ES2689477T3 - Método para producir éster del ácido metacrílico - Google Patents
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Abstract
Método para producir éster del ácido metacrílico que comprende: una etapa de producir metacrilil-CoA a partir de isobutiril-CoA o 3-hidroxiisobutiril-CoA, y una etapa de sintetizar éster del ácido metacrílico provocando que un alcohol o fenol que tiene la fórmula R-OH actúe sobre metacrilil-CoA en presencia de una alcohol aciltransferasa, en la que R representa un grupo hidrocarbonado C1-20 lineal o ramificado de un tipo no cíclico saturado o insaturado o de un tipo cíclico saturado o insaturado.
Description
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DESCRIPCION
Método para producir éster del ácido metacrílico Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para producir éster del ácido metacrílico usando un biocatalizador. Antecedentes de la técnica
Los ésteres del ácido metacrílico se usan principalmente como materia prima en resinas acrílicas, y se demanda mucho también como monómero en campos tales como pinturas, adhesivos y modificadores de resina. Hay pocos métodos como métodos de fabricación industrial y, por ejemplo, se conocen el método de ACH (cianohidrina de acetona) que usa acetona y cianuro de hidrógeno como materias primas, y el método de oxidación directa que usa isobutileno y alcohol terc-butílico como materias primas. Estos métodos de producción química dependen de materias primas fósiles, y requieren una gran cantidad de energía.
En los últimos años, se les ha prestado atención a las tecnologías para producir diversos productos químicos a partir de biomasa como fuente de carbono que sustituye a las materias primas fósiles convencionales desde los puntos de vista de prevención del calentamiento global y protección del medio ambiente. Aunque la producción a partir de materia prima de biomasa también se espera para ésteres del ácido metacrílico, no se ha notificado ningún ejemplo de producción específico a partir de materias primas de biomasa usando un biocatalizador.
Por ejemplo, se han propuesto métodos que utilizan microorganismos que existen en la naturaleza para producir ácido 2-hidroxiisobutírico y ácido 3-hidroxiisobutírico que sirven como precursores de ácido metacrílico a partir de una fuente natural tal como azúcar (se remite a los documentos de patente 1 y 2, y documento no de patente 1). Sin embargo, en estos métodos, los procedimientos para deshidratar el precursor y formar ácido metacrílico todavía dependen de técnicas químicas.
Además, aunque se han propuesto métodos de formación de ácido metacrílico a partir de glucosa usando microorganismos recombinantes que no existen en la naturaleza y se producen introduciendo una pluralidad de genes de enzimas, estos se combinan con una reacción enzimática ya conocida y una reacción enzimática teórica por analogía a esta, y por tanto no se ha demostrado (se remite a los documentos de patente 3 a 5). En particular, el documento de patente 5 ejemplifica diversos biocatalizadores (hidrolasa, éster de cera sintetasa, alcohol acetiltransferasa) que tiene una actividad de formación de éster general; sin embargo, no está claro si los biocatalizadores ejemplificados tienen actividad de síntesis para éster del ácido metacrílico.
Además, el documento de patente 6 da a conocer un método para producir éster del ácido acrílico provocando que la hidrolasa funcione en presencia de acrilil-CoA y alcohol. El mismo documento sugiere que la producción es posible de manea similar también para ésteres del ácido metacrílico. Sin embargo, cuando se tiene en cuenta la diversidad y especificidad de sustrato de los biocatalizadores, simplemente ilustra que la producción de una parte de los ésteres del ácido acrílico es posible con hidrolasa, y no está claro si pueden producirse de manera similar por la hidrolasa ésteres del ácido metacrílico que tienen una estructura diferente. Además, no está nada claro si es posible la producción con otros tipos de biocatalizadores que tienen mecanismos de reacción diferentes. Además, en el caso de la síntesis de ésteres mediante la hidrolasa descrita en el documento de patente 6, se supone que el éster formado se descompondrá mediante la actividad de hidrólisis en primer lugar, y por tanto es bastante improbable como método de producción eficaz.
Por otro lado, la alcohol acetiltransferasa se ha conocido como sintetasa de aroma frutal. Identificando los mismos genes de enzimas contenidos en frutas específicas, el documento de patente 7 propone métodos de síntesis de diversos ésteres que son aromas a frutas. Sin embargo, no se ha notificado si pueden sintetizarse ésteres del ácido metacrílico con estas enzimas, y no ha estado nada claro.
Tal como se estableció anteriormente, aunque se han hecho unas pocas propuestas o estudios, no hay ningún ejemplo de producción actual de derivados de ácido metacrílico por medio de microorganismos, y por tanto se ha deseado el establecimiento de un método de producción eficaz.
[Documento de patente 1] Documento de publicación internacional PCT n.° WO2007/110394
[Documento de patente 2] Documento de publicación internacional PCT n.° WO2008/145737
[Documento de patente 3] Documento de publicación internacional PCT n.° WO2009/135074
[Documento de patente 4] Documento de publicación internacional PCT n.° WO2011/031897
[Documento de patente 5] Documento de publicación internacional PCT n.° WO2012/135789
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[Documento de patente 6] Documento de publicación internacional PCT n.° WO2007/039415
[Documento de patente 7] Documento de publicación internacional PCT n.° WO2000/32789
[Documento de patente 8] Solicitud de patente japonesa no examinada, publicación n.° 2011-200133
[Documento de patente 9] Solicitud de patente japonesa no examinada, publicación n.° H05-64589
[Documento de patente 10] Solicitud de patente japonesa no examinada, publicación n.° H10-337185
[Documento de patente 11] Solicitud de patente japonesa no examinada, publicación n.° H10-24867
[Documento no de patente 1] Green Chemistry, 2012, 14, 1942-1948
[Documento no de patente 2] Methods in Enzymology, 2000, 324, 73-79
[Documento no de patente 3] Botanical Journal of the Linnean Society, 2009, 161, 105-121
[Documento no de patente 4] Microbiology, 1999, 145, 2323-2334
Divulgación de la invención
Problemas que van a solucionarse mediante la invención
La presente invención tiene el objeto de proporcionar un método para producir éster del ácido metacrílico por medio de un biocatalizador.
Medios para solucionar los problemas
Se ha encontrado que la alcohol aciltransferasa tiene actividad para sintetizar ésteres del ácido metacrílico, llegando de ese modo a la finalización de la presente invención. Más específicamente, la presente invención es tal como sigue.
Según un primer aspecto de la invención, un método para producir éster del ácido metacrílico comprende una etapa de producir metacrilil-CoA a partir de isobutiril-CoA o 3-hidroxiisobutiril-CoA, y una etapa de sintetizar éster del ácido metacrílico provocando que un alcohol o fenol que tiene la fórmula R-OH actúe sobre metacrilil-CoA en presencia de una alcohol aciltransferasa, en la que R representa un grupo hidrocarbonado C1-20 lineal o ramificado de un tipo no cíclico saturado o insaturado o de un tipo cíclico saturado o insaturado. Según un segundo aspecto de la invención, en el método para producir éster del ácido metacrílico tal como se describe en el primer aspecto, el éster del ácido metacrílico se acumula en al menos 0,001 mM.
Según un tercer aspecto de la invención, en el método para producir éster del ácido metacrílico tal como se describe en el primer aspecto, la isobutiril-CoA se produce a partir de ácido 2-oxoisovalérico.
Según un cuarto aspecto de la invención, en el método para producir éster del ácido metacrílico tal como se describió en cualquiera de los aspectos anteriores, la alcohol aciltransferasa es de origen vegetal.
Según un quinto aspecto de la invención, en el método para producir éster del ácido metacrílico tal como se describe en el cuarto aspecto, la planta pertenece a cualquier orden seleccionado del grupo que consiste en Zingiberales, Rosales, Ericales, Cucurbitales, Brassicales y Laurales.
Según un sexto aspecto de la invención, en el método para producir éster del ácido metacrílico tal como se describe en el cuarto aspecto, la planta pertenece a cualquier familia seleccionada del grupo que consiste en Musaceae, Rosaceae, Ericaceae, Actinidiaceae, Cucurbitaceae, Caricaceae y Lauraceae.
Según un séptimo aspecto de la invención, en el método para producir éster del ácido metacrílico tal como se describe en el cuarto aspecto, la planta pertenece a cualquier género seleccionado del grupo que consiste en Musa, Fragaria, Malus, Prunus, Pyrus, Vaccinium, Actinidia, Cucumis, Carica y Persea.
Según un octavo aspecto de la invención, en el método para producir éster del ácido metacrílico tal como se describe en el cuarto aspecto, la planta es cualquier género seleccionado de Musa, Malus, Prunus, Pyrus, Vaccinium, Actinidia, Cucumis, Carica y Persea.
Según un noveno aspecto de la invención, en el método para producir éster del ácido metacrílico tal como se describe en el cuarto aspecto, la planta es cualquier género seleccionado de Musa, Malus, Pyrus, Actinidia,
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Cucumis, Carica y Persea.
Según un décimo aspecto de la invención, en el método para producir éster del ácido metacrílico tal como se describe en el cuarto aspecto, la planta es una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en plátano, fresa, manzana, Prunus mume, Pyrus communis, arándano, kiwi, melón, papaya y aguacate.
Según un decimoprimer aspecto de la invención, en el método para producir éster del ácido metacrílico tal como se describe en el cuarto aspecto, la planta es una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en plátano, manzana, Prunus mume, Pyrus communis, arándano, kiwi, melón, papaya y aguacate.
Según un decimosegundo aspecto de la invención, en el método para producir éster del ácido metacrílico tal como se describe en el cuarto aspecto, la planta es una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en plátano, manzana, Pyrus communis, kiwi, melón, papaya y aguacate.
Según un decimotercer aspecto de la invención, el método para producir éster del ácido metacrílico tal como se describe en cualquiera de los aspectos primero a decimosegundo usa un microorganismo modificado genéticamente al que se le ha transferido un gen para expresar alcohol aciltransferasa.
Además, la presente invención es tal como sigue en otro aspecto.
Según un decimocuarto aspecto de la invención, un método para producir éster del ácido metacrílico produce el éster del ácido metacrílico usando un microorganismo que pertenece al género Rhodococcus. Las siguientes características opcionales del método para producir ácido metacrílico tal como se describió anteriormente se dan a conocer adicionalmente a continuación en el presente documento:
- El método para producir éster del ácido metacrílico usa un microorganismo que pertenece al género Rhodococcus que tiene ADN 16Sr que incluye una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 95 % con la secuencia de nucleótidos de ADN 16Sr mostrada en SEQ ID NO. 31.
- El microorganismo que pertenece al género Rhodococcus es Rhodococcus erythropolis.
- El método usa una cepa derivada del microorganismo que pertenece al género Rhodococcus.
- El microorganismo que pertenece al género Rhodococcus es la cepa PR-4 de Rhodococcus erythropolis o una cepa derivada de la misma.
- La cepa derivada anterior es una cepa modificada genéticamente que tiene una modificación de al menos una de (a) o (b) mostradas a continuación.
(a) Modificación mediante introducción del gen de cetoácido ramificado deshidrogenasa y/o gen de acil-CoA deshidrogenasa.
(b) Modificación de deleción o inactivación del gen de enoil-CoA hidratasa, gen de 3-hidroxiisobutiril-CoA hidratasa y/o gen de ácido 3-hidroxiisobutírico deshidrogenasa.
- La cepa derivada anterior tiene un plásmido para la expresión de alcohol aciltransferasa y/o acil-CoA deshidrogenasa.
Efectos de la invención
Por medio de la presente invención, se hace posible la producción de éster del ácido metacrílico por medio de un biocatalizador. Combinando el método de producción de la presente invención con el metabolismo in vivo, también puede lograrse la producción fermentativa de éster del ácido metacrílico. Como resultado de lo mismo, la energía, los recursos y la carga para el medio ambiente pueden reducirse notablemente en comparación con un procedimiento de producción química convencional, y se hace posible producir eficazmente éster del ácido metacrílico.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una vista que muestra las etapas de producción a partir de 3-hidroxiisobutiril-CoA para dar éster del ácido metacrílico;
la figura 2 es una vista que muestra las etapas de producción a partir de ácido 2-oxoisovalérico para dar éster del ácido metacrílico;
la figura 3 es una vista que muestra la estructura de un plásmido para la deleción del gen homólogo LigD;
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la figura 4 es una vista que ilustra un método de preparación para un plásmido para deleción génica usando el método In Fusion; y
la figura 5 es una vista que muestra las estructuras de los plásmidos para la coexpresión de ACD-AAT. Realizaciones para llevar a cabo la invención
A continuación en el presente documento, se explicarán modos preferidos para llevar a cabo la presente invención mientras se hace referencia a los dibujos.
1. Método de producción de éster del ácido metacrílico a partir de alcohol aciltransferasa Éster del ácido metacrílico
En la presente invención, el éster del ácido metacrílico es un compuesto expresado por la fórmula 1. En la fórmula 1, R representa un grupo hidrocarbonado C1-20 lineal o ramificado. El grupo hidrocarbonado puede ser de tipo no cíclico saturado o insaturado, o puede ser de tipo cíclico saturado o insaturado. Es preferiblemente un grupo alquilo, grupo aralquilo o grupo arilo no sustituido C1-10 lineal o ramificado. Es más preferiblemente un grupo alquilo C1-8 tal como un grupo metilo, grupo etilo, grupo n-propilo, grupo isopropilo, grupo n-butilo, grupo isobutilo, grupo sec- butilo, grupo terc-butilo, grupo n-pentilo, grupo isopentilo, grupo terc-pentilo, grupo n-hexilo, grupo isohexilo, grupo 2- hexilo, grupo dimetilbutilo, grupo etilbutilo, grupo heptilo, grupo octilo, grupo 2-etilhexilo; un grupo bencilo o un grupo fenilo.
CH2=C(CHa)COO-R (Fórmula 1)
“Ácido metacrílico” (nombre IUPAC: ácido 2-metil-2-propenoico) indica un compuesto que tiene la fórmula a continuación, y también incluye cualquier sal o forma ionizada del mismo. Como sales de ácido metacrílico, por ejemplo, pueden ejemplificarse sales de sodio, sales de potasio, sales de calcio, sales de magnesio, etc.
CH2=C(CHa)COOH
Metacrilil-CoA
En la presente invención, la metacrilil-CoA es un compuesto expresado por la fórmula estructural a continuación. La metacrilil-CoA se conoce como producto intermedio metabólico de valina dentro de los organismos. La metacrilil- CoA usada en la presente invención se produce a partir de isobutiril-CoA o 3-hidroxiisobutiril-CoA. Como método de síntesis de metacrilil-CoA, se conocen el método de síntesis organoquímica de coenzima A con anhídrido metacrílico (Methods in Enzymology, 324, 73-79 (2000)) o un método de síntesis usando una reacción enzimática.
[Fórm. quím. 1]
En la presente invención, entre estos, pueden usarse favorablemente metacrilil-CoA (se remite a la figura 2) transformada mediante la acción de acil-CoA deshidrogenasa (EC 1.3.99.3) (a continuación en el presente documento denominada ACD) con isobutiril-CoA como materia prima o metacrilil-CoA (se remite a la figura 1) transformada mediante la acción de enoil-CoA hidratasa (EC 4.2.1.17) (a continuación en el presente documento denominada ECH) a partir de 3-hidroxiisobutiril-CoA. En otras palabras, el método de la presente invención incluye una etapa de producir metacrilil-CoA a partir de isobutiril-CoA o 3-hidroxiisobutiril-CoA. A partir de la reacción continua mediante la enzima, junto con estar relacionado con una mejora del rendimiento así como una supresión de la materia extraña, se hace posible la síntesis directa de éster del ácido metacrílico sin pasar a través de ácido metacrílico que tiene una alta toxicidad para los organismos, o la formación de subproductos. Según el método, es posible lograr la producción de éster del ácido metacrílico mediante una reacción continua in vivo (fermentación metabólica) con baja carga medioambiental.
Para la isobutiril-CoA usada en la presente invención, puede usarse una producida a partir de ácido 2-oxoisovalérico
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(se remite a la figura 2). En otras palabras, el método de la presente invención puede incluir además una etapa de producir isobutiril-CoA a partir de ácido 2-oxoisovalérico.
Alcoholes y fenoles
Los alcoholes o fenoles que sirven como materias primas en la producción del éster del ácido metacrílico en la presente invención son compuestos expresados por la fórmula 2 a continuación. La estructura del alcohol o los fenoles corresponde a éster del ácido metacrílico; por tanto, la estructura de los mismos se define igual que R en la fórmula 1, y representa un grupo hidrocarbonado C1-20 lineal o ramificado. El grupo hidrocarbonado puede ser de tipo no cíclico saturado o insaturado, o puede ser de tipo cíclico saturado o insaturado. Es preferiblemente un alcohol, alcohol aralquílico o fenol no sustituido C1-10 lineal o ramificado, y de manera particularmente preferible un alcohol alquílico C1-8 tal como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, sec-butanol, terc- butanol, alcohol n-pentílico, alcohol isopentílico, alcohol terc-pentílico, alcohol n-hexílico, alcohol isohexílico, alcohol 2-hexílico, alcohol dimetilbutílico, alcohol etilbutílico, alcohol heptílico, alcohol octílico, alcohol 2-etilhexílico; un alcohol bencílico o un fenol.
R-OH (Fórmula 2)
Alcohol aciltransferasa
La alcohol aciltransferasa de la presente invención (a continuación en el presente documento denominada AAT) es una enzima que tiene una acción catalítica para sintetizar éster provocando que el grupo acilo de acil-CoA se transfiera al alcohol o fenol. Se considera que la AAT participa en la formación de ésteres en diversas frutas. Se sabe que la AAT está presente en plantas tales como Zingiberales (plátano), Rosales (fresa, manzana, pera, melocotón), Cucurbitales (melón), Ericales (kiwi), Lamiales (aceituna), Solanales (tomate) y Sapindales (limón, mango).
La AAT usada en la presente invención no está particularmente limitada siempre que sea un catalizador de origen biológico que tiene una capacidad para producir éster del ácido metacrílico con metacrilil-CoA y alcohol o fenol como materias primas, y la clase y el origen de la misma no son de importancia. Una de origen vegetal es preferible como fuente de enzima, y entre ellas, es preferible una clasificada como una angiosperma.
La AAT adecuada para la presente invención puede seleccionarse fácilmente a partir de las plantas mediante el siguiente método. Se adquiere mediante corte una parte apropiada del tejido según sea necesario. Se añade una disolución que contiene metacrilil-CoA y un alcohol o fenol representado por la fórmula 2 a esta parte cortada, se agitan y se permite que reaccionen durante un tiempo determinado. Es posible confirmar la actividad de síntesis confirmando la presencia de éster del ácido metacrílico en esta disolución de reacción mediante CG (cromatografía de gases). Más específicamente, por ejemplo, se corta el sarcocarpio o pericarpio, se añade al mismo una disolución que contiene metacrilil-CoA de 1 a 10 mM, KCl 0,35 y de 5 a 50 veces la cantidad molar de n-butanol, y se agitan durante de 1 a 10 horas a 30 °C. Tras la finalización de la reacción, puede seleccionarse una AAT aplicable a la presente invención confirmando la presencia de éster del ácido metacrílico por medio de CG.
La fuente de enzima AAT adecuada para la presente invención, por ejemplo, es una que pertenece a cualquier orden seleccionado del grupo que consiste en Zingiberales, Rosales, Ericales, Cucurbitales, Brassicales, Laurales, Poales, Arecales, Asparagales, Saxifragales, Caryophyllales, Vitales, Malpighiales, Oxalidales, Fabales, Sapindales, Malvales, Myrtales, Ranunculales, Solanales, Lamiales, Gentianales y Asterales. Entre ellas, es preferiblemente una que pertenece a cualquier orden seleccionado del grupo que consiste en Zingiberales, Rosales, Ericales, Cucurbitales, Brassicales y Laurales.
Son preferibles plantas de Musaceae y Zingiberaceaeare como las que pertenecen al orden Zingiberales; son preferibles plantas de Rosaceae y Moraceae como las que pertenecen al orden Rosales; son preferibles plantas de Ericaceae, Actinidiaceae, Ebenaceae y Theaceae como las que pertenecen al orden Ericales; son preferibles plantas de Cucurbitaceae como las que pertenecen al orden Cucurbitales; son preferibles plantas de Caricaceae y Brassicaceae como las que pertenecen al orden Brassicales; son preferibles plantas de Lauraceae como las que pertenecen al orden Laurales; son preferibles plantas de Bromeliaceae y Poaceae como las que pertenecen al orden Poales; son preferibles plantas de Arecaceae como las que pertenecen al orden Arecales; son preferibles plantas de Orchidaceae e Iridaceae como las que pertenecen al orden Asparagales; son preferibles plantas de Grossulariaceae como las que pertenecen al orden Saxifragales; son preferibles plantas de Caryophyllaceae como las que pertenecen al orden Caryophyllales; son preferibles plantas de Vitaceae como las que pertenecen al orden Vitales; son preferibles plantas de Malpighiaceae, Passifloraceae, Euphorbiaceae y Salicaceae como las que pertenecen al orden Malpighiales; son preferibles plantas de Oxalidaceae como las que pertenecen al orden Oxalidales; son preferibles plantas de Fabaceae como las que pertenecen al orden Fabales; son preferibles plantas de Rutaceae, Sapindaceae y Anacardiaceae como las que pertenecen al orden Sapindales; son preferibles plantas de Malvaceae como las que pertenecen al orden Malvales; son preferibles plantas de Lythraceae, Onagraceae y Myrtaceae como las que pertenecen al orden Myrtales; son preferibles plantas de Ranunculaceae y Papaveraceae como las que pertenecen al orden Ranunculales; son preferibles plantas de Solanaceae como las que pertenecen al orden
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Solanales; son preferibles plantas de Oleaceae, Verbenaceae y Lamiaceae como las que pertenecen al orden Lamíales; son preferibles plantas de Apocynaceae como las que pertenecen al orden Gentianales; y son preferibles plantas de Asteraceae como las que pertenecen al orden Asterales. También puede emplearse una especie relacionada de las plantas mencionadas anteriormente. Entre ellas, es más preferiblemente una planta que pertenece a Musacea, Rosaceae, Ericeae, Actinidiaceae, Cucurbitaceae, Caricaceae o Lauraceae.
Más específicamente, son preferibles plantas de Musa como las que pertenecen a la familia Musaceae; son preferibles plantas de Zingiber como las que pertenecen a la familia Zingiberaceae; son preferibles plantas de Fragaria, Malus, Prunus, Pyrus, Eriobotrya, Chaenomeles, Rubus y Rosa como las que pertenecen a la familia Rosaceae; son preferibles plantas de Ficus como las que pertenecen a la familia Moraceae; son preferibles plantas de Vaccinium como las que pertenecen a la familia Ericaceae; son preferibles plantas de Actinidia como las que pertenecen a la familia Actinidiaceae; son preferibles plantas de Diospyros como las que pertenecen a la familia Ebenaceae; son preferibles plantas de Camellia como las que pertenecen a la familia Theaceae; son preferibles plantas de Cucumis y Citrullus como las que pertenecen a la familia Cucurbitaceae; son preferibles plantas de Carica y Vasconcellea como las que pertenecen a la familia Caricaceae; son preferibles plantas de Arabidopsis como las que pertenecen a la familia Brassicaceae; son preferibles plantas de Persea como las que pertenecen a la familia Lauraceae; son preferibles plantas de Ananas como las que pertenecen a la familia Bromeliaceae; son preferibles plantas de Oryza, Triticum, Hordeum, Zea, Sorghum y Brachipodium como las que pertenecen a la familia Poaceae; son preferibles plantas de Cocus como las que pertenecen a la familia Arecaceae; son preferibles plantas de Vanda como las que pertenecen a la familia Orchidaceae; son preferibles plantas de Iris como las que pertenecen a la familia Iridaceae; son preferibles plantas de Ribes como las que pertenecen a la familia Grossulariaceae; son preferibles plantas de Gypsophila como las que pertenecen a la familia Caryophyllaceae; son preferibles plantas de Vitis como las que pertenecen a la familia Vitaceae; son preferibles plantas de Malpighia como las que pertenecen a la familia Malpighiaceae; son preferibles plantas de Passiflora como las que pertenecen a la familia Passifloraceae; son preferibles plantas de Ricinus como las que pertenecen a la familia Euphorbiaceae; son preferibles plantas de Populus como las que pertenecen a la familia Salicaceae; son preferibles plantas de Averrhoa como las que pertenecen a la familia Oxalidaceae; son preferibles plantas de Medicago, Lupinus, Glicina y Clitoria como las que pertenecen a la familia Fabaceae; son preferibles plantas de Citrus y Aegle como las que pertenecen a la familia Rutaceae; son preferibles plantas de Litchi como las que pertenecen a la familia Sapindaceae; son preferibles plantas de Mangifera como las que pertenecen a la familia Anacardiaceae; son preferibles plantas de Durio y Theobroma como las que pertenecen a la familia Malvaceae; son preferibles plantas de Punica como las que pertenecen a la familia Lythraceae; son preferibles plantas de Clarkia como las que pertenecen a la familia Onagraceae; son preferibles plantas de Psidium como las que pertenecen a la familia Myrtaceae; son preferibles plantas de Actaea como las que pertenecen a la familia Ranunculaceae; son preferibles plantas de Papaver como las que pertenecen a la familia Papaveraceae; son preferibles plantas de Solanum, Capsicum, Nicotiana y Petunia como las que pertenecen a la familia Solanaceae; son preferibles plantas de Olea como las que pertenecen a la familia Oleaceae; son preferibles plantas de Glandularia como las que pertenecen a la familia Verbenaceae; son preferibles plantas de Salvia como las que pertenecen a la familia Lamiaceae; son preferibles plantas de Rauvolfia y Catharanthus como las que pertenecen a la familia Apocynaceae; y son preferibles plantas de Chamaemelum como las que pertenecen a la familia Asteraceae. Entre ellas, son más preferibles plantas que pertenecen a Musa, Fragaria, Malus, Prunus, Pyrus, Vaccinium, Actinidia, Cucumis, Carica o Persea. Además, entre ellas, son particularmente preferibles plantas que pertenecen a Musa, Malus, Pyrus, Actinidia, Cucumis, Carica o Persea.
Además, más específicamente, son particularmente preferibles plantas de Musa paradisiaca, Musa basjoo, Musa coccinea y Musa acuminata como las que pertenecen al género Musa; son particularmente preferibles plantas de Zingiber officinale como las que pertenecen al género Zingiber; son particularmente preferibles plantas de Fragaria xananassa, Fragaria virginiana, Fragaria chiloensis y Fragaria vesca como las que pertenecen al género Fragaria; son particularmente preferibles plantas de Malus pumila, Malus domestica, Malus baccata, Malus halliana, Malus floribunda y Malus prunifolia como las que pertenecen al género Malus; son particularmente preferibles plantas de Prunus mume, Prunus avium, Prunus persica, Prunus armeniaca, Prunus dulcis, Prunus salicina y Prunus domestica como las que pertenecen al género Prunus; son particularmente preferibles plantas de Pyrus communis, Pyrus pirifolia, Pyrus calleryana y Pyrus pyraster como las que pertenecen al género Pyrus; son particularmente preferibles plantas de Eriobotrya japonica como las que pertenecen al género Eriobotrya; son particularmente preferibles plantas de Chaenomeles sinensis como las que pertenecen al género Chaenomeles; son particularmente preferibles plantas de Rubus idaeus y Rubus fruticosus como las que pertenecen al género Rubus; son particularmente preferibles plantas de Rosa rugosa como las que pertenecen al género Rosa; son particularmente preferibles plantas de Ficus carica como las que pertenecen al género Ficus; son particularmente preferibles plantas de Vaccinium corymbosum, Vaccinium angustifolium, Vaccinium myrtillus, Vaccinium vitis-idaea y Vaccinium oxicoccos como las que pertenecen al género Vaccinium; son particularmente preferibles plantas de Actinidia chinensis, Actinidia deliciosa, Actinidia arguta, Actinidia rufa y Actinidia polygama como las que pertenecen al género Actinidia; son particularmente preferibles plantas de Diospyros kaki como las que pertenecen al género Diospyros; son particularmente preferibles plantas de Camellia sinensis como las que pertenecen al género Camellia; son particularmente preferibles plantas de Cucumis sativus, Cucumis melo, Cucumis anguria y Cucumis metulifer como las que pertenecen al género Cucumis; son particularmente preferibles plantas de Citrullus lanatus como las que pertenecen al género Citrullus; son particularmente preferibles plantas de Carica papaya como las que pertenecen al género Caricaceae; son particularmente preferibles plantas de Vasconcellea cundinamarcensis como las que
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pertenecen al género Vasconcellea; son particularmente preferibles plantas de Arabidopsis thaliana y Arabidopsis lyrata como las que pertenecen al género Arabidopsis; son particularmente preferibles plantas de Persea americana como las que pertenecen al género Persea; son particularmente preferibles plantas de Ananas comosus como las que pertenecen al género Ananas; son particularmente preferibles plantas de Oryza sativa como las que pertenecen al género Oryza; son particularmente preferibles plantas de Triticum aestivum como las que pertenecen al género Triticum; son particularmente preferibles plantas de Hordeum vulgare como las que pertenecen al género Hordeum; son particularmente preferibles plantas de Zea mays como las que pertenecen al género Zea; son particularmente preferibles plantas de Sorghum bicolor como las que pertenecen al género Sorghum; son particularmente preferibles plantas de Brachipodium distachyon como las que pertenecen al género Brachipodium; son particularmente preferibles plantas de Cocos nucífera como las que pertenecen al género Cocos; son particularmente preferibles plantas de Vanda hybridcultivar como las que pertenecen al género Vanda; son particularmente preferibles plantas de Iris hollandica como las que pertenecen al género Iris; son particularmente preferibles plantas de Ribes nigrum como las que pertenecen al género Ribes; son particularmente preferibles plantas de Gypsophila paniculata y Gypsophila elegans como las que pertenecen al género Gypsophila; son particularmente preferibles plantas de Vitis vinifera y Vitis labrusca como las que pertenecen al género Vitis; son particularmente preferibles plantas de Malpighia glabra como las que pertenecen al género Malpighia; son particularmente preferibles plantas de Passiflora edulis como las que pertenecen al género Passiflora; son particularmente preferibles plantas de Ricinus communis como las que pertenecen al género Ricinus; son particularmente preferibles plantas de Populus trichocarpa como las que pertenecen al género Populus; son particularmente preferibles plantas de Averrhoa carambola como las que pertenecen al género Averrhoa; son particularmente preferibles plantas de Medicago truncatula como las que pertenecen al género Medicago; son particularmente preferibles plantas de Lupinus albus como las que pertenecen al género Lupinus; son particularmente preferibles plantas de Glycine max como las que pertenecen al género Glycine; son particularmente preferibles plantas de Clitoria ternatea como las que pertenecen al género Clitoria; son particularmente preferibles plantas de Citrus limon, Citrus sudachi, Citrus sphaerocarpa, Citrus paradisi, Citrus junos, Citrus aurantifolia, Citrus unshiu y Citrus sinensis como las que pertenecen al género Citrus; son particularmente preferibles plantas de Aegle marmelos como las que pertenecen al género Aegle; son particularmente preferibles plantas de Litchi chinensis como las que pertenecen al género Litchi; son particularmente preferibles plantas de Mangifera indica como las que pertenecen al género Mangifera; son particularmente preferibles plantas de Durio zibetinus como las que pertenecen al género Durio; son particularmente preferibles plantas de Theobroma cacao como las que pertenecen al género Theobroma; son particularmente preferibles plantas de Punica granatum como las que pertenecen al género Punica; son particularmente preferibles plantas de Clarkia breweri y Clarkia concinna como las que pertenecen al género Clarkia; son particularmente preferibles plantas de Psidium guajava como las que pertenecen al género Psidium; son particularmente preferibles plantas de Actaea racemosa como las que pertenecen al género Actaea; son particularmente preferibles plantas de Papaver somniferum, Papaver orientale y Papaver bracteatum como las que pertenecen al género Papaver; son particularmente preferibles plantas de Solanum lycopersicum como las que pertenecen al género Solanum; son particularmente preferibles plantas de Capsicum annuum y Capsicum chinense como las que pertenecen al género Capsicum; son particularmente preferibles plantas de Nicotiana tabacum y Nicotiana attenuata como las que pertenecen al género Nicotiana; son particularmente preferibles plantas de Petunia hybrida como las que pertenecen al género Petunia; son particularmente preferibles plantas de Olea europaea como las que pertenecen al género Olea; son particularmente preferibles plantas de Glandularia hybrida como las que pertenecen al género Glandularia; son particularmente preferibles plantas de Salvia splendens como las que pertenecen al género Salvia; son particularmente preferibles plantas de Rauvolfia serpentina como las que pertenecen al género Rauvolfia; son particularmente preferibles plantas de Catharanthus roseus como las que pertenecen al género Catharanthus; y son particularmente preferibles plantas de Chamaemelum nobile como las que pertenecen al género Chamaemelum. Entre ellas, es más preferible plátano, fresa, manzana, albaricoque japonés, pera europea, arándano, kiwi, melón, papaya o aguacate. Además, entre ellas, es particularmente preferible plátano, manzana, pera europea, kiwi, melón, papaya o aguacate.
Debe indicarse que, en el caso de realizar la reacción de síntesis usando una planta tal cual como fuente de enzima, en particular, es más preferible usar plantas que pertenecen a Malus, Carica y Persea, cuando se define un alcohol C1-2 como sustrato. Esto se debe a que tienen una eficacia de generación superior a plantas que pertenecen a otro género.
En la presente invención, las clasificaciones de plantas se definen siguiendo el Botanical Journal de la Linnean Society, 2009, 161, 105121.
En la presente invención, tras suministrar AAT para la reacción, el modo de uso no está particularmente limitado siempre que presente la actividad catalítica mencionada anteriormente, y es posible usar el tejido biológico o producto procesado del mismo tal cual. Como tal tejido biológico, puede usarse toda la planta, órganos de la planta (por ejemplo, fruto, hojas, pétalos, tallo, semilla, etc.), o tejido de la planta (por ejemplo, piel del fruto, sarcocarpio, etc.). Como producto procesado de la misma, puede ejemplificarse el líquido enzimático en bruto de la extracción de AAT a partir de estos tejidos biológicos, enzima purificada, o similares.
Microorganismo recombinante de expresión de actividad de AAT
Además, tras suministrar AAT para la reacción, el gen para la AAT se aísla, por ejemplo, se introduce en un sistema
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de huésped-vector general, y puede usarse el microorganismo transformado mediante este sistema de vector. Como huésped, con respecto a bacterias, pueden ejemplificarse E. coli, Rhodococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, etc.; con respecto a levaduras, pueden ejemplificarse Saccharomyces, Candida, Shizosaccharomyces y Pichia; y con respecto a hongos filamentosos, pueden ejemplificarse Aspergillus, etc. Entre estos, es particularmente fácil usar bacterias, y también es preferible en eficacia.
Se han publicado varios genes de AAT (por ejemplo, se remite al documento de patente 7). Se prepara una sonda de ADN basándose en esta publicación, y por ejemplo, se prepara un cebador usado en PCR, y este gen puede aislarse realizando PCR. Además, también es posible sintetizar completamente la secuencia de nucleótidos del gen de AAT mediante un método común. Puede confirmarse de manera similar mediante el método si estas AAT para las que se conoce la información genética tienen actividad de síntesis para éster del ácido metacrílico. Por otro lado, para AAT que tienen información genética que no está clara, puede purificarse la AAT, y puede obtenerse información genética mediante un método de ingeniería genética basándose en las proteínas de la misma.
Como gen de AAT preferido para su uso en el método de la presente invención, no está particularmente limitado siempre que el producto traducido del mismo tenga la capacidad de producir éster del ácido metacrílico, y se selecciona apropiadamente de entre las fuentes de enzima AAT. De manera particularmente preferible, pueden ejemplificarse el gen de AAT derivado de manzana (SEQ ID NO: 2), gen de AAT derivado de fresa (SEQ ID NO: 4) y gen de AAT derivado de fresa (SEQ ID NO: 6).
Debe indicarse que los genes que codifican proteínas que tienen actividad para producir éster del ácido metacrílico a partir de metacrilil-CoA y alcohol que incluyen una secuencia de aminoácidos en la que uno o una pluralidad de aminoácidos se han sustituido, delecionado o añadido a una secuencia de aminoácidos de tipo natural también se incluyen en los genes de AAT para su uso en el método de la presente invención.
En el presente documento, el término “pluralidad” se refiere a de 1 a 40, preferiblemente de 1 a 20, y más preferiblemente no más de 10. Con el fin de introducir mutación en el gen, es posible usar un kit para la introducción de mutaciones usando un método de mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange™ (Stratagene), el sistema de mutagénesis dirigida al sitio GeneTailor™ (Invitrogen), el sistema de mutagénesis dirigida al sitio TaKaRa (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.: Takara Bio), etc., mediante un método conocido tal como el método Kunkel o el método Gapped duplex. Alternativamente, todo el gen que tiene una secuencia que incluye mutación puede sintetizarse artificialmente.
En el presente método, la confirmación de la secuencia de nucleótidos de ADN puede realizarse mediante determinación de la secuencia mediante un método común. Por ejemplo, basándose en el método de Sanger, es posible confirmar la secuencia usando un secuenciador de ADN apropiado.
Además, en el gen de AAT para su uso en el método de la presente invención, también se incluyen genes que codifican proteínas que tienen actividad para producir éster del ácido metacrílico a partir de metacrilil-CoA y alcohol que expresan una identidad de al menos el 90 % con la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de tipo natural, preferiblemente el 95 %, más preferiblemente el 99,5 % e incluso más preferiblemente el 99,9 %.
Además, en el gen de AAT para su uso en el método de la presente invención, también se incluyen genes que se hibridan en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de tipo natural, y que codifican una proteína que tiene actividad para producir éster del ácido metacrílico a partir de metacrilil-CoA y alcohol. Como condiciones rigurosas, por ejemplo, es posible ejemplificar condiciones de realizar la hibridación manteniendo una membrana de nailon que fija el ADN a la misma temperatura mientras se estudia con sonda a 65 °C durante 20 horas en una disolución que contiene 6 * SSC (1 * SSC se prepara disolviendo 8,76 g de cloruro de sodio y 4,41 g de citrato de sodio en 1 litro de agua), SDS al 1 %, ADN de esperma de salmón 100 |ig/ml, albúmina sérica bovina al 0,1 %, polivinilpirrolidona al 0,1 % y ficoll al 0,1 %. Para un experto en la técnica, es posible tener en cuenta otros términos y condiciones tales como concentración de sonda, longitud de sonda y tiempo de reacción además de condiciones tales como concentración de sal, temperatura del tampón, etc. para establecer las condiciones de hibridación. Como condiciones de secado tras la hibridación, por ejemplo, pueden ejemplificarse “2 * SSC, SDS al 0,1 %, 42 °C” y“1 * SSC, SDS al 0,1 %, 37 °C”, y como condiciones más rigurosas, por ejemplo, condiciones tales como “1 * SSC, SDS al 0,1 %, 65 °C” y “0,5 * SSC, SDS al 0,1 %, 50 °C”.
Con respecto a la secuencia detallada del método de hibridación, es posible referirse a Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2.a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons (1987-1997)), o similares.
Además, en el gen de AAT para su uso en el método de la presente invención, cuando se calcula usando la secuencia de nucleótidos de tipo natural, BLAST, etc. (por ejemplo, parámetros por defecto, es decir configuración inicial, parámetros), también se incluyen genes que codifican proteína que tiene actividad para producir éster del ácido metacrílico a partir de metacrilil-CoA y alcohol que consisten en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 90 % y más preferiblemente al menos el 95 %.
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Además, los codones de los genes de AAT mencionados anteriormente pueden cambiarse según la frecuencia de uso de codones en el microorganismo huésped usado en la transformación genética.
En el presente documento, a “identidad” de la secuencia, cuando es el caso de una secuencia de nucleótidos, se llega alineando ambas secuencias de nucleótidos de modo que las bases de las dos secuencias de nucleótidos que van a compararse coincidan tanto como sea posible, y luego expresando un valor al que se llega restando el número de bases coincidentes del número total de bases como un porcentaje. Tras la alineación mencionada anteriormente, se insertan huecos apropiados en una o ambas de las dos secuencias comparadas según sea necesario. Una alineación de secuencias de este tipo puede realizarse usando un programa conocido tal como BLAST, FASTA y CLUSTAL, por ejemplo. En el caso de que estén insertándose huecos, el número total de bases mencionado anteriormente se convierte en el número de bases al que se llega contando un hueco como una base. En el caso de que el número total de bases al que se llega contando de ese modo difiera entre las dos secuencias comparadas, la identidad (%) se calcula restando el número de bases coincidentes del número total de bases en la secuencia más larga. Esto se aplica de manera similar también para la identidad de secuencias de aminoácidos.
En la reacción de síntesis del éster del ácido metacrílico, es posible usar el caldo obtenido cultivando estos microorganismos recombinantes tal cual, o usar la célula bacteriana obtenida mediante una operación de cosecha tal como centrifugación de este caldo, un producto procesado del mismo, o similar. Como producto procesado de células bacterianas, pueden ejemplificarse una célula bacteriana tratada con acetona, tolueno o similar, células bacterianas secadas por congelación, células bacterianas rotas o extracto no celular a partir de células bacterianas rotas, enzima en bruto extraída de estas enzimas o enzima purificada, etc.
El éster del ácido metacrílico también puede sintetizarse con isobutiril-CoA o 3-hidroxiisobutiril-CoA como materia prima introduciendo simultáneamente gen de ACD o gen de ECH con gen de AAT (se remite a la figura 1 y la figura 2). Además, combinando e introduciendo gen de ácido 2-oxoisovalérico deshidrogenasa (a continuación en el presente documento denominada BCKAD), también es posible sintetizar ácido metacrílico a partir de ácido 2- oxoisovalérico.
Aunque no hay ninguna limitación particular en los orígenes de ACD, ECH y BCKAD, pueden ejemplificarse los microorganismos enumerados a continuación.
Es un microorganismo que pertenece al género Magnetospirillum, Rhodospirillum, Azospirillum, Tistrella, Acidiphilium, Rhodobacter, Paracoccus, Ruegeria, Jannaschia, Roseobacter, Dinoroseobacter, Pseudovibrio, Phaeobacter, Octadecabacter, Hyphomonas, Maricaulis, Hirschia, Sphingomonas, Novosphingobium, Sphingopyxis, Sphingobium, Erythrobacter, Brevundimonas, Caulobacter, Phenylobacterium, Asticcacaulis, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Xanthobacter, Azorhizobium, Brucella, Ochrobactrum, Mesorhizobium, Chelativorans, Aurantimonas, Bradyrhizobium, Agromonas, Rhodopseudomonas, Nitrobacter, Methylobacterium, Rhodomicrobium, Pelagibacterium, Parvibaculum, Methylocystis, Parvularcula, Burkholderia, Ralstonia, Cupriavidus, Polynucleobacter, Achromobacter, Bordetella, Taylorella, Pusillimonas, Comamonas, Alicycliphilus, Delftia, Ramlibacter, Rhodoferax, Variovorax, Polaromonas, Acidovorax, Verminephrobacter, Herminiimonas, Herbaspirillum, Collimonas, Chromobacterium, Laribacter, Pseudogulbenkiania, Nitrosomonas, Nitrosospira, Aromatoleum, Azoarcus, Dechloromonas, Thauera, Azospira (Dechlorosoma), Rheinheimera, Nitrosococcus, Halorhodospira, Xanthomonas, Stenotrophomonas, Pseudoxanthomonas, Rhodanobacter, Francisella, Cycloclasticus, Oceanospirillum, Hahella, Halomonas, Alcanivorax, Kangiella, Pseudomonas, Azotobacter, Acinetobacter, Psychrobacter, Alishewanella, Alteromonas, Glaciecola, Marinobacter, Marinobacterium, Saccharophagus, Shewanella, Ferrimonas, Idiomarina, Colwellia, Pseudoalteromonas, Listonella, Vibrio, Photobacterium, Aeromonas, Oceanimonas, Salinisphaera, Legionella, Coxiella, Desulfococcus, Desulfobacterium, Desulfatibacillum, Desulfobulbus, Desulfarculus, Geobacter, Syntrophobacter, Syntrophus, Desulfomonile, Bdellovibrio, Bacteriovorax, Stigmatella, Myxococcus, Anaeromyxobacter, Sorangium, Haliangium, Acidobacterium, Granulicella, Ilumatobacter, Streptosporangium, Nocardiopsis, Thermobifida, Thermomonospora, Pseudonocardia, Amycolatopsis, Saccharomonospora,
Saccharopolyspora, Thermobispora, Actinosynnema, Micromonospora, Salinispora, Verrucosispora, Nocardioides, Kribbella, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Gordonia, Dietzia, Mycobacterium, Amycolicicoccus, Tsukamurella, Segniliparus, Microbacterium, Micrococcus, Arthrobacter, Citricoccus, Renibacterium, Kocuria, Kytococcus, Cellulomonas, Intrasporangium, Serinicoccus, Frankia, Acidothermus, Nakamurella, Geodermatophilus, Stackebrandtia, Streptomyces, Catenulispora, Rubrobacter, Conexibacter, Bacillus, Geobacillus, Oceanobacillus, Lysinibacillus, Halobacillus, Alicyclobacillus, Kyrpidia, Paenibacillus, Lactobacillus, Carnobacterium, Clostridium, Alkaliphilus, Syntrophomonas, Syntrophothermus, Eubacterium, Desulfitobacterium, Desulfotomaculum, Pelotomaculum, Butyrivibrio, Roseburia, Oscillibacter, Thermoanaerobacter, Carboxydothermus, Natranaerobius, Sphingobacterium, Pedobacter, Haliscomenobacter, Porphyromonas, Odoribacter, Spirosoma, Runella, Maribacter, Deinococcus, Thermus, Meiothermus, Oceanithermus, Marinithermus, Gemmatimonas, Fusobacterium, Ilyobacter, Roseiflexus, Herpetosiphon, Thermomicrobium, Thermotoga, Thermosipho, Fervidobacterium, Deferribacter, Calditerrivibrio, Flexistipes, Metallosphaera, Aeropyrum, Pyrobaculum, Caldivirga, Vulcanisaeta, Acidilobus, Haloarcula, Haloquadratum, Natronomonas, Halorubrum, Haloterrigena, Natrialba, Halalkalicoccus,
Halogeometricum, Thermoplasma, Picrophilus, Ferroplasma, Archaeoglobus, Ferroglobus, Polymorphum, Micavibrio, Simiduia, Leptothrix, Thiomonas, Rubrivivax, Methylibium, Exiguobacterium y Anaerococcus.
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Además, Magnetospirillum magneticum es particularmente preferible como el microorganismo clasificado como Magnetospirillum; son particularmente preferibles Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum centenum y Rhodospirillum photometricum como el microorganismo clasificado como Rhodospirillum; son particularmente preferibles
Azospirillum lipoferum y Azospirillum brasilense como el microorganismo clasificado como Azospirillum; es particularmente preferible Tistrella mobilis como el microorganismo clasificado como Tistrella; son particularmente preferibles Acidiphilium cryptum y Acidiphilium multivorum como el microorganismo clasificado como Acidiphilium; son particularmente preferibles Rhodobacter sphaeroides y Rhodobacter capsulatus como el microorganismo clasificado como Rhodobacter, son particularmente preferibles Paracoccus denitrificans y Paracoccus aminophilus como el microorganismo clasificado como Paracoccus; es particularmente preferible Ruegeria pomeroyi como el microorganismo clasificado como Ruegeria; son particularmente preferibles Roseobacter denitrificans y Roseobacter litoralis como el microorganismo clasificado como Roseobacter; es particularmente preferible Dinoroseobacter shibae como el microorganismo clasificado como Dinoroseobacter, es particularmente preferible Phaeobacter gallaeciensis como el microorganismo clasificado como Phaeobacter; son particularmente preferibles
Octadecabacter antarcticus y Octadecabacter arcticus como el microorganismo clasificado como Octadecabacter; es particularmente preferible Hiphomonas neptunium como el microorganismo clasificado como Hiphomonas; es particularmente preferible Maricaulis maris como el microorganismo clasificado como Maricaulis; es particularmente preferible Hirschia baltica como el microorganismo clasificado como Hirschia; son particularmente preferibles Sphingomonas paucimobilis y Sphingomonas wittichii como el microorganismo clasificado como Sphingomonas; es particularmente preferible Novosphingobium aromaticivorans como el microorganismo clasificado como
Novosphingobium; es particularmente preferible Sphingopyxis alaskensis como el microorganismo clasificado como Sphingopyxis; son particularmente preferibles Sphingobium japonicum y Sphingobium clorofenolicum como el microorganismo clasificado como Sphingobium; es particularmente preferible Erythrobacter litoralis como el microorganismo clasificado como Erythrobacter; son particularmente preferibles Brevundimonas diminuta,
Brevundimonas subvibrioides y Brevundimonas vesicularis como el microorganismo clasificado como
Brevundimonas; son particularmente preferibles Caulobacter crescentus y Caulobacter segnis como el
microorganismo clasificado como Caulobacter; es particularmente preferible Phenylobacterium zucineum como el microorganismo clasificado como Phenylobacterium; es particularmente preferible Asticcacaulis excentricus como el microorganismo clasificado como Asticcacaulis; son particularmente preferibles Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter y Agrobacterium luteum como el microorganismo clasificado como Agrobacterium; son particularmente preferibles Rhizobium leguminosarum, Rhizobium etli y Rhizobium tropici como el microorganismo clasificado como Rhizobium; son particularmente preferibles Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium medicae y Sinorhizobium fredii como el microorganismo clasificado como Sinorhizobium; son particularmente preferibles Xanthobacter agilis, Xanthobacter aminoxidans, Xanthobacter autotrophicus, Xanthobacter flavus, Xanthobacter tagetidis y Xanthobacter viscosus como el microorganismo clasificado como Xanthobacter; es particularmente preferible Azorhizobium caulinodans como el microorganismo clasificado como Azorhizobium; son particularmente preferibles Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella ovis, Brucella canis, Brucella microti, Brucella pinnipedialis y Brucella ceti como el microorganismo clasificado como Brucella; son particularmente preferibles Ochrobactrum anthropi, Ochrobactrum cytisi, Ochrobactrum daejeonense, Ochrobactrum gallinifaecis, Ochrobactrum grignonense, Ochrobactrum haemophilum, Ochrobactrum intermedium, Ochrobactrum lupini, Ochrobactrum oryzae, Ochrobactrum pseudintermedium, Ochrobactrum pseudogrignonense, Ochrobactrum tiofenivorans y Ochrobactrum tritici como el microorganismo clasificado como Ochrobactrum; son particularmente preferibles Mesorhizobium alhagi, Mesorhizobium albiziae, Mesorhizobium amorphae, Mesorhizobium australicum, Mesorhizobium caraganae, Mesorhizobium chacoense, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium gobiense, Mesorhizobium loti, Mesorhizobium mediterraneum, Mesorhizobium metallidurans, Mesorhizobium opportunistum, Mesorhizobium plurifarium, Mesorhizobium huakuii, Mesorhizobium septentrionale, Mesorhizobium shangrilense, Mesorhizobium tarimense, Mesorhizobium temperatum, Mesorhizobium tiogangeticu y Mesorhizobium tianshanense como el microorganismo clasificado como Mesorhizobium; es particularmente preferible Aurantimonas manganoxidans como el microorganismo clasificado como Aurantimonas; es particularmente preferible Bradyrhizobium japonicum como el microorganismo clasificado como Bradyrhizobium; es particularmente preferible Agromonas oligotrophica como el microorganismo clasificado como Agromonas; es particularmente preferible Rhodopseudomonas palustris como el microorganismo clasificado como Rhodopseudomonas; son particularmente preferibles Nitrobacter winogradskyi y Nitrobacter hamburgensis como el microorganismo clasificado como Nitrobacter; son particularmente preferibles Methylobacterium extorquens, Methylobacterium radiotolerans y Methylobacterium nodulans como el microorganismo clasificado como Methylobacterium; es particularmente preferible Rhodomicrobium vannielii como el microorganismo clasificado como Rhodomicrobium; es particularmente preferible Pelagibacterium halotolerans como el microorganismo clasificado como Pelagibacterium; es particularmente preferible Parvibaculum lavamentivorans como el microorganismo clasificado como Parvibaculum; es particularmente preferible Parvularcula bermudensis como el microorganismo clasificado como Parvularcula; son particularmente preferibles Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia thailandensis, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia ambifaria, Burkholderia multivorans, Burkholderia cepacia, Burkholderia xenovorans, Burkholderia phymatum, Burkholderia phytofirmans, Burkholderia glumae, Burkholderia rhizoxinica, Burkholderia gladioli, Burkholderia fenoliruptrix y Burkholderia oklahomensis como el microorganismo clasificado como Burkholderia; son particularmente preferibles Ralstonia solanacearum, Ralstonia pickettii y Ralstonia eutropha como el microorganismo clasificado como Ralstonia; son particularmente preferibles Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus taiwanensis y Cupriavidus necator como el microorganismo clasificado como Cupriavidus; es particularmente preferible Polynucleobacter necessarius como el microorganismo clasificado como Polynucleobacter; son particularmente
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preferibles Achromobacter arsenitoxydans, Achromobacter cholinophagum, Achromobacter cycloclastes, Achromobacter denitrificans, Achromobacter fischeri, Achromobacter hartlebii, Achromobacter immobilis, Achromobacter insolitus, Achromobacter lactolyticus, Achromobacter lyticus, Achromobacter methanolophila, Achromobacter pestifer, Achromobacter piechaudii, Achromobacter ruhlandii, Achromobacter spanios, Achromobacter viscosus, Achromobacter xerosis y Achromobacter xilosoxidans como el microorganismo clasificado como Achromobacter; son particularmente preferibles Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella petrii y Bordetella avium como el microorganismo clasificado como Bordetella; es particularmente preferible Taylorella equigenitalis como el microorganismo clasificado como Taylorella; son particularmente preferibles Comamonas acidovorans, Comamonas aquatica, Comamonas badia, Comamonas composti, Comamonas denitrificans, Comamonas granuli, Comamonas kerstersii, Comamonas koreensis, Comamonas nitrativorans, Comamonas odontotermites, Comamonas terrae, Comamonas terrigena, Comamonas testosteroni, Comamonas tiooxidans y Comamonas zonglianii como el microorganismo clasificado como Comamonas; es particularmente preferible Alicycliphilus denitrificans como el microorganismo clasificado como Alicycliphilus; es particularmente preferible Delftia acidovorans como el microorganismo clasificado como Delftia; es particularmente preferible Ramlibacter tataouinensis como el microorganismo clasificado como Ramlibacter, es particularmente preferible Rhodoferax ferrireducens como el microorganismo clasificado como Rhodoferax; es particularmente preferible Variovorax paradoxus como el microorganismo clasificado como Variovorax; es particularmente preferible Polaromonas naphthalenivorans como el microorganismo clasificado como Polaromonas; son particularmente preferibles Acidovorax citrulli, Acidovorax ebreus y Acidovorax avenae como el microorganismo clasificado como Acidovorax; es particularmente preferible Verminephrobacter eiseniae como el microorganismo clasificado como Verminephrobacter; es particularmente preferible Herminiimonas arsenicoxidans como el microorganismo clasificado como Herminiimonas; es particularmente preferible Herbaspirillum seropedicae como el microorganismo clasificado como Herbaspirillum; es particularmente preferible Collimonas fungivorans como el microorganismo clasificado como Collimonas; es particularmente preferible Chromobacterium violaceum como el microorganismo clasificado como Chromobacterium; es particularmente preferible Laribacter hongkongensis como el microorganismo clasificado como Laribacter, es particularmente preferible Pseudogulbenkiania ferrooxidans como el microorganismo clasificado como Pseudogulbenkiania; es particularmente preferible Nitrosomonas europaea como el microorganismo clasificado como Nitrosomonas; es particularmente preferible Nitrosospira multiformis como el microorganismo clasificado como Nitrosospira; es particularmente preferible Aromatoleum aromaticum como el microorganismo clasificado como Aromatoleum; es particularmente preferible Decloromonas aromatica como el microorganismo clasificado como Decloromonas; es particularmente preferible Azospira oryzae (Declorosoma suillum) como el microorganismo clasificado como Azospira (Declorosoma); es particularmente preferible Rheinheimera nanhaiensis como el microorganismo clasificado como Rheinheimera; es particularmente preferible Nitrosococcus oceani como el microorganismo clasificado como Nitrosococcus; es particularmente preferible Halorhodospira halophila como el microorganismo clasificado como Halorhodospira; son particularmente preferibles Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas oryzae, Xanthomonas albilineans y Xanthomonas citri como el microorganismo clasificado como Xanthomonas; es particularmente preferible Stenotrophomonas maltophilia como el microorganismo clasificado como Stenotrophomonas; son particularmente preferibles Pseudoxanthomonas suwonensis y Pseudoxanthomonas spadix como el microorganismo clasificado como Pseudoxanthomonas; son particularmente preferibles Francisella tularensis y Francisella novicida como el microorganismo clasificado como Francisella; es particularmente preferible Cycloclasticus zancles como el microorganismo clasificado como Cycloclasticus; es particularmente preferible Hahella chejuensis como el microorganismo clasificado como Hahella; es particularmente preferible Halomonas elongata como el microorganismo clasificado como Halomonas; son particularmente preferibles Alcanivorax borkumensis y Alcanivorax dieselolei como el microorganismo clasificado como Alcanivorax; es particularmente preferible Kangiella koreensis como el microorganismo clasificado como Kangiella; son particularmente preferibles Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas agarici, Pseudomonas syringae, Pseudomonas amygdale y Pseudomonas stutzeri, por ejemplo, como el microorganismo clasificado como Pseudomonas; es particularmente preferible Azotobacter vinelandii como el microorganismo clasificado como Azotobacter, son particularmente preferibles Acinetobacter baumannii, Acinetobacter ailyi, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter gyllenbergii, Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacter johnsonii, Acinetobacter junii, Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter oleivorans y Acinetobacter parvus como el microorganismo clasificado como Acinetobacter; son particularmente preferibles Psychrobacter arcticus y Psychrobacter cryohalolentis como el microorganismo clasificado como Psychrobacter, es particularmente preferible Alishewanella jeotgali como el microorganismo clasificado como Alishewanella; es particularmente preferible Alteromonas macleodii como el microorganismo clasificado como Alteromonas; son particularmente preferibles Glaciecola nitratireducens, Glaciecola psychrophila y Glaciecola punicea como el microorganismo clasificado como Glaciecola; son particularmente preferibles Marinobacter aquaeolei, Marinobacter hidrocarbonoclasticus, Marinobacter adhaerens, Marinobacter algicola y Marinobacter manganoxidans como el microorganismo clasificado como Marinobacter; es particularmente preferible Marinobacterium stanieri como el microorganismo clasificado como Marinobacterium; es particularmente preferible Saccharophagus degradans como el microorganismo clasificado como Saccharophagus; son particularmente preferibles Shewanella piezotolerans, Shewanella abyssi, Shewanella affinis, Shewanella algae, Shewanella algidipiscicola, Shewanella amazonensis, Shewanella aquimarina, Shewanella arctica, Shewanella atlantica, Shewanella baltica, Shewanella basaltis, Shewanella benthica, Shewanella candadensis, Shewanella chilikensis, Shewanella colwelliana, Shewanella corallii, Shewanella decoloracionis, Shewanella denitrificans, Shewanella donghaensis, Shewanella fidelis, Shewanella fodinae, Shewanella frigidimarina, Shewanella gaetbuli, Shewanella gelidimarina, Shewanella glacialipiscicola, Shewanella gopherii,
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Shewanella hafniensis, Shewanella halifaxensis, Shewanella haliotis, Shewanella hanedai, Shewanella japónica, Shewanella kaireitica, Shewanella ivingstonensis, Shewanella loihica, Shewanella marina, Shewanella marinintestina, Shewanella marisflavi, Shewanella morhuae, Shewanella olleyana, Shewanella oneidensis, Shewanella pacifica, Shewanella pealeana, Shewanella pneumatophori, Shewanella profunda, Shewanella putrefaciens, Shewanella sairae, Shewanella schlegeliana, Shewanella sediminis, Shewanella surugensis, Shewanella vesiculosa, Shewanella violacea, Shewanella waksmanii, Shewanella woodyi y Shewanella xiamenensis como el microorganismo clasificado como Shewanella; es particularmente preferible Ferrimonas balearica como el microorganismo clasificado como Ferrimonas; son particularmente preferibles Idiomarina loihiensis e Idiomarina baltica como el microorganismo clasificado como Idiomarina; es particularmente preferible Colwellia psychrerythraea como el microorganismo clasificado como Colwellia; son particularmente preferibles Pseudoalteromonas haloplanktis, Pseudoalteromonas atlantica y Pseudoalteromonas tunicata como el microorganismo clasificado como Pseudoalteromonas; son particularmente preferibles Listonella anguillara, Listonella anguillarum y Listonella pelagia como el microorganismo clasificado como Listonella; son particularmente preferibles Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio harveyi, Vibrio furnissii, Vibrio tubiashii, Vibrio sinaloensis, Vibrio rotiferianus, Vibrio orientalis, Vibrio harveyi, Vibrio coralliilyticus, Vibrio caribbenthicus, Vibrio brasiliensis y Vibrio alginolyticus como el microorganismo clasificado como Vibrio; es particularmente preferible Photobacterium profundum como el microorganismo clasificado como Photobacterium; son particularmente preferibles Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida y Aeromonas veronii como el microorganismo clasificado como Aeromonas; es particularmente preferible Salinisphaera shabanensis como el microorganismo clasificado como Salinisphaera; son particularmente preferibles Legionella pneumophila y Legionella longbeachae como el microorganismo clasificado como Legionella; es particularmente preferible Coxiella burnetii como el microorganismo clasificado como Coxiella; es particularmente preferible Desulfococcus oleovorans como el microorganismo clasificado como Desulfococcus; es particularmente preferible Desulfobacterium autotrophicum como el microorganismo clasificado como Desulfobacterium; es particularmente preferible Desulfatibacillum alquenivorans como el microorganismo clasificado como Desulfatibacillum; es particularmente preferible Desulfobulbus propionicus como el microorganismo clasificado como Desulfobulbus; es particularmente preferible Desulfarculus baarsii como el microorganismo clasificado como Desulfarculus; son particularmente preferibles Geobacter metallireducens, Geobacter uraniireducens y Geobacter bemidjiensis como el microorganismo clasificado como Geobacter; es particularmente preferible Syntrophobacter fumaroxidans como el microorganismo clasificado como Syntrophobacter; es particularmente preferible Syntrophus aciditrophicus como el microorganismo clasificado como Syntrophus; es particularmente preferible Desulfomonile tiedjei como el microorganismo clasificado como Desulfomonile; son particularmente preferibles Bdellovibrio bacteriovorus y Bdellovibrio exovorus como el microorganismo clasificado como Bdellovibrio; es particularmente preferible Bacteriovorax marinus como el microorganismo clasificado como Bacteriovorax; es particularmente preferible Stigmatella aurantiaca como el microorganismo clasificado como Stigmatella; son particularmente preferibles Myxococcus xanthus y Myxococcus fulvus como el microorganismo clasificado como Myxococcus; es particularmente preferible Anaeromyxobacter dehalogenoans como el microorganismo clasificado como Anaeromyxobacter; es particularmente preferible Sorangium cellulosum como el microorganismo clasificado como Sorangium; es particularmente preferible Haliangium ochraceum como el microorganismo clasificado como Haliangium; es particularmente preferible Acidobacterium capsulatum como el microorganismo clasificado como Acidobacterium; es particularmente preferible Granulicella tundricola como el microorganismo clasificado como Granulicella; es particularmente preferible Ilumatobacter coccineum como el microorganismo clasificado como Ilumatobacter; es particularmente preferible Streptosporangium roseum como el microorganismo clasificado como Streptosporangium; es particularmente preferible Nocardiopsis dassonvillei como el microorganismo clasificado como Nocardiopsis; es particularmente preferible Thermobifida fusca como el microorganismo clasificado como Thermobifida; es particularmente preferible Thermomonospora curvata como el microorganismo clasificado como Thermomonospora; es particularmente preferible Pseudonocardia dioxanivorans como el microorganismo clasificado como Pseudonocardia; es particularmente preferible Amycolatopsis mediterranei como el microorganismo clasificado como Amycolatopsis; son particularmente preferibles Saccharomonospora viridis y Saccharomonospora xinjiangensis como el microorganismo clasificado como Saccharomonospora; son particularmente preferibles Saccharopolyspora erythraea y Saccharopolyspora spinosa como el microorganismo clasificado como Saccharopolyspora; es particularmente preferible Thermobispora bispora como el microorganismo clasificado como Thermobispora; es particularmente preferible Actinosynnema mirum como el microorganismo clasificado como Actinosynnema; es particularmente preferible Micromonospora aurantiaca como el microorganismo clasificado como Micromonospora; son particularmente preferibles Salinispora tropica y Salinispora arenicola como el microorganismo clasificado como Salinispora; es particularmente preferible Verrucosispora maris como el microorganismo clasificado como Verrucosispora; es particularmente preferible Kribbella flavida como el microorganismo clasificado como Kribbella; son particularmente preferibles Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium urealyticum y Corynebacterium kroppenstedtii como el microorganismo clasificado como Corynebacterium; son particularmente preferibles Nocardia farcinica, Nocardia brasiliensis y Nocardia cyriacigeorgica como el microorganismo clasificado como Nocardia; son particularmente preferibles Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus equi, Rhodococcus rhodnii, Rhodococcus corallinus, Rhodococcus rubropertinctus, Rhodococcus coprophilus, Rhodococcus globerulus, Rhodococcus chlorofenolicus, Rhodococcus luteus, Rhodococcus aichiensis, Rhodococcus chubuensis, Rhodococcus maris y Rhodococcus fascines como el microorganismo clasificado como Rhodococcus; son particularmente preferibles Gordonia bronchialis, Gordonia neofelifaecis y Gordonia terrae como el microorganismo clasificado como Gordonia; es particularmente preferible Dietzia cinnamea como el microorganismo clasificado como Dietzia; son particularmente preferibles Mycobacterium tuberculosis,
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Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium avium, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium vanbaalenii, Mycobacterium gilvum, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium marinu, Mycobacterium massiliense, Mycobacterium phlei, Mycobacterium thermoresistibile, Mycobacterium tusciae, Mycobacterium xenopi y Mycobacterium rhodesiae como el microorganismo clasificado como Mycobacterium; es particularmente preferible Amycolicicoccus subflavus como el microorganismo clasificado como Amycolicicoccus; es particularmente preferible Tsukamurella paurometabola como el microorganismo clasificado como Tsukamurella; es particularmente preferible Segniliparus rotundus como el microorganismo clasificado como Segniliparus; es particularmente preferible Microbacterium testaceum como el microorganismo clasificado como Microbacterium; es particularmente preferible Micrococcus luteus como el microorganismo clasificado como Micrococcus; son particularmente preferibles Arthrobacter arