 내지 1.3(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1(w/v)%가 된다. 0.01(w/v)% 이상 사용하는 것은 미생물의 메타크릴산에스테르 생산 능력이 상승하기 때문이며, 1(w/v)% 이하로 하는 것은 그 이상 첨가해도 비약적인 효과의 상승이 나타나지 않기 때문이다.
그 밖에, 배지에는, 미량 금속, 비타민 등이 필요에 따라서 첨가된다. 또한, 필요에 따라 미생물의 생육에 필요한 각종 유기물, 무기물, 계면 활성제 또는 통상 사용되는 소포제 등을 배지 중에 추가할 수 있다.
배지에 대한 유전자 재조합 미생물의 파종은, 종래 공지된 방법에 의해 행하면 된다. 배양 방법도, 특별히 한정되지 않고 진탕 배양, 통기 교반 배양 및 정치 배양 등의 공지 방법을 사용할 수 있다.
배양 조건은, 유전자 재조합 미생물이 생육하고, 또한 메타크릴산에스테르를 생성하는 한 특별히 한정되지 않는다. 배양은, 호기적 조건 하에서 행하여지거나 혐기적 조건 하에서 행하여져도 된다.
pH, 온도 및 배양 시간은, 유전자 재조합 미생물이 생육하고, 또한 메타크릴산에스테르를 생성할 수 있는 조건이라면 특별히 한정되지 않는다. pH는, 바람직하게는 3 내지 10, 보다 바람직하게는 4 내지 9, 더욱 바람직하게는 5 내지 8이 된다. 온도는, 바람직하게는 10 내지 45℃, 보다 바람직하게는 15 내지 40℃, 또한 바람직하게는 20 내지 35℃가 된다. 배양 시간은, 바람직하게는 10 내지 1000시간, 보다 바람직하게는 15 내지 480시간, 더욱 바람직하게는 20 내지 240시간이 된다.
이 배양 조건은, 탄소원 또는 전구체의 이용량에 대한 메타크릴산에스테르의 생산량의 비율을 최대화하도록, 균주마다 적절히 선택 또는 최적화된다. 또한, 탄소원의 양 및 배양 조건을 적절히 조정함으로써, 메타크릴산에스테르의 생산량을 조정할 수도 있다.
메타크릴산에스테르를 0.001mM 이상 축적시키기 위한 적합한 조건으로서는, pH5.5 내지 7.5의 조건 하, 배지 중의 탄소원 또는 전구체의 농도를 직접 또는 간접적으로 0.1% 이상으로, 또한 알코올 또는 페놀류의 농도를 직접 또는 간접적으로 0.1% 이상으로 유지하고, 온도를 20 내지 40℃의 범위로 조정하여, 3시간 이상 반응시킨다. 또한, 배양액 중의 미생물의 농도는, 배양액의 환경이 미생물 또는 배양 세포의 증식에 있어서 부적절하게 되어 사멸되는 비율이 높아지지 않는 범위에서, 높은 상태로 유지하는 것이 효율적인 생산성을 얻는데 바람직하고, 예를 들어 건조 중량으로서 2g/L 이상으로 유지함으로써 양호한 생산 효율이 얻어지고, 생성물의 축적 농도를 향상시킬 수 있다.
(2) 휴지 균체 반응에 의한 메타크릴산에스테르의 제조
본 발명에 따른 메타크릴산에스테르의 제조 방법에서는, 상술한 바와 같이, 유전자 재조합 미생물의 배양에 의한 방법 외에 이하의 방법도 채용할 수 있다. 유전자 재조합 미생물이 증식 능력을 갖고 있거나 없어도 되고, 미리 배양한 배양물을 전구체를 포함하는 수성 매체에 접촉시켜, 실질적으로 증식을 수반하지 않는 휴지 균체 반응에 의해 메타크릴산에스테르를 생산시킬 수도 있다.
휴지 균체 반응에 사용되는 상기 전구체의 농도는, 상기의 배양에 의한 메타크릴산에스테르의 제조 경우와 마찬가지이어도 된다. 휴지 균체 반응에 사용되는 알코올 또는 페놀 및 그 농도는, 상기의 배양에 의한 메타크릴산에스테르의 제조 경우와 마찬가지이어도 된다.
반응액에는, 무기 금속염류 등을 첨가해도 된다. 무기 금속염으로서는, 예를 들어 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등이 사용된다.
무기 염류의 반응액 중에서의 농도는, 메타크릴산에스테르를 생산할 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. 농도는, 예를 들어 0.0001 내지 2(w/v)%, 바람직하게는 0.0003 내지 1.3(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.001 내지 1(w/v)%가 된다.
그 밖에, 반응액에는, 미량 금속, 비타민 등이 필요에 따라서 첨가된다. 또한, 필요에 따라 반응에 필요한 각종 유기물, 무기물, 계면 활성제 또는 통상 사용되는 소포제 등을 반응액 내에 추가할 수 있다.
휴지 균체 반응에는, 미리 배양한 유전자 재조합 미생물의 배양액을 그대로 사용하거나, 또는 여과 또는 원심 분리 등으로 회수한 균체를 사용한다. 회수한 배양물은, 적당한 완충액 등에 재현탁시켜, 임의의 균 농도로 하여 사용할 수 있다. 완충액 등에는, 생리 식염수, 인산칼륨 완충액, 트리스-염산 완충액, 글리신-수산화나트륨 완충액 및 붕산-수산화나트륨 완충액 등이 사용된다.
또한, 휴지 균체 반응에는, 회수한 배양물의 처리물(예를 들어, 파쇄물, 조 효소 또는 정제 효소 등)을 사용할 수도 있다. 또한, 공지된 방법으로 적당한 담체에 고정화하여, 그 고정화물을 반응에 사용해도 된다.
반응 조건은, 메타크릴산에스테르를 생성하는 한 특별히 한정되지 않는다. 반응은, 호기적 조건 하에서 행하여지거나 혐기적 조건 하에서 행하여져도 된다. 반응 방법도, 특별히 한정되지 않고 진탕 반응, 통기 교반 반응 및 정치 반응 등의 공지 방법을 사용할 수 있다.
pH, 온도 및 반응 시간은, 메타크릴산을 생성할 수 있는 조건이라면 특별히 한정되지 않는다. pH는, 바람직하게는 3 내지 10, 보다 바람직하게는 4 내지 9, 더욱 바람직하게는 5 내지 8이 된다. 온도는, 바람직하게는 10 내지 45℃, 보다 바람직하게는 15 내지 40℃, 또한 바람직하게는 20 내지 35℃가 된다. 반응 시간은, 바람직하게는 5 내지 180시간, 보다 바람직하게는 10 내지 150시간, 더욱 바람직하게는 15 내지 120시간이 된다.
이 반응 조건은, 메타크릴산에스테르의 생산량의 비율을 최대화하도록, 균주마다 적절히 선택 또는 최적화된다. 또한, 반응 조건을 적절히 조정함으로써, 메타크릴산에스테르의 생산량을 조정할 수도 있다.
메타크릴산에스테르를 0.001mM 축적시키기 위한 적합한 조건으로서는, pH5.5 내지 7.5의 조건 하, 배지 중의 탄소원 또는 전구체의 농도를 직접 또는 간접적으로 0.1% 이상으로, 또한 알코올 또는 페놀류의 농도를 직접 또는 간접적으로 0.1% 이상으로 유지하고, 온도를 20 내지 40℃의 범위로 조정하여, 3시간 이상 반응시킨다. 또한, 반응액 내의 미생물의 농도는 높은 상태로 유지하는 것이 효율적인 생산성을 얻는데 바람직하고, 예를 들어 건조 중량으로서 2g/L 이상으로 유지함으로써 양호한 생산 효율이 얻어지고, 생성물의 축적 농도를 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 메타크릴산에스테르의 제조 방법에서는, 상술한 배양에 의한 메타크릴산에스테르의 제조와 휴지 균체 반응에 의한 메타크릴산에스테르의 제조를 적절히 조합하여 행해도 된다. 2개의 방법을 조합함으로써, 보다 효율적인 메타크릴산에스테르의 생산이 가능하게 된다.
(3) 메타크릴산에스테르의 회수
배지 중 또는 반응액 내에 생성된 메타크릴산에스테르 및 그 생성량은, 고속 액체 크로마토그래피 및 LC-MS 등의 통상의 방법을 사용해서 검출하여 측정할 수 있다. 또한, 배양 용기 또는 반응 용기의 기상부(헤드 스페이스부)에 휘발된 메타크릴산에스테르 및 그 생성량은, 가스 크로마토그래피 등의 통상의 방법을 사용해서 검출하여 측정할 수 있다.
메타크릴산에스테르는, 여과, 원심 분리, 진공 농축, 이온 교환 또는 흡착 크로마토그래피, 용매 추출, 증류 및 결정화 등의 주지의 조작을 필요에 따라서 적절히 조합하여 사용함으로써, 배지 또는 반응액 내로부터 분리 정제할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하는데, 본 발명의 범위는 이들 실시예의 범위에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1: 메타크릴산 이소부틸의 합성]
바나나의 가죽을 제거하고, 과육을 커터로 약 1밀리 두께로 얇게 썰고, 또한 그것을 4 분할하였다. 얇게 썬 바나나 2g, 2.3mM 메타크릴릴-CoA 및 0.35M KCl을 포함하는 용액 2ml 및 5μl 이소부틸알코올을 100ml 플라스크에 순서대로 첨가하였다. 밀폐하고 30℃에서 반응시켰다. 1, 2 또는 3시간 후의 생성된 메타크릴산이소부틸을 포함하는 반응 혼합물을, 100ml 플라스크의 헤드 스페이스 150μl를 채취하여 이하의 GC 조건에서 분석을 하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
Figure pct00002
GC 분석 조건
칼럼: DB-WAX, 30m×0.32mm
칼럼 온도: 50℃·5min→5℃/min→100℃(총 15min)
캐리어 가스: He
주입(Inject): 200℃ 스플릿레스(샘플링 타임 1min)
검출(Detect): 250℃ FID 주입량: 150μl
또한, 메타크릴산에스테르의 농도는, 먼저 농도가 기지인 수용액을 조정하고, 100ml 플라스크에 동일 수용액을 2ml 넣고, 30℃에서 30min 인큐베이션한 후에 헤드 스페이스를 마찬가지의 방법으로 채취하여 GC 분석하고, 검량선을 작성하여 산출하였다.
[실시예 2: 메타크릴산부틸의 합성]
이소부틸알코올 대신에 n-부틸알코올을 사용한 것 이외는 실시예 1과 마찬가지로 실시하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure pct00003
[실시예 3: 메타크릴산부틸의 합성 2]
표 3에 나타내는 식물편을 2g, 2.3mM 메타크릴릴-CoA 및 0.35M KCl을 포함하는 용액 2ml 및 10μl의 n-부틸알코올을 100ml 플라스크에 순서대로 첨가하였다. 밀폐하고 30℃에서 반응시켰다. 메타크릴산에스테르의 분석은 실시예 1과 마찬가지로 실시하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure pct00004
[실시예 4: 메타크릴산에틸의 합성]
표 4에 나타내는 식물편을 2g, 2.3mM 메타크릴릴-CoA 및 0.35M KCl을 포함하는 용액 2ml 및 6.4μl 에틸알코올을 100ml 플라스크에 순서대로 첨가하였다. 밀폐하고 30℃에서 반응시켰다. 메타크릴산에스테르의 분석은 실시예 1과 마찬가지로 실시하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
Figure pct00005
[실시예 5: 메타크릴산메틸의 합성]
표 5에 나타내는 식물편을 2g, 2.3mM 메타크릴릴-CoA 및 0.35M KCl을 포함하는 용액 2ml 및 4.4μl 메틸알코올을 100ml 플라스크에 순서대로 첨가하였다. 밀폐하고 30℃에서 반응시켰다. 메타크릴산에스테르의 분석은 실시예 1과 마찬가지로 실시하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
Figure pct00006
[참고예 1: 콤페턴트 셀의 제작]
대장균 JM109주를 LB 배지(1% 백트 트립톤, 0.5% 백트 효모 추출물, 0.5% NaCl) 1mL에 접종해서 37℃, 5시간 호기적으로 전(前) 배양하고, 이 배양물 0.4mL를 SOB 배지 40mL(2% 백트 트립톤, 0.5% 백트 효모 추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 1mM MgSO4, 1mM MgCl2) 외에, 18℃에서 20시간 배양하였다. 이 배양물을 원심 분리에 의해 집균한 후, 냉각한 TF 용액(20mM PIPES-KOH(pH6.0), 200mM KCl, 10mM CaCl2, 40mM MnCl2)을 13mL 첨가하여, 0℃에서 10분간 방치하였다. 그 후, 다시 원심하고, 상층액을 제거한 후, 침전된 대장균을 냉 TF 용액 3.2mL에 현탁하고, 0.22mL의 디메틸술폭시드를 첨가해서 0℃에서 10분간 방치하여, 콤페턴트 셀을 제작하였다.
