JP6146308B2 - メタクリル酸エステルの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体触媒を用いたメタクリル酸エステルの製造方法に関する。

メタクリル酸エステルは、主にアクリル樹脂の原料として使われており、塗料、接着剤、樹脂改質剤などの分野のコモノマーとしても多くの需要がある。工業的な製法としてはいくつかの方法があり、例えば、アセトンおよびシアン化水素を原料とするＡＣＨ（アセトンシアノヒドリン）法、イソブチレンおよびｔｅｒｔ−ブチルアルコールを原料とする直酸法が知られている。これら化学的な製造方法は、化石原料に依存しており、また多くのエネルギーを必要とする。

近年、地球温暖化防止及び環境保護の観点から、従来の化石原料の代替となる炭素源として、バイオマスから種々の化学製品を製造する技術が注目されている。メタクリル酸エステルもバイオマス原料からの製造が期待されているが、生体触媒を用いたバイオマス原料からの具体的な製造例は報告されていない。

例えば、天然に存在する微生物を利用し、糖などの天然物からメタクリル酸の前駆体となる２−ヒドロキシイソ酪酸及び３−ヒドロキシイソ酪酸を生産する方法が提案されている（特許文献１、２及び非特許文献１参照）。しかし、これらの方法は、前駆体を脱水してメタクリル酸を生成する工程を依然として化学的な手法に依存するものである。

また、複数の酵素遺伝子を導入した、天然に存在しない組換え微生物を用いてグルコースからメタクリル酸を生成する方法が提案されているが、これらは既知の酵素反応及びそれから類推される仮想の酵素反応を組み合わせたものであり、実証されたものではない（特許文献３〜５参照）。特に特許文献５には、一般的なエステル生成活性を有する多種の生体触媒（加水分解酵素、ワックスエステル合成酵素、アルコールアセチルトランスフェラーゼ）が例示されているが、例示の生体触媒がメタクリル酸エステルの合成活性を有するかどうかは不明であった。

さらに、特許文献６には、アクリリル−ＣｏＡとアルコールの存在下、加水分解酵素を作用させて、アクリル酸エステルを製造する方法が開示されている。同文献にはメタクリル酸エステルについても同様に製造が可能な旨が示唆されている。しかし、生体触媒の多様性、基質特異性を考慮すると一部の加水分解酵素でアクリル酸エステルの製造が可能であることを示したに過ぎず、構造が異なるメタクリル酸エステルが同様に加水分解酵素により製造可能であるかは不明であった。さらに、反応機構の異なる他の種類の生体触媒で製造できるかどうかは、全く不明であった。また、特許文献６記載の加水分解酵素によりエステルを合成した場合、生成したエステルがそもそも加水分解活性で分解されてしまうことが予想され、効果的な製造方法とは考えにくい。

一方、アルコールアシルトランスフェラーゼはフルーティーフレーバー合成酵素として知られている。特許文献７には、特定の果実中に含まれる同酵素遺伝子を同定し、果実フレーバーである各種エステルの合成方法を提案している。しかしながら、メタクリル酸エステルがこれらの酵素で合成可能かどうかは報告されておらず全く不明であった。

以上のように、いくつかの提案あるいは検討がなされているものの、実際に微生物によりメタクリル酸誘導体を製造した例はなく、有効な製造方法の確立が望まれていた。

国際公開第２００７／１１０３９４号パンフレット 国際公開第２００８／１４５７３７号パンフレット 国際公開第２００９／１３５０７４号パンフレット 国際公開第２０１１／０３１８９７号パンフレット 国際公開第２０１２／１３５７８９号パンフレット 国際公開第２００７／０３９４１５号パンフレット 国際公開第００／３２７８９号パンフレット 特開２０１１‐２００１３３号公報 特開平５−６４５８９号公報 特開平１０−３３７１８５号 特開平１０−２４８６７号

Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１２， １４， １９４２−１９４８ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２０００， ３２４， ７３−７９ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｎｎｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ２００９， １６１， １０５１２１ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９９， １４５， ２３２３−２３３４

本発明は、生体触媒によるメタクリル酸エステルの製造方法を提供することを目的とする。

アルコールアシルトランスフェラーゼがメタクリル酸エステルを合成しうる活性を有すること見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。

（１）アルコールアシルトランスフェラーゼの存在下、メタクリリル−ＣｏＡにアルコールまたはフェノール類を作用させて、メタクリル酸エステルを合成する工程を含むメタクリル酸エステルの製造方法。
（２）メタクリル酸エステルを０．００１ｍＭ以上蓄積させる（１）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（３）イソブチリル−ＣｏＡあるいは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡを製造する工程をさらに含む、（１）または（２）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（４）イソブチリル−ＣｏＡが２−オキソイソ吉草酸から製造されることを特徴とする、（３）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（５）アルコールアシルトランスフェラーゼが植物由来である（１）から（４）のいずれかに記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
（６）植物が、ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）目、バラ（Ｒｏｓａｌｅｓ）目、ツツジ（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）目、ウリ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｌｅｓ）目、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｌｅｓ）目およびクスノキ（Ｌａｕｒａｌｅｓ）目からなる群から選択されるいずれかの目に属するものである（５）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（７）植物が、バショウ（Ｍｕｓａｃｅａｅ）科、バラ（Ｒｏｓａｃｅａｅ）科、ツツジ（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）科、マタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）科、ウリ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）科、パパイア（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）科およびクスノキ（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものである（５）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（８）植物が、バショウ（Ｍｕｓａ）属、オランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）属、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属、サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ）属、ナシ（Ｐｙｒｕｓ）属、スノキ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）属、マタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）属、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ）属、パパイア（Ｃａｒｉｃａ）属およびワニナシ（Ｐｅｒｓｅａ）属からなる群から選択されるいずれかの属に属するものである（５）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（９）植物が、バショウ属、リンゴ属、サクラ属、ナシ属、スノキ属、マタタビ属、キュウリ属、パパイア属およびワニナシ属からなる群から選択されるいずれかの属に属するものである（５）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（１０）植物が、バショウ属、リンゴ属、ナシ属、マタタビ属、キュウリ属、パパイア属およびワニナシ属からなる群から選択されるいずれかの属に属するものである（５）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（１１）植物が、バナナ、イチゴ、リンゴ、ウメ、セイヨウナシ、ブルーベリー、キウイ、メロン、パパイアおよびアボカドからなる群から選択されるいずれかである（５）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（１２）植物が、バナナ、リンゴ、ウメ、セイヨウナシ、ブリーベリー、キウイ、メロン、パパイアおよびアボカドからなる群から選択されるいずれかである（５）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（１３）植物が、バナナ、リンゴ、セイヨウナシ、キウイ、メロン、パパイアおよびアボカドからなる群から選択されるいずれかである（５）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（１４）アルコールアシルトランスフェラーゼを発現するように遺伝子導入された遺伝子組換え微生物を用いる（１）〜（１３）のいずれかに記載のメタクリル酸エステルの製造方法。

また、本発明は、他の一側面において以下の通りである。
（１５）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物を用いてメタクリル酸エステルを製造するメタクリル酸エステルの製造方法。
（１６）ロドコッカス属に属し、配列番号３１に示す１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＤＮＡを有する微生物を用いる（１５）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（１７）ロドコッカス属に属する微生物が、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）である（１５）又は（１６）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（１８）ロドコッカス属に属する微生物として、当該微生物の誘導株を用いる（１５）又は（１６）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（１９）ロドコッカス属に属する微生物が、ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ−４株又はその誘導株である（１８）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（２０）誘導株が、以下に示す（ａ）又は（ｂ）の少なくとも一方の改変を有する遺伝子改変株である（１８）のメタクリル酸エステルの製造方法。
（ａ）分岐鎖ケト酸脱水素酵素遺伝子及び／又はアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の導入による改変。
（ｂ）エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子及び／又は３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損又は不活化する改変。
（２１）誘導株が、アルコールアシルトランスフェラーゼ及び／又はアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ発現用プラスミドを有する（１９）又は（２０）のメタクリル酸エステルの製造方法。

本発明により、生体触媒によるメタクリル酸エステルの製造が可能となる。本発明の製造方法と生体内代謝を組み合わせることにより、メタクリル酸エステルの発酵生産も達成できる。その結果、従来の化学製造プロセスと比較して、エネルギー、資源、環境への負荷を格段に低減でき、かつ効率的にメタクリル酸エステルを製造することが可能になる。

３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからメタクリル酸エステルへの製造工程を示す図である。 ２−オキソイソ吉草酸からメタクリル酸エステルへの製造工程を示す図である。 ＬｉｇＤホモログ遺伝子欠失用プラスミドの構造を示す図である。 Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ法を用いた遺伝子欠失用プラスミドの作製方法を説明する図である。 ＡＣＤ−ＡＡＴ両発現用プラスミドの構造を示す図である。

以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

１．アルコールアシルトランスフェラーゼによるメタクリル酸エステルの製造方法
［メタクリル酸エステル］
本発明において、メタクリル酸エステルとは式１で示される化合物である。式１において、Ｒは直鎖あるいは分岐の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式であってもよく、飽和又は不飽和の環式であってもよい。好ましくは直鎖あるいは分岐鎖の炭素数１〜１０の無置換のアルキル基、アラルキル基またはアリール基である。特に好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、２−ヘキシル基、ジメチルブチル基、エチルブチル基、ヘプチル基、オクチル基、２−エチルヘキシル基の炭素数１〜８のアルキル基、ベンジル基またはフェニル基である。

ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯＯ−Ｒ （式１）

「メタクリル酸」（ＩＵＰＡＣ名：２−メチル−２−プロペン酸）は、下記式を有する化合物を意味し、その任意の塩あるいはイオン化した形態をも含む。メタクリル酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩などが挙げられる。

ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯＯＨ

［メタクリリル−ＣｏＡ］
本発明において、メタクリリル−ＣｏＡとは、以下の構造式で示される化合物である。メタクリリル−ＣｏＡは、生体内ではバリンの代謝中間体として知られている。本発明で使用するメタクリリル−ＣｏＡは公知又は新規な方法で製造したものともできる。その合成方法としては無水メタクリル酸と補酵素Ａを有機化学的に合成する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ． ３２４， ７３−７９ （２０００））あるいは酵素反応を用いた合成方法が知られている。

本発明においては、これらの中でも、イソブチリル−ＣｏＡを原料にアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．３）（以下、ＡＣＤという）の作用によって変換されたメタクリリル−ＣｏＡ（図２参照）あるいは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからエノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．１７）（以下、ＥＣＨという）の作用によって変換されるメタクリリル−ＣｏＡ（図１参照）を好適に使用することができる。すなわち、本発明の方法は、イソブチリル−ＣｏＡあるいは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡを製造する工程を更に含むことが好ましい。酵素による連続反応により、収率向上ならびに不純物抑制に繋がるともに、生体に対して毒性の高いメタクリル酸を経由あるいは副生することなくメタクリル酸エステルを直接合成が可能となる。前記方法により、環境負荷の低い生体内連続反応（代謝発酵）でのメタクリル酸エステルの製造を達成することができる。

本発明で使用するイソブチリル−ＣｏＡは、２−オキソイソ吉草酸から製造されたものが使用できる（図２参照）。すなわち、本発明の方法は、２−オキソイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡを製造する工程をさらに含んでいてもよい。

［アルコール・フェノール類］
本発明におけるメタクリル酸エステルの製造の原料となるアルコールまたはフェノール類は以下の式２で示される化合物である。アルコールまたはフェノール類の構造は、メタクリル酸エステルに対応することから、その構造は、前記式１のＲと同じ定義であり、直鎖あるいは分岐の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式であってもよく、飽和又は不飽和の環式であってもよい。好ましくは直鎖あるいは分岐の炭素数１〜１０の無置換のアルコール、アラルキルアルコールまたはフェノール類であり、特に好ましくはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−ペンチルアルコール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール、イソヘキシルアルコール、２−ヘキシルアルコール、ジメチルブチルアルコール、エチルブチルアルコール、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、２−エチルヘキシルアルコールの炭素数１〜８のアルキルアルコール、ベンジルアルコールまたはフェノールである。

Ｒ−ＯＨ （式２）

［アルコールアシルトランスフェラーゼ］
本発明のアルコールアシルトランスフェラーゼ（以下、ＡＡＴという）は、アルコールまたはフェノール類にアシル−ＣｏＡのアシル基を転移させてエステルを合成する触媒作用を有する酵素である。ＡＡＴは、種々の果物におけるエステルの生成に関与していると言われている。ＡＡＴはショウガ目（バナナ）、バラ目（イチゴ、リンゴ、ナシ、モモ）、ウリ目（メロン）、ツツジ目（キウイ）、シソ目（オリーブ）、ナス目（トマト）、ムクロジ目（レモン、マンゴー）等の植物に存在することが知られている。

本発明において使用するＡＡＴは、メタクリリル−ＣｏＡとアルコールまたはフェノール類を原料に、メタクリル酸エステルを製造する能力を有する生体由来の触媒であれば、特に限定されず、その種類及び起源を問わない。酵素源としては植物由来のものが好ましく、その中でも被子植物に分類されるものが好ましい。

本発明に適したＡＡＴは以下の方法により、前記植物から容易に選択することが可能である。組織の適当な部位を必要に応じて裁断することにより取得する。その裁断部位にメタクリリル−ＣｏＡと式２で表されるアルコールまたはフェノール類を含む溶液を添加し、振とうし、一定時間反応させる。その反応液中のメタクリル酸エステルの有無をＧＣ（ガスクロマトグラフィー）により確認することにより、合成活性を確認可能である。具体的には、例えば、果肉あるいは果皮を裁断し、それに１〜１０ｍＭのメタクリリル−ＣｏＡ、０．３５Ｍ ＫＣｌおよび５〜５０倍モル量のｎ−ブタノールを含む溶液を添加し、３０℃で１〜１０時間振とうする。反応終了後、ＧＣによりメタクリル酸エステルの有無を確認することにより、本発明に応用可能なＡＡＴを選択することができる。

本発明に適したＡＡＴの酵素源としては、例えば、ショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、ウリ目（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｌｅｓ）、アブラナ目（Ｂｒａｓｓｉｃａｌｅｓ）、クスノキ目（Ｌａｕｒａｌｅｓ）、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）、ヤシ目（Ａｒｅｃａｌｅｓ）、クサスギカズラ目（Ａｓｐａｒａｇａｌｅｓ）、ユキノシタ目（Ｓａｘｉｆｒａｇａｌｅｓ）、ナデシコ目（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ）、ブドウ目（Ｖｉｔａｌｅｓ）、キントラノオ目（Ｍａｌｐｉｇｈｉａｌｅｓ）、カタバミ目（Ｏｘａｌｉｄａｌｅｓ）、マメ目（Ｆａｂａｌｅｓ）、ムクロジ目（Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ）、アオイ目（Ｍａｌｖａｌｅｓ）、フトモモ目（Ｍｙｒｔａｌｅｓ）、キンポウゲ目（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）、ナス目（Ｓｏｌａｎａｌｅｓ）、シソ目（Ｌａｍｉａｌｅｓ）、リンドウ目（Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ）およびキク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）からなる群から選択されるいずれかの目に属するものである。これらの中で、好ましくは、ショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、ウリ目（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｌｅｓ）、アブラナ目（Ｂｒａｓｓｉｃａｌｅｓ）およびクスノキ目（Ｌａｕｒａｌｅｓ）からなる群から選択されるいずれかの目に属するものである。

ショウガ目に属するものとしてはバショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）およびショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）、バラ目に属するものとしてはバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）およびクワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）、ツツジ目に属するものとしてはツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）、カキノキ科（Ｅｂｅｎａｃｅａｅ）およびツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）、ウリ目に属するものとしてはウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、アブラナ目に属するものとしてはパパイア科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）およびアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、クスノキ目に属するものとしてはクスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、イネ目に属するものとしてはパイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）およびイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、ヤシ目に属するものとしてはヤシ科（Ａｒｅｃａｃｅａｅ）、クサスギカズラ目に属するものとしてはラン科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）およびアヤメ科（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）、ユキノシタ目に属するものとしてはスグリ科（Ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、ナデシコ目に属するものとしてはナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、ブドウ目に属するものとしてはブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）、キントラノオ目に属するものとしてはキントラノオ科（Ｍａｌｐｉｇｈｉａｃｅａｅ）、トケイソウ科（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）およびヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）、カタバミ目に属するものとしてはカタバミ科（Ｏｘａｌｉｄａｃｅａｅ）、マメ目に属するものとしてはマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、ムクロジ目に属するものとしてはミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）、ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）およびウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、アオイ目に属するものとしてはアオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、フトモモ目に属するものとしてはミソハギ科（Ｌｙｔｈｒａｃｅａｅ）、アカバナ科（Ｏｎａｇｒａｃｅａｅ）およびフトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）、キンポウゲ目に属するものとしてはキンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）およびケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、ナス目に属するものとしてはナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、シソ目に属するものとしてはモクセイ科（Ｏｌｅａｃｅａｅ）、クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）およびシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）、リンドウ目に属するものとしてはキョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、キク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）に属するものとしてはキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）の植物が好ましい。上記植物の近縁種も利用することができる。これらの中でさらに好ましくは、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、パパイア科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）およびクスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）に属する植物である。

具体的にはバショウ科に属するものとしてはバショウ（Ｍｕｓａ）属、ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）に属するものとしてはショウガ属（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ）、バラ科に属するものとしてはオランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）属、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属、サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ）属、ナシ（Ｐｙｒｕｓ）属、ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ）属、ボケ（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ）属、キイチゴ（Ｒｕｂｕｓ）属およびバラ（Ｒｏｓａ）属、クワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）に属するものとしてはイチジク（Ｆｉｃｕｓ）属、ツツジ科に属するものとしてはスノキ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）属、マタタビ科に属するものとしてはマタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）属、カキノキ科に属するものとしてはカキノキ（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ）属、ツバキ科に属するものとしてはツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属、ウリ科に属するものとしてはキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ）属およびスイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）属、パパイア科に属するものとしてはパパイア（Ｃａｒｉｃａ）属およびヴァスコンセレア（Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅａ）属、アブラナ科に属するものとしてはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属、クスノキ科に属するものとしてはワニナシ（Ｐｅｒｓｅａ）属、パイナップル科に属するものとしてはアナナス属（Ａｎａｎａｓ）、イネ科に属するものとしてはイネ（Ｏｒｙｚａ）属、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）属、トウモロコシ（Ｚｅａ）属、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）属およびヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）属、ヤシ科に属するものとしてはココヤシ（Ｃｏｃｏｓ）属、ラン科に属するものとしてはバンダ（Ｖａｎｄａ）属、アヤメ科に属するものとしてはアヤメ（Ｉｒｉｓ）属、スグリ科に属するものとしてはスグリ（Ｒｉｂｅｓ）属、ナデシコ科に属するものとしてはカスミソウ属（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）、ブドウ科に属するものとしてはブドウ（Ｖｉｔｉｓ）属、キントラノオ科に属するものとしてはヒイラギトラノオ（Ｍａｌｐｉｇｈｉａ）属、トケイソウ科に属するものとしてはトケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）属、トウダイグサ科に属するものとしてはトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ）属、ヤナギ科に属するものとしてはヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）属、カタバミ科に属するものとしてはゴレンシ（Ａｖｅｒｒｈｏａ）属、マメ科に属するものとしてはウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）属、ハウチワマメ（Ｌｕｐｉｎｕｓ）属、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）属およびチョウマメ（Ｃｌｉｔｏｒｉａ）属、ミカン科に属するものとしてはミカン（Ｃｉｔｒｕｓ）属およびアエグレ（Ａｅｇｌｅ）属、ムクロジ科に属するものとしてはレイシ（Ｌｉｔｃｈｉ）属、ウルシ科に属するものとしてはマンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ）属、アオイ科に属するものとしてはドリアン（Ｄｕｒｉｏ）属およびカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属、ミソハギ科に属するものとしてはザクロ（Ｐｕｎｉｃａ）属、アカバナ科に属するものとしてはサンジソウ（Ｃｌａｒｋｉａ）属、フトモモ科に属するものとしてはバンジロウ（Ｐｓｉｄｉｕｍ）属、キンポウゲ科に属するものとしてはルイヨウショウマ（Ａｃｔａｅａ）属、ケシ科に属するものとしてはケシ（Ｐａｐａｖｅｒ）属、ナス科に属するものとしてはナス（Ｓｏｌａｎｕｍ）属、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）属、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属およびツクバネアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ）属、モクセイ科に属するものとしてはオリーブ（Ｏｌｅａ）属、クマツヅラ科に属するものとしてはグランデュラリア（Ｇｌａｎｄｕｌａｒｉａ）属、シソ科に属するものとしてはアキギリ（Ｓａｌｖｉａ）属、キョウチクトウ科に属するものとしてはラウオルフィア（Ｒａｕｖｏｌｆｉａ）属およびニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）属、キク科に属するものとしてはカミツレ（Ｃｈａｍａｅｍｅｌｕｍ）属の植物が好ましい。その中でも、バショウ属、オランダイチゴ属、リンゴ属、サクラ属、ナシ属、スノキ属、マタタビ属、キュウリ属、パパイア属又はワニナシ属に属する植物がより好ましい。
さらにその中でも、バショウ属、リンゴ属、ナシ属、マタタビ属、キュウリ属、パパイア属又はワニナシ属に属する植物が特に好ましい。

さらに、具体的にはバショウ属に属するものとしてはバナナ（Ｍｕｓａｘｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）、バショウ（Ｍｕｓａｂａｓｊｏｏ）、ヒメバショウ（Ｍｕｓａｃｏｃｃｉｎｅａ）およびマレーヤマバショウ（Ｍｕｓａａｃｕｍｉｎａｔａ）、ショウガ属に属するものとしてはショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、オランダイチゴ属に属するものとしてはイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａｘａｎａｎａｓｓａ）、バージニアイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、チリイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ）およびエゾノヘビイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａｖｅｓｃａ）、リンゴ属に属するものとしてはリンゴ（Ｍａｌｕｓｐｕｍｉｌａ、Ｍａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ、Ｍａｌｕｓｂａｃｃａｔａ）、ハナカイドウ（Ｍａｌｕｓｈａｌｌｉａｎａ）、カイドウズミ（Ｍａｌｕｓｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）およびイヌリンゴ（Ｍａｌｕｓｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ）、サクラ属に属するものとしてはウメ（Ｐｒｕｎｕｓｍｕｍｅ）、セイヨウミザクラ（Ｐｒｕｎｕｓａｖｉｕｍ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓｐｅｒｓｉｃａ）、アンズ（Ｐｒｕｎｕｓａｒｍｅｎｉａｃａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓｄｕｌｃｉｓ）、スモモ（Ｐｒｕｎｕｓｓａｌｉｃｉｎａ）およびセイヨウスモモ（Ｐｒｕｎｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ナシ属に属するものとしてはセイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ナシ（Ｐｙｒｕｓｐｙｒｉｆｏｌｉａ）、マメナシ（Ｐｙｒｕｓｃａｌｌｅｒｙａｎａ）およびヤセイセイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓｐｙｒａｓｔｅｒ）、ビワ属に属するものとしてはビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａｊａｐｏｎｉｃａ）、ボケ属に属するものとしてはカリン（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）、キイチゴ属に属するものとしてはラズベリー（Ｒｕｂｕｓｉｄａｅｕｓ）およびブラックラズベリー（Ｒｕｂｕｓｆｒｕｔｉｃｏｓｕｓ）、バラ属に属するものとしてはハマナス（Ｒｏｓａｒｕｇｏｓａ）、イチジク属に属するものとしてはイチジク（Ｆｉｃｕｓｃａｒｉｃａ）、スノキ属に属するものとしてはブリーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ、Ｖａｃｃｉｎｉｕｍａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ）、ビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｍｙｒｔｉｌｌｕｓ）、コケモモ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｖｉｔｉｓ-ｉｄａｅａ）およびツルコケモモ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｏｘｙｃｏｃｃｏｓ）、マタタビ属に属するものとしてはキウイ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ａｃｔｉｎｉｄｉａｄｅｌｉｃｉｏｓａ）、サルナシ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａａｒｇｕｔａ）、シマサルナシ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｒｕｆａ）およびマタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｐｏｌｙｇａｍａ）、カキノキ属に属するものとしてはカキ（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓｋａｋｉ）、ツバキ属に属するものとしてはチャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ）、キュウリ属に属するものとしてはキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓｍｅｌｏ）、ニシインドコキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓａｎｇｕｒｉａ）およびツノニガウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓｍｅｔｕｌｉｆｅｒ）、スイカ属に属するものとしてはスイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓｌａｎａｔｕｓ）、パパイア属に属するものとしてはパパイア（Ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａ）、ヴァスコンセレア属に属するものとしてはマウンテンパパイア（Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅａｃｕｎｄｉｎａｍａｒｃｅｎｓｉｓ）、シロイヌナズナ属に属するものとしてはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）およびミヤマハタザオ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｌｙｒａｔａ）、ワニナシ属に属するものとしてはアボカド（Ｐｅｒｓｅａａｍｅｒｉｃａｎａ）、アナナス属に属するものとしてはパイナップル（Ａｎａｎａｓｃｏｍｏｓｕｓ）、イネ属に属するものとしてはイネ（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）、コムギ属に属するものとしてはコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）、オオムギ属に属するものとしてはオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍｖｕｌｇａｒｅ）、トウモロコシ属に属するものとしてはトウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）、モロコシ属に属するものとしてはモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）、ヤマカモジグサ属に属するものとしてはセイヨウヤマカモジ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ココヤシ属に属するものとしてはココナッツ（Ｃｏｃｏｓｎｕｃｉｆｅｒａ）、バンダ属に属するものとしてはバンダ（Ｖａｎｄａｈｙｂｒｉｄｃｕｌｔｉｖａｒ）、アヤメ属に属するものとしてはオランダアヤメ（Ｉｒｉｓｘｈｏｌｌａｎｄｉｃａ）、スグリ属に属するものとしてはクロスグリ（カシス）（Ｒｉｂｅｓｎｉｇｒｕｍ）、カスミソウ属に属するものとしてはカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａｅｌｅｇａｎｓ）、ブドウ属に属するものとしてはブドウ（Ｖｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｖｉｔｉｓｌａｂｒｕｓｃａ）、ヒイラギトラノオ属に属するものとしてはアセロラ（Ｍａｌｐｉｇｈｉａｇｌａｂｒａ）、トケイソウ属に属するものとしてはパッションフルーツ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｅｄｕｌｉｓ）、トウゴマ属に属するものとしてはトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ヤマナラシ属に属するものとしてはコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、ゴレンシ属に属するものとしてはスターフルーツ（Ａｖｅｒｒｈｏａｃａｒａｍｂｏｌａ）、ウマゴヤシ属に属するものとしてはタルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、ハウチワマメ属に属するものとしてはルピナス（シロバナハウチワマメ）（Ｌｕｐｉｎｕｓａｌｂｕｓ）、ダイズ属に属するものとしてはダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）、チョウマメ属に属するものとしてはチョウマメ（Ｃｌｉｔｏｒｉａｔｅｒｎａｔｅａ）、ミカン属に属するものとしてはレモン（Ｃｉｔｒｕｓｌｉｍｏｎ）、スダチ（Ｃｉｔｒｕｓｓｕｄａｃｈｉ）、カボス（Ｃｉｔｒｕｓｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐａ）、グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓｘｐａｒａｄｉｓｉ）、ユズ（Ｃｉｔｒｕｓｊｕｎｏｓ）ライム（Ｃｉｔｒｕｓａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉａ）、ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓｕｎｓｈｉｕ）およびオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）、アエグレ属に属するものとしてはアエグレ・マルメロス（Ａｅｇｌｅｍａｒｍｅｌｏｓ）、レイシ属に属するものとしてはライチ（Ｌｉｔｃｈｉｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、マンゴー属に属するものとしてはマンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａｉｎｄｉｃａ）、ドリアン属に属するものとしてはドリアン（Ｄｕｒｉｏｚｉｂｅｔｈｉｎｕｓ）、カカオ属に属するものとしてはカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａｃａｃａｏ）、ザクロ属に属するものとしてはザクロ（Ｐｕｎｉｃａｇｒａｎａｔｕｍ）、サンジソウ属に属するものとしてはフェアリーファンズ（ｆａｉｒｙｆａｎｓ）（Ｃｌａｒｋｉａｂｒｅｗｅｒｉ）およびレッドリボンズ（Ｒｅｄｒｉｂｂｏｎｓ）（Ｃｌａｒｋｉａｃｏｎｃｉｎｎａ）、バンジロウ属に属するものとしてはグァバ（Ｐｓｉｄｉｕｍｇｕａｊａｖａ）、ルイヨウショウマ属に属するものとしてはアメリカショウマ（Ａｃｔａｅａｒａｃｅｍｏｓａ）、ケシ属に属するものとしてはケシ（Ｐａｐａｖｅｒｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、オニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒｏｒｉｅｎｔａｌｅ）およびハカマオニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）、ナス属に属するものとしてはトマト（Ｓｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、トウガラシ属に属するものとしてはピーマン（Ｃａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍ）およびハバネロ（Ｃａｐｓｉｃｕｍｃｈｉｎｅｎｓｅ）、タバコ属に属するものとしてはタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａａｔｔｅｎｕａｔａ）、ツクバネアサガオ属に属するものとしてはペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａｘｈｙｂｒｉｄａ）、オリーブ属に属するものとしてはオリーブ（Ｏｌｅａｅｕｒｏｐａｅａ）、グランデュラリア属に属するものとしてはビジョザクラ（Ｇｌａｎｄｕｌａｒｉａｘｈｙｂｒｉｄａ）、アキギリ属に属するものとしてはサルビア（Ｓａｌｖｉａｓｐｌｅｎｄｅｎｓ）、ラウオルフィア属に属するものとしてはインドジャボク（Ｒａｕｖｏｌｆｉａｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）、ニチニチソウ属に属するものとしてはニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓｒｏｓｅｕｓ）、カミツレ属に属するものとしてはローマカミツレ（Ｃｈａｍａｅｍｅｌｕｍｎｏｂｉｌｅ）が特に好ましい。その中でも、バナナ、イチゴ、リンゴ、ウメ、セイヨウナシ、ブリーベリー、キウイ、メロン、パパイア又はアボカドがより好ましい。さらにその中でも、バナナ、リンゴ、セイヨウナシ、キウイ、メロン、パパイア又はアボカドが特に好ましい。

なお、酵素源として植物をそのまま使用して合成反応を行った場合において、炭素数１〜２のアルコールを基質とする場合、特にリンゴ属、パパイア属およびワニナシ属に属する植物を使用することがより好ましい。他の属に属する植物よりも生成効率が高くなるためである。

本発明において、植物の分類はＡＰＧ植物分類体系第３版（Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｎｎｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ２００９， １６１， １０５１２１）に従うものとする。

本発明において、ＡＡＴを反応に供するに際しては、前記の触媒活性を示す限りその使用形態は特に限定されず、生体組織又はその処理物をそのまま用いることも可能である。このような生体組織として植物体全体、植物器官（例えば果実、葉、花弁、茎、種子等）、植物組織（例えば果実表皮、果肉等）を用いることが出来る。その処理物としてはこれら生体組織からＡＡＴを抽出した粗酵素液又は精製酵素等が挙げられる。

［ＡＡＴ活性発現用組換え微生物］
さらに、ＡＡＴを反応に供するに際しては、前記ＡＡＴの遺伝子を単離し、例えば一般的な宿主ベクター系に導入し、該ベクター系で形質転換した微生物を利用することも可能である。宿主としては、細菌では大腸菌、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属などが挙げられ、酵母ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、糸状菌ではＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属などが挙げられる。これらの中で、特に大腸菌を用いることが簡便であり、効率もよく好ましい。

ＡＡＴ遺伝子はいくつか公表されているものある（例えば、特許文献７参照）。該情報に基づきＤＮＡプローブを作製し、たとえば、ＰＣＲに用いるプライマーを作製し、ＰＣＲを行うことにより該遺伝子を単離することもできる。また、ＡＡＴ遺伝子の塩基配列を通常の方法で全合成することも可能である。これら遺伝子情報が公知なＡＡＴがメタクリル酸エステルの合成活性を有するかどうかについては、前記の方法で同様に確認することができる。一方、遺伝子情報の不明なＡＡＴについては、ＡＡＴを精製し、そのタンパク質をもとに遺伝子工学的な手法により遺伝子情報を得ることができる。

本発明において、好ましいＡＡＴ遺伝子としては、その翻訳産物がメタクリル酸エステルを製造する能力を有していれば、特に限定されず、前記ＡＡＴ酵素源の中から適宜選択される。特に好ましくは、ＡＡＴリンゴ由来ＡＡＴ遺伝子（配列番号２）、イチゴ由来ＡＡＴ遺伝子（配列番号４）、イチゴ由来ＡＡＴ遺伝子（配列番号６）が挙げられる。

なお、本発明においてＡＡＴ遺伝子には、野生型のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、メタクリリル−ＣｏＡとアルコールからメタクリル酸エステルを生成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。

ここで用語「数個」とは、１〜４０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１０個以下をいう。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法や Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社）等を用いることができる。あるいは、変異を含む配列を有する遺伝子全体を人工合成してもよい。

本発明において、ＤＮＡの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、サンガー法に基づき、適当なＤＮＡシークエンサーを利用して配列を確認することも可能である。

また、本発明においてＡＡＴ遺伝子には、野生型のアミノ酸配列からなるタンパク質と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９．５％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の同一性を示し、メタクリリル−ＣｏＡとアルコールからメタクリル酸エステルを生成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。

さらに、本発明においてＡＡＴ遺伝子には、野生型の塩基配列に対する相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、メタクリリル−ＣｏＡとアルコールとからメタクリル酸エステルを生成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。前記のストリンジェントな条件としては、例えば、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」等の条件を挙げることができる。

ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））等を参照することができる。

さらに、本発明においてＡＡＴ遺伝子には、野生型の塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、メタクリリル−ＣｏＡとアルコールとからメタクリル酸エステルを生成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。また、上記ＡＡＴ遺伝子のコドンは、形質転換に用いる微生物宿主のコドン使用頻度に合わせて変換されたものであっても良い。

ここで、配列の「同一性」とは、塩基配列の場合であれば、比較すべき２つの塩基配列の塩基ができるだけ多く一致するように両塩基配列を整列させ、一致した塩基数を、全塩基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数となる。このようにして数えた全塩基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、同一性（％）は、長い方の配列の全塩基数で、一致した塩基数を除して算出される。アミノ酸配列の同一性についても同様である。

メタクリル酸エステル合成反応にはそれら組換え微生物を培養して得られる培養液をそのまま用いるか、又は、該培養液から遠心分離等の集菌操作によって得られる菌体又はその処理物等を用いることができる。菌体処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、これらから酵素を抽出した粗酵素又は精製酵素等が挙げられる。

ＡＡＴ遺伝子とＡＣＤ遺伝子あるいはＥＣＨ遺伝子を同時に導入して、イソブチリル−ＣｏＡあるいは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを原料として、メタクリル酸エステルを合成することも可能である（図１及び図２参照）。さらに、２−オキソイソ吉草酸脱水素酵素遺伝子（以下、ＢＣＫＡＤという）を組み合わせて導入することにより、２−オキソイソ吉草酸からメタクリル酸エステルを合成することも可能である。

本発明におけるＡＣＤ、ＥＣＨおよびＢＣＫＡＤの由来に特に制限はないが、以下に示す微生物が挙げられる。
Magnetospirillum属、Rhodospirillum属、Azospirillum属、Tistrella属、Acidiphilium属、Rhodobacter属、Paracoccus属、Ruegeria属、Jannaschia属、Roseobacter属、Dinoroseobacter属、Pseudovibrio属、Phaeobacter属、Octadecabacter属、Hyphomonas属、Maricaulis属、Hirschia属、Sphingomonas属、Novosphingobium属、Sphingopyxis属、Sphingobium属、Erythrobacter属、Brevundimonas属、Caulobacter属、Phenylobacterium属、Asticcacaulis属、Agrobacterium属、Rhizobium属、Sinorhizobium属、Xanthobacter属、Azorhizobium属、Brucella属、Ochrobactrum属、Mesorhizobium属、Chelativorans属、Aurantimonas属、Bradyrhizobium属、Agromonas属、Rhodopseudomonas属、Nitrobacter属、Methylobacterium属、Rhodomicrobium属、Pelagibacterium属Parvibaculum属、Methylocystis属、Parvularcula属、Burkholderia属、Ralstonia属、Cupriavidus属、Polynucleobacter属、Achromobacter属、Bordetella属、Taylorella属、Pusillimonas属、Comamonas属、Alicycliphilus属、Delftia属、Ramlibacter属、Rhodoferax属、Variovorax属、Polaromonas属、Acidovorax属、Verminephrobacter属、Herminiimonas属、Herbaspirillum属、Collimonas属、Chromobacterium属、Laribacter属、Pseudogulbenkiania属、Nitrosomonas属、Nitrosospira属、Aromatoleum属、Azoarcus属、Dechloromonas属、Thauera属、Azospira (Dechlorosoma)属、Rheinheimera属、Nitrosococcus属、Halorhodospira属、Xanthomonas属、Stenotrophomonas属、Pseudoxanthomonas属、Rhodanobacter属、Francisella属、Cycloclasticus 属、Oceanospirillum属、Hahella属、Halomonas属、Alcanivorax属、Kangiella属、Pseudomonas属、Azotobacter属、Acinetobacter属、Psychrobacter属、Alishewanella属、Alteromonas属、Glaciecola属、Marinobacter属、Marinobacterium属、Saccharophagus属、Shewanella属、Ferrimonas属、Idiomarina属、Colwellia属、Pseudoalteromonas属、Listonella属、Vibrio属、Photobacterium属、Aeromonas属、Oceanimonas属、Salinisphaera属、Legionella属、Coxiella属、Desulfococcus属、Desulfobacterium属、Desulfatibacillum属、Desulfobulbus属、Desulfarculus属、Geobacter属、Syntrophobacter属、Syntrophus属、Desulfomonile属、Bdellovibrio属、Bacteriovorax属、Stigmatella属、Myxococcus属、Anaeromyxobacter属、Sorangium属、Haliangium属、Acidobacterium属、Granulicella属、Ilumatobacter属、Streptosporangium属、Nocardiopsis属、Thermobifida属、Thermomonospora属、Pseudonocardia属、Amycolatopsis属、Saccharomonospora属、Saccharopolyspora属、Thermobispora属、Actinosynnema属、Micromonospora属、Salinispora属、Verrucosispora属、Nocardioides属、Kribbella属、Corynebacterium属、Nocardia属、Rhodococcus属、 Gordonia属、Dietzia属、Mycobacterium属、Amycolicicoccus属、Tsukamurella属、Segniliparus属、Microbacterium属、Micrococcus属、Arthrobacter属、Citricoccus属、Renibacterium属、Kocuria属、Kytococcus属、Cellulomonas属、Intrasporangium属、Serinicoccus属、Frankia属、Acidothermus属、Nakamurella属、Geodermatophilus属、Stackebrandtia属、Streptomyces属Catenulispora属、Rubrobacter属、Conexibacter属、Bacillus属、Geobacillus属、Oceanobacillus属、Lysinibacillus属、Halobacillus属、Alicyclobacillus属、Kyrpidia属、Paenibacillus属Lactobacillus属、Carnobacterium属、Clostridium属、Alkaliphilus属、Syntrophomonas属、Syntrophothermus属、Eubacterium属、Desulfitobacterium属、Desulfotomaculum属、Pelotomaculum属、Butyrivibrio属、Roseburia属、Oscillibacter属、Thermoanaerobacter属、Carboxydothermus属、Natranaerobius属、Sphingobacterium属、Pedobacter属、Haliscomenobacter属、Porphyromonas属、Odoribacter属、Spirosoma属、Runella属、Maribacter属、Deinococcus属、Thermus属、Meiothermus属、Oceanithermus属、Marinithermus属、Gemmatimonas属、Fusobacterium属、Ilyobacter属、Roseiflexus属、Herpetosiphon属、Thermomicrobium属、Thermotoga属、Thermosipho属、Fervidobacterium属、Deferribacter属、Calditerrivibrio属、Flexistipes属、Metallosphaera属、Aeropyrum属、Pyrobaculum属、Caldivirga属、Vulcanisaeta属、Acidilobus属、Haloarcula属、Haloquadratum属、Natronomonas属、Halorubrum属、Haloterrigena属、Natrialba属、Halalkalicoccus属、Halogeometricum属、Thermoplasma属、Picrophilus属、Ferroplasma属、Archaeoglobus属、Ferroglobus属、Polymorphum属、Micavibrio属、Simiduia属、Leptothrix属、Thiomonas属、Rubrivivax属、Methylibium属、Exiguobacterium属およびAnaerococcus属に属する微生物である。

さらに、Magnetospirillum属に分類される微生物としてはMagnetospirillum magneticum、Rhodospirillum属に分類される微生物としてはRhodospirillum rubrum、Rhodospirillum centenumおよびRhodospirillum photometricum、Azospirillum属に分類される微生物としては、Azospirillum lipoferumおよびAzospirillum brasilense、Tistrella属に分類される微生物としてはTistrella mobilis、Acidiphilium属に分類される微生物としてはAcidiphilium cryptumおよびAcidiphilium multivorum、Rhodobacter属に分類される微生物としてはRhodobacter sphaeroidesおよびRhodobacter capsulatus、Paracoccus属に分類される微生物としてはParacoccus denitrificans、Paracoccus aminophilus、Ruegeria属に分類される微生物としてはRuegeria pomeroyi、Roseobacter属に分類される微生物としてはRoseobacter denitrificansおよびRoseobacter litoralis、Dinoroseobacter属に分類される微生物としてはDinoroseobacter shibae、Phaeobacter属に分類される微生物としてはPhaeobacter gallaeciensis、Octadecabacter属に分類される微生物としてはOctadecabacter antarcticusおよびOctadecabacter arcticus、Hyphomonas属に分類される微生物としてはHyphomonas neptunium、Maricaulis属に分類される微生物としてはMaricaulis maris、Hirschia属に分類される微生物としてはHirschia baltica、Sphingomonas属に分類される微生物としてはSphingomonas paucimobilisおよびSphingomonas wittichii、Novosphingobium属に分類される微生物としてはNovosphingobium aromaticivorans、Sphingopyxis属に分類される微生物としてはSphingopyxis alaskensis、Sphingobium属に分類される微生物としてはSphingobium japonicumおよびSphingobium chlorophenolicum、Erythrobacter属に分類される微生物としてはErythrobacter litoralis、Brevundimonas属に分類される微生物としてはBrevundimonas diminuta、Brevundimonas subvibrioidesおよびBrevundimonas vesicularis、Caulobacter属に分類される微生物としてはCaulobacter crescentusおよびCaulobacter segnis、Phenylobacterium属に分類される微生物としてはPhenylobacterium zucineum、Asticcacaulis属に分類される微生物としてはAsticcacaulis excentricus、Agrobacterium属に分類される微生物としてはAgrobacterium tumefaciens、Agrobacterium radiobacterおよびAgrobacterium luteum、Rhizobium属に分類される微生物としてはRhizobium leguminosarum、Rhizobium etliおよびRhizobium tropici、Sinorhizobium属に分類される微生物としてはSinorhizobium meliloti、Sinorhizobium medicaeおよびSinorhizobium fredii、Xanthobacter属に分類される微生物としてはXanthobacter agilis、Xanthobacter aminoxidans 、Xanthobacter autotrophicus、Xanthobacter flavus、Xanthobacter tagetidis、Xanthobacter viscosus、Azorhizobium属に分類される微生物としてはAzorhizobium caulinodans、Brucella属に分類される微生物としてはBrucella melitensis、Brucella abortus、Brucella suis、Brucella ovis、Brucella canis、Brucella microti、Brucella pinnipedialisおよびBrucella ceti、Ochrobactrum属に分類される微生物としてはOchrobactrum anthropi、Ochrobactrum cytisi、Ochrobactrum daejeonense、Ochrobactrum gallinifaecis、Ochrobactrum grignonense、Ochrobactrum haemophilum、Ochrobactrum intermedium、Ochrobactrum lupini、Ochrobactrum oryzae、Ochrobactrum pseudintermedium、Ochrobactrum pseudogrignonense、Ochrobactrum thiophenivoransおよびOchrobactrum tritici、Mesorhizobium属に分類される微生物としてはMesorhizobium alhagi、Mesorhizobium albiziae、Mesorhizobium amorphae、Mesorhizobium australicum、Mesorhizobium caraganae、Mesorhizobium chacoense、Mesorhizobium ciceri、Mesorhizobium gobiense、Mesorhizobium loti、Mesorhizobium mediterraneum、Mesorhizobium metallidurans、Mesorhizobium opportunistum、Mesorhizobium plurifarium、Mesorhizobium huakuii、Mesorhizobium septentrionale、Mesorhizobium shangrilense、Mesorhizobium tarimense、Mesorhizobium temperatum、Mesorhizobium thiogangeticuおよびMesorhizobium tianshanense、Aurantimonas属に分類される微生物としてはAurantimonas manganoxydans、Bradyrhizobium属に分類される微生物としてはBradyrhizobium japonicum、Agromonas属に分類される微生物としてはAgromonas oligotrophica、Rhodopseudomonas属に分類される微生物としてはRhodopseudomonas palustris、Nitrobacter属に分類される微生物としてはNitrobacter winogradskyiおよびNitrobacter hamburgensis、Methylobacterium属に分類される微生物としてはMethylobacterium extorquens、Methylobacterium radiotoleransおよびMethylobacterium nodulans、Rhodomicrobium属に分類される微生物としてはRhodomicrobium vannielii、Pelagibacterium属に分類される微生物としてはPelagibacterium halotolerans、Parvibaculum属に分類される微生物としてはParvibaculum lavamentivorans、Parvularcula属に分類される微生物としてはParvularcula bermudensis、Burkholderia属に分類される微生物としてはBurkholderia mallei、Burkholderia pseudomallei、Burkholderia thailandensis、Burkholderia vietnamiensis、Burkholderia cenocepacia、Burkholderia ambifaria、Burkholderia multivorans、Burkholderia cepacia、Burkholderia xenovorans、Burkholderia phymatum、Burkholderia phytofirmans、Burkholderia glumae、Burkholderia rhizoxinica、Burkholderia gladioli、Burkholderia phenoliruptrixおよびBurkholderia oklahomensis、Ralstonia属に分類される微生物としてはRalstonia solanacearum、Ralstonia pickettiiおよびRalstonia eutropha、Cupriavidus属に分類される微生物としてはCupriavidus metallidurans、Cupriavidus taiwanensisおよびCupriavidus necator、Polynucleobacter属に分類される微生物としてはPolynucleobacter necessarius、Achromobacter属に分類される微生物としてはAchromobacter arsenitoxydans、Achromobacter cholinophagum、Achromobacter cycloclastes、Achromobacter denitrificans、Achromobacter fischeri、Achromobacter hartlebii、Achromobacter immobilis、Achromobacter insolitus、Achromobacter lactolyticus、Achromobacter lyticus、Achromobacter methanolophila、Achromobacter pestifer、Achromobacter piechaudii、Achromobacter ruhlandii、Achromobacter spanios、Achromobacter viscosus、Achromobacter xerosisおよびAchromobacter xylosoxidans、Bordetella属に分類される微生物としてはBordetella pertussis、Bordetella parapertussis、Bordetella petriiおよびBordetella avium、Taylorella属に分類される微生物としてはTaylorella equigenitalis、Comamonas属に分類される微生物としてはComamonas acidovorans、Comamonas aquatica、Comamonas badia、Comamonas composti、Comamonas denitrificans、Comamonas granuli、Comamonas kerstersii、Comamonas koreensis、Comamonas nitrativorans、Comamonas odontotermites、Comamonas terrae、Comamonas terrigena、Comamonas testosteroni、Comamonas thiooxydansおよびComamonas zonglianii、Alicycliphilus属に分類される微生物としてはAlicycliphilus denitrificans、Delftia属に分類される微生物としてはDelftia acidovorans、Ramlibacter属に分類される微生物としてはRamlibacter tataouinensis、Rhodoferax属に分類される微生物としてはRhodoferax ferrireducens、Variovorax属に分類される微生物としてはVariovorax paradoxus、Polaromonas属に分類される微生物としてはPolaromonas naphthalenivorans、Acidovorax属に分類される微生物としてはAcidovorax citrulli、Acidovorax ebreusおよびAcidovorax avenae、Verminephrobacter属に分類される微生物としてはVerminephrobacter eiseniae、Herminiimonas属に分類される微生物としてはHerminiimonas arsenicoxydans、Herbaspirillum属に分類される微生物としてはHerbaspirillum seropedicae、Collimonas属に分類される微生物としてはCollimonas fungivorans、Chromobacterium属に分類される微生物としてはChromobacterium violaceum、Laribacter属に分類される微生物としてはLaribacter hongkongensis、Pseudogulbenkiania属に分類される微生物としてはPseudogulbenkiania ferrooxidans、Nitrosomonas属に分類される微生物としてはNitrosomonas europaea、Nitrosospira属に分類される微生物としてはNitrosospira multiformis、Aromatoleum属に分類される微生物としてはAromatoleum aromaticum、Dechloromonas属に分類される微生物としてはDechloromonas aromatica、Azospira (Dechlorosoma)属に分類される微生物としてはAzospira oryzae(Dechlorosoma suillum)、Rheinheimera属に分類される微生物としてはRheinheimera nanhaiensis、Nitrosococcus属に分類される微生物としてはNitrosococcus oceani、Halorhodospira属に分類される微生物としてはHalorhodospira halophila、Xanthomonas属に分類される微生物としてはXanthomonas campestris、Xanthomonas axonopodis、Xanthomonas oryzae、Xanthomonas albilineansおよびXanthomonas citri、Stenotrophomonas属に分類される微生物としてはStenotrophomonas maltophilia、Pseudoxanthomonas属に分類される微生物としてはPseudoxanthomonas suwonensisおよびPseudoxanthomonas spadix、Francisella属に分類される微生物としてはFrancisella tularensisおよびFrancisella novicida、Cycloclasticus 属に分類される微生物としてはCycloclasticus zancles、Hahella属に分類される微生物としてはHahella chejuensis 、Halomonas属に分類される微生物としてはHalomonas elongata、Alcanivorax属に分類される微生物としてはAlcanivorax borkumensisおよびAlcanivorax dieselolei、Kangiella属に分類される微生物としてはKangiella koreensis、Pseudomonas属に分類される微生物としては、例えば、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas agarici、Pseudomonas syringae、Pseudomonas amygdale およびPseudomonas stutzeri、Azotobacter属に分類される微生物としてはAzotobacter vinelandii、Acinetobacter属に分類される微生物としてはAcinetobacter baumannii、Acinetobacter aylyi、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter gyllenbergii、Acinetobacter haemolyticus、Acinetobacter johnsonii、Acinetobacter junii、Acinetobacter lwoffii、Acinetobacter oleivorans、Acinetobacter parvus、Psychrobacter属に分類される微生物としてはPsychrobacter arcticusおよびPsychrobacter cryohalolentis、Alishewanella属に分類される微生物としてはAlishewanella jeotgali、Alteromonas属に分類される微生物としてはAlteromonas macleodii、Glaciecola属に分類される微生物としてはGlaciecola nitratireducens、Glaciecola psychrophilaおよびGlaciecola punicea、Marinobacter属に分類される微生物としてはMarinobacter aquaeolei、Marinobacter hydrocarbonoclasticus、Marinobacter adhaerens、Marinobacter algicolaおよびMarinobacter manganoxydans、Marinobacterium属に分類される微生物としてはMarinobacterium stanieri、Saccharophagus属に分類される微生物としてはSaccharophagus degradans、Shewanella属に分類される微生物としてはShewanella piezotolerans、Shewanella abyssi、Shewanella affinis、Shewanella algae、Shewanella algidipiscicola、Shewanella amazonensis、Shewanella aquimarina、Shewanella arctica、Shewanella atlantica、Shewanella baltica、Shewa
nella basaltis、Shewanella benthica、Shewanella candadensis、Shewanella chilikensis、Shewanella colwelliana、Shewanella corallii、Shewanella decolorationis、Shewanella denitrificans、Shewanella donghaensis、Shewanella fidelis、Shewanella fodinae、Shewanella frigidimarina、Shewanella gaetbuli、Shewanella gelidimarina、Shewanella glacialipiscicola、Shewanella gopherii、Shewanella hafniensis、Shewanella halifaxensis、Shewanella haliotis、Shewanella hanedai、Shewanella japonica、Shewanella kaireitica、Shewanella ivingstonensis、Shewanella loihica、Shewanella marina、Shewanella marinintestina、Shewanella marisflavi、Shewanella morhuae、Shewanella olleyana、Shewanella oneidensis、Shewanella pacifica、Shewanella pealeana、Shewanella pneumatophori、Shewanella profunda、Shewanella putrefaciens、Shewanella sairae、Shewanella schlegeliana、Shewanella sediminis、Shewanella surugensis、Shewanella vesiculosa、Shewanella violacea、Shewanella waksmanii、Shewanella woodyiおよびShewanella xiamenensis、Ferrimonas属に分類される微生物としてはFerrimonas balearica、Idiomarina属に分類される微生物としてはIdiomarina loihiensisおよびIdiomarina baltica、Colwellia属に分類される微生物としてはColwellia psychrerythraea、Pseudoalteromonas属に分類される微生物としてはPseudoalteromonas haloplanktis、Pseudoalteromonas atlanticaおよびPseudoalteromonas tunicata、Listonella属に分類される微生物としてはListonella anguillara、Listonella anguillarumおよびListonella pelagia、Vibrio属に分類される微生物としてはVibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus、Vibrio harveyi、Vibrio furnissii、Vibrio tubiashii、Vibrio sinaloensis、Vibrio rotiferianus、Vibrio orientalis、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Vibrio caribbenthicus、Vibrio brasiliensisおよびVibrio alginolyticus、Photobacterium属に分類される微生物としてはPhotobacterium profundum、Aeromonas属に分類される微生物としてはAeromonas hydrophila、Aeromonas salmonicidaおよびAeromonas veronii、Salinisphaera属に分類される微生物としてはSalinisphaera shabanensis、Legionella属に分類される微生物としてはLegionella pneumophilaおよびLegionella longbeachae、Coxiella属に分類される微生物としてはCoxiella burnetii、Desulfococcus属に分類される微生物としてはDesulfococcus oleovorans、Desulfobacterium属に分類される微生物としてはDesulfobacterium autotrophicum、Desulfatibacillum属に分類される微生物としてはDesulfatibacillum alkenivorans、Desulfobulbus属に分類される微生物としてはDesulfobulbus propionicus、Desulfarculus属に分類される微生物としてはDesulfarculus baarsii、Geobacter属に分類される微生物としてはGeobacter metallireducens、Geobacter uraniireducensおよびGeobacter bemidjiensis、Syntrophobacter属に分類される微生物としてはSyntrophobacter fumaroxidans、Syntrophus属に分類される微生物としてはSyntrophus aciditrophicus、Desulfomonile属に分類される微生物としてはDesulfomonile tiedjei、Bdellovibrio属に分類される微生物としてはBdellovibrio bacteriovorusおよびBdellovibrio exovorus、Bacteriovorax属に分類される微生物としてはBacteriovorax marinus、Stigmatella属に分類される微生物としてはStigmatella aurantiaca、Myxococcus属に分類される微生物としてはMyxococcus xanthusおよびMyxococcus fulvus、Anaeromyxobacter属に分類される微生物としてはAnaeromyxobacter dehalogenans、Sorangium属に分類される微生物としてはSorangium cellulosum、Haliangium属に分類される微生物としてはHaliangium ochraceum、Acidobacterium属に分類される微生物としてはAcidobacterium capsulatum、Granulicella属に分類される微生物としてはGranulicella tundricola、Ilumatobacter属に分類される微生物としてはIlumatobacter coccineum、Streptosporangium属に分類される微生物としてはStreptosporangium roseum、Nocardiopsis属に分類される微生物としてはNocardiopsis dassonvillei、Thermobifida属に分類される微生物としてはThermobifida fusca、Thermomonospora属に分類される微生物としてはThermomonospora curvata、Pseudonocardia属に分類される微生物としてはPseudonocardia dioxanivorans、Amycolatopsis属に分類される微生物としてはAmycolatopsis mediterranei、Saccharomonospora属に分類される微生物としてはSaccharomonospora viridisおよびSaccharomonospora xinjiangensis、Saccharopolyspora属に分類される微生物としてはSaccharopolyspora erythraeaおよびSaccharopolyspora spinosa、Thermobispora属に分類される微生物としてはThermobispora bispora、Actinosynnema属に分類される微生物としてはActinosynnema mirum、Micromonospora属に分類される微生物としてはMicromonospora aurantiaca、Salinispora属に分類される微生物としてはSalinispora tropicaおよびSalinispora arenicola、Verrucosispora属に分類される微生物としてはVerrucosispora maris、Kribbella属に分類される微生物としてはKribbella flavida、Corynebacterium属に分類される微生物としてはCorynebacterium jeikeium、Corynebacterium urealyticumおよびCorynebacterium kroppenstedtii、Nocardia属に分類される微生物としてはNocardia farcinica、Nocardia brasiliensisおよびNocardia cyriacigeorgica、Rhodococcus属に分類される微生物としてはRhodococcus rhodochrous、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus equi、Rhodococcus rhodnii、Rhodococcus corallinus、Rhodococcus rubropertinctus、Rhodococcus coprophilus、Rhodococcus globerulus、Rhodococcus chlorophenolicus、Rhodococcus luteus、Rhodococcus aichiensis、Rhodococcus chubuensis、Rhodococcus marisおよびRhodococcus fascines、Gordonia属に分類される微生物としてはGordonia bronchialis、Gordonia neofelifaecisおよびGordonia terrae、Dietzia属に分類される微生物としてはDietzia cinnamea、Mycobacterium属に分類される微生物としてはMycobacterium tuberculosis、Mycobacterium bovis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium avium、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium ulcerans、Mycobacterium vanbaalenii、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium abscessus、Mycobacterium marinu、Mycobacterium massiliense、Mycobacterium phlei、Mycobacterium thermoresistibile、Mycobacterium tusciae、Mycobacterium xenopiおよびMycobacterium rhodesiae、Amycolicicoccus属に分類される微生物としてはAmycolicicoccus subflavus、Tsukamurella属に分類される微生物としてはTsukamurella paurometabola、Segniliparus属に分類される微生物としてはSegniliparus rotundus、Microbacterium属に分類される微生物としてはMicrobacterium testaceum、Micrococcus属に分類される微生物としてはMicrococcus luteus、Arthrobacter属に分類される微生物としてはArthrobacter arilaitensis、Arthrobacter chlorophenolicus、Arthrobacter globiformisおよびArthrobacter phenanthrenivorans、Renibacterium属に分類される微生物としてはRenibacterium salmoninarum、Kocuria属に分類される微生物としてはKocuria rhizophila、Kytococcus属に分類される微生物としてはKytococcus sedentarius、Cellulomonas属に分類される微生物としてはCellulomonas fimi、Intrasporangium属に分類される微生物としてはIntrasporangium calvum、Serinicoccus属に分類される微生物としてはSerinicoccus profundi、Frankia属に分類される微生物としてはFrankia alni、Acidothermus属に分類される微生物としてはAcidothermus cellulolyticus、Nakamurella属に分類される微生物としてはNakamurella multipartita、Geodermatophilus属に分類される微生物としてはGeodermatophilus obscurus、Stackebrandtia属に分類される微生物としてはStackebrandtia nassauensis、Streptomyces属に分類される微生物としてはStreptomyces albus 、Streptomyces avermitilis、Streptomyces bingchenggensis、Streptomyces chartreusis、Streptomyces clavuligerus、Streptomyces coelicoflavus、Streptomyces coelicolor、Streptomyces ghanaensis、Streptomyces griseus、Streptomyces hygroscopicus、Streptomyces lividans、Streptomyces roseosporus、Streptomyces scabiei、Streptomyces sviceus、Streptomyces venezuelae、Streptomyces violaceusnigerおよびStreptomyces viridochromogenes、Catenulispora属に分類される微生物としてはCatenulispora acidiphila、Rubrobacter属に分類される微生物としてはRubrobacter xylanophilus、Conexibacter属に分類される微生物としてはConexibacter woesei、Bacillusに分類される微生物としてはBacillus thuringiensis、Bacillus megaterium、Bacillus pseudofirmus、Bacillus clausii、Bacillus cereus、Bacillus subtilisおよびBacillus thuringiensis、Geobacillus属に分類される微生物としてはGeobacillus caldoproteolyticus、Geobacillus caldoxylosilyticus、Geobacillus debilis、Geobacillus galactosidasius、Geobacillus gargensis、Geobacillus jurassicus、Geobacillus kaustophilus、Geobacillus lituanicus、Geobacillus pallidus、Geobacillus stearothermophilus、Geobacillus stromboliensis、Geobacillus subterraneus、Geobacillus tepidamans、Geobacillus thermocatenulatus、Geobacillus thermodenitrificans、Geobacillus thermoglucosidasius、Geobacillus thermoleovorans、Geobacillus toebii、Geobacillus uzensis、Geobacillus vulcani、Geobacillus zalihae、Oceanobacillus属に分類される微生物としてはOceanobacillus iheyensis、Lysinibacillus属に分類される微生物としてはLysinibacillus sphaericus、Halobacillus属に分類される微生物としてはHalobacillus halophilus、Alicyclobacillus属に分類される微生物としてはAlicyclobacillus acidocaldarius、Kyrpidia属に分類される微生物としてはKyrpidia tusci、Paenibacillus属に分類される微生物としてはPaenibacillus polymyxa、Paenibacillus mucilaginosusおよびPaenibacillus terrae、Lactobacillus属に分類される微生物としてはLactobacillus buchneri、Clostridium属に分類される微生物としてはClostridium acetobutylicum、Clostridium perfringens、Clostridium kluyveri、Clostridium cellulovorans、Clostridium difficileおよびClostridium sticklandii、Alkaliphilus属に分類される微生物としてはAlkaliphilus metalliredigensおよびAlkaliphilus oremlandii、Syntrophomonas属に分類される微生物としてはSyntrophomonas wolfei、Syntrophothermus属に分類される微生物としてはSyntrophothermus lipocalidus、Eubacterium属に分類される微生物としてはEubacterium rectaleおよびEubacterium limosum、Desulfitobacterium属に分類される微生物としてはDesulfitobacterium hafniense、Desulfotomaculum属に分類される微生物としてはDesulfotomaculum reducens、Pelotomaculum属に分類される微生物としてはPelotomaculum thermopropionicum、Butyrivibrio属に分類される微生物としてはButyrivibrio proteoclasticus、Roseburia属に分類される微生物としてはRoseburia hominis、Oscillibacter属に分類される微生物としてはOscillibacter valericigenes、Thermoanaerobacter属に分類される微生物としてはThermoanaerobacter tengcongensis、Carboxydothermus属に分類される微生物としてはCarboxydothermus hydrogenoformans、Natr
anaerobius属に分類される微生物としてはNatranaerobius thermophilus、Sphingobacterium属に分類される微生物としては、Sphingobacterium multivorum、Sphingobacterium spiritivorum、Sphingobacterium alimentarium、Sphingobacterium anhuiense、Sphingobacterium antarcticum、Sphingobacterium bambusae、Sphingobacterium canadense、Sphingobacterium composti、Sphingobacterium daejeonense、Sphingobacterium faecium、Sphingobacterium heparinum、Sphingobacterium kitahiroshimense、Sphingobacterium lactis、Sphingobacterium mizutaii、Sphingobacterium nematocida、Sphingobacterium piscium、Sphingobacterium shayense、Sphingobacterium siyangense、Sphingobacterium thalpophilumおよびSphingobacterium wenxiniae、Pedobacter属に分類される微生物としては、Pedobacter steynii 、Pedobacter duraquae、Pedobacter metabolipauper、Pedobacter hartonius、Pedobacter heparinus Pedobacter africanus、Pedobacter agri、Pedobacter alluviusおよびPedobacter saltans、Haliscomenobacter属に分類される微生物としてはHaliscomenobacter hydrossis、Porphyromonas属に分類される微生物としてはPorphyromonas gingivalisおよびPorphyromonas asaccharolytica、Odoribacter属に分類される微生物としてはOdoribacter splanchnicus、Spirosoma属に分類される微生物としてはSpirosoma linguale、Runella属に分類される微生物としてはRunella slithyformis、Deinococcus属に分類される微生物としてはDeinococcus radiodurans、Deinococcus geothermalis、Deinococcus deserti、Deinococcus maricopensis、Deinococcus proteolyticusおよびDeinococcus gobiensis、Thermus属に分類される微生物としてはThermus thermophilusおよびThermus scotoductus、Meiothermus属に分類される微生物としてはMeiothermus ruberおよびMeiothermus silvanus、Oceanithermus属に分類される微生物としてはOceanithermus profundus、Marinithermus属に分類される微生物としてはMarinithermus hydrothermalis、Gemmatimonas属に分類される微生物としてはGemmatimonas aurantiaca、Fusobacterium属に分類される微生物としてはFusobacterium nucleatum、Ilyobacter属に分類される微生物としてはIlyobacter polytropus、Roseiflexus属に分類される微生物としてはRoseiflexus castenholzii、Herpetosiphon属に分類される微生物としてはHerpetosiphon aurantiacus、Thermomicrobium属に分類される微生物としてはThermomicrobium roseum、Thermotoga属に分類される微生物としてはThermotoga lettingae、Thermosipho属に分類される微生物としてはThermosipho melanesiensisおよびThermosipho africanus、Fervidobacterium属に分類される微生物としてはFervidobacterium nodosum、Deferribacter属に分類される微生物としてはDeferribacter desulfuricans、Calditerrivibrio属に分類される微生物としてはCalditerrivibrio nitroreducens、Flexistipes属に分類される微生物としてはFlexistipes sinusarabici、Metallosphaera属に分類される微生物としてはMetallosphaera sedula、Aeropyrum属に分類される微生物としてはAeropyrum pernix、Pyrobaculum属に分類される微生物としてはPyrobaculum aerophilum、Pyrobaculum islandicum、Pyrobaculum calidifontisおよびPyrobaculum neutrophilum、Caldivirga属に分類される微生物としてはCaldivirga maquilingensis、Vulcanisaeta属に分類される微生物としてはVulcanisaeta distributa、Acidilobus属に分類される微生物としてはAcidilobus saccharovorans、Haloarcula属に分類される微生物としてはHaloarcula marismortui、Haloquadratum属に分類される微生物としてはHaloquadratum walsbyi、Natronomonas属に分類される微生物としてはNatronomonas pharaonis、Halorubrum属に分類される微生物としてはHalorubrum lacusprofundi、Haloterrigena属に分類される微生物としてはHaloterrigena turkmenica、Natrialba属に分類される微生物としてはNatrialba magadii、Halalkalicoccus属に分類される微生物としてはHalalkalicoccus jeotgali、Halogeometricum属に分類される微生物としてはHalogeometricum borinquense、Thermoplasma属に分類される微生物としてはThermoplasma acidophilumおよびThermoplasma volcanium、Picrophilus属に分類される微生物としてはPicrophilus torridus、Ferroplasma属に分類される微生物としてはFerroplasma acidarmanus、Archaeoglobus属に分類される微生物としてはArchaeoglobus fulgidusおよびArchaeoglobus veneficus、Ferroglobus属に分類される微生物としてはFerroglobus placidus、Polymorphum属に分類される微生物としてはPolymorphum gilvum、Micavibrio属に分類される微生物としてはMicavibrio aeruginosavorus、Simiduia属に分類される微生物としてはSimiduia agarivorans、Leptothrix属に分類される微生物としてはLeptothrix cholodnii、Thiomonas属に分類される微生物としてはThiomonas intermedia、Rubrivivax属に分類される微生物としてはRubrivivax gelatinosus、Methylibium属に分類される微生物としてはMethylibium petroleiphilum、Anaerococcus属に分類される微生物としてはAnaerococcus prevotiiが特に好ましい。

ここで例示した微生物は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）や、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）や、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＦＥＲＭ）等から入手可能である。

［メタクリル酸エステルの合成工程］
メタクリル酸エステルの製造は、以下の方法で行うことができる。溶媒にメタクリリル−ＣｏＡ及び式２で表されるアルコールまたはフェノール類を添加して溶液を調製し、溶解又は懸濁させる。そして、この溶液又は懸濁液に、ＡＡＴを接触させ、温度等の条件を制御しながらメタクリリル−ＣｏＡとアルコールまたはフェノール類とを反応させる。前記反応により、メタクリリル−ＣｏＡのメタクリル基を式２のアルコールまたはフェノール類に転移させて、メタクリル酸エステルを生成させる。

メタクリリル−ＣｏＡ及び式２で表されるアルコールまたはフェノール類を含む溶液は、通常、緩衝液等の水性媒体で調製する。ここで、反応を円滑に進行させるために、浸透圧調整剤等によりモル浸透圧濃度および／またはイオン強度を制御することが可能である。浸透圧調整剤としては、細胞内部等の溶液の浸透圧に対して等張または高張になるように調節する目的で加えられる水溶性物質であればよく、例えば、塩又は糖類であり、好ましくは塩である。塩は、好ましくは金属塩、より好ましくはアルカリ金属塩、より好ましくはハロゲン化アルカリ金属であり、例えば、塩化ナトリウムや塩化カリウムが挙げられる。糖類は、好ましくは単糖類又はオリゴ糖類、より好ましくは単糖類又は二糖類であり、例えば、グルコース、スクロース、マンニトール等が挙げられる。浸透圧調整剤は１ｍＭ以上の濃度で添加することが好ましく、使用する生体細胞内の溶液と比して等張または高張になるように調節することが特に好ましい。

また、生成したメタクリル酸エステルを分離する目的で、あらかじめ、有機溶媒を添加し、２相系で反応させることも可能である。有機溶媒としては、例えば直鎖状、分岐状又は環状の、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素、飽和又は不飽和芳香族炭化水素等を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。具体的には、例えば、炭化水素系溶媒（例えばペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレンなど）、ハロゲン化炭化水素系溶媒（例えば塩化メチレン、クロロホルムなど）、エーテル系溶媒（例えばジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタンなど）、エステル系溶媒（例えばギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル）などが挙げられる。これらの有機溶媒を添加しておくことで、生成したメタクリル酸エステルが有機相に移行し、効率的に反応が進行する場合がある。

反応液中のメタクリリル−ＣｏＡおよび式２で表されるアルコールまたはフェノール類のモル比、濃度は任意であり、特に制限はない。また、ＡＡＴの使用量または反応条件は、用いる原料に応じて適宜決定される。通常、各原料の濃度は、メタクリリル−ＣｏＡの場合は０．００００００１〜１０質量％の範囲に設定し、アルコールまたはフェノール類は用いるメタクリリル−ＣｏＡに対して０．１〜１０００倍モル、好ましくは０．５〜５０倍モルの濃度で添加する。

その他の反応温度又は反応時間等の各種条件は使用する原料、酵素の活性等により、適宜決定されるもので、特に制限はないが、通常５〜８０℃で、１時間〜１週間反応させればよい。好ましくは、１０〜７０℃で、１〜１２０時間であり、３時間以上がより好ましく、４時間以上が更に好ましい。このような条件で反応が終了する条件を選択することが好ましい。反応液のｐＨについても反応が効率良く進行すれば特に限定されないが、例えば、ｐＨ４〜１０の範囲、好ましくはｐＨ５．５〜８．５である。

メタクリル酸エステルを０．００１ｍＭ以上蓄積させるための好適な条件としては、ｐＨ５．５〜７．５の条件下、メタクリリル−ＣｏＡの濃度が直接あるいは間接的に０．０００００１〜１質量％の範囲になるように調整し、アルコールまたはフェノール類は用いるメタクリリル−ＣｏＡに対して１〜５０倍モルになるように濃度を調整する。そして、温度を２０〜４０℃の範囲に調整し、３時間以上反応させる。これらの原料（基質）については前述の範囲になるように連続的に供給することも可能であり、そうすることで生成物の蓄積濃度を向上させることができる。

減圧下あるいは通気条件下で本反応を実施することも有効である。前記条件下において、生成したメタクリル酸エステルを連続的に分離でき、その結果、効率的に反応が進行する場合があるからである。

イソブチリル−ＣｏＡを原料にＡＣＤの作用によって変換されたメタクリリル−ＣｏＡあるいは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからＥＣＨの作用によって変換されたメタクリリル−ＣｏＡを用いてメタクリル酸エステルを製造する場合においても、前記条件の範囲になるよう調整して実施することが好ましい。なお、ＡＣＤあるいはＥＣＨによるメタクリリル−ＣｏＡ合成反応は公知の方法により実施可能である（例えば、ＡＣＤの反応条件としてＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）， １４５，２３２３−２３３４記載の条件）。さらに他の生体反応と組み合わせることで、メタクリル酸エステルの生体内での連続反応（発酵生産）が可能となる。

本発明の方法によって生成されたメタクリル酸エステルは、必要に応じて、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などによって、測定又は定量分析することができる。

反応液からのメタクリル酸エステルの単離は、蒸留、薄膜蒸留、溶剤抽出、カラム分離など公知の精製法の単独あるいは組み合わせにより行うことができる。また、得られたメタクリル酸エステルは通常の方法により重合し、従来の用途に遜色なく使用することが可能である。

このようにして得られたメタクリル酸エステルおよびその重合物はエネルギー、資源、環境に対する負荷を格段に低減することができ、石油製品を出発原料とした従来の化学製造品と比較して環境低負荷材料として非常に大きな社会的価値を有するものである。

２．遺伝子組換え微生物により前駆体からメタクリル酸エステルを製造する方法

［前駆体からのメタクリル酸エステル生成能を有する組換え体微生物］
前述のように本発明では、ＡＡＴ遺伝子を導入した微生物に必要に応じてＡＣＤ遺伝子、ＥＣＨ遺伝子、ＢＣＫＡＤ遺伝子等を導入して、イソブチリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡあるいは２−オキソイソ吉草酸等の前駆体からメタクリル酸エステルを合成することも可能である。

「前駆体」とは、メタクリリル−ＣｏＡへ誘導可能な化合物を意味し、イソブチリル−ＣｏＡあるいは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ、さらにはこれら２化合物へ誘導可能な物質のことを示す。
２化合物へ誘導可能な物質とは例えば、２−オキソイソ吉草酸、イソ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸、酢酸、ピルビン酸、乳酸、アセト酢酸、酪酸、プロピオン酸、リンゴ酸、フマル酸、クエン酸およびコハク酸等の酸、バリン、アラニン、ロイシン、リジンおよびグルタミン酸等のアミノ酸類、グルコース、フルクトースおよびキシロース等の糖類などが挙げられる。
これら前駆体からメタクリル酸エステルを生成させるには宿主微生物が本来有する各種代謝系をそのまま利用することも可能である。必要に応じて遺伝子を導入あるいは欠損させることもできる。

（１）宿主微生物
宿主微生物としては、前記前駆体からのメタクリリル−ＣｏＡを生成させるための酵素群およびＡＡＴの発現能力を有する宿主であれば特に制限はないが、細菌では、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属などが挙げられ、酵母ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、糸状菌ではＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属などが挙げられる。

宿主としてロドコッカス属微生物が好ましい。その理由としては、本発明の過程で、ロドコッカス属微生物がバリン資化能を有するということを実験的に確認し、その機能を利用することで、図２で示されるルートによるメタクリル酸エステル生成へ応用できることを見出した知見によるものである。

例えば以下の微生物から選択される１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）に分類される微生物としては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、ロドコッカス・ロドニ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｎｉｉ）、 ロドコッカス・コラリヌス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、ロドコッカス・ルブロペルチンクタス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）、ロドコッカス・コプロフィラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）、ロドコッカス・グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）、ロドコッカス・クロロフェノリカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）、ロドコッカス・ルテウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、ロドコッカス・アイシェンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ａｉｃｈｉｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス・チュブエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｃｈｕｂｕｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス・マリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｓ）およびロドコッカス・ファシエンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｓｃｉｎｅｓ）等が挙げられる。

好ましい例としては、ロドコッカス・エリスロポリスが挙げられる。より好ましい株としては、ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ−４株、ロドコッカス・エリスロポリスＫＡ２−５−１株、ロドコッカス・エリスロポリスＩＧＴＳ８株、ロドコッカス・エリスロポリスＤ−１株、ロドコッカス・エリスロポリスＨ−２株、ロドコッカス・エリスロポリスＮ１−３６株、ロドコッカス・エリスロポリスＩ−１９株、ロドコッカス・エリスロポリスＥＣＲＤ−１株、ロドコッカス・エリスロポリスＢ１株、ロドコッカス・エリスロポリスＳＹ−１株、ロドコッカス・エリスロポリスＵＭ３株、ロドコッカス・エリスロポリスＵＭ９株又はロドコッカス・エスピーＴ０９株等が挙げられ、特に好ましくはロドコッカス・エリスロポリスＰＲ−４株が挙げられる。さらにこれら株の誘導株が含まれる。

誘導株としては、培養条件（例えば培地組成、温度など）の変化や、化学的若しくは物理的処理（例えばγ線照射など）によって、メタクリリル−ＣｏＡ生成能を有する微生物に遺伝子変異を誘発して得た変異株や、下記のようにして活性が強化された、あるいは活性を欠損又は低下させた遺伝子改変株が含まれる。

活性の強化とは、菌体外から微生物へ導入された遺伝子に基づいて当該微生物での酵素遺伝子（由来を問わず）の発現量が増大することを意味し、酵素をコードする遺伝子を微生物の菌体外から菌体内に導入することの他に、微生物がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化すること又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたもの、或いは当該酵素遺伝子のリプレッサー活性を低減化又は不活化することの結果として当該酵素活性を強化させることを含む。

遺伝子改変株は、メタクリリル−ＣｏＡ合成反応を阻害する酵素の活性を欠損又は低下させた遺伝子改変を行った改変株であってもよい。活性の「欠損」又は「低下」とは、当該微生物での当該酵素遺伝子の発現が全く無なくなるか減少することを意味し、当該酵素遺伝子に置換、欠失又は挿入が起こることの他に、微生物がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を低下させること又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子の発現を抑制させたもの、或いは当該酵素遺伝子のリプレッサー活性を強化又は活性化することの結果として当該酵素活性を低減させることを含む。なお、これらの遺伝子改変は、常法に従って行えばよい。

図２で示されるルートでメタクリル酸エステル製造を実施する場合の好ましい改変株としては、以下に示す（ａ）又は（ｂ）の少なくとも一方の特徴を有する改変株が挙げられる。
（ａ）ＢＣＫＡＤ遺伝子及び／又はＡＣＤ遺伝子が導入されたことにより、メタクリリル−ＣｏＡ生成活性が強化されている。
（ｂ）ＥＣＨ遺伝子、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子及び／又は３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠損又は不活化により、メタクリリル−ＣｏＡ生成活性が強化されている。欠損又は不活化は、遺伝子の全部又は塩基配列の一部に置換、欠失もしくは挿入により行う。

（２）挿入遺伝子
前記前駆体からメタクリリル−ＣｏＡを生成させるための酵素群の各遺伝子およびＡＡＴ遺伝子を必要に応じて宿主へ導入することが必要となる。宿主微生物が本来有する各種酵素はそのまま利用することも可能である。あるいは必要に応じて遺伝子導入により活性の強化することも可能である。

前記前駆体からメタクリリル−ＣｏＡを生成させるための酵素は宿主および合成ルートにより、適宜選択あるいは最適化され、特に限定されるものではないが、以下、ロドコッカス属微生物を宿主に用いて、図２で示されるルートによるメタクリル酸エステル生成に関して必要な酵素遺伝子について詳述する。

（２−１）アルコールアシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）
本発明において使用するＡＡＴは、メタクリリル−ＣｏＡとアルコールまたはフェノール類を原料にメタクリル酸エステルを製造する能力を有するものであれば、特に限定されず、その種類及び起源を問わない。植物由来のものが好ましく、代表的なものとして、上述のショウガ目、バラ目、ツツジ目、ウリ目、アブラナ目およびクスノキ目からなる群から選択されるいずれかの目に属に由来するものが挙げられる。

（２−２）アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）
本発明において使用するＡＣＤは、アシルＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡを生成する能力を有するものであれば、特に限定されず、その由来及び種類を問わない。微生物由来のものが好ましく、代表的なものとして、前記に示すとおりである。

より好ましくは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓに由来するものであり、好ましい株としては、ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ−４株、ロドコッカス・エリスロポリスＫＡ２−５−１株、ロドコッカス・エリスロポリスＩＧＴＳ８株、ロドコッカス・エリスロポリスＤ−１株、ロドコッカス・エリスロポリスＨ−２株、ロドコッカス・エリスロポリスＮ１−３６株、ロドコッカス・エリスロポリスＩ−１９株、ロドコッカス・エリスロポリスＥＣＲＤ−１株、ロドコッカス・エリスロポリスＢ１株、ロドコッカス・エリスロポリスＳＹ−１株、ロドコッカス・エリスロポリスＵＭ３株、ロドコッカス・エリスロポリスＵＭ９株又はロドコッカス・エスピーＴ０９株等が挙げられ、特に好ましくはロドコッカス・エリスロポリスＰＲ−４株が挙げられる。

ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ−４株由来ＡＣＤ遺伝子の塩基配列を配列番号３３に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号３２に示す。なお、本発明においてＡＣＤ遺伝子には、配列番号３２に示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、アシルＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡを生成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。また、本発明においてＡＣＤ遺伝子には、配列番号３２で示すアミノ酸配列からなるタンパク質と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９．５％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の同一性を示し、アシルＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡを生成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。

さらに、本発明においてＡＣＤ遺伝子には、配列番号３３に示す塩基配列に対する相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アシルＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡを生成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、本発明においてＡＣＤ遺伝子には、配列番号３３に示す塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、アシルＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡを生成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。また、上記ＡＣＤ遺伝子のコドンは、形質転換に用いる微生物のコドン使用頻度に合わせて変換されたものであっても良い。

上記ＡＡＴ遺伝子及び／又はＡＣＤ遺伝子をコードするＤＮＡをロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）に属する微生物に導入して、当該微生物内でタンパク質に転写翻訳させて使用する。当該微生物に導入されるＤＮＡは、ベクターに組み込まれた形態にあることが好ましい。

（３）組換え体微生物の作製
上記ＡＡＴ遺伝子及び／又はＡＣＤ遺伝子をコードするＤＮＡを宿主微生物に導入して、当該微生物内でタンパク質に転写翻訳させて使用する。当該微生物に導入されるＤＮＡは、ベクターに組み込まれた形態にあることが好ましい。すなわち、各遺伝子を前記宿主細胞で発現可能な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入する。

前記のベクターは、宿主微生物中で自立複製可能なものであり、ＡＡＴ遺伝子及び／又はＡＣＤ遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの微生物に適したベクターを用いることができる。ＤＮＡをロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）に属する微生物に導入するためのベクターとしては、例えばｐＫ１、ｐＫ２、ｐＫ３およびｐＫ４、並びにｐＳＪ０３４（特開平１０−３３７１８５号参照）、ｐＳＪ０２３およびｐＳＪ００２（特開平１０−２４８６７号を参照）、ｐＳＪ２０１およびｐＬＫ００５等（これらに限定されない）、公知のベクターを用いることができる。ｐＳＪ０２３は形質転換体Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３２）として産業総合技術研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。

上記ＡＡＴ遺伝子及び／又はＡＣＤ遺伝子のベクターへの挿入は、当業者に知られた遺伝子組換え技術を用いて行うことができる。例えば、制限酵素切断とライゲーションキットを用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎキット（タカラバイオ）等を利用することができる。ベクターに挿入される遺伝子は、宿主生物中で各遺伝子にコードされるタンパク質の転写翻訳を調節することが可能なプロモーターの下流に、連結して挿入される。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、必要に応じて、遺伝子を導入しようとする宿主生物において利用可能なターミネーター配列、エンハンサー配列、スプライシングシグナル配列、ポリＡ付加シグナル配列、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列、選択マーカー遺伝子などを連結することができる。選択マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子の他、アミノ酸や核酸等の栄養素の細胞内生合成に関与する遺伝子、あるいはルシフェラーゼ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子などを挙げることができる。挿入にともない、ＤＮＡがコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。

上記の点から、本発明においては、ベクターとしてｐＫ４に変異処理を行い取得したｐＬＫ００５を用いることが特に好ましい。ｐＬＫ００５のプロモーターの３’下流に配置されるようにＡＡＴ遺伝子又はＡＣＤ遺伝子を連結・挿入して、プロモーターによってＡＡＴ遺伝子又は／およびＡＣＤ遺伝子を発現する発現プラスミドベクターを構築することができる。

ベクターには、ＡＡＴ遺伝子群又はＡＣＤ遺伝子群より選択されるいずれか１個の遺伝子を挿入しても良いし、複数個の遺伝子を挿入しても良い。ベクターに挿入される遺伝子について用いられる場合「複数個」とは２〜５個、２〜４個、好ましくは２〜３個の遺伝子を挿入することが可能である。また、一つのベクターに複数個の遺伝子が挿入される場合、これらの遺伝子はオペロンを形成することが好ましい。ここで「オペロン」とは、同一のプロモーターの制御下に転写される１またはそれ以上の遺伝子から構成される核酸配列単位である。

上記の遺伝子、好ましくはベクターの形態にある遺伝子は、当業者に知られた方法によって、宿主微生物に導入される。宿主微生物への組換えベクターの導入方法としては、宿主微生物に適した方法であれば特に限定されるものではなく、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、接合伝達法等が挙げられる。

［メタクリル酸エステルの製造方法］
ＡＡＴ遺伝子及び／又はＡＣＤ遺伝子等の必要な遺伝子を導入した組換え微生物を前記前駆体と接触させ、メタクリル酸エステルを製造する。ここで、「接触」とは、微生物と物質（前駆体）を一定時間曝露処理することを意味する。具体的には、微生物を前駆体（原料）等を含む水性媒体中で培養すること、あるいは原料を含む水性媒体に微生物の培養物を添加し、懸濁混合し、水性媒体中及び／又は気相中にメタクリル酸エステルを得る。その際、微生物の増殖があっても構わない。該工程では、組換え微生物と、メタクリル酸エステルと、を含有する混合物が得られる。

「水性媒体」とは、水、あるいは水を主成分とする水溶液を指し、溶解していない液体・固体が分散したものも含む。「気相」とは培養槽（微生物を培養する容器）又は反応槽（反応を行う容器）において液体（培地等）が占める部分を除いた気体や水蒸気等が占める部分をいう。「培養物」とは、菌体、培養液、無細胞抽出液、細胞膜などの培養により得られるものを意味する。

（１）培養によるメタクリル酸エステルの製造
本発明において、メタクリル酸エステルの製造は、ＡＡＴ遺伝子が導入された遺伝子組換え微生物を、前記前駆体を含む水性媒体中で培養することによって培養菌体又は培養物中にメタクリル酸エステルを生成蓄積させ、該培養菌体又は培養物又は培養容器気相部からメタクリル酸エステルを回収することにより行われる。

微生物の培養に用いられる培地は、増殖可能な、少なくとも一種類の炭素源を含む十分な栄養素を含む固形培地又は液体培地である。前駆体が炭素源として使用可能な場合は炭素源として使用することも可能である。

培地中の炭素源あるいは前駆体の濃度は、メタクリル酸エステルを産生することができれば特に限定されない。濃度は、例えば、０．０５〜２０（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．１〜１５（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．２〜１０（ｗ／ｖ）％とされる。０．２（ｗ／ｖ）％以上用いるのは微生物のメタクリル酸産生能が上昇するからであり、１０（ｗ／ｖ）％以下とするのはそれ以上添加しても飛躍的な効果の上昇が認められないからである。

培養によるメタクリル酸エステルの製造には、目的のメタクリル酸エステルに応じて、アルコールあるいはフェノールを添加する。使用するアルコールまたはフェノールは式２に示すものが好ましい。

アルコールまたはフェノールの培地中における濃度は、メタクリル酸エステルを産生することができれば特に限定されない。濃度は、例えば、０．０１〜２０（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．０５〜１０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．１〜５（ｗ／ｖ）％とされる。また、これらは予め培地に添加しておくこともできるし、培養を行いながら連続的に又は２回以上に分けて間欠的に添加することもできる。

培地には、無機窒素源又は無機金属塩類等を添加しても良い。無機窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩等が用いられる。

窒素源の培地中における濃度は、メタクリル酸エステルを産生することができれば特に限定されない。濃度は、例えば、０．０１〜１０（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．０５〜８（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．１〜４（ｗ／ｖ）％とされる。

無機金属塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。

無機塩類の培地中における濃度は、メタクリル酸エステルを産生することができれば特に限定されない。濃度は、例えば、０．００１〜１．６（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．００５〜１．３（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．０１〜１（ｗ／ｖ）％とされる。０．０１（ｗ／ｖ）％以上用いるのは微生物のメタクリル酸エステル産生能が上昇するからであり、１（ｗ／ｖ）％以下とするのはそれ以上添加しても飛躍的な効果の上昇が認められないからである。

この他、培地には、微量金属、ビタミンなどが必要に応じて添加される。また、必要に応じて微生物の生育に必要な各種の有機物、無機物、界面活性剤あるいは通常用いられる消泡剤などを培地中に追添加することができる。

培地への遺伝子組換え微生物の播種は、従来公知の手法によって行えばよい。培養方法も、特に限定されず、振盪培養、通気撹拌培養及び静置培養などの公知手法を用いることができる。

培養条件は、遺伝子組換え微生物が生育し、かつメタクリル酸エステルを生成する限りにおいて特に限定されない。培養は、好気的条件下で行われても嫌気的条件下で行われてもよい。

ｐＨ、温度及び培養時間は、遺伝子組換え微生物が生育し、かつメタクリル酸エステルを生成し得る条件であれば特に限定されない。ｐＨは、好ましくは３〜１０、より好ましくは４〜９、さらに好ましくは５〜８とされる。温度は、好ましくは１０〜４５℃、より好ましくは１５〜４０℃、さらに好ましくは２０〜３５℃とされる。培養時間は、好ましくは１０〜１０００時間、より好ましくは１５〜４８０時間、さらに好ましくは２０〜２４０時間とされる。

これらの培養条件は、炭素源あるいは前駆体の利用量に対するメタクリル酸エステルの産生量の比率を最大化するように、菌株毎に適宜選択又は最適化される。なお、炭素源の量及び培養条件を適宜調整することで、メタクリル酸エステルの産生量を調整することもできる。

メタクリル酸エステルを０．００１ｍＭ以上蓄積させるための好適な条件としては、ｐＨ５．５〜７．５の条件下、培地中の炭素源あるいは前駆体の濃度を直接あるいは間接的に０．１％以上に、且つアルコールまたはフェノール類の濃度を直接あるいは間接的に０．１％以上に維持し、温度を２０〜４０℃の範囲に調整し、３時間以上反応させる。さらに、培養液中の微生物の濃度は、培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましく、例えば、乾燥重量として２ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られ、生成物の蓄積濃度を向上させることができる。

（２）休止菌体反応によるメタクリル酸エステルの製造
本発明に係るメタクリル酸エステルの製造方法では、上述のように、遺伝子組換え微生物の培養による方法の他に以下の方法も採用できる。遺伝子組換え微生物が増殖能を有していてもいなくてもよく、予め培養した培養物を前駆体を含む水性媒体に接触させ、実質的に増殖を伴わない休止菌体反応によりメタクリル酸エステルを産生させることもできる。

休止菌体反応に用いられる前記前駆体の濃度は、上記の培養によるメタクリル酸エステルの製造の場合と同様であってよい。休止菌体反応に用いられるアルコールあるいはフェノール及びその濃度は、上記の培養によるメタクリル酸エステルの製造の場合と同様であってよい。

反応液には、無機金属塩類等を添加しても良い。無機金属塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。

無機塩類の反応液中における濃度は、メタクリル酸エステルを産生することができれば特に限定されない。濃度は、例えば、０．０００１〜２（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．０００３〜１．３（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．００１〜１（ｗ／ｖ）％とされる。
この他、反応液には、微量金属、ビタミンなどが必要に応じて添加される。また、必要に応じて反応に必要な各種の有機物、無機物、界面活性剤あるいは通常用いられる消泡剤などを反応液中に追添加することができる。

休止菌体反応には、予め培養した遺伝子組換え微生物の培養液をそのまま用いるか、あるいはろ過又は遠心分離などで回収した菌体を使用する。回収した培養物は、適当な緩衝液等に再懸濁させ、任意の菌濃度にして用いることができる。緩衝液等には、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液及びホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液などが用いられる。

また、休止菌体反応には、回収した培養物の処理物（例えば、破砕物、粗酵素又は精製酵素など）を使用することもできる。さらに、公知の方法で適当な担体に固定化し、その固定化物を反応に使用してもよい。

反応条件は、メタクリル酸エステルを生成する限りにおいて特に限定されない。反応は、好気的条件下で行われても嫌気的条件下で行われてもよい。反応方法も、特に限定されず、振盪反応、通気撹拌反応及び静置反応などの公知手法を用いることができる。

ｐＨ、温度及び反応時間は、メタクリル酸を生成し得る条件であれば特に限定されない。ｐＨは、好ましくは３〜１０、より好ましくは４〜９、さらに好ましくは５〜８とされる。温度は、好ましくは１０〜４５℃、より好ましくは１５〜４０℃、さらに好ましくは２０〜３５℃とされる。反応時間は、好ましくは５〜１８０時間、より好ましくは１０〜１５０時間、さらに好ましくは１５〜１２０時間とされる。

これらの反応条件は、メタクリル酸エステルの産生量の比率を最大化するように、菌株毎に適宜選択又は最適化される。なお、反応条件を適宜調整することで、メタクリル酸エステルの産生量を調整することもできる。

メタクリル酸エステルを０．００１ｍＭ蓄積させるための好適な条件としては、ｐＨ５．５〜７．５の条件下、培地中の炭素源あるいは前駆体の濃度を直接あるいは間接的に０．１％以上に、且つアルコールまたはフェノール類の濃度を直接あるいは間接的に０．１％以上に維持し、温度を２０〜４０℃の範囲に調整し、３時間以上反応させる。さらに、反応液中の微生物の濃度は高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましく、例えば、乾燥重量として２ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られ、生成物の蓄積濃度を向上させることができる。

本発明に係るメタクリル酸エステルの製造方法においては、上述した培養によるメタクリル酸エステルの製造と休止菌体反応によるメタクリル酸エステルの製造を適宜組み合わせて行ってもよい。２つの方法を組み合わせることによって、より効率的なメタクリル酸エステルの生産が可能となる。

（３）メタクリル酸エステルの回収
培地中又は反応液中に生成したメタクリル酸エステル及びその生成量は、高速液体クロマトグラフィー及びＬＣ−ＭＳなどの通常の方法を用いて検出し、測定することができる。また、培養容器又は反応容器の気相部（ヘッドスペース部）に揮発したメタクリル酸エステル及びその生成量は、ガスクロマトグラフィーなどの通常の方法を用いて検出し、測定することができる。
メタクリル酸エステルは、ろ過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換又は吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出、蒸留及び結晶化などの周知の操作を必要に応じて適宜組み合わせて用いることにより、培地又は反応液中から分離・精製できる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。

［実施例１：メタクリル酸イソブチルの合成］
バナナの皮を取り除き、果肉をカッターで約１ミリ厚さにスライスし、さらにそれを４分割した。スライスしたバナナ２ｇ、２．３ｍＭメタクリリル−ＣｏＡおよび０．３５ＭＫＣｌを含む溶液２ｍｌおよび５μｌイソブチルアルコールを１００ｍｌフラスコに順に加えた。密閉し、３０℃で反応させた。１、２または３時間後の生成したメタクリル酸イソブチルを含む反応混合物を、１００ｍｌフラスコのヘッドスペース１５０μｌを採取して以下のＧＣ条件にて分析を行った。その結果を表１に示す。

ＧＣ分析条件
カラム：ＤＢ−ＷＡＸ， ３０ｍ×０．３２ｍｍ
カラム温度：５０℃・５ｍｉｎ→５℃／ｍｉｎ→１００℃（計１５ｍｉｎ）
キャリアガス：Ｈｅ
Ｉｎｊｅｃｔ：２００℃ スプリットレス（サンプリングタイム１ｍｉｎ）
Ｄｅｔｅｃｔ：２５０℃ ＦＩＤ 注入量：１５０μｌ

なお、メタクリル酸エステルの濃度は、初めに濃度既知の水溶液を調整し、１００ｍｌフラスコに同水溶液を２ｍｌ入れ、３０℃で３０ｍｉｎインキュベートした後にヘッドスペースを同様の方法で採取してＧＣ分析し、検量線を作成して算出した。

［実施例２：メタクリル酸ブチルの合成］
イソブチルアルコールの代わりにｎ−ブチルアルコールを用いた以外は実施例１と同様に実施した。その結果を表２に示す。

［実施例３：メタクリル酸ブチルの合成２］
表３に示す植物片を２ｇ、２．３ｍＭメタクリリル−ＣｏＡおよび０．３５Ｍ ＫＣｌを含む溶液２ｍｌおよび１０μｌのｎ−ブチルアルコールを１００ｍｌフラスコに順に加えた。密閉し、３０℃で反応させた。メタクリル酸エステルの分析は実施例１と同様に実施した。その結果を表３に示す。

［実施例４：メタクリル酸エチルの合成］
表４に示す植物片を２ｇ、２．３ｍＭ メタクリリル−ＣｏＡおよび０．３５Ｍ ＫＣｌを含む溶液２ｍｌおよび６．４μｌ エチルアルコールを１００ｍｌフラスコに順に加えた。密閉し、３０℃で反応させた。メタクリル酸エステルの分析は実施例１と同様に実施した。その結果を表４に示す。

［実施例５：メタクリル酸メチルの合成］
表５に示す植物片を２ｇ、２．３ｍＭメタクリリル−ＣｏＡおよび０．３５Ｍ ＫＣｌを含む溶液２ｍｌおよび４．４μｌ メチルアルコールを１００ｍｌフラスコに順に加えた。密閉し、３０℃で反応させた。メタクリル酸エステルの分析は実施例１と同様に実施した。その結果を表５に示す。

［参考例１：コンピテントセルの作製］
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ）１ｍＬに接種し３７℃、５時間好気的に前培養し、この培養物 ０．４ｍＬをＳＯＢ培地４０ｍＬ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に加え、１８℃で２０時間培養した。この培養物を遠心分離により集菌した後、冷却したＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、４０ｍＭ ＭｎＣｌ_２）を１３ｍＬ加え、０℃で１０分間放置した。その後、再度遠心し、上澄を除いた後、沈殿した大腸菌を冷ＴＦ溶液３．２ｍＬに懸濁し、０．２２ｍＬのジメチルスルフォキシドを加え０℃で１０分間放置し、コンピテントセルを作製した。

［実施例６：植物由来ＡＡＴ遺伝子が導入された大腸菌組換え体の作製］
配列番号２、４及び６に示される植物由来ＡＡＴ遺伝子をタカラバイオ株式会社で委託合成した。
リンゴＡＡＴ（ＭｐＡＡＴ１）：アミノ酸配列（配列番号１）、塩基配列（配列番号２）
イチゴＡＡＴ（ＳＡＡＴ）：アミノ酸配列（配列番号３）、塩基配列（配列番号４）
イチゴＡＡＴ（ＶＡＡＴ）：アミノ酸配列（配列番号５）、塩基配列（配列番号６）

これらの合成した遺伝子断片はベクターｐＭＤ１９に挿入され、それぞれｐＡＡＴ００１〜００３と命名した。（表６）これらのｐＡＡＴ００１〜００３を鋳型にして、ＡＡＴ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようオリゴヌクレオチドを設計し、ＰＣＲ法により調製した。

オリゴヌクレオチドプライマー
ＭＭＡ−０４４：５’−ＧＴＴＴＧＣＡＣＧＣＣＴＧＣＣＧＴＴＣＧＡＣＧ−３’（配列番号１１）
ＭＭＡ−０４５：５’−ＣＧＧＴＡＣＧＣＧＣＧＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１２）

反応液組成
滅菌水 ２２ μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ社製） ２５ μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ １ μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ １ μＬ
ゲノムＤＮＡ １ μＬ
総量 ５０ μＬ

温度サイクル
９８℃ １０秒、５５℃ １５秒及び７２℃ １５０秒の反応を３０サイクル

得られた増幅産物のバンドをＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製した各ＤＮＡを制限酵素ＰａｇＩ（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ中に切断認識部位が含まれる）およびＳｓｅ８３８７Ｉ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ中に切断認識部位が含まれる）で切断した。アガロースゲル電気泳動により分離を行い、ゲルから目的のバンドを切り出し、精製を行った。精製にはＧｅｌ／ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ社製）を用い、３０μＬの滅菌水に溶出した。

精製したＤＮＡ（５μＬ）、ＮｃｏＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで予め消化しておいたベクターｐＴｒｃ９９Ａ（１μＬ）、蒸留水（４μＬ）およびｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μＬ）を混合し１２時間、１６℃でインキュベートすることでＰＣＲ増幅産物とベクターをライゲーションした。

参考例１の方法で作製したコンピテントセル２００μＬに上記のライゲーション溶液を１０μＬ加え、０℃で３０分放置後、４２℃で３０秒間ヒ−トショックを与え、０℃で２分間冷却後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコ−ス、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）１ｍＬを添加して３７℃にて１時間振盪培養した。

培養後、１００μＬずつＬＢＡｍｐ寒天培地（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、１．５％寒天を含有するＬＢ培地）に塗布し、さらに３７℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニー複数個を１．５ｍＬのＬＢＡｍｐ培地（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養し、集菌後ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。

得られた組換え各プラスミドＤＮＡについて、その塩基配列をＣＥＱ ＤＴＣＳ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔおよび蛍光シ−ケンサＣＥＱ ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ（いずれもＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ、米国）を用いて確認し、プラスミドｐＡＡＴ１０１〜ｐＡＡＴ１０３と命名した（表６）。

ｐＥＴ１６ｂベクターについても同様の操作によりＡＡＴ遺伝子を挿入し、得られたプラスミドをｐＡＡＴ２０１〜ｐＡＡＴ２０３と命名した（表６）。ただし、ｐＥＴ１６ｂにはＳｓｅ８３８７Ｉ部位が無いため、ｐＥＴ１６ｂのＢａｍＨＩ部位にＳｓｅ８３８７Ｉ切断配列を含むリンカーを挿入したものを予め作製し、これをベクターとして用いた。

プラスミドｐＡＡＴ１０１〜ｐＡＡＴ１０３はＪＭ１０９株に導入し、組換え体ＪＭ１０９／ ｐＡＡＴ１０１〜ｐＡＡＴ１０３を得た。プラスミドｐＡＡＴ２０１〜ｐＡＡＴ２０３はＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、組換え体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＡＴ２０１〜ｐＡＡＴ２０３を得た。

［実施例７：ＡＡＴ遺伝子を発現させた大腸菌組換え体からの細胞抽出液の調製］
（１）ｐＴｒｃ９９Ａをベクターとして用いた大腸菌組換え体の培養
実施例６で得られた大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＡＡＴ１０１〜ｐＡＡＴ１０３を１ｍｌの１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃にて７時間前培養を行った。培養液を０．１ｍｌ取り、１００ｍｌの同培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭＩＰＴＧ含有）に加え、３７℃にて１５時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。対照株としてＪＭ１０９／ｐＴｒｃ９９Ａを用いた。

（２）ｐＥＴ１６ｂをベクターとして用いた大腸菌組換え体の培養
実施例６で得られた大腸菌組換え体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＡＴ２０１〜ｐＡＡＴ２０３を１ｍＬの１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃にて１４時間前培養を行った。培養液を０．１ｍＬ取り、１００ｍＬの同培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）に加え、３７℃にてＯＤが０．３になるまで振盪培養した後、終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し更に数時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液にＯＤ６（６３０ｎｍ）になるよう懸濁した。対照株としてＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ１６ｂを用いた。

（３）細胞抽出液の調製
得られた菌体懸濁液から細胞抽出液を調製した。超音波破砕機ＶＰ−１５Ｓ（タイテック、日本）を用いて、出力コントロ−ル４、ＤＵＴＹ ＣＹＣＬＥ ４０％、ＰＵＬＳ、ＴＩＭＥＲ＝Ｂモ−ド１０ｓの条件で菌体懸濁液を氷冷しながら１分間破砕した。次に遠心分離を行い（１０，０００×ｇ、５分間、４℃）、得られた上清（細胞抽出液）１ｍｌを採取した。

［実施例８：ＡＡＴ遺伝子組換え体細胞抽出液を用いたメタクリル酸ブチルの合成］
実施例７に記載された方法で調製された細胞抽出液を用いて以下の反応を行った。反応液の終濃度が７ｍＭメタクリリル−ＣｏＡと４０．５ｍＭｎ−ブタノールとなるようにメタクリリル−ＣｏＡとアルコールの溶液が０.８ｍｌ入った１０ｍｌ容量のセプタム付サンプル瓶（ＧＣ用）に、０．２ｍｌの細胞抽出液を添加することにより反応を開始した。セプタム付サンプル瓶を３０℃で１〜５時間インキュベートして反応させた。

セプタム付サンプル瓶のヘッドスペースの気体を実施例１と同様に分析した。結果を表７に示した。

［実施例９Ａ：ＡＡＴ遺伝子組換え体細胞抽出液を用いたメタクリル酸エステルの合成］
アルコールとして、メタノール、エタノールまたはｎ−ブタノールを用い、細胞抽出液に、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＡＴ２０１（リンゴ）由来のものを用いて、実施例８と同様にして反応を行った。表８に５時間後の生成物の分析結果を示した。

［実施例９Ｂ：ＡＡＴ遺伝子組換え体細胞抽出液を用いたメタクリル酸エステルの合成２］
アルコールとして、イソブタノール、フェノール、ベンジルアルコールまたは２−エチルヘキシルアルコールを用い、実施例７で得られたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＡＴ２０１（リンゴ）の細胞抽出液で以下の反応を行った。

反応液の終濃度が１ｍＭメタクリリル−ＣｏＡと４０ｍＭアルコールとなるようにメタクリリル−ＣｏＡとアルコールを含む０.８ｍｌの溶液が入った１０ｍｌ容量のセプタム付サンプル瓶（ＧＣ用）に、０．２ｍｌの細胞抽出液を添加することにより反応を開始した。
セプタム付サンプル瓶を３０℃で１〜５時間インキュベートして反応させた。反応終了後、セプタム付サンプル瓶中の反応液に１ｍＬのアセトニトリルを添加しよく混和した。その後、シリンジフィルターＤＩＳＭＩＣ／穴径０．４５μｍ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過後、ＨＰＬＣ分析に供した。表９に５時間後の生成物の分析結果を示した。

ＡＡＴ遺伝子組換え体を用いたメタクリル酸エステル（メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸フェニル、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸２−エチルヘキシル）の合成

ＨＰＬＣ分析条件
装置：Ｗａｔｅｒｓ ２６９５
カラム：Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０ ５μｍ
移動相：６５％ＭｅＯＨ, ０．２％リン酸
流量：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３５℃
検出：ＵＶ ２１０ ｎｍ
注入量：１０μＬ

［実施例１０：ＡＣＤ遺伝子が導入された大腸菌組換え体の作製］
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１からのＡＣＤホモログ遺伝子のクローニングと高発現組換え体の作製
（１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１からのゲノムＤＮＡの調製
ＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）上で生育させたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１株（ＮＢＲＣ１０６０５２）を１０ｍｌのＬＢ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、０．５％ＮａＣｌ）に植菌し、３７℃にて１５時間振盪培養を行った。培養終了後、２ｍｌの培養液より菌体を遠心により回収し、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ株式会社）を用いてゲノムＤＮＡ１００μｌを取得した。

（２）発現ベクターへのクローニング
得られたゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＡＣＤをコードすることが推定された遺伝子を含むＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようＰＣＲ法により調製した。

オリゴヌクレオチドプライマー
ＭＭＡ−００３： ５’− ＧＡＣＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＣＧＡＣＣＴＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＣ −３’ （配列番号１３）
ＭＭＡ−００４： ５’− ＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＧＡＴＧＧＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣ −３’（配列番号１４）

反応液組成
滅菌水 ２２ μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ社製） ２５ μｌ
ＭＭＡ−００３（配列番号１３） １ μｌ
ＭＭＡ−００４（配列番号１４） １ μｌ
ゲノムＤＮＡ １ μｌ
総量 ５０ μｌ

温度サイクル
９８℃ １０秒、５５℃ １５秒及び７２℃ １５０秒の反応を３０サイクル

得られた約１．２ｋｂの増幅産物のバンドをＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ（オリゴヌクレオチドＭＭＡ−００３中に切断認識部位が含まれる）およびＳｓｅ８３８７Ｉ（オリゴヌクレオチドＭＭＡ−００４中に切断認識部位が含まれる）で消化し、フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿により精製した。精製したＤＮＡ（５μｌ）、ＮｃｏＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで予め消化しておいたベクターｐＴｒｃ９９Ａ（１μｌ）、蒸留水（４μｌ）およびｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μｌ）を混合し１２時間、１６℃でインキュベ−トしてＰＣＲ増幅産物とベクターをライゲーションした。

参考例１の方法で作製したコンピテントセル ２００μｌに上記のライゲーション溶液を１０μｌ加え、０℃で３０分放置後、４２℃で３０秒間ヒ−トショックを与え、０℃で２分間冷却後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭ グルコ−ス、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）１ｍｌを添加して３７℃にて１時間振盪培養した。

培養後、２００μｌずつＬＢＡｍｐ寒天培地（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ、１．５％寒天を含有するＬＢ培地）に塗布し、さらに３７℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニ−複数個を１．５ｍｌのＬＢＡｍｐ培地（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養し、集菌後、Ｆｌｅｘｉ Ｐｒｅｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。

（３）形質転換
得られた組換えプラスミドＤＮＡについて、その塩基配列をＣＥＱ ＤＴＣＳ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔおよび蛍光シ−ケンサＣＥＱ ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ（いずれもＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ、米国）を用いて確認し、プラスミドｐＭＭＡ００２と命名した。プラスミドｐＭＭＡ００２を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ＡＣＤ遺伝子（配列番号８）が導入された組換え体を作製した。アミノ酸配列は、配列番号７で示される。

［実施例１１：ＡＣＤ遺伝子を発現させた大腸菌組換え体からの細胞抽出液の調製］
実施例１０で得られたＡＣＤ遺伝子（配列番号８）が導入された大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＭＭＡ００２を１ｍｌの１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃にて７時間前培養を行った。培養液を０．１ｍｌ取り、１００ｍｌの同培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭＩＰＴＧ含有）に加え、３７℃にて１５時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液にＯＤ６（６３０ｎｍ）になるよう懸濁した。対照株としてＪＭ１０９／ｐＴｒｃ９９Ａを用いた。

得られた菌体懸濁液から以下のようにして細胞抽出液１ｍｌを調製した。超音波破砕機ＶＰ−１５Ｓ（タイテック、日本）を用いて、出力コントロ−ル４、ＤＵＴＹ ＣＹＣＬＥ ４０％、ＰＵＬＳ、ＴＩＭＥＲ＝Ｂモ−ド１０ｓの条件で氷冷しながら１分間破砕した。次に遠心分離を行い（１０，０００×ｇ、５分間、４℃）、得られた上清を細胞抽出液として採取した。

［実施例１２：ＡＣＤ遺伝子組換え体細胞抽出液と植物片を用いた、イソブチリル−ＣｏＡからメタクリル酸ブチルの合成］
（１）ＡＣＤ遺伝子組換え体細胞抽出液による、イソブチリル−ＣｏＡを基質としたメタクリリル−ＣｏＡ合成反応：
１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中に６ｍＭの１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチル硫酸塩、０．４ｍＭのフラビンアデニンジヌクレオチドおよび１ｍＭのイソブチリル−ＣｏＡを含む溶液１．８４ｍｌに、実施例１０で得られたＡＣＤ活性を有する細胞抽出液０．１６ｍｌを加え、反応液２ｍｌに調整した。３７℃で３０分間反応させ、以下に示すＨＰＬＣ条件にて分析を行った。その結果、イソブチリル−ＣｏＡのピークは消失し、メタクリリル−ＣｏＡの生成を確認した。

ＨＰＬＣ分析条件
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３Ｖ，４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
移動相：３０％ ＭｅＯＨ，５０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４，ｐＨ５．７
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ カラム温度：３５℃ 検出：ＵＶ ２５４ｎｍ
注入量１０μｌ 反応溶液を移動相で１０倍希釈し測定。

（２）メタクリリル−ＣｏＡ合成反応液への、ｎ−ブチルアルコールと植物片の添加によるメタクリル酸ブチルの合成
バナナの皮を取り除き、果肉をカッターで約１ミリ厚さにスライスし、さらにそれを４分割した。スライスしたバナナ１ｇ、前記メタクリリル−ＣｏＡ合成反応液０．９ｍｌ、３．５Ｍ ＫＣｌ溶液０．１ｍｌおよび５μｌのｎ−ブチルアルコールを５０ｍｌフラスコに加え、密閉し、３０℃で２時間反応させた。実施例１と同様にメタクリル酸エステルの分析を実施したところ、０．０１５ｍＭのメタクリル酸ブチルが生成していた。

［実施例１３：ＥＣＨ遺伝子が導入された大腸菌組換え体の作製］
（１）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌からのゲノムＤＮＡの調製
ＬＢ寒天培地培地上で生育させたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＰＲ４株（ＮＢＲＣ１００８８７）を１０ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３０℃にて３６時間振盪培養を行った。培養終了後、２ｍＬの培養液より菌体を遠心により回収し、実施例１０と同様にしてゲノムＤＮＡ１００μＬを取得した。

（２）発現ベクターへのクローニング
得られたゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＥＣＨ遺伝子をコ−ドすることが推定された塩基配列を含むＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようＰＣＲ法により調製した。

オリゴヌクレオチドプライマー：
ＭＭＡ−０３１： ５’−ＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣ −３’ （配列番号１５）
ＭＭＡ−０３２： ５’−ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＣ −３’（配列番号１６）

実施例１０と同様にしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡを制限酵素ＢｓｐＨＩ（オリゴヌクレオチドＭＭＡ−０３１中に切断認識部位が含まれる）およびＳｓｅ８３８７Ｉ（オリゴヌクレオチドＭＭＡ−０３２中に切断認識部位が含まれる）で切断した。切断後、実施例６と同様の操作を行い、ＥＣＨ遺伝子（配列番号１０）が組み込まれた目的プラスミドＤＮＡを取得し、プラスミドｐＭＭＡ０１１と命名した。アミノ酸配列は、配列番号９で示される。

（３）形質転換
プラスミドｐＭＭＡ０１１を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ＥＣＨ遺伝子発現大腸菌組換え体を作製した。

［実施例１４：ＥＣＨ遺伝子発現大腸菌組換え体細胞抽出液およびＡＡＴ遺伝子組換え体細胞抽出液を用いた、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからメタクリル酸ブチルの合成］
（１）ＥＣＨ活性を有する細胞破砕液の調製
実施例１３で得られたＥＣＨ遺伝子が導入された大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＭＭＡ０１１を２ｍｌの１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃にて２４時間前培養を行った。培養液を０．１ｍｌ取り、１００ｍｌの同培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭＩＰＴＧ含有）に加え、３７℃にて２４時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した後、同緩衝液にＯＤ６（６３０ｎｍ）となるように希釈した。

得られた菌体懸濁液から以下のようにして細胞破砕液１ｍｌを調製した。超音波破砕機Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０Ｄ（ブランソン、米国）を用いて、アンプリチュード（振幅）：１５％／Ｏｎ：１秒，ｏｆｆ：１秒の条件で氷冷しながら５分間破砕した。

（２）ＥＣＨ遺伝子発現大腸菌組換え体細胞破砕液を用いたメタクリリル−ＣｏＡ合成反応
０．５Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．２ｍｌ、１．２ｍＭの３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水溶液０．４ｍｌおよび１．２ｍｌの水を混合したものに、上記のようにして得られたエノイルＣｏＡヒドラターゼ活性を有する細胞破砕液０．２ｍｌを加え、反応液２ｍｌに調整した。３７℃で３０分間反応させ、実施例１２示すＨＰＬＣ条件にて分析を行った。その結果、メタクリリル−ＣｏＡの生成を確認した。

（３）ＡＡＴ遺伝子組換え体細胞抽出液を用いたメタクリル酸ブチルの合成
１０ｍｌ容サンプル瓶に前記メタクリリル−ＣｏＡ合成反応液０．４ｍｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．１ｍｌおよび０．２ｍｌの水を加え、さらに０．４Ｍｎ−ブタノール溶液０．１ｍｌおよび実施例７と同様に調製したリンゴＡＡＴ（ＭｐＡＡＴ）細胞破砕液０．２ｍｌを加え、密閉し、３０℃で３時間反応させた。実施例１と同様にメタクリル酸エステルの分析を実施したところ、０．００１ｍＭのメタクリル酸ブチルが生成していた。

［実施例１５：ＢＣＫＡＤ遺伝子のクローニングと高発現組換え体の作製、細胞抽出液の調製、及びタンパク質の発現解析］
遺伝子のクローニングと発現プラスミドの作製および組換え体の作製は、実施例１０と同様にして行った。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＢＣＫＡＤ複合体遺伝子をコードする遺伝子オペロン全体を含むＤＮＡ断片を、以下に示すプライマーを用いてＰＣＲ法により調製した。得られた断片を制限酵素ＢｓｐＨＩとＳｓｅ８３８７Ｉにより消化し、実施例１０と同様にしてベクターｐＴｒｃ９９Ａに挿入して組換えプラスミド（ｐＷＡ１０８）を得た。

オリゴヌクレオチドプライマー：
ＭＡＡ−１５：５’−ＧＧＣＣＴＧＴＣＡＴＧＡＧＴＧＡＴＴＡＣＧＡＧＣＣＧ−３’（配列番号１７）
ＭＡＡ−１６：５’−ＣＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＧＣＧＧＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＴＧＣ−３’（配列番号１８）

上記のようにして得られた大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＷＡ１０８を実施例１０と同様にして培養を行った。ただし、本組換え体の場合には、予備検討結果から、ＩＰＴＧの添加を行わなくても高いタンパク質の発現が認められたことから、ＩＰＴＧの添加を行わないで実施した。細胞抽出液の調製は、実施例１１と同様に実施した。

［実施例１６：ＢＣＫＡＤ遺伝子高発現組換え体の細胞抽出液の活性測定］
ＢＣＫＡＤ活性は、以下のように２−オキソイソ吉草酸を基質としたイソブチリル−ＣｏＡの生成により測定した。

１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に終濃度がそれぞれ１ｍＭＭｇＣｌ２、０．２ｍＭチアミンピロリン酸、１ｍＭＣｏＡ−ＳＨ及び２ｍＭＤＴＴを含む溶液０．７ｍＬに、実施例１５で得られた細胞抽出液０．２ｍＬを加え、０．９ｍＬとした。これに２−オキソイソ吉草酸カルシウム塩０．１ｍＬ（終濃度４ｍＭ）を加え３７℃で３０分間反応後、セントリカット超ミニＷ−１０（倉敷紡績株式会社）を用いた限外濾過を行った。除タンパク質を行うことにより反応を停止させ、以下の条件にてＨＰＬＣによる分析を行った。その結果、ＪＭ１０９／ｐＷＡ１０８では０．８３ｍＭのイソブチリル−ＣｏＡの生成が認められた。

ＨＰＬＣ分析条件
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３Ｖ，４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
移動相：３５％ＭｅＯＨ，５０ｍＭＨ３ＰＯ４，ｐＨ５．７
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ カラム温度：３５℃ 検出：ＵＶ２５４ｎｍ（２１０ｎｍ）
注入量：１０μｌ（反応溶液を移動相で１０倍希釈し測定）

［実施例１７：ＢＣＫＡＤ遺伝子高発現組換え体およびＡＣＤ遺伝子を発現させた組換え体からの細胞抽出液混合物による２−オキソイソ吉草酸からのメタクリリル−ＣｏＡの合成（図１）］
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に終濃度がそれぞれ１ｍＭＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭチアミンピロリン酸、１ｍＭＣｏＡ−ＳＨ、２ｍＭＤＴＴ、２ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、０．０４ｍＭフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、２ｍＭバリンを含む溶液０．６ｍＬに、実施例１１及び実施例１５の方法で得られた細胞抽出液（ＪＭ１０９／ｐＭＭＡ００２及びＪＭ１０９／ｐＷＡ１０８）各０．１ｍＬを加え、０．８ｍＬとした。これに２−オキソイソ吉草酸カルシウム塩０．１ｍＬ（終濃度４ｍＭ）を加え３７℃で３０分間反応後、ＨＰＬＣによりイソブチリル−ＣｏＡの生成を確認するとともに、０．１ｍＬの１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチル硫酸塩（終濃度６ｍＭ）を加え更に３時間反応させた。反応後、セントリカット超ミニＷ−１０（倉敷紡績株式会社）を用いた限外濾過を行った。除タンパク質を行うことにより反応を停止させ、ＨＰＬＣによる分析を行った。その結果、０．２ｍＭのメタクリリル−ＣｏＡの生成が認められた。

［参考例２：接合伝達用レシピエントＰＲ４ＫＳの作製］
ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＰＲ４（製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門；受託番号：ＮＢＲＣ １００８８７）を特開２０１１‐２００１３３号公報に記載の方法により改変し、１２０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールに耐性を示し、且つカナマイシン耐性遺伝子を欠失した誘導株を作製し、ＰＲ４ＫＳ株と命名した。

具体的には、クロラムフェニコール耐性を強化するために、ＭＹＫ培地（０．５％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、０．３％ ｂａｃｔ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．３％ ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．２％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２％ Ｋ_２ＨＰＯ_４）中のクロラムフェニコールの濃度を１０ｍｇ／ｍＬから始めて１２０ｍｇ／ｍＬまで段階的に徐々に高めつつ、ＰＲ４株を継体培養することにより自然変異を誘発し、１２０ｍｇ／ｍＬのクロラムフェニコールに耐性を有する誘導株ＲｈＣｍＳＲ−０９株を得た。

次いで、上記ＲｈＣｍＳＲ−０９株を、特開２０１１‐２００１３３号公報に記載のカナマイシン耐性遺伝子欠失変異導入用プラスミドｐＫＭ０４３を保有する大腸菌株と１：１の比率で混合して培養し、接合伝達によりＲｈＣｍＳＲ−０９株内にｐＫＭ０４３を導入後、カナマイシン硫酸塩２００ｍｇ／Ｌ及びクロラムフェニコール５０ ｍｇ／Ｌ含有ＭＹＫ寒天培地（０．５％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、０．３％ ｂａｃｔ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．３％ ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．２％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２％ Ｋ_２ＨＰＯ_４、１．５％寒天）にて培養することにより、ｐＫＭ０４３がＲｈＣｍＳＲ−０９株ゲノム内に挿入された相同組換え株を得た。前記相同組換え株を、１０％スクロース含有ＭＹＫ寒天培地にて培養し、得られたコロニーの中からカナマイシン感受性株となった誘導株、すなわちカナマイシン耐性遺伝子欠失変異誘導株ＰＲ４ＫＳ株を得た。

［参考例３：ＬｉｇＤホモログ遺伝子のクローニングと遺伝子欠失用プラスミドの作製］
ＰＲ４ＫＳ株のＬｉｇＤホモログ遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ： ＹＰ＿００２７６７９６９）を標的遺伝子とした。ＬｉｇＤホモログ遺伝子周辺配列を含む約５．４ ｋｂのＤＮＡをＰＣＲにより増幅後、特開２０１１‐２００１３３号公報に記載された、ｓａｃＢ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子の下流且つ同方向に導入されたプラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１にクローニングし、プラスミドｐＴＪ００１を得た。ＰＣＲ条件は以下の通りである。

プライマー
ＧＢ−１３８： ５’− ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣＣＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＧＴＧＴＣ −３’ （配列番号１９）
ＧＢ−１３９： ５’− ＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＣＣＡＡＴＧＣＧ −３’（配列番号２０）

反応液組成：
滅菌水 ２２ μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ社製） ２５ μｌ
ＧＢ−１３８（配列番号１９） １ μｌ
ＧＢ−１３９（配列番号２０） １ μｌ
ＰＲ４ＫＳゲノム（５０ ｎｇ／μｌ） １ μｌ
総量 ５０ μｌ

温度サイクル
９８℃ １０秒、５５℃ １０秒及び７２℃ １２０秒の反応を３５サイクル

ｐＴＪ００１内部のＬｉｇＤホモログ遺伝子全長（約２．３ ｋｂ）を欠失させＬｉｇＤホモログ遺伝子の上流及び下流配列のみを残存させた、ＬｉｇＤホモログ遺伝子欠失用プラスミドｐＴＪ００２を作製した（図３参照）。ｐＴＪ００２は、標的であるＬｉｇＤホモログ遺伝子の開始コドン付近の配列と終始コドン付近の配列の両方を含み、それぞれ開始コドンから上流方向又は終始コドンから下流方向に伸長するように設計されたプライマーＧＢ−１４０とＧＢ−１４１によりｐＴＪ００１内部の配列を増幅することにより得られたＬｉｇＤホモログ遺伝子を含まないＰＣＲ産物により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して、環状ＤＮＡとすることにより取得した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。

プライマー
ＧＢ−１４０： ＧＡＧＧＡＡＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＧＣＧＡＧＡＡＴＡＧＧＴＴＧ （配列番号２１）
ＧＢ−１４１： ＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＡＴＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧ （配列番号２２）

反応液組成
滅菌水 ２２ μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ社製） ２５ μｌ
ＧＢ−１４０（配列番号２１） １ μｌ
ＧＢ−１４１（配列番号２２） １ μｌ
ｐＴＪ００１ １ μｌ
総量 ５０ μｌ

温度サイクル
９８℃ １０秒、５０度 １０秒及び７２℃ １８０秒の反応を３０サイクル

ＰＣＲ終了後、サンプル１μｌを用い、０．７％アガロースゲル電気泳動により断片の確認を行ったところ、断片の増幅が認められた。上記プラスミドｐＴＪ００２製造手順において、ＰＲ４株からのゲノム抽出にはＷｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を、制限酵素により切断したＤＮＡ断片及びＰＣＲ産物の精製にはＧｅｌ／ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ社製）を、ＤＮＡ同士の接続にはＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を、プラスミドの抽出にはＱＩＡｐｒｅｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。

［参考例４：ＰＲ４ＫＳのＬｉｇＤホモログ遺伝子欠失誘導株の作製］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１λｐｉｒをｐＴＪ００２により形質転換したものをドナーとし、参考例２の方法により得られたＰＲ４ＫＳをレシピエントとして、特開２０１１‐２００１３３号公報に記載の方法と同様に接合伝達を行い、相同組換えによって生じた１３株のＬｉｇＤホモログ遺伝子欠失誘導株を得た。前記欠失誘導株から１株を選び、ＰＲ４ＫＳΔlｉｇＤ誘導株と命名した。

［参考例５：ロドコッカス属細菌用プラスミドｐＬＫ００５及びそれを用いたニトリルヒドラターゼ発現用プラスミドｐＳＪ２０１の作製］
（１）ｐＬＫ００５の取得と解析
ｐＫ４（特開平５−６４５８９号公報参照）を用いて、上記エレクトロポレーション法によりロドコッカス ｓｐ Ｎ７７５（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−９６１）を形質転換した。得られた形質転換体を１０ｍｌのＭＹＫ培地に植菌し、３０℃にて１日培養した。これをクリーンベンチ内で紫外線を照射することにより変異処理を行った。変異処理を行った培養液を５０〜４００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃にて３日間培養した。

寒天培地上に現れた複数のコロニーをそれぞれＭＹＫ培地にて培養し、形質転換体よりプラスミドを回収した。回収したプラスミドを用いてロドコッカス ｓｐ Ｎ７７５を再度形質転換して、形質転換体のカナマイシン耐性度が向上しているかどうかを調べた。その結果、明らかにカナマイシン耐性度が向上している形質転換体が数株認められた。

カナマイシン耐性度が向上することが認められたプラスミドの塩基配列を調べたところ、ｐＫ４のカナマイシン耐性遺伝子の上流域の配列に変化が起こっていること（８塩基配列ＧＴＴＧＴＡＧＧの重複）が認められた。このカナマイシン耐性度が向上することが認められたプラスミドをｐＬＫ００５と命名した。

（２）ｐＳＪ０４０の作製
プラスミドｐＳＪ０３４は、特開平１０−３３７１８５号公報記載の方法によりプラスミドｐＳＪ０２３から作製したものである。ｐＳＪ０３４には３カ所のＥｃｏＲＩ制限酵素部位が存在するが、このうちの１カ所をＳｐｅＩ部位に変換したプラスミドｐＳＪ０４０を作製した。作製方法は、ｐＳＪ０３４を制限酵素ＥｃｏＲＩにより部分分解し、タカラＢｌｕｎｔｉｎｇキットを用いて切断個所の平滑化を行った。ＳｐｅＩリンカーの存在下でライゲーション反応を行い、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換体を培養後、プラスミドを抽出し、ＳｐｅＩリンカーが挿入されたプラスミドを選別した。ｐＳＪ０３４の３つのＥｃｏＲＩ部位のうち、カナマイシン耐性遺伝子の下流に存在するＥｃｏＲＩ部位にＳｐｅＩリンカーが挿入されたものをｐＳＪ０４０と命名した。

（３）ｐＳＪ２０１の構築
ｐＬＫ００５をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、約２．１ｋｂの断片を調製した。一方、ｐＳＪ０４０をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、約９．８ｋｂの断片を調製した。これらの２断片を用いてライゲーション反応を行い、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換体を培養後、プラスミドを抽出し、その塩基配列を確認した結果、ｐＬＫ００５由来の変異配列（ＧＴＴＧＴＡＧＧの重複）を持ち、それ以外はｐＳＪ０４０と同様の配列を有するプラスミドをｐＳＪ２０１と命名した。

［参考例６：ＰＲ４ＫＳΔｌｉｇＤ誘導株のＲＥ＿ａｃｄ１／ＲＥ＿ｅｃｈＡ／ＲＥ＿ｈｃｈＡ／ＲＥ＿ｍｍｓＢ遺伝子欠失誘導株の作製］
（１）Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ法を用いた遺伝子欠失用プラスミドの作製
ＰＲ４ＫＳ株のＲＥ＿ａｃｄ１／ＲＥ＿ｅｃｈＡ／ＲＥ＿ｈｃｈＡ／ＲＥ＿ｍｍｓＢ遺伝子を標的遺伝子としたＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）による遺伝子欠失用プラスミドの作製を行った（図４参照）。

標的遺伝子の上流及び下流配列のＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りである。

断片１用プライマー
ＭＭＡ−０６１： ＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣ （配列番号２３）
ＭＭＡ−０６２： ＡＧＴＧＴＧＡＧＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＣＡＧＴＴＣＡＴ （配列番号２４）
断片２用プライマー
ＭＭＡ−０６３： ＣＡＣＴＴＴＣＣＴＣＡＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧ （配列番号２５）
ＭＭＡ−０６４： ＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＡＧＣＧＣＧＡＣＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＡＣ （配列番号２６）

反応液組成
鋳型（ＰＲ４ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅゲノムＤＮＡ） １μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ(TAKARA社製) ２５μｌ
Ｆｗ Ｐｒｉｍｅｒ（２０ μＭ） １μｌ
Ｒｖ Ｐｒｉｍｅｒ（２０ μＭ） １μｌ
Ｄ．Ｗ． ２２μｌ
Ｔｏｔａｌ ５０μｌ

温度サイクル
９８℃ １０秒、６０℃ １０秒及び７２℃ １２０秒の反応を３０サイクル

ＰＣＲ終了後、サンプル１μｌを用い、０．７％アガロースゲル電気泳動により断片の確認を行ったところ、断片の増幅が認められた。ＰＣＲ産物（断片１及び断片２）をＧｅｌ／ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ社製）を使用し、バッファー置換を行い、以下に示すＩｎ−Ｆｕｓｉｏｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによる反応に用いた。

（２）Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによるベクターと目的断片の連結及び形質転換
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用い、上記断片とベクターの連結を行った。反応条件は以下の通りである。

反応液組成
５ｘ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｅｍｉｘ ２μｌ
ベクター断片 １．５μｌ
ＤＮＡ断片１ １μｌ
ＤＮＡ断片２ ２μｌ
Ｄ．Ｗ． ３．５μｌ
Ｔｏｔａｌ １０μｌ

上記反応液を５０℃で１５分間インキュベートした後、氷上で冷却し、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換に用いた。大腸菌形質転換体の選択はカナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地（以下、 ＬＢ Ｋｍ５０寒天培地）にて行った。得られた形質転換体よりＭｉｎｉ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドを調製し、目的のプラスミドを得た。プラスミドの確認はＸｂａＩ制限酵素処理後の断片サイズ及び挿入断片とベクターの接続領域の配列を調べることにより行った。目的のプラスミドをｐＭＭＡ３０２と命名した。

（３）ＰＲ４ＫＳΔｌｉｇＤ誘導株の相同組換え誘導株及び遺伝子欠失誘導株の作製
ＰＲ４ＫＳΔｌｉｇＤ株コンピテントセル２０μｌに ｐＭＭＡ３０２を１μｌ添加し、氷上で１０分間インキュベートした。インキュベートした上記溶液を氷冷したエレクトロポレーションキュベット（０．１ｃｍ）に全量移し、１．５ｋＶ （２００Ω）の高電圧をかけ、直ちに６００μｌのＬＢ液体培地を加え、３０℃にて６時間静置した。２００μｌをカナマイシン硫酸塩１０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地（以下、ＬＢ Ｋｍ１０寒天培地）に撒き３０℃にて４日間培養した。生育したコロニーをＬＢ Ｋｍ１０寒天培地にストリークし、４日間培養した後、以下に示した条件によりコロニーＰＣＲを行い相同組換え誘導株の確認を行った。

プライマー
ＭＭＡ−０６９： ＧＣＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣ（配列番号２７）
ＭＭＡ−０７０： ＧＣＧＡＣＧＣＴＣＡＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣ（配列番号２８）

反応液組成
鋳型 ４．０μｌ
２×ＭｉｇｈｔｙＡｍｐＢｕｆｆｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ社製） ５．０μｌ
Ｆｗ Ｐｒｉｍｅｒ（２０ μＭ） ０．２５μｌ
Ｒｖ Ｐｒｉｍｅｒ（２０ μＭ） ０．２５μｌ
Ｄ．Ｗ． ０．３μｌ
ＭｉｇｈｔｙＡｍｐＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ(TAKARA社製)０．２μｌ
Ｔｏｔａｌ １０．０μｌ

温度サイクル
９８℃ １０秒、６８℃ １８０秒の反応を３０サイクル

相同組換え誘導株であることが認められたコロニーをＬＢ培地２００μｌに懸濁し、１００μｌをＬＢ＋１０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ寒天培地に撒き、３日間培養した。生育したコロニーからカナマイシン感受性となっているものを選択し、これらについてコロニーＰＣＲにより目的の遺伝子欠失を確認した。その結果、ＰＲ４ＫＳΔｌｉｇＤ誘導株よりＲＥ＿ａｃｄ１、ＲＥ＿ｅｃｈＡ、ＲＥ＿ｈｃｈＡ、ＲＥ＿ｍｍｓＢの４遺伝子を欠失したものが得られ、ＤＭＡ００８株と命名した。

［実施例１８：ロドコッカス属に属する微生物におけるＡＣＤ及びＡＡＴ両発現用プラスミドの作製］
ロドコッカス属に属する微生物においてＡＣＤ及び／又はＡＡＴを発現させるためのプラスミドを作製した。
ＲＥ＿ａｃｄ１遺伝子発現用プラスミドｐＭＭＡ４０１のＲＥ＿ａｃｄ１遺伝子の下流に、ＭｐＡＡＴ１遺伝子発現用プラスミドｐＡＡＴ３０１を鋳型にしてＰＣＲ反応により得られた「ニトリラーゼプロモーター＋ＭｐＡＡＴ１遺伝子」断片を挿入した。

「ニトリラーゼプロモーター＋ＭｐＡＡＴ１遺伝子」断片の増幅は下記のように行った。
プライマー
ＭＭＡ−１３３（Ｓｓｅ−ＰｒｏＦｗ）： ＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＴＣＣＧＣＴＧＣＧＡＣＡＴＧＴＡＴＣＧＡ （配列番号２９）
ＭＭＡ−１３１（Ｓｓｅ−００１Ｒｖ）： ＡＣＴＣＴＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＧＡＴＣＴＡＡＧＧＴＴＧＴＴＡＣＡ （配列番号３０）

ＰＣＲ反応組成
鋳型（ｐＡＡＴ３０１） １μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ(TAKARA社製)１０μｌ
Ｆｗ Ｐｒｉｍｅｒ（１０ μＭ） ０．６μｌ
Ｒｖ Ｐｒｉｍｅｒ（１０ μＭ） ０．６μｌ
Ｄ．Ｗ． ７．８μｌ
Ｔｏｔａｌ ２０μｌ

温度サイクル
９８℃ ５秒、６０℃ ５秒、７２℃ ４５秒の反応を３０サイクル

こうして得られた「ニトリラーゼプロモーター＋ＭｐＡＡＴ１遺伝子」断片を制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉで処理した。一方、ｐＭＭＡ４０１もＳｓｅ８３８７Ｉで処理後、ＳＡＰ処理を行った。これらのＤＮＡ断片を０．７％アガロースゲル電気泳動を行った後、Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ社製）を用いて精製した。制限酵素処理反応条件及びライゲーション反応条件は以下の通りである。

制限酵素処理反応組成（ＡＡＴ断片）
ＰＣＲ増幅断片 ４０μｌ
１０×Ｍバッファー ５μｌ
０．１％ ＢＳＡ ４μｌ
Ｓｓｅ８３８７Ｉ（ＴＡＫＡＲＡ社製） １μｌ
Ｔｏｔａｌ ５０μｌ

制限酵素処理反応組成（ベクター断片）
ｐＭＭＡ４０１（ベクター） ３μｌ
１０×Ｍバッファー ４μｌ
０．１％ ＢＳＡ ４μｌ
ＡＰ １μｌ
Ｓｓｅ８３８７Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製） １μｌ
Ｄ．Ｗ． ２７μｌ
Ｔｏｔａｌ ４０μｌ

ライゲーション反応組成
ｐＭＭＡ４０１ １μｌ
挿入断片 ２μｌ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ社製） ３μｌ
Ｔｏｔａｌ ６μｌ

上記組成で混合したライゲーション反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出した。制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ処理後にアガロース電気泳動を行い、目的サイズの断片が挿入されていることを確認した。得られたプラスミドの挿入断片の接続領域の塩基配列解析により目的のプラスミドであることを確認し、本プラスミドをｐＡＣＤＡＡＴ１と命名した。

上記手法と同様の手法を用い配列の異なるＡＣＤ及びＡＡＴ両発現用プラスミドを計６種（ｐＡＣＤＡＡＴ２、ｐＡＣＤＡＡＴ３、ｐＡＣＤＡＡＴ４、ｐＡＣＤＡＡＴ６、及びｐＡＣＤＡＡＴ８）作製した（図５参照）。

［実施例１９：ＡＣＤ及びＡＡＴ両発現組換え体によるメタクリル酸ブチルの製造］
参考例６の（３）で得られたＤＭＡ００８株を、プラスミドｐＡＣＤＡＡＴ１、ｐＡＣＤＡＡＴ２、ｐＡＣＤＡＡＴ３、ｐＡＣＤＡＡＴ４、ｐＡＣＤＡＡＴ６、及びｐＡＣＤＡＡＴ８によりそれぞれ形質転換した。得られた組換え体（ＤＭＡ００８／ｐＡＣＤＡＡＴ１、ＤＭＡ００８／ｐＡＣＤＡＡＴ２、ＤＭＡ００８／ｐＡＣＤＡＡＴ３、ＤＭＡ００８／ｐＡＣＤＡＡＴ４、ＤＭＡ００８／ｐＡＣＤＡＡＴ６及びＤＭＡ００８／ｐＡＣＤＡＡＴ８）を用いて休止菌体反応によりメタクリル酸エステルの製造を行った。また、コントロールとして、ＤＭＡ００８／ｐＬＫ００５を用いた。

２ｍｌＬＢ Ｋｍ１０液体培地（ワッセルマン試験管）に１白金耳植菌し、３０℃、ロータリーシェーカー（１８０ ｒｐｍ）、好気条件にて、２日間培養を行った（前培養）。前培養液を１００ｍＬＬＢ Ｋｍ１０（培地１００ｍＬ／５００ｍＬ容三角フラスコ）に１ｍｌ植菌し、３０℃、ロータリーシェーカー（２３０ ｒｐｍ）、好気条件にて、３日間培養を行った（本培養）。

本培養後、本培養液４０ｍＬを５０ｍＬ容コニカルチューブに移し遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分）し、菌体を得た。この菌体を用い以下の反応を行った。１０ｍｌ容量のガラスサンプル瓶に、１ｍｌの反応液を加え、３０℃、ロータリーシェーカー（１８０ｒｐｍ）、好気条件にて、１８時間行った。

反応液組成
ＯＤ６３０＝１０ 菌体 （終濃度）
５．０ｇ／ｌ ２−オキソイソ吉草酸（終濃度）
４０ｍＭ アルコール（終濃度）
５０ｍＭ リン酸バッファー／ｐＨ７．５（終濃度）

アルコールとして、ｎ−ブタノールを用いた。

反応後、反応液に１ｍＬのアセトニトリルを添加しよく混和した後、シリンジフィルターＤＩＳＭＩＣ／穴径０．４５μｍ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過後、実施例９Ｂ記載のＨＰＬＣ分析にて分析した。表１０に１８時間後の生成物の分析結果を示した。

ＡＣＤ及びＡＡＴ両発現組換え体によるメタクリル酸ブチルの生成

［実施例２０：ＡＣＤ及びＡＡＴ両発現組換え体によるメタクリル酸エステルの製造］
参考例６の（３）で得られたＤＭＡ００８株を、プラスミドｐＡＣＤＡＡＴ１によりそれぞれ形質転換した。得られた組換え体（ＤＭＡ００８／ｐＡＣＤＡＡＴ１）を用いて休止菌体反応によりメタクリル酸エステルの製造を行った。また、コントロールとして、ＤＭＡ００８／ｐＬＫ００５を用いた。実施例１９記載の方法を用いて、組換え体の培養を行い菌体を得た。

反応液組成
ＯＤ６３０＝１０ 菌体 （終濃度）
５．０ｇ／ｌ ２−オキソイソ吉草酸（終濃度）
４０ｍＭ アルコール（終濃度）
５０ｍＭ リン酸バッファー／ｐＨ７．５（終濃度）

アルコールとして、ｎ−ブタノール、イソブタノール、２−エチルヘキシルアルコールを用いた。

反応後、反応液に１ｍＬのアセトニトリルを添加しよく混和した後、シリンジフィルターＤＩＳＭＩＣ／穴径０．４５μｍ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過後、実施例９Ｂ記載のＨＰＬＣ分析にて分析した。表１１に１８時間後の生成物の分析結果を示した。

ＡＣＤ及びＡＡＴ両発現組換え体によるメタクリル酸エステルの生成

［比較例１：酵母由来ＡＡＴ遺伝子組換え体細胞抽出液によるメタクリル酸エステルの合成反応］
実施例６と同様にして酵母由来ＡＡＴ遺伝子発現プラスミドを作製し（表１２）、これらを用いて大腸菌を形質転換しＡＡＴ発現組換え体を得た。

酵母由来ＡＡＴ遺伝子発現用プラスミド

実施例７と同様にして細胞抽出液を調製し、実施例８と同様にメタクリリル−ＣｏＡとｎ-ブタノールを基質にしてメタクリル酸ブチルの合成反応を行った。その結果、メタクリル酸ブチルの生成は認められなかった。一方、アセチル−ＣｏＡとｎ−ブタノールを基質にした場合には、酢酸ブチルの生成が認められた。

酵母ＡＡＴ遺伝子組換え体を用いたエステルの生成

配列番号１１：ＭＭＡ−０４４
配列番号１２：ＭＭＡ−０４５
配列番号１３：ＭＭＡ−００３
配列番号１４：ＭＭＡ−００４
配列番号１５：ＭＭＡ−０３１
配列番号１６：ＭＭＡ−０３２
配列番号１７：ＭＡＡ−１５
配列番号１８：ＭＡＡ−１６
配列番号１９：ＧＢ−１３８
配列番号２０：ＧＢ−１３９
配列番号２１：ＧＢ−１４０
配列番号２２：ＧＢ−１４１
配列番号２３：ＭＭＡ−０６１
配列番号２４：ＭＭＡ−０６２
配列番号２５：ＭＭＡ−０６３
配列番号２６：ＭＭＡ−０６４
配列番号２７：ＭＭＡ−０６９
配列番号２８：ＭＭＡ−０７０
配列番号２９：ＭＭＡ−１３３
配列番号３０：ＭＭＡ−１３１

Claims (9)

1. イソブチリル−ＣｏＡあるいは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡを製造する工程と、
   植物由来アルコールアシルトランスフェラーゼの存在下、メタクリリル−ＣｏＡに式Ｒ−ＯＨで示されるアルコールまたはフェノール類を作用させて、メタクリル酸エステルを合成する工程、ここで、Ｒは、直鎖あるいは分岐の炭素数１〜２０の飽和又は不飽和の非環式又は飽和又は不飽和の環式の炭化水素基を表す、
   とを含むメタクリル酸エステルの製造方法。
2. メタクリル酸エステルを０．００１ｍＭ以上蓄積させる請求項１記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
3. イソブチリル−ＣｏＡが２−オキソイソ吉草酸から製造されることを特徴とする、請求項１又は２記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
4. 植物が、ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）目、バラ（Ｒｏｓａｌｅｓ）目、ツツジ（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）目、ウリ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｌｅｓ）目、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｌｅｓ）目およびクスノキ（Ｌａｕｒａｌｅｓ）目からなる群から選択されるいずれかの目に属するものである請求項１〜３のいずれか１項に記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
5. 植物が、バショウ（Ｍｕｓａｃｅａｅ）科、バラ（Ｒｏｓａｃｅａｅ）科、ツツジ（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）科、マタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）科、ウリ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）科、パパイア（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）科およびクスノキ（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものである請求項１〜３のいずれか１項に記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
6. 植物が、バショウ（Ｍｕｓａ）属、オランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）属、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属、サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ）属、ナシ（Ｐｙｒｕｓ）属、スノキ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）属、マタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）属、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ）属、パパイア（Ｃａｒｉｃａ）属およびワニナシ（Ｐｅｒｓｅａ）属からなる群から選択されるいずれかの属に属するものである請求項１〜３のいずれか１項に記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
7. 植物が、バナナ、イチゴ、リンゴ、ウメ、セイヨウナシ、ブルーベリー、キウイ、メロン、パパイアおよびアボカドなる群から選択されるいずれかである請求項１〜３のいずれか１項に記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
8. 植物由来アルコールアシルトランスフェラーゼを発現するように遺伝子導入された遺伝子組換え微生物を用いる請求項１〜７のいずれか１項に記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
9. 植物由来アルコールアシルトランスフェラーゼを発現するように遺伝子導入された遺伝子組換え微生物にロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物を用いる請求項８記載のメタクリル酸エステルの製造方法。

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