[실시예 6: 식물 유래 AAT 유전자가 도입된 대장균 재조합체의 제작]
서열 번호 2, 4 및 6에 나타내는 식물 유래 AAT 유전자를 다카라 바이오 가부시끼가이샤에서 위탁 합성하였다.
사과 AAT(MpAAT1): 아미노산 서열(서열 번호 1), 염기 서열(서열 번호 2)
딸기 AAT(SAAT): 아미노산 서열(서열 번호 3), 염기 서열(서열 번호 4)
딸기 AAT(VAAT): 아미노산 서열(서열 번호 5), 염기 서열(서열 번호 6)
이들 합성한 유전자 단편은 벡터 pMD19에 삽입되어, 각각 pAAT001 내지 003이라고 명명하였다(표 6). 이들 pAAT001 내지 003을 주형으로 해서, AAT 유전자를 포함하는 DNA 단편을, 발현 벡터에 용이하게 도입 가능한 제한 효소 인식 부위가 부가된 형태가 되도록 올리고뉴클레오티드를 설계하여, PCR법에 의해 제조하였다.
올리고뉴클레오티드 프라이머
MMA-044: 5'-GTTTGCACGCCTGCCGTTCGACG-3' (서열 번호 11)
MMA-045: 5'-CGGTACGCGCGGATCTTCCAGAG-3' (서열 번호 12)
반응액 조성
멸균수 22μL
2×프라임스타(PrimeSTAR)(다카라 바이오사제) 25μL
전방향 프라이머(Forward primer) 1μL
역방향 프라이머(Reverse primer) 1μL
게놈 DNA 1μL
총량 50μL
온도 사이클
98℃ 10초, 55℃ 15초 및 72℃ 150초의 반응을 30 사이클
얻어진 증폭 산물의 밴드를 퀴아퀵 겔 익스트랙션 키트(QIAquick Gel Extraction Kit)(퀴아젠(QIAGEN))로 정제하였다. 정제한 각 DNA를 제한 효소 PagI(전방향 프라이머 중에 절단 인식 부위가 포함됨) 및 Sse8387I(역방향 프라이머 중에 절단 인식 부위가 포함됨)로 절단하였다. 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 분리를 행하고, 겔로부터 원하는 밴드를 잘라내어 정제를 행하였다. 정제에는 Gel/PCR 정제 키트(Purification Kit)(파보르겐(FAVORGEN)사 제조)를 사용하여, 30μL의 멸균수에 용출하였다.
정제한 DNA(5μL), NcoI 및 Sse8387I에서 미리 소화해 둔 벡터 pTrc99A(1μL), 증류수(4μL) 및 솔루션(solution) I(DNA 라이게이션 키트 버전(Ligation Kit ver.) 2(다카라 바이오(주)))(10μL)를 혼합해서 12시간, 16℃에서 인큐베이션함으로써 PCR 증폭 산물과 벡터를 라이게이션하였다.
참고예 1의 방법에서 제작한 콤페턴트 셀 200μL에 상기의 라이게이션 용액을 10μL 첨가하고, 0℃에서 30분 방치한 후, 42℃에서 30초간 히트 쇼크를 부여하고, 0℃에서 2분간 냉각한 후, SOC 배지(20mM 글루코오스, 2% 백트 트립톤, 0.5% 백트 효모 추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 1mM MgSO4, 1mM MgCl2) 1mL를 첨가하여 37℃에서 1시간 진탕 배양하였다.
배양 후, 100μL씩 LBAmp 한천 배지(암피실린 100mg/L, 1.5% 한천을 함유하는 LB 배지)에 도포하고, 또한 37℃에서 배양하였다. 한천 배지 위에 생육한 형질전환체 콜로니 복수 개를 1.5mL의 LBAmp 배지(암피실린 100mg/L를 함유하는 LB 배지)에서 37℃에서 밤새 배양하고, 집균 후 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep kit)(퀴아젠사)를 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다.
얻어진 재조합 각 플라스미드 DNA에 대해서, 그 염기 서열을 CEQ DTCS 퀵 스타트 키트(Quick Start Kit) 및 형광 시퀀서 CEQ 2000XL DNA 아날리시스(Analysis)(모두 베크만 코울터(BECKMAN COULTER), 미국)를 사용하여 확인하고, 플라스미드 pAAT101 내지 pAAT103이라고 명명했다(표 6).
pET16b 벡터에 대해서도 마찬가지의 조작에 의해 AAT 유전자를 삽입하고, 얻어진 플라스미드를 pAAT201 내지 pAAT203이라고 명명했다(표 6). 단, pET16b에는 Sse8387I 부위가 없기 때문에, pET16b의 BamHI 부위에 Sse8387I 절단 서열을 포함하는 링커를 삽입한 것을 미리 제작하여, 이것을 벡터로서 사용하였다.
플라스미드 pAAT101 내지 pAAT103은 JM109주에 도입하여, 재조합체 JM109/pAAT101 내지 pAAT103을 얻었다. 플라스미드 pAAT201 내지 pAAT203은 BL21(DE3)주에 도입하여, 재조합체 BL21(DE3)/pAAT201 내지 pAAT203을 얻었다.
Figure pct00007
[실시예 7: AAT 유전자를 발현시킨 대장균 재조합체로부터의 세포 추출액의 제조]
(1) pTrc99A를 벡터로서 사용한 대장균 재조합체의 배양
실시예 6에서 얻어진 대장균 재조합체 JM109/pAAT101 내지 pAAT103을 1ml의 100μg/ml 암피실린을 포함하는 LB 배지에 식균하고, 37℃에서 7시간 전 배양을 행하였다. 배양액을 0.1ml 취하고, 100ml의 동일 배지(100μg/ml 암피실린, 1mMIPTG 함유)에 가하여, 37℃에서 15시간 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액으로부터 원심 분리(3,700×g, 10분간, 4℃)에 의해 균체를 회수하고, 10mM 인산-나트륨 완충액(pH7.0)으로 세정한 후, 동일 완충액에 현탁하였다. 대조주로서 JM109/pTrc99A를 사용하였다.
(2) pET16b를 벡터로서 사용한 대장균 재조합체의 배양
실시예 6에서 얻어진 대장균 재조합체 BL21(DE3)/pAAT201 내지 pAAT203을 1mL의 100μg/mL 암피실린을 포함하는 LB 배지에 식균하고, 37℃에서 14시간 전 배양을 행하였다. 배양액을 0.1mL 취하고, 100mL의 동일 배지(100μg/mL 암피실린)에 가하여, 37℃에서 OD가 0.3이 될 때까지 진탕 배양한 후, 최종 농도가 1mM가 되도록 IPTG를 첨가해서 또한 수시간 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액으로부터 원심 분리(3,700×g, 10분간, 4℃)에 의해 균체를 회수하고, 10mM 인산-나트륨 완충액(pH7.0)으로 세정한 후, 동일 완충액에 OD6(630nm)이 되도록 현탁하였다. 대조주로서 BL21(DE3)/pET16b를 사용하였다.
(3) 세포 추출액의 제조
얻어진 균체 현탁액으로부터 세포 추출액을 제조하였다. 초음파 파쇄기 VP-15S(다이테크, 일본)를 사용하여, 출력 컨트롤 4, DUTY CYCLE 40%, PULS, TIMER=B 모드 10s의 조건에서 균체 현탁액을 빙냉하면서 1분간 파쇄하였다. 다음으로 원심 분리를 행하여(10,000×g, 5분간, 4℃), 얻어진 상청(세포 추출액) 1ml를 채취하였다.
[실시예 8: AAT 유전자 재조합체 세포 추출액을 사용한 메타크릴산부틸의 합성]
실시예 7에 기재된 방법으로 제조된 세포 추출액을 사용하여 이하의 반응을 행하였다. 반응액의 최종 농도가 7mM 메타크릴릴-CoA와 40.5m Mn-부탄올이 되도록 메타크릴릴-CoA와 알코올의 용액이 0.8ml 들어간 10ml 용량의 셉텀 구비 샘플 병(GC용)에, 0.2ml의 세포 추출액을 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 셉텀 구비 샘플 병을 30℃에서 1 내지 5시간 인큐베이션하여 반응시켰다.
셉텀 구비 샘플 병의 헤드 스페이스 기체를 실시예 1과 마찬가지로 분석하였다. 결과를 표 7에 나타냈다.
Figure pct00008
[실시예 9A: AAT 유전자 재조합체 세포 추출액을 사용한 메타크릴산에스테르의 합성]
알코올로서, 메탄올, 에탄올 또는 n-부탄올을 사용하고, 세포 추출액에, BL21(DE3)/pAAT201(사과) 유래의 것을 사용하여, 실시예 8과 마찬가지로 하여 반응을 행하였다. 표 8에 5시간 후의 생성물의 분석 결과를 나타냈다.
Figure pct00009
[실시예 9B: AAT 유전자 재조합체 세포 추출액을 사용한 메타크릴산에스테르의 합성 2]
알코올로서, 이소부탄올, 페놀, 벤질알코올 또는 2-에틸헥실알코올을 사용하여, 실시예 7에서 얻어진 BL21(DE3)/pAAT201(사과)의 세포 추출액으로 이하의 반응을 행하였다.
반응액의 최종 농도가 1mM 메타크릴릴-CoA와 40mM 알코올이 되도록 메타크릴릴-CoA와 알코올을 포함하는 0.8ml의 용액이 들어간 10ml 용량의 셉텀 구비 샘플 병(GC용)에, 0.2ml의 세포 추출액을 첨가함으로써 반응을 개시하였다.
셉텀 구비 샘플 병을 30℃에서 1 내지 5시간 인큐베이션하여 반응시켰다. 반응 종료 후, 셉텀 구비 샘플 병 중의 반응액에 1mL의 아세토니트릴을 첨가하여 잘 혼화하였다. 그 후, 시린지 필터 DISMIC/구멍 직경 0.45㎛(아드반텍(ADVANTEC)사 제조)를 사용하여 여과한 후, HPLC 분석에 제공하였다. 표 9에 5시간 후의 생성물의 분석 결과를 나타냈다.
AAT 유전자 재조합체를 사용한 메타크릴산에스테르(메타크릴산이소부틸, 메타크릴산페닐, 메타크릴산벤질, 메타크릴산2-에틸헥실)의 합성
Figure pct00010
HPLC 분석 조건
장치: 와터스(Waters) 2695
칼럼: 시세이도(Shiseido) 캅셀 팩(CAPCELL PAK) C18 UG120 5㎛
이동상: 65% MeOH, 0.2% 인산
유량: 0.25ml/min
칼럼 온도: 35℃
검출: UV 210nm
주입량: 10μL
[실시예 10: ACD 유전자가 도입된 대장균 재조합체의 제작]
슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) PAO1로부터의 ACD 호몰로그 유전자의 클로닝과 고발현 재조합체의 제작
(1) 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) PAO1로부터의 게놈 DNA의 제조
LB 한천 배지(1% 백트 트립톤, 0.5% 백트 효모 추출물, 0.5% NaCl, 1.5% 한천) 위에서 생육시킨 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) PAO1주(NBRC106052)를 10ml의 LB 액체 배지(1% 백트 트립톤, 0.5% 백트 효모 추출물, 0.5% NaCl)에 식균하고, 37℃에서 15시간 진탕 배양을 행하였다. 배양 종료 후, 2ml의 배양액으로부터 균체를 원심에 의해 회수하고, 위자드 게노믹(Wizard Genomic) DNA 정제 키트(Purification Kit)(프로메가 가부시끼가이샤)를 사용하여 게놈 DNA 100μl를 취득하였다.
(2) 발현 벡터에 대한 클로닝
얻어진 게놈 DNA를 주형으로 해서, ACD를 코딩하는 것으로 추정된 유전자를 포함하는 DNA 단편을, 발현 벡터에 용이하게 도입 가능한 제한 효소 인식 부위가 부가된 형태가 되도록 PCR법에 의해 제조하였다.
올리고뉴클레오티드 프라이머
MMA-003: 5'-GACCCATGGATTTCGACCTCACCGAAGAAC-3' (서열 번호 13)
MMA-004: 5'-GCCCTGCAGGATGCGATGGTTCGCGGCGTTC-3' (서열 번호 14)
반응액 조성
멸균수 22μl
2×프라임스타(다카라 바이오사제) 25μl
MMA-003(서열 번호 13) 1μl
MMA-004(서열 번호 14) 1μl
게놈 DNA 1μl
총량 50μl
온도 사이클
98℃ 10초, 55℃ 15초 및 72℃ 150초의 반응을 30 사이클
얻어진 약 1.2kb의 증폭 산물의 밴드를 퀴아퀵 겔 익스트랙션 키트(퀴아젠)으로 정제하였다. 정제한 DNA를 제한 효소 NcoI(올리고뉴클레오티드 MMA-003 중에 절단 인식 부위가 포함됨) 및 Sse8387I(올리고뉴클레오티드 MMA-004 중에 절단 인식 부위가 포함됨)에서 소화하고, 페놀 추출 클로로포름 추출 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 정제한 DNA(5μl), NcoI 및 Sse8387I에서 미리 소화해 둔 벡터 pTrc99A(1μl), 증류수(4μl) 및 솔루션 I(DNA 라이게이션 키트 버전 2(다카라 바이오(주)))(10μl)를 혼합해서 12시간, 16℃에서 인큐베이션하여 PCR 증폭 산물과 벡터를 라이게이션하였다.
참고예 1의 방법으로 제작한 콤페턴트 셀 200μl에 상기의 라이게이션 용액을 10μl 첨가하고, 0℃에서 30분 방치한 후, 42℃에서 30초간 히트 쇼크를 부여하여, 0℃에서 2분간 냉각한 후, SOC 배지(20mM 글루코오스, 2% 백트 트립톤, 0.5% 백트 효모 추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 1mM MgSO4, 1mM MgCl2) 1ml를 첨가하여 37℃에서 1시간 진탕 배양하였다.
배양 후, 200μl씩 LBAmp 한천 배지(암피실린 100mg/L, 1.5% 한천을 함유하는 LB 배지)에 도포하여, 또한 37℃에서 배양하였다. 한천 배지 위에 생육한 형질전환체 콜로니 복수 개를 1.5ml의 LBAmp 배지(암피실린 100mg/L를 함유하는 LB 배지)에서 37℃에서 밤새 배양하고, 집균한 후, 플렉시 프렙(Flexi Prep)(아마샴 바이오 사이언스사 제조)를 사용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다.
(3) 형질 전환
얻어진 재조합 플라스미드 DNA에 대해서, 그 염기 서열을 CEQ DTCS 퀵 스타트 키트 및 형광 시퀀서 CEQ 2000XL DNA 아날리시스(모두 베크만 코울터, 미국)를 사용하여 확인하고, 플라스미드 pMMA002라고 명명하였다. 플라스미드 pMMA002를 사용하여 대장균 JM109주를 형질 전환하여, ACD 유전자(서열 번호 8)가 도입된 재조합체를 제작하였다. 아미노산 서열은, 서열 번호 7로 나타낸다.
[실시예 11: ACD 유전자를 발현시킨 대장균 재조합체로부터의 세포 추출액의 제조]
실시예 10에서 얻어진 ACD 유전자(서열 번호 8)가 도입된 대장균 재조합체 JM109/pMMA002를 1ml의 100μg/ml 암피실린을 포함하는 LB 배지에 식균하고, 37℃에서 7시간 전 배양을 행하였다. 배양액을 0.1ml 취하고, 100ml의 동일 배지(100μg/ml 암피실린, 1mM IPTG 함유)에 가하여, 37℃에서 15시간 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액으로부터 원심 분리(3,700×g, 10분간, 4℃)에 의해 균체를 회수하고, 10mM 인산-나트륨 완충액(pH7.0)으로 세정한 후, 동일 완충액에 OD6(630nm)이 되도록 현탁하였다. 대조주로서 JM109/pTrc99A를 사용하였다.
얻어진 균체 현탁액으로부터 이하와 같이 하여 세포 추출액 1ml를 제조하였다. 초음파 파쇄기 VP-15S(다이테크, 일본)를 사용하여, 출력 컨트롤 4, DUTY CYCLE 40%, PULS, TIMER=B 모드 10s의 조건에서 빙냉하면서 1분간 파쇄하였다. 다음으로 원심 분리를 행하여(10,000×g, 5분간, 4℃), 얻어진 상청을 세포 추출액으로서 채취하였다.
[실시예 12: ACD 유전자 재조합체 세포 추출액과 식물편을 사용한, 이소부티릴-CoA로부터 메타크릴산 부틸의 합성]
(1) ACD 유전자 재조합체 세포 추출액에 의한, 이소부티릴-CoA를 기질로 한 메타크릴릴-CoA 합성 반응:
100mM 인산나트륨 완충액(pH8.0) 중에 6mM의 1-메톡시-5-메틸페나지니움메틸황산염, 0.4mM의 플라빈아데닌디뉴클레오티드 및 1mM의 이소부티릴-CoA를 포함하는 용액 1.84ml에, 실시예 10에서 얻어진 ACD 활성을 갖는 세포 추출액 0.16ml를 첨가하여, 반응액 2ml로 조정하였다. 37℃에서 30분간 반응시켜, 이하에 나타내는 HPLC 조건에서 분석을 하였다. 그 결과, 이소부티릴-CoA의 피크는 소실되고, 메타크릴릴-CoA의 생성을 확인하였다.
HPLC 분석 조건
칼럼: 이너트실(Inertsil) ODS-3V, 4.6mm×250mm
이동상: 30% MeOH, 50mM H3PO4, pH5.7
유량: 1.0ml/min 칼럼 온도: 35℃ 검출: UV 254nm
주입량 10μl 반응 용액을 이동상에서 10배 희석하여 측정.
(2) 메타크릴릴-CoA 합성 반응액에 대한, n-부틸알코올과 식물편의 첨가에 의한 메타크릴산 부틸의 합성
바나나의 가죽을 제거하고, 과육을 커터로 약 1밀리 두께로 얇게 썰어, 또한 그것을 4 분할하였다. 얇게 썬 바나나 1g, 상기 메타크릴릴-CoA 합성 반응액 0.9ml, 3.5M KCl 용액 0.1ml 및 5μl의 n-부틸알코올을 50ml 플라스크에 가하고, 밀폐하여 30℃에서 2시간 반응시켰다. 실시예 1과 마찬가지로 메타크릴산에스테르의 분석을 실시한 결과, 0.015mM의 메타크릴산부틸이 생성되었다.
[실시예 13: ECH 유전자가 도입된 대장균 재조합체의 제작]
(1) 로도코커스(Rhodococcus)속 세균으로부터의 게놈 DNA의 제조
LB 한천 배지 위에서 생육시킨 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) PR4주(NBRC100887)를 10mL의 LB 액체 배지에 식균하고, 30℃에서 36시간 진탕 배양을 행하였다. 배양 종료 후, 2mL의 배양액으로부터 균체를 원심에 의해 회수하고, 실시예 10과 마찬가지로 하여 게놈 DNA 100μL를 취득하였다.
(2) 발현 벡터에 대한 클로닝
얻어진 게놈 DNA를 주형으로 해서, ECH 유전자를 코딩하는 것으로 추정된 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을, 발현 벡터에 용이하게 도입 가능한 제한 효소 인식 부위가 부가된 형태가 되도록 PCR법에 의해 제조하였다.
올리고뉴클레오티드 프라이머:
MMA-031: 5'-GGTCATGACCGACTTCAACACCATCATCCTC-3' (서열 번호 15)
MMA-032: 5'-GGCCTGCAGGTTCAGCTGTTCGAAAGTTCAGCGC-3' (서열 번호 16)
실시예 10과 마찬가지로 하여 PCR을 행하고, 얻어진 DNA를 제한 효소 BspHI(올리고뉴클레오티드 MMA-031 중에 절단 인식 부위가 포함됨) 및 Sse8387I(올리고뉴클레오티드MMA-032 중에 절단 인식 부위가 포함된다)로 절단하였다. 절단 후, 실시예 6과 마찬가지의 조작을 행하여, ECH 유전자(서열 번호 10)가 내장된 목적 플라스미드 DNA를 취득하고, 플라스미드 pMMA011이라고 명명하였다. 아미노산 서열은, 서열 번호 9로 나타낸다.
(3) 형질 전환
플라스미드 pMMA011을 사용해서 대장균 JM109주를 형질 전환하여, ECH 유전자 발현 대장균 재조합체를 제작하였다.
[실시예 14: ECH 유전자 발현 대장균 재조합체 세포 추출액 및 AAT 유전자 재조합체 세포 추출액을 사용한, 3-히드록시이소부티릴-CoA로부터 메타크릴산부틸의 합성]
(1) ECH 활성을 갖는 세포 파쇄액의 제조
실시예 13에서 얻어진 ECH 유전자가 도입된 대장균 재조합체 JM109/pMMA011을 2ml의 100μg/ml 암피실린을 포함하는 LB 배지에 식균하고, 37℃에서 24시간 전 배양을 행하였다. 배양액을 0.1ml 취하고, 100ml의 동일 배지(100μg/ml 암피실린, 1mM IPTG 함유)에 가하여, 37℃에서 24시간 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액으로부터 원심 분리(3,700×g, 10분간, 4℃)에 의해 균체를 회수하고, 10mM 인산-나트륨 완충액(pH7.0)으로 2회 세정한 후, 동일 완충액에 OD6(630nm)이 되도록 희석하였다.
얻어진 균체 현탁액으로부터 이하와 같이 하여 세포 파쇠액 1ml를 제조하였다. 초음파 파쇄기 소니파이어(Sonifier) 250D(브란슨, 미국)를 사용하여, 앰플리튜드(진폭): 15%/온(On): 1초, 오프(off): 1초의 조건에서 빙냉하면서 5분간 파쇄하였다.
(2) ECH 유전자 발현 대장균 재조합체 세포 파쇄액을 사용한 메타크릴릴-CoA 합성 반응
0.5M의 트리스 염산 완충액(pH7.4) 0.2ml, 1.2mM의 3-히드록시이소부티릴-CoA 수용액 0.4ml 및 1.2ml의 물을 혼합한 것에, 상기와 같이 하여 얻어진 에노일 CoA 히드라타제 활성을 갖는 세포 파쇄액 0.2ml를 첨가하여, 반응액 2ml로 조정하였다. 37℃에서 30분간 반응시켜, 실시예 12에 나타내는 HPLC 조건에서 분석을 하였다. 그 결과, 메타크릴릴-CoA의 생성을 확인하였다.
(3) AAT 유전자 재조합체 세포 추출액을 사용한 메타크릴산부틸의 합성
10ml 용량 샘플 병에 상기 메타크릴릴-CoA 합성 반응액 0.4ml, 10mM 인산나트륨 완충액(pH7.5) 0.1ml 및 0.2ml의 물을 첨가하고, 또한 0.4M n-부탄올 용액 0.1ml 및 실시예 7과 마찬가지로 제조한 사과 AAT(MpAAT) 세포 파쇄액 0.2ml를 첨가하여 밀폐하고, 30℃에서 3시간 반응시켰다. 실시예 1과 마찬가지로 메타크릴산에스테르의 분석을 실시한 결과, 0.001mM의 메타크릴산부틸이 생성되었다.
[실시예 15: BCKAD 유전자의 클로닝과 고발현 재조합체의 제작, 세포 추출액의 제조 및 단백질의 발현 해석]
유전자의 클로닝과 발현 플라스미드의 제작 및 재조합체의 제작은, 실시예 10과 마찬가지로 해서 행하였다. 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) PAO1주의 게놈 DNA를 주형으로 해서, BCKAD 복합체 유전자를 코딩하는 유전자 오페론 전체를 포함하는 DNA 단편을, 이하에 나타내는 프라이머를 사용하여 PCR법에 의해 제조하였다. 얻어진 단편을 제한 효소 BspHI와 Sse8387I에 의해 소화하고, 실시예 10과 마찬가지로 해서 벡터 pTrc99A에 삽입하여 재조합 플라스미드(pWA108)를 얻었다.
올리고뉴클레오티드 프라이머:
MAA-15: 5'-GGCCTGTCATGAGTGATTACGAGCCG-3' (서열 번호 17)
MAA-16: 5'-CGGCCCTGCAGGTTCGCGGGAATCAGATGTGC-3' (서열 번호 18)
상기와 같이 하여 얻어진 대장균 재조합체 JM109/pWA108을 실시예 10과 마찬가지로 하여 배양을 행하였다. 단, 본 재조합체의 경우에는, 예비 검토 결과로부터, IPTG의 첨가를 행하지 않아도 높은 단백질의 발현이 인정되므로, IPTG의 첨가를 행하지 않고 실시하였다. 세포 추출액의 제조는, 실시예 11과 마찬가지로 실시하였다.
[실시예 16: BCKAD 유전자량 발현 재조합체의 세포 추출액의 활성 측정]
BCKAD 활성은, 이하와 같이 2-옥소이소발레르산을 기질로 한 이소부티릴-CoA의 생성에 의해 측정하였다.
100mM 인산 칼륨 완충액(pH7.0) 중에 최종 농도가 각각 1mM MgCl2, 0.2mM 티아민 피로인산, 1mM CoA-SH 및 2mM DTT를 포함하는 용액 0.7mL에, 실시예 15에서 얻어진 세포 추출액 0.2mL를 첨가하여, 0.9mL로 하였다. 이것에 2-옥소이소발레르산칼슘염 0.1mL(최종 농도 4mM)를 첨가해서 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 센트리 커트 초미니 W-10(구라보호세끼 가부시끼가이샤)을 사용한 한외 여과를 행하였다. 단백질 제거를 행함으로써 반응을 정지시켜, 이하의 조건에서 HPLC에 의한 분석을 하였다. 그 결과, JM109/pWA108에서는 0.83mM의 이소부티릴-CoA의 생성이 나타났다.
HPLC분석 조건
칼럼: 이너트실 ODS-3V, 4.6mm×250mm
이동상: 35% MeOH, 50mM H3PO4, pH5.7
유량: 1.0ml/min 칼럼 온도: 35℃ 검출: UV 254nm(210nm)
주입량: 10μl(반응 용액을 이동상에서 10배 희석해서 측정)
[실시예 17: BCKAD 유전자량 발현 재조합체 및 ACD 유전자를 발현시킨 재조합체로부터의 세포 추출액 혼합물에 의한 2-옥소이소발레르산으로부터의 메타크릴릴-CoA의 합성(도 1)]
100mM 인산칼륨 완충액(pH7.0) 중에 최종 농도가 각각 1mM MgCl2, 0.2mM 티아민 피로인산, 1mM CoA-SH, 2mM DTT, 2mM 니코틴아미도아데닌디뉴클레오티드(NAD), 0.04mM 플라빈아데닌디뉴클레오티드(FAD), 2mM 발린을 포함하는 용액 0.6mL에, 실시예 11 및 실시예 15의 방법으로 얻어진 세포 추출액(JM109/pMMA002 및 JM109/pWA108) 각 0.1mL를 첨가하여, 0.8mL로 하였다. 이것에 2-옥소이소발레르산칼슘염 0.1mL(최종 농도 4mM)를 첨가해서 37℃에서 30분간 반응시킨 후, HPLC에 의해 이소부티릴-CoA의 생성을 확인함과 함께, 0.1mL의 1-메톡시-5-메틸페나지니움메틸황산염(최종 농도 6mM)을 첨가해서 또한 3시간 반응시켰다. 반응 후, 센트리 커트 초미니 W-10(구라보호세끼 가부시끼가이샤)을 사용한 한외 여과를 행하였다. 단백질 제거를 행함으로써 반응을 정지시켜, HPLC에 의한 분석을 하였다. 그 결과, 0.2mM의 메타크릴릴-CoA의 생성이 나타났다.
[참고예 2: 접합 전달용 레시피언트 PR4KS의 제작]
로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) PR4(제품 평가 기술 기반 기구 생물 유전 자원 부문; 수탁 번호: NBRC 100887)를 일본 특허 공개 제2011-200133호 공보에 기재된 방법에 의해 개변하여, 120mg/L의 클로람페니콜에 내성을 나타내고, 또한 카나마이신 내성 유전자를 결실한 유도주를 제작하고, PR4KS주라고 명명하였다.
구체적으로는, 클로람페니콜 내성을 강화하기 위해서, MYK 배지(0.5% 폴리펩톤(polypeptone), 0.3% 백트 효모 추출물(bact yeast extract), 0.3% 말트 추출물(malt extract), 0.2% KH2PO4, 0.2% K2HPO4) 중의 클로람페니콜의 농도를 10mg/mL에서 시작하여 120mg/mL까지 단계적으로 서서히 높이면서, PR4주를 계체 배양함으로써 자연 변이를 유발하여, 120mg/mL의 클로람페니콜에 내성을 갖는 유도주 RhCmSR-09주를 얻었다.
계속해서, 상기 RhCmSR-09주를, 일본 특허 공개 제2011-200133호 공보에 기재된 카나마이신 내성 유전자 결실 변이 도입용 플라스미드 pKM043을 보유하는 대장균주와 1:1의 비율로 혼합해서 배양하고, 접합 전달에 의해 RhCmSR-09주 내에 pKM043을 도입한 후, 카나마이신 황산염 200mg/L 및 클로람페니콜 50mg/L 함유 MYK 한천 배지(0.5% 폴리펩톤, 0.3% 백트 효모 추출물, 0.3% 말트 추출물, 0.2% KH2PO4, 0.2% K2HPO4, 1.5% 한천)에서 배양함으로써, pKM043이 RhCmSR-09주 게놈 내에 삽입된 상동 재조합주를 얻었다. 상기 상동 재조합주를, 10% 수크로오스 함유 MYK 한천 배지에서 배양하고, 얻어진 콜로니 중으로부터 카나마이신 감수성주가 된 유도주, 즉 카나마이신 내성 유전자 결실 변이 유도주 PR4KS주를 얻었다.
[참고예 3: LigD 호몰로그 유전자의 클로닝과 유전자 결실용 플라스미드의 제작]
PR4KS주의 LigD 호몰로그 유전자(등록 번호(accession no): YP_002767969)를 표적 유전자로 하였다. LigD 호몰로그 유전자 주변 서열을 포함하는 약 5.4kb의 DNA를 PCR에 의해 증폭한 후, 일본 특허 공개 제2011-200133호 공보에 기재된, sacB 유전자가 카나마이신 내성 유전자의 하류이면서 또한 동일 방향으로 도입된 플라스미드 벡터 pK19mobsacB1에 클로닝하여, 플라스미드 pTJ001을 얻었다. PCR 조건은 이하와 같다.
프라이머
GB-138: 5'-GGCCTGCAGGTACCGATCATCACCATCGGTGTC-3' (서열 번호 19)
GB-139: 5'-GGTCTAGACTGAGCAGTGTTCCAATGCG-3' (서열 번호 20)
반응액 조성:
멸균수 22μl
2×프라임스타(다카라 바이오사제) 25μl
GB-138(서열 번호 19) 1μl
GB-139(서열 번호 20) 1μl
PR4KS 게놈(50ng/μl) 1μl
총량 50μl
온도 사이클
98℃ 10초, 55℃ 10초 및 72℃ 120초의 반응을 35 사이클
pTJ001 내부의 LigD 호몰로그 유전자 전체 길이(약 2.3kb)를 결실시켜 LigD 호몰로그 유전자의 상류 및 하류 서열만을 잔존시킨, LigD 호몰로그 유전자 결실용 플라스미드 pTJ002를 제작했다(도 3 참조). pTJ002는, 표적인 LigD 호몰로그 유전자의 개시 코돈 부근의 서열과 시종 코돈 부근의 서열의 양쪽을 포함하고, 각각 개시 코돈으로부터 상류 방향 또는 시종 코돈으로부터 하류 방향으로 신장하도록 설계된 프라이머 GB-140과 GB-141에 의해 pTJ001 내부의 서열을 증폭함으로써 얻어진 LigD 호몰로그 유전자를 포함하지 않는 PCR 산물에 의해 대장균 JM109주를 형질 전환하여, 환상 DNA로 함으로써 취득하였다. PCR의 조건은 이하와 같다.
프라이머
GB-140: GAGGAAATGGTCACAGGGCGAGAATAGGTTG (서열 번호 21)
GB-141: GCCCTGTGACCATTTCCTCATTGTGCTGG (서열 번호 22)
반응액 조성
멸균수 22μl
2×프라임스타(다카라 바이오사제) 25μl
GB-140(서열 번호 21) 1μl
GB-141(서열 번호 22) 1μl
pTJ001 1μl
총량 50μl
온도 사이클
98℃ 10초, 50℃ 10초 및 72℃ 180초의 반응을 30 사이클
PCR 종료 후, 샘플 1μl를 사용하여, 0.7% 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 단편의 확인을 행한 결과, 단편의 증폭이 나타났다. 상기 플라스미드 pTJ002 제조 수순에 있어서, PR4주로부터의 게놈 추출에는 위자드 게노믹 DNA 정제 키트(프로메가사 제조)를, 제한 효소에 의해 절단한 DNA 단편 및 PCR 산물의 정제에는 Gel/PCR 정제 키트(파보르겐사 제조)를, DNA끼리의 접속에는 DNA 라이게이션 키트 <마이티 믹스(Mighty Mix)>(다카라 바이오사 제조)를, 플라스미드의 추출에는 퀴아프렙 미니프렙 키트(QIAprep miniprep kit)(퀴아젠사 제조)를 사용하였다.
[참고예 4: PR4KS의 LigD 호몰로그 유전자 결실 유도주의 제작]
대장균(Escherichia coli) S17-1λpir를 pTJ002에 의해 형질 전환한 것을 도너로 하고, 참고예 2의 방법에 의해 얻어진 PR4KS를 레시피언트로 해서, 일본 특허 공개 제2011-200133호 공보에 기재된 방법과 마찬가지로 접합 전달을 행하여, 상동 재조합에 의해 발생한 13주의 LigD 호몰로그 유전자 결실 유도주를 얻었다. 상기 결실 유도주로부터 1주를 선택하여, PR4KSΔligD 유도주라고 명명하였다.
[참고예 5: 로도코커스속 세균용 플라스미드 pLK005 및 그것을 사용한 니트릴 히드라타제 발현용 플라스미드 pSJ201의 제작]
(1) pLK005의 취득과 해석
pK4(일본 특허 공개 평5-64589호 공보 참조)를 사용하여, 상기 일렉트로포레이션법에 의해 로도코커스 sp N775(독립 행정법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 기탁 번호 FERM BP-961)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질전환체를 10ml의 MYK 배지에 식균하여, 30℃에서 1일 배양하였다. 이것을 클린 벤치 내에서 자외선을 조사함으로써 변이 처리를 행하였다. 변이 처리를 행한 배양액을 50 내지 400μg/ml의 카나마이신을 포함하는 MYK 한천 배지에 도포하고, 30℃에서 3일간 배양하였다.
한천 배지 위에 나타난 복수의 콜로니를 각각 MYK 배지에서 배양하여, 형질전환체로부터 플라스미드를 회수하였다. 회수한 플라스미드를 사용하여 로도코커스 sp N775를 다시 형질 전환하여, 형질전환체의 카나마이신 내성도가 향상되었는지 여부를 조사하였다. 그 결과, 명백하게 카나마이신 내성도가 향상된 형질전환체가 몇 주 인정되었다.
카나마이신 내성도가 향상되는 것이 인정된 플라스미드의 염기 서열을 조사한 결과, pK4의 카나마이신 내성 유전자의 상류 영역 서열에 변화가 일어난 것(8염기 서열 GTTGTAGG의 중복)이 인정되었다. 이 카나마이신 내성도가 향상되는 것이 인정된 플라스미드를 pLK005라고 명명하였다.
(2) pSJ040의 제작
플라스미드 pSJ034는, 일본 특허 공개 평10-337185호 공보 기재된 방법에 의해 플라스미드 pSJ023으로부터 제작한 것이다. pSJ034에는 3군데의 EcoRI 제한 효소 부위가 존재하는데, 이 중의 1군데를 SpeI 부위로 변환한 플라스미드 pSJ040을 제작하였다. 제작 방법은, pSJ034를 제한 효소 EcoRI에 의해 부분 분해하고, 다카라 블런팅(Blunting) 키트를 사용하여 절단 부위의 평활화를 행하였다. SpeI 링커의 존재 하에서 라이게이션 반응을 행하고, 반응액을 사용하여 대장균 JM109주를 형질 전환하였다. 형질전환체를 배양한 후, 플라스미드를 추출하고, SpeI 링커가 삽입된 플라스미드를 선별하였다. pSJ034의 3개의 EcoRI 부위 중, 카나마이신 내성 유전자의 하류에 존재하는 EcoRI 부위에 SpeI 링커가 삽입된 것을 pSJ040이라고 명명하였다.
(3) pSJ201의 구축
pLK005를 HindIII으로 절단하여, 약 2.1kb의 단편을 제조하였다. 한편, pSJ040을 HindIII으로 절단하여, 약 9.8kb의 단편을 제조하였다. 이 2 단편을 사용하여 라이게이션 반응을 행하고, 반응액을 사용하여 대장균 JM109주를 형질 전환하였다. 형질전환체를 배양한 후, 플라스미드를 추출하고, 그 염기 서열을 확인한 결과, pLK005 유래의 변이 서열(GTTGTAGG의 중복)을 갖고, 그 이외는 pSJ040과 마찬가지의 서열을 갖는 플라스미드를 pSJ201이라고 명명하였다.
[참고예 6: PR4KSΔligD 유도주의 RE_acd1/RE_echA/RE_hchA/RE_mmsB 유전자 결실 유도주의 제작]
(1) 인 퓨전법을 사용한 유전자 결실용 플라스미드의 제작
PR4KS주의 RE_acd1/RE_echA/RE_hchA/RE_mmsB 유전자를 표적 유전자로 한 인 퓨전 HD 클로닝 키트(Cloning kit)(다카라 바이오사 제조)에 의한 유전자 결실용 플라스미드의 제작을 행했다(도 4 참조).
표적 유전자의 상류 및 하류 서열의 DNA를 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 조건은 이하와 같다.
단편 1용 프라이머
MMA-061: CGACTCTAGAGGATCGCTCAGTACATCTACGAGAC (서열 번호 23)
MMA-062: AGTGTGAGGAAAGTGTTCCGATCAGTTCAT (서열 번호 24)
단편 2용 프라이머
MMA-063: CACTTTCCTCACACTCGTCGAGAGTATGAG (서열 번호 25)
MMA-064: CGGTACCCGGGGATCAGCGCGACGAACAACGAGAC (서열 번호 26)
반응액 조성
주형(PR4 야생형(wild type) 게놈 DNA) 1μl
2×프라임스타 맥스 프리믹스(PrimeSTAR Max Premix)(다카라사 제조) 25μl
Fw 프라이머(20μM) 1μl
Rv 프라이머(20μM) 1μl
D.W. 22μl
총량 50μl
온도 사이클
98℃ 10초, 60℃ 10초 및 72℃ 120초의 반응을 30 사이클
PCR 종료 후, 샘플 1μl를 사용하여, 0.7% 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 단편의 확인을 행한 결과, 단편의 증폭이 나타났다. PCR 산물(단편 1 및 단편 2)을 Gel/PCR 정제 키트(파보르겐사 제조)를 사용하여, 버퍼 치환을 행하고, 이하에 나타내는 인 퓨전 HD 클로닝 키트에 의한 반응에 사용하였다.
(2) 인 퓨전 HD 클로닝 키트에 의한 벡터와 목적 단편의 연결 및 형질 전환
인 퓨전 HD 클로닝 키트를 사용하여, 상기 단편과 벡터의 연결을 행하였다. 반응 조건은 이하와 같다.
반응액 조성
5x 인 퓨전 HD 효소 프리믹스(Enzyme Premix) 2μl
벡터 단편 1.5μl
DNA 단편 11μl
DNA 단편 22μl
D.W. 3.5μl
총량 10μl
상기 반응액을 50℃에서 15분간 인큐베이션한 후, 빙상에서 냉각하고, 대장균 JM109주의 형질 전환에 사용하였다. 대장균 형질전환체의 선택은 카나마이신 황산염 50mg/L를 포함하는 LB 한천 배지(이하, LB Km50 한천 배지)에서 행하였다. 얻어진 형질전환체로부터 미니 프렙 키트(Mini prep Kit)(퀴아젠사)를 사용하여 플라스미드를 제조하여, 원하는 플라스미드를 얻었다. 플라스미드의 확인은 XbaI 제한 효소 처리 후의 단편 사이즈 및 삽입 단편과 벡터의 접속 영역의 서열을 조사함으로써 행하였다. 원하는 플라스미드를 pMMA302라고 명명하였다.
(3) PR4KSΔligD 유도주의 상동 재조합 유도주 및 유전자 결실 유도주의 제작
PR4KSΔligD주 콤페턴트 셀 20μl에 pMMA302를 1μl 첨가하고, 빙상에서 10분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 상기 용액을 빙냉한 일렉트로포레이션 큐벳트(0.1cm)에 전량 옮겨, 1.5kV(200Ω)의 고전압을 걸고, 즉시 600μl의 LB 액체 배지를 가하여, 30℃에서 6시간 정치하였다. 200μl를 카나마이신황산염 10mg/L를 포함하는 LB 한천 배지(이하, LB Km10 한천 배지)에 뿌려 30℃에서 4일간 배양하였다. 생육한 콜로니를 LB Km10 한천 배지에 스트리크하고, 4일간 배양한 후, 이하에 나타낸 조건에 의해 콜로니 PCR을 행하여 상동 재조합 유도주의 확인을 행하였다.
프라이머
MMA-069: GCGCATCTACAAGGAAGAGATC (서열 번호 27)
MMA-070: GCGACGCTCATCGAGATCTC (서열 번호 28)
반응액 조성
주형 4.0μl
2×마이티 앰프 버퍼(MightyAmp Buffer)(다카라사 제조) 5.0μl
Fw 프라이머(20μM) 0.25μl
Rv 프라이머(20μM) 0.25μl
D.W. 0.3μl
마이티 앰프 DNA 폴리머라제(MightyAmp DNA Polymerase)(다카라사 제조) 0.2μl
총량 10.0μl
온도 사이클
98℃도 10초, 68℃ 180초의 반응을 30 사이클
상동 재조합 유도주인 것이 인정된 콜로니를 LB 배지 200μl에 현탁하고, 100μl를 LB+10% 수크로오스(Sucrose) 한천 배지에 뿌려 3일간 배양하였다. 생육한 콜로니에서 카나마이신 감수성으로 되어 있는 것을 선택하고, 이들에 대하여 콜로니 PCR에 의해 원하는 유전자 결실을 확인하였다. 그 결과, PR4KSΔligD 유도주로부터 RE_acd1, RE_echA, RE_hchA, RE_mmsB의 4 유전자를 결실한 것이 얻어져, DMA008주라고 명명하였다.
[실시예 18: 로도코커스속에 속하는 미생물에서의 ACD 및 AAT 양쪽 발현용 플라스미드의 제작]
로도코커스속에 속하는 미생물에 있어서 ACD 및/또는 AAT를 발현시키기 위한 플라스미드를 제작하였다.
RE_acd1 유전자 발현용 플라스미드 pMMA401의 RE_acd1 유전자의 하류에, MpAAT1 유전자 발현용 플라스미드 pAAT301을 주형으로 하여 PCR 반응에 의해 얻어진 「니트릴라제 프로모터+MpAAT1 유전자」 단편을 삽입하였다.
「니트릴라제 프로모터+MpAAT1 유전자」 단편의 증폭은 하기와 같이 행하였다.
프라이머
MMA-133(Sse-ProFw): TGACCTGCAGGTGCACTCCGCTGCGACATGTATCGA (서열 번호 29)
MMA-131(Sse-001Rv): ACTCTAGCCTGCAGGTCATTGACTAGTTGATCTAAGGTTGTTACA (서열 번호 30)
PCR 반응 조성
주형(pAAT301) 1μl
2×프라임스타 맥스 프리믹스(다카라사 제조) 10μl
Fw 프라이머(10μM) 0.6μl
Rv 프라이머(10μM) 0.6μl
D.W. 7.8μl
총량 20μl
온도 사이클
98℃ 5초, 60℃ 5초, 72℃ 45초의 반응을 30 사이클
이렇게 하여 얻어진 「니트릴라제 프로모터+MpAAT1 유전자」 단편을 제한 효소 Sse8387I로 처리하였다. 한편, pMMA401도 Sse8387I로 처리한 후, SAP 처리를 행하였다. 이 DNA 단편을 0.7% 아가로오스 겔 전기 영동을 행한 후, Gel/PCR 정제 키트(파보르겐사 제조)를 사용하여 정제하였다. 제한 효소 처리 반응 조건 및 라이게이션 반응 조건은 이하와 같다.
제한 효소 처리 반응 조성(AAT 단편)
PCR 증폭 단편 40μl
10×M 버퍼 5μl
0.1% BSA 4μl
Sse8387I(다카라사 제조) 1μl
총량 50μl
제한 효소 처리 반응 조성(벡터 단편)
pMMA401(벡터) 3μl
10×M 버퍼 4μl
0.1% BSA 4μl
AP 1μl
Sse8387I(프로메가사 제조) 1μl
D.W. 27μl
총량 40μl
라이게이션 반응 조성
pMMA401 1μl
삽입 단편 2μl
라이게이션 믹스(다카라사 제조) 3μl
총량 6μl
상기 조성으로 혼합한 라이게이션 반응액을 사용하여 대장균 JM109주의 형질 전환을 행하였다. 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드를 추출하였다. 제한 효소 Sse8387I 처리 후에 아가로오스 전기 영동을 행하고, 목적 사이즈의 단편이 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 얻어진 플라스미드의 삽입 단편의 접속 영역의 염기 서열 해석에 의해 원하는 플라스미드인 것을 확인하고, 본 플라스미드를 pACDAAT1이라고 명명하였다.
상기 방법과 마찬가지의 방법을 사용해서 서열이 상이한 ACD 및 AAT 양쪽 발현용 플라스미드를 총 6종(pACDAAT2, pACDAAT3, pACDAAT4, pACDAAT6 및 pACDAAT8) 제작했다(도 5 참조).
[실시예 19: ACD 및 AAT 양쪽 발현 재조합체에 의한 메타크릴산부틸의 제조]
참고예 6의 (3)에서 얻어진 DMA008주를, 플라스미드 pACDAAT1, pACDAAT2, pACDAAT3, pACDAAT4, pACDAAT6 및 pACDAAT8에 의해 각각 형질 전환하였다. 얻어진 재조합체(DMA008/pACDAAT1, DMA008/pACDAAT2, DMA008/pACDAAT3, DMA008/pACDAAT4, DMA008/pACDAAT6 및 DMA008/pACDAAT8)를 사용하여 휴지 균체 반응에 의해 메타크릴산에스테르의 제조를 행하였다. 또한, 컨트롤로서 DMA008/pLK005를 사용하였다.
2mlLB Km10 액체 배지(와서만 시험관)에 1 백금이 식균하고, 30℃, 로터리 셰이커(180rpm), 호기 조건에서, 2일간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양액을 100mLLB Km10(배지 100mL/500mL 용량 삼각 플라스크)에 1ml 식균하고, 30℃, 로터리 셰이커(230rpm), 호기 조건에서, 3일간 배양을 행했다(본 배양).
본 배양 후, 본 배양액 40mL를 50mL 용량 코니칼 튜브에 옮겨 원심 분리(12000rpm, 10분)하여, 균체를 얻었다. 이 균체를 사용해서 이하의 반응을 행하였다. 10ml 용량의 유리 샘플 병에 1ml의 반응액을 첨가하고, 30℃, 로터리 셰이커(180rpm), 호기 조건에서, 18시간 행하였다.
반응액 조성
OD630=10균체(최종 농도)
5.0g/l 2-옥소이소발레르산(최종 농도)
40mM 알코올(최종 농도)
50mM 인산 버퍼/pH7.5(최종 농도)
알코올로서 n-부탄올을 사용하였다.
반응 후, 반응액에 1mL의 아세토니트릴을 첨가하여 잘 혼화한 후, 시린지 필터 DISMIC/구멍 직경 0.45㎛(아드반텍사 제조)을 사용하여 여과한 후, 실시예 9B에 기재된 HPLC 분석으로 분석하였다. 표 10에 18시간 후의 생성물의 분석 결과를 나타냈다.
ACD 및 AAT 양쪽 발현 재조합체에 의한 메타크릴산부틸의 생성
Figure pct00011
[실시예 20: ACD 및 AAT 양쪽 발현 재조합체에 의한 메타크릴산에스테르의 제조]
참고예 6의 (3)에서 얻어진 DMA008주를, 플라스미드 pACDAAT1에 의해 각각 형질 전환하였다. 얻어진 재조합체(DMA008/pACDAAT1)를 사용하여 휴지 균체 반응에 의해 메타크릴산에스테르의 제조를 행하였다. 또한, 컨트롤로서, DMA008/pLK005를 사용하였다. 실시예 19에 기재된 방법을 사용하여, 재조합체의 배양을 행하여 균체를 얻었다.
반응액 조성
OD630=10균체(최종 농도)
5.0g/l 2-옥소이소발레르산(최종 농도)
40mM 알코올(최종 농도)
50mM 인산 버퍼/pH7.5(최종 농도)
알코올로서, n-부탄올, 이소부탄올, 2-에틸헥실알코올을 사용하였다.
반응 후, 반응액에 1mL의 아세토니트릴을 첨가하여 잘 혼화한 후, 시린지 필터 DISMIC/구멍 직경 0.45㎛(아드반텍사 제조)를 사용하여 여과한 후, 실시예 9B에 기재된 HPLC 분석으로 분석하였다. 표 11에 18시간 후의 생성물의 분석 결과를 나타냈다.
ACD 및 AAT 양쪽 발현 재조합체에 의한 메타크릴산에스테르의 생성
Figure pct00012
[비교예 1: 효모 유래 AAT 유전자 재조합체 세포 추출액에 의한 메타크릴산에스테르의 합성 반응]
실시예 6과 마찬가지로 하여 효모 유래 AAT 유전자 발현 플라스미드를 제작하고(표 12), 이들을 사용하여 대장균을 형질 전환해서 AAT 발현 재조합체를 얻었다.
효모 유래 AAT 유전자 발현용 플라스미드
Figure pct00013
실시예 7과 마찬가지로 하여 세포 추출액을 제조하고, 실시예 8과 마찬가지로 메타크릴릴-CoA와 n-부탄올을 기질로 해서 메타크릴산부틸의 합성 반응을 행하였다. 그 결과, 메타크릴산부틸의 생성은 나타나지 않았다. 한편, 아세틸-CoA와 n-부탄올을 기질로 했을 경우에는, 아세트산부틸의 생성이 나타났다.
효모 AAT 유전자 재조합체를 사용한 에스테르의 생성
Figure pct00014
[서열표 프리 텍스트]
서열 번호 11: MMA-044
서열 번호 12: MMA-045
서열 번호 13: MMA-003
서열 번호 14: MMA-004
서열 번호 15: MMA-031
서열 번호 16: MMA-032
서열 번호 17: MAA-15
서열 번호 18: MAA-16
서열 번호 19: GB-138
서열 번호 20: GB-139
서열 번호 21: GB-140
서열 번호 22: GB-141
서열 번호 23: MMA-061
서열 번호 24: MMA-062
서열 번호 25: MMA-063
서열 번호 26: MMA-064
서열 번호 27: MMA-069
서열 번호 28: MMA-070
서열 번호 29: MMA-133
서열 번호 30: MMA-131
SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Rayon Co., Ltd. <120> METHOD FOR PRODUCING METACRYLIC ACID <130> PMR-9009WO <150> JP2012-198840 <151> 2012-09-10 <150> JP2013-160300 <151> 2013-08-01 <150> JP2013-170404 <151> 2013-08-20 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 455 <212> PRT <213> Malus x domestica(MpAAT1) <400> 1 Met Lys Ser Phe Ser Val Leu Gln Val Lys Arg Leu Gln Pro Glu Leu 1 5 10 15 Ile Thr Pro Ala Lys Ser Thr Pro Gln Glu Thr Lys Phe Leu Ser Asp 20 25 30 Ile Asp Asp Gln Glu Ser Leu Arg Val Gln Ile Pro Ile Ile Met Cys 35 40 45 Tyr Lys Asp Asn Pro Ser Leu Asn Lys Asn Arg Asn Pro Val Lys Ala 50 55 60 Ile Arg Glu Ala Leu Ser Arg Ala Leu Val Tyr Tyr Tyr Pro Leu Ala 65 70 75 80 Gly Arg Leu Arg Glu Gly Pro Asn Arg Lys Leu Val Val Asp Cys Asn 85 90 95 Gly Glu Gly Ile Leu Phe Val Glu Ala Ser Ala Asp Val Thr Leu Glu 100 105 110 Gln Leu Gly Asp Lys Ile Leu Pro Pro Cys Pro Leu Leu Glu Glu Phe 115 120 125 Leu Tyr Asn Phe Pro Gly Ser Asp Gly Ile Ile Asp Cys Pro Leu Leu 130 135 140 Leu Ile Gln Val Thr Cys Leu Thr Cys Gly Gly Phe Ile Leu Ala Leu 145 150 155 160 Arg Leu Asn His Thr Met Cys Asp Ala Ala Gly Leu Leu Leu Phe Leu 165 170 175 Thr Ala Ile Ala Glu Met Ala Arg Gly Ala His Ala Pro Ser Ile Leu 180 185 190 Pro Val Trp Glu Arg Glu Leu Leu Phe Ala Arg Asp Pro Pro Arg Ile 195 200 205 Thr Cys Ala His His Glu Tyr Glu Asp Val Ile Gly His Ser Asp Gly 210 215 220 Ser Tyr Ala Ser Ser Asn Gln Ser Asn Met Val Gln Arg Ser Phe Tyr 225 230 235 240 Phe Gly Ala Lys Glu Met Arg Val Leu Arg Lys Gln Ile Pro Pro His 245 250 255 Leu Ile Ser Thr Cys Ser Thr Phe Asp Leu Ile Thr Ala Cys Leu Trp 260 265 270 Lys Cys Arg Thr Leu Ala Leu Asn Ile Asn Pro Lys Glu Ala Val Arg 275 280 285 Val Ser Cys Ile Val Asn Ala Arg Gly Lys His Asn Asn Val Arg Leu 290 295 300 Pro Leu Gly Tyr Tyr Gly Asn Ala Phe Ala Phe Pro Ala Ala Ile Ser 305 310 315 320 Lys Ala Glu Pro Leu Cys Lys Asn Pro Leu Gly Tyr Ala Leu Glu Leu 325 330 335 Val Lys Lys Ala Lys Ala Thr Met Asn Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Val 340 345 350 Ala Asp Leu Leu Val Leu Arg Gly Arg Pro Gln Tyr Ser Ser Thr Gly 355 360 365 Ser Tyr Leu Ile Val Ser Asp Asn Thr Arg Val Gly Phe Gly Asp Val 370 375 380 Asn Phe Gly Trp Gly Gln Pro Val Phe Ala Gly Pro Val Lys Ala Leu 385 390 395 400 Asp Leu Ile Ser Phe Tyr Val Gln His Lys Asn Asn Thr Glu Asp Gly 405 410 415 Ile Leu Val Pro Met Cys Leu Pro Ser Ser Ala Met Glu Arg Phe Gln 420 425 430 Gln Glu Leu Glu Arg Ile Thr Gln Glu Pro Lys Glu Asp Ile Cys Asn 435 440 445 Asn Leu Arg Ser Thr Ser Gln 450 455 <210> 2 <211> 1368 <212> DNA <213> Malus x domestica(MpAAT1) <400> 2 atgaaatcat tctcagtact tcaggtgaaa cgattgcaac cggaacttat aactccggca 60 aagtcaacgc ctcaagaaac aaagtttctc tcagatattg acgaccaaga aagcttgaga 120 gttcagattc caatcataat gtgttacaaa gacaaccctt cacttaataa aaatcgtaat 180 cccgttaagg caattaggga agccttaagt agagcattag tgtattacta ccccttagct 240 ggaaggctta gggaagggcc taatagaaag ctcgtggtcg attgcaatgg tgaaggtatc 300 ttgttcgttg aggcttctgc tgatgtcaca cttgagcaac taggagacaa aattctaccc 360 ccttgtccac ttttagagga gttcttatat aattttccag gctctgatgg aattattgat 420 tgtcctttgc tgctgattca ggtgacctgt cttacatgtg gaggtttcat acttgcattg 480 cgcctaaacc acacaatgtg tgatgcagct ggattgctct tgttcctgac cgccatcgcg 540 gagatggcaa gaggcgcaca tgcaccatct attctaccag tgtgggagag agagctcttg 600 ttcgctcgag atccaccaag aattacatgt gctcatcacg aatatgaaga cgtgattggt 660 cattctgatg gctcatacgc atccagtaac cagtcaaaca tggttcaacg atctttctac 720 tttggtgcca aggagatgag agtccttcga aaacagattc caccccacct aatttccact 780 tgctccacat ttgacttgat cacagcttgt ttgtggaaat gtcgcactct tgcacttaac 840 attaatccaa aagaggctgt tcgagtttca tgcattgtca atgcacgagg aaagcacaac 900 aatgtacgtc ttcccttggg atactatggc aatgcatttg catttccagc tgcaatttcg 960 aaggctgaac ctctatgcaa aaatccactg ggatatgctt tggagttggt gaagaaggct 1020 aaagctacca tgaatgaaga atacttaaga tcagtggcag atcttttggt actaagaggg 1080 cgacctcaat attcatcgac aggaagttat ttaatagttt ctgataatac gcgtgtaggt 1140 tttggagatg tcaattttgg atggggacag ccggtatttg ctggacccgt caaggccttg 1200 gatttgatta gcttctacgt tcaacacaaa aacaacacag aggatggaat attggtacca 1260 atgtgtttgc catcctcggc catggagaga tttcagcagg aactagagag gattactcag 1320 gaacctaagg aggatatatg taacaacctt agatcaacta gtcaatga 1368 <210> 3 <211> 452 <212> PRT <213> Fragaria x ananassa(SAAT) <400> 3 Met Asn Lys Ile Glu Val Ser Ile Asn Ser Lys His Thr Ile Lys Pro 1 5 10 15 Ser Thr Ser Ser Thr Pro Leu Gln Pro Tyr Lys Leu Thr Leu Leu Asp 20 25 30 Gln Leu Thr Pro Pro Ala Tyr Val Pro Ile Val Phe Phe Tyr Pro Ile 35 40 45 Thr Asp His Asp Phe Asn Leu Pro Gln Thr Leu Ala Asp Leu Arg Gln 50 55 60 Ala Leu Ser Glu Thr Leu Thr Leu Tyr Tyr Pro Leu Ser Gly Arg Val 65 70 75 80 Lys Asn Asn Leu Tyr Ile Asp Asp Phe Glu Glu Gly Val Pro Tyr Leu 85 90 95 Glu Ala Arg Val Asn Cys Asp Met Thr Asp Phe Leu Arg Leu Arg Lys 100 105 110 Ile Glu Cys Leu Asn Glu Phe Val Pro Ile Lys Pro Phe Ser Met Glu 115 120 125 Ala Ile Ser Asp Glu Arg Tyr Pro Leu Leu Gly Val Gln Val Asn Val 130 135 140 Phe Asp Ser Gly Ile Ala Ile Gly Val Ser Val Ser His Lys Leu Ile 145 150 155 160 Asp Gly Gly Thr Ala Asp Cys Phe Leu Lys Ser Trp Gly Ala Val Phe 165 170 175 Arg Gly Cys Arg Glu Asn Ile Ile His Pro Ser Leu Ser Glu Ala Ala 180 185 190 Leu Leu Phe Pro Pro Arg Asp Asp Leu Pro Glu Lys Tyr Val Asp Gln 195 200 205 Met Glu Ala Leu Trp Phe Ala Gly Lys Lys Val Ala Thr Arg Arg Phe 210 215 220 Val Phe Gly Val Lys Ala Ile Ser Ser Ile Gln Asp Glu Ala Lys Ser 225 230 235 240 Glu Ser Val Pro Lys Pro Ser Arg Val His Ala Val Thr Gly Phe Leu 245 250 255 Trp Lys His Leu Ile Ala Ala Ser Arg Ala Leu Thr Ser Gly Thr Thr 260 265 270 Ser Thr Arg Leu Ser Ile Ala Ala Gln Ala Val Asn Leu Arg Thr Arg 275 280 285 Met Asn Met Glu Thr Val Leu Asp Asn Ala Thr Gly Asn Leu Phe Trp 290 295 300 Trp Ala Gln Ala Ile Leu Glu Leu Ser His Thr Thr Pro Glu Ile Ser 305 310 315 320 Asp Leu Lys Leu Cys Asp Leu Val Asn Leu Leu Asn Gly Ser Val Lys 325 330 335 Gln Cys Asn Gly Asp Tyr Phe Glu Thr Phe Lys Gly Lys Glu Gly Tyr 340 345 350 Gly Arg Met Cys Glu Tyr Leu Asp Phe Gln Arg Thr Met Ser Ser Met 355 360 365 Glu Pro Ala Pro Asp Ile Tyr Leu Phe Ser Ser Trp Thr Asn Phe Phe 370 375 380 Asn Pro Leu Asp Phe Gly Trp Gly Arg Thr Ser Trp Ile Gly Val Ala 385 390 395 400 Gly Lys Ile Glu Ser Ala Ser Cys Lys Phe Ile Ile Leu Val Pro Thr 405 410 415 Gln Cys Gly Ser Gly Ile Glu Ala Trp Val Asn Leu Glu Glu Glu Lys 420 425 430 Met Ala Met Leu Glu Gln Asp Pro His Phe Leu Ala Leu Ala Ser Pro 435 440 445 Lys Thr Leu Ile 450 <210> 4 <211> 1359 <212> DNA <213> Fragaria x ananassa(SAAT) <400> 4 atgaacaaaa ttgaggtcag tataaattcc aaacacacca tcaaaccatc aacttcctct 60 acaccacttc agccttacaa gcttaccctc ctggaccagc tcactcctcc ggcgtatgtc 120 cccatcgtgt tcttctaccc cattactgac catgacttca atcttcctca aaccctagct 180 gacttaagac aagccctttc ggagactctc actttgtact atccactctc tggaagggtc 240 aaaaacaacc tatacatcga tgattttgaa gaaggtgtcc cataccttga ggctcgagtg 300 aattgtgaca tgactgattt tctaaggctt cggaaaatcg agtgccttaa tgagtttgtt 360 ccaataaaac catttagtat ggaagcaata tctgatgagc gttacccctt gcttggagtt 420 caagtcaacg ttttcgattc tggaatagca atcggtgtct ccgtctctca caagctcatc 480 gatggaggaa cggcagactg ttttctcaag tcctggggtg ctgtttttcg agggtgtcgt 540 gaaaatatca tacatcctag tctctctgaa gcagcattgc ttttcccacc gagagatgac 600 ttgcctgaaa agtatgtcga tcagatggaa gcgttatggt ttgccggaaa aaaagttgct 660 acaaggagat ttgtatttgg tgtgaaagcc atatcttcaa ttcaagatga agcgaagagc 720 gagtccgtgc ccaagccatc acgagttcat gccgtcactg gttttctctg gaaacatcta 780 atcgctgctt ctcgggcact aacatcaggt actacttcaa caagactttc tatagcggcc 840 caggcagtga acttaagaac acggatgaac atggagacag tgttggataa tgccactgga 900 aacttgttct ggtgggcaca ggccatacta gagctaagtc atacaacacc agagatcagt 960 gatcttaagc tgtgtgactt ggttaacttg ctcaatggat ctgtcaaaca atgtaacggt 1020 gattactttg agactttcaa gggtaaagag ggatatggaa gaatgtgcga gtatctagat 1080 tttcagagga ctatgagttc tatggaacca gcaccggata tttatttatt ctcgagctgg 1140 actaattttt tcaacccact tgattttgga tgggggagga catcatggat tggagttgca 1200 ggaaaaattg aatctgcaag ttgcaagttc ataatattag ttccaacaca atgcggttct 1260 ggaattgaag cgtgggtgaa tctagaagaa gagaaaatgg ctatgctaga acaagatccc 1320 cattttctag cgttagcatc tccaaagacc ttaatttaa 1359 <210> 5 <211> 455 <212> PRT <213> Fragaria vesca(VAAT) <400> 5 Met Asn Lys Ile Glu Val Ser Ile Ile Ser Lys His Thr Ile Lys Pro 1 5 10 15 Ser Thr Ser Ser Ser Pro Leu Gln Pro Tyr Lys Leu Thr Leu Leu Asp 20 25 30 Gln Leu Thr Pro Pro Ser Tyr Val Pro Met Val Phe Phe Tyr Pro Ile 35 40 45 Thr Gly Pro Ala Val Phe Asn Leu Gln Thr Leu Ala Asp Leu Arg His 50 55 60 Ala Leu Ser Glu Thr Leu Thr Leu Tyr Tyr Pro Leu Ser Gly Arg Val 65 70 75 80 Lys Asn Asn Leu Tyr Ile Asp Asp Phe Glu Glu Gly Val Pro Tyr Leu 85 90 95 Glu Ala Arg Val Asn Cys Asp Met Asn Asp Phe Leu Arg Leu Pro Lys 100 105 110 Ile Glu Cys Leu Asn Glu Phe Val Pro Ile Lys Pro Phe Ser Met Glu 115 120 125 Ala Ile Ser Asp Glu Arg Tyr Pro Leu Leu Gly Val Gln Val Asn Ile 130 135 140 Phe Asn Ser Gly Ile Ala Ile Gly Val Ser Val Ser His Lys Leu Ile 145 150 155 160 Asp Gly Arg Thr Ser Asp Cys Phe Leu Lys Ser Trp Cys Ala Val Phe 165 170 175 Arg Gly Ser Arg Asp Lys Ile Ile His Pro Asn Leu 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tacatcctaa tctctctcaa gcagcattgc ttttcccacc aagagatgac 600 ttgcctgaaa agtatgcccg tcagatggaa gggttatggt ttgtcggaaa aaaagttgct 660 acaaggagat ttgtatttgg tgcgaaagcc atatctgtaa ttcaagatga agcaaagagc 720 gagtccgtgc ccaagccatc acgagttcag gctgtcacta gttttctctg gaaacatcta 780 atcgctactt ctcgggcact aacatcaggt actacttcaa caagactttc tatagcaacc 840 caggtagtga acataagatc acggaggaac atggagacag tgtgggataa tgccattgga 900 aacttgatat ggttcgctcc ggccatacta gagctaagtc atacaacact agagatcagt 960 gatcttaagc tgtgtgactt ggttaacttg ctcaatggat ctgtcaaaca atgtaacggt 1020 gattactttg agactttcat gggtaaagag ggatatggaa gcatgtgcga gtatctagat 1080 tttcagagga ctatgagttc tatggaacca gcaccagaga tttatttatt cacgagctgg 1140 actaattttt tcaaccaact tgattttgga tgggggagga catcatggat tggagttgca 1200 ggaaaaattg aatctgcatt ttgcaatctc acaacattag ttccaacacc atgcgatact 1260 ggaattgaag cgtgggtgaa tctagaagaa gaaaaaatgg ctatgctaga acaagatccc 1320 cagtttctag cactagcatc tccaaagacg ctaatttcaa gatattga 1368 <210> 7 <211> 387 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa PAO1(acd1) <400> 7 Met Asp Phe Asp Leu Thr Glu Glu Gln Arg Leu Leu Val Glu Ser Ala 1 5 10 15 Arg Ala Phe Ala Arg His Glu Leu Ala Pro Lys Ala Ala Asp Trp Asp 20 25 30 Arg Asp His His Phe Pro Val Glu Val Ile Arg Ala Ala Ala Glu Gln 35 40 45 Gly Tyr Leu Gly Leu Tyr Ile Ala Glu Glu Asp Gly Gly Leu Gly Leu 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Thr Ser Leu Ile Phe Glu Gln Leu Ala Ala Gly Cys 65 70 75 80 Val Ala Thr Thr Ala Tyr Ile Ser Ile His Asn Met Ala Ala Trp Met 85 90 95 Leu Ala Ser Phe Gly Asp Ala Ala Leu Lys Glu Ala Trp Leu Pro Gly 100 105 110 Leu Ile Gly Gly Glu Ser Leu Ala Ser Tyr Cys Leu Thr Glu Pro Asp 115 120 125 Ala Gly Ser Asp Ala Ala Arg Leu Arg Thr Arg Ala Arg Arg Glu Gly 130 135 140 Asp Glu Tyr Val Leu Asp Gly Ser Lys Cys Phe Ile Ser Gly Ala Gly 145 150 155 160 Ser Thr Gln Val Leu Ile Val Met Ala Arg Thr Gly Glu Asp Gly Ala 165 170 175 Arg Gly Ile Ser Cys Phe Leu Val Pro Ala Asp Ala Pro Gly Ile Arg 180 185 190 Tyr Gly Arg Asn Glu Asp Lys Met Gly Trp Arg Ala Gln Pro 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Thr Ala Arg 1 5 10 15 Asp Phe Ala Ala Glu His Leu Ala Pro Asn Ala Val Glu Trp Asp Gln 20 25 30 Thr Lys His Phe Pro Val Asp Val Leu Arg Lys Ala Ala Ser Leu Gly 35 40 45 Met Gly Gly Ile Tyr Ile Arg Glu Asp Val Gly Gly Ser Glu Leu Ser 50 55 60 Arg Val Asp Ala Ala Arg Ile Phe Glu Glu Leu Ala Lys Gly Asp Pro 65 70 75 80 Ser Ile Ala Ala Tyr Ile Ser Ile His Asn Met Val Thr Trp Met Ile 85 90 95 Asp Gln Phe Gly Asn Asp Glu Gln Arg His Lys Trp Val Pro Gly Leu 100 105 110 Cys Ser Met Asp Gln Leu Gly Ser Tyr Cys Leu Thr Glu Pro Gly Ala 115 120 125 Gly Ser Asp Ala Ala Gly Leu Ser Thr Lys Ala Val Arg Asp Gly Asp 130 135 140 Asp Tyr Ile Leu Asn Gly Val Lys Gln Phe Ile Ser Gly Ala Gly Thr 145 150 155 160 Ser Asp Val Tyr Val Val Met Ala Arg Thr Gly Ser Ala Gly Ala Lys 165 170 175 Gly Ile Ser Ala Phe Ile Val Pro Lys Asp Ser Pro Gly Leu Ser Phe 180 185 190 Gly Ala Asn Glu Val Lys Met Gly Trp Asn Ala Gln Pro Thr Arg Gln 195 200 205 Val Ile Phe Glu Asp Val Arg Val Pro Ala Ala Asn Met Leu Gly Glu 210 215 220 Glu Gly Ser Gly Phe Arg Ile Ala Met Lys Gly Leu Asn Gly Gly Arg 225 230 235 240 Leu Asn Ile Ala Ala Cys Ser Val Gly Gly Ala Gln Ala Ala Leu Glu 245 250 255 Lys Ala Val Ala Tyr Leu Val Asp Arg Lys Ala Phe Gly Ser Ala Leu 260 265 270 Ile Glu Ser Gln Ala Leu Gln Phe Gln Leu Ala Asp Met Arg Thr Glu 275 280 285 Leu Glu Ala Ala Arg Thr Leu Leu Trp Arg Ala Ala Ala Ala Leu Glu 290 295 300 Asp Gly Ala Ser Asp Val Val Glu Leu Cys Ala Met Ala Lys Arg Phe 305 310 315 320 Ala Thr Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Asn Lys Ala Leu Gln Leu His 325 330 335 Gly Gly Tyr Gly Tyr Leu Ala Glu Tyr Gly Ile Glu Lys Ile Val Arg 340 345 350 Asp Leu Arg Val His Gln Ile Leu Glu Gly Ser Asn Glu Ile Met Arg 355 360 365 Val Val Ile Ala Arg Ser Val Val Ala Ser Gly Gln Gly Lys Gln Gly 370 375 380 Ala Ala 385 <210> 33 <211> 1161 <212> DNA <213> Rhodococcus erythropolis PR4 RE_Acd1 <400> 33 atgtttactc tgaccgatga cgagcgggcg attcgcgaca ctgcccgcga cttcgcggcc 60 gagcatctgg cgcccaacgc agtggagtgg gatcagacca agcatttccc ggtggacgtc 120 ctccgtaagg cggcgtccct ggggatgggc ggtatctaca ttcgtgagga cgtgggcggc 180 agtgagctga gccgcgtcga cgctgcccgg atcttcgaag agctggccaa gggcgatccg 240 tcgatcgccg cgtacatctc catccacaac atggtcacgt ggatgatcga ccagttcggc 300 aacgacgaac agcgccacaa gtgggtcccc ggactctgct cgatggatca actgggcagc 360 tactgcctca ccgaacccgg cgctggctcc gatgctgcgg gcttgagcac caaggccgtt 420 cgtgacggcg acgactacat cctcaacggc gtcaaacagt tcatttccgg cgcaggcact 480 tccgacgtgt acgtcgtgat ggcacgcacc ggatctgccg gtgccaaggg gatctcggcg 540 ttcatcgtgc ccaaggattc gcccggactg tcgttcggtg ccaacgaggt caagatgggc 600 tggaacgcgc agcccacccg tcaggtgatc ttcgaagacg tgcgagttcc tgccgccaac 660 atgctcggtg aagagggcag cggcttccgc atcgctatga agggtctcaa cggcggccgg 720 ctgaacatcg ccgcctgctc ggtcggtggg gcccaggcag cgctggagaa ggcagtcgca 780 tatctggtgg accgcaaagc tttcggttcg gcactgatcg agtcgcaggc cctgcagttc 840 cagctcgccg acatgcgtac cgaactcgaa gcggccagga cgttgctgtg gcgcgccgct 900 gccgcactcg aagacggagc gtccgacgtc gtggagttgt gtgcgatggc caagcgcttt 960 gccaccgaca ccgggttcga cgtagccaac aaggctctcc agcttcacgg cgggtacggc 1020 tatcttgctg agtacgggat cgagaagatc gtccgcgatc ttcgggttca tcagatcctc 1080 gaaggcagca acgagatcat gagggtggtc atcgcgcgaa gcgtggtcgc atcaggtcag 1140 ggaaagcaag gagcagcatg a 1161 <210> 34 <211> 1578 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 34 atgaatgaaa tcgatgagaa aaatcaggcc cccgtgcaac aagaatgcct gaaagagatg 60 attcagaatg ggcatgctcg gcgtatggga tctgttgaag atctgtatgt tgctctcaac 120 agacaaaact tatatcgaaa cttctgcaca tatggagaat tgagtgatta ctgtactagg 180 gatcagctca cattagcttt gagggaaatc tgcctgaaaa atccaactct tttacatatt 240 gttctaccaa caagatggcc aaatcatgaa aattattatc gcagttccga atactattca 300 cggccacatc cagtgcatga ttatatttca gtattacaag aattgaaact gagtggtgtg 360 gttctcaatg aacaacctga gtacagtgca gtaatgaagc aaatattaga agaattcaaa 420 aatagtaagg gttcctatac tgcaaaaatt tttaaactta ctaccacttt gactattcct 480 tactttggac caacaggacc gagttggcgg ctaatttgtc ttccagaaga gcacacagaa 540 aagtggaaaa aatttatctt tgtatctaat cattgcatgt ctgatggtcg gtcttcgatc 600 cacttttttc atgatttaag agacgaatta aataatatta aaactccacc aaaaaaatta 660 gattacattt tcaagtacga ggaggattac caattattga ggaaacttcc agaaccgatc 720 gaaaaggtga tagactttag accaccgtac ttgtttattc cgaagtcact tctttcgggt 780 ttcatctaca atcatttgag attttcttca aaaggtgtct gtatgagaat ggatgatgtg 840 gaaaaaaccg atgatgttgt caccgagatc atcaatattt caccaacaga atttcaagcg 900 attaaagcaa atattaaatc aaatatccaa ggtaagtgta ctatcactcc gtttttacat 960 gtttgttggt ttgtatctct tcataaatgg ggtaaatttt tcaaaccatt gaacttcgaa 1020 tggcttacgg atatttttat ccccgcagat tgccgctcac aactaccaga tgatgatgaa 1080 atgagacaga tgtacagata tggcgctaac gttggattta ttgacttcac cccctggata 1140 agcgaatttg acatgaatga taacaaagaa aatttttggc cacttattga gcactaccat 1200 gaagtaattt cggaagcttt aagaaataaa aagcatctcc atggcttagg gttcaatata 1260 caaggcttcg ttcaaaaata tgtgaacatt gacaaggtaa tgtgcgatcg tgccatcggg 1320 aaaagacgcg gaggtacatt gttaagcaat gtaggtctgt ttaatcagtt agaggagccc 1380 gatgccaaat attctatatg cgatttggca tttggccaat ttcaaggatc ctggcaccaa 1440 gcattttcct tgggtgtttg ttcgactaat gtaaagggga tgaatattgt tgttgcttca 1500 acaaagaatg ttgttggtag tcaagaatct ctcgaagagc tttgctccat ttacaaagct 1560 ctccttttag gcccttag 1578 <210> 35 <211> 525 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 35 Met Asn Glu Ile Asp Glu Lys Asn Gln Ala Pro Val Gln Gln Glu Cys 1 5 10 15 Leu Lys Glu Met Ile Gln Asn Gly His Ala Arg Arg Met Gly Ser Val 20 25 30 Glu Asp Leu Tyr Val Ala Leu Asn Arg Gln Asn Leu Tyr Arg Asn Phe 35 40 45 Cys Thr Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Tyr Cys Thr Arg Asp Gln Leu Thr 50 55 60 Leu Ala Leu Arg Glu Ile Cys Leu Lys Asn Pro Thr Leu Leu His Ile 65 70 75 80 Val Leu Pro Thr Arg Trp Pro Asn His Glu Asn Tyr Tyr Arg Ser Ser 85 90 95 Glu Tyr Tyr Ser Arg Pro His Pro Val His Asp Tyr Ile Ser Val Leu 100 105 110 Gln Glu Leu Lys Leu Ser Gly Val Val Leu Asn Glu Gln Pro Glu Tyr 115 120 125 Ser Ala Val Met Lys Gln Ile Leu Glu Glu Phe Lys Asn Ser Lys Gly 130 135 140 Ser Tyr Thr Ala Lys Ile Phe Lys Leu Thr Thr Thr Leu Thr Ile Pro 145 150 155 160 Tyr Phe Gly Pro Thr Gly Pro Ser Trp Arg Leu Ile Cys Leu Pro Glu 165 170 175 Glu His Thr Glu Lys Trp Lys Lys Phe Ile Phe Val Ser Asn His Cys 180 185 190 Met Ser Asp Gly Arg Ser Ser Ile His Phe Phe His Asp Leu Arg Asp 195 200 205 Glu Leu Asn Asn Ile Lys Thr Pro Pro Lys Lys Leu Asp Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Tyr Glu Glu Asp Tyr Gln Leu Leu Arg Lys Leu Pro Glu Pro Ile 225 230 235 240 Glu Lys Val Ile Asp Phe Arg Pro Pro Tyr Leu Phe Ile Pro Lys Ser 245 250 255 Leu Leu Ser Gly Phe Ile Tyr Asn His Leu Arg Phe Ser Ser Lys Gly 260 265 270 Val Cys Met Arg Met Asp Asp Val Glu Lys Thr Asp Asp Val Val Thr 275 280 285 Glu Ile Ile Asn Ile Ser Pro Thr Glu Phe Gln Ala Ile Lys Ala Asn 290 295 300 Ile Lys Ser Asn Ile Gln Gly Lys Cys Thr Ile Thr Pro Phe Leu His 305 310 315 320 Val Cys Trp Phe Val Ser Leu His Lys Trp Gly Lys Phe Phe Lys Pro 325 330 335 Leu Asn Phe Glu Trp Leu Thr Asp Ile Phe Ile Pro Ala Asp Cys Arg 340 345 350 Ser Gln Leu Pro Asp Asp Asp Glu Met Arg Gln Met Tyr Arg Tyr Gly 355 360 365 Ala Asn Val Gly Phe Ile Asp Phe Thr Pro Trp Ile Ser Glu Phe Asp 370 375 380 Met Asn Asp Asn Lys Glu Asn Phe Trp Pro Leu Ile Glu His Tyr His 385 390 395 400 Glu Val Ile Ser Glu Ala Leu Arg Asn Lys Lys His Leu His Gly Leu 405 410 415 Gly Phe Asn Ile Gln Gly Phe Val Gln Lys Tyr Val Asn Ile Asp Lys 420 425 430 Val Met Cys Asp Arg Ala Ile Gly Lys Arg Arg Gly Gly Thr Leu Leu 435 440 445 Ser Asn Val Gly Leu Phe Asn Gln Leu Glu Glu Pro Asp Ala Lys Tyr 450 455 460 Ser Ile Cys Asp Leu Ala Phe Gly Gln Phe Gln Gly Ser Trp His Gln 465 470 475 480 Ala Phe Ser Leu Gly Val Cys Ser Thr Asn Val Lys Gly Met Asn Ile 485 490 495 Val Val Ala Ser Thr Lys Asn Val Val Gly Ser Gln Glu Ser Leu Glu 500 505 510 Glu Leu Cys Ser Ile Tyr Lys Ala Leu Leu Leu Gly Pro 515 520 525 <210> 36 <211> 1608 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 36 atggaagata tagaaggata cgaaccacat atcactcaag agttgataga ccgtggccat 60 gcaagacgta tgggccactt ggaaaactac tttgctgttt tgagtaggca gaaaatgtac 120 tcgaatttta ctgtttacgc ggaattgaat aaaggtgtta ataagagaca 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ctgttcacaa aatctcttct cgagtatggg ttcgatgtgg ctattccaag caacgcaaga 1080 aggtttttac caaacgatga agagttaaga gattcttata aatacggctc caacgttgga 1140 ggttcgcatt acgcctatct aatctcctca ttcgacattc ccgaaggtga caatgacaag 1200 ttttggagtc ttgtcgaata ctactatgac cgctttttag aatcgtacga caacggtgac 1260 cacttgattg gtctgggggt cctacaactt gattttatcg ttgaaaacaa gaatatagac 1320 agccttcttg ccaactctta tttgcaccag caaagaggcg gtgcaatcat cagtaataca 1380 ggacttgtct cgcaagatac gaccaagccg tactacgttc gggatttaat cttctcgcag 1440 tctgcaggcg ccttgagatt tgcgttcggc ctaaacgttt gctccacaaa cgtgaatggt 1500 atgaacatgg acatgagcgt ggttcagggc actctacggg atcgtggcga atgggaatcg 1560 ttctgcaagc tcttctacca aaccatcggc gaatttgcgt cgctttaa 1608 <210> 37 <211> 535 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 37 Met Glu Asp Ile Glu Gly Tyr Glu Pro His Ile Thr Gln Glu Leu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Gly His Ala Arg Arg Met Gly His Leu Glu Asn Tyr Phe Ala 20 25 30 Val Leu Ser Arg Gln Lys Met Tyr Ser Asn Phe Thr Val Tyr Ala Glu 35 40 45 Leu Asn Lys Gly Val Asn Lys Arg Gln Leu Met Leu Val Leu Lys Val 50 55 60 Leu Leu Gln Lys Tyr Ser Thr Leu Ala His Thr Ile Ile Pro Lys His 65 70 75 80 Tyr Pro His His Glu Ala Tyr Tyr Ser Ser Glu Glu Tyr Leu Ser Lys 85 90 95 Pro Phe Pro Gln His Asp Phe Ile Lys Val Ile Ser His Leu Glu Phe 100 105 110 Asp Asp Leu Ile Met Asn Asn Gln Pro Glu Tyr Arg Glu Val Met Glu 115 120 125 Lys Ile Ser Glu Gln Phe Lys Lys Asp Asp Phe Lys Val Thr Asn Arg 130 135 140 Leu Ile Glu Leu Ile Ser Pro Val Ile Ile Pro Leu Gly Asn Pro Lys 145 150 155 160 Arg Pro Asn Trp Arg Leu Ile Cys Leu Pro Gly Lys Asp Thr Asp Gly 165 170 175 Phe Glu Thr Trp Lys Asn Phe Val Tyr Val Thr Asn His Cys Gly Ser 180 185 190 Asp Gly Val Ser Gly Ser Asn Phe Phe Lys Asp Leu Ala Leu Leu Phe 195 200 205 Cys Lys Ile Glu Glu Lys Gly Phe Asp Tyr Asp Glu Glu Phe Ile Glu 210 215 220 Asp Gln Val Ile Ile Asp Tyr Asp Arg Asp Tyr Thr Glu Ile Ser Lys 225 230 235 240 Leu Pro Lys Pro Ile Thr Asp Arg Ile Asp Tyr Lys Pro Ala Leu Thr 245 250 255 Ser Leu Pro Lys Phe Phe Leu Thr Thr Phe Ile Tyr Glu His Cys Asn 260 265 270 Phe Lys Thr Ser Ser Glu Ser Thr Leu Thr Ala Arg Tyr Ser Pro Ser 275 280 285 Ser Asn Ala Asn Ala Ser Tyr Asn Tyr Leu Leu His Phe Ser Thr Lys 290 295 300 Gln Val Glu Gln Ile Arg Ala Gln Ile Lys Lys Asn Val His Asp Gly 305 310 315 320 Cys Thr Leu Thr Pro Phe Ile Gln Ala Cys Phe Leu Val Ala Leu Tyr 325 330 335 Arg Leu Asp Lys Leu Phe Thr Lys Ser Leu Leu Glu Tyr Gly Phe Asp 340 345 350 Val Ala Ile Pro Ser Asn Ala Arg Arg Phe Leu Pro Asn Asp Glu Glu 355 360 365 Leu Arg Asp Ser Tyr Lys Tyr Gly Ser Asn Val Gly Gly Ser His Tyr 370 375 380 Ala Tyr Leu Ile Ser Ser Phe Asp Ile Pro Glu Gly Asp Asn Asp Lys 385 390 395 400 Phe Trp Ser Leu Val Glu Tyr Tyr Tyr Asp Arg Phe Leu Glu Ser Tyr 405 410 415 Asp Asn Gly Asp His Leu Ile Gly Leu Gly Val Leu Gln Leu Asp Phe 420 425 430 Ile Val Glu Asn Lys Asn Ile Asp Ser Leu Leu Ala Asn Ser Tyr Leu 435 440 445 His Gln Gln Arg Gly Gly Ala Ile Ile Ser Asn Thr Gly Leu Val Ser 450 455 460 Gln Asp Thr Thr Lys Pro Tyr Tyr Val Arg Asp Leu Ile Phe Ser Gln 465 470 475 480 Ser Ala Gly Ala Leu Arg Phe Ala Phe Gly Leu Asn Val Cys Ser Thr 485 490 495 Asn Val Asn Gly Met Asn Met Asp Met Ser Val Val Gln Gly Thr Leu 500 505 510 Arg Asp Arg Gly Glu Trp Glu Ser Phe Cys Lys Leu Phe Tyr Gln Thr 515 520 525 Ile Gly Glu Phe Ala Ser Leu 530 535

Claims (11)

  1. 알코올 아실 트랜스페라아제의 존재 하, 메타크릴릴-CoA에 알코올 또는 페놀류를 작용시켜서, 메타크릴산에스테르를 합성하는 공정을 포함하는 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    메타크릴산에스테르를 0.001mM 이상 축적시키는, 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    이소부티릴-CoA 또는 3-히드록시이소부티릴-CoA로부터 메타크릴릴-CoA를 제조하는 공정을 더 포함하는, 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    이소부티릴-CoA가 2-옥소이소발레르산으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는, 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    알코올 아실 트랜스페라아제가 식물 유래인, 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    식물이, 생강(Zingiberales)목, 장미(Rosales)목, 철쭉(Ericales)목, 박(Cucurbitales)목, 유채(Brassicales)목 및 녹나무(Laurales)목으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 목에 속하는 것인, 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    식물이, 파초(Musaceae)과, 장미(Rosaceae)과, 철쭉(Ericaceae)과, 다래나무(Actinidiaceae)과, 박(Cucurbitaceae)과, 파파야(Caricaceae)과 및 녹나무(Lauraceae)과로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 과에 속하는 것인, 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    식물이, 파초(Musa)속, 네덜란드 딸기(Fragaria)속, 사과(Malus)속, 벚나무(Prunus)속, 배나무(Pyrus)속, 산앵도나무(Vaccinium)속, 다래나무(Actinidia)속, 오이(Cucumis)속, 파파야(Carica)속 및 페르세아(Persea)속으로 이루어지는 군이 선택되는 어느 하나의 속에 속하는 것인, 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
  9. 제5항에 있어서,
    식물이, 바나나, 딸기, 사과, 매실, 서양배, 블루베리, 키위, 멜론, 파파야 및 아보카도로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인, 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    알코올 아실 트랜스페라아제를 발현하도록 유전자 도입된 유전자 재조합 미생물을 사용하는, 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    알코올 아실 트랜스페라아제를 발현하도록 유전자 도입된 유전자 재조합 미생물에 로도코커스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물을 사용하는, 메타크릴산에스테르의 제조 방법.
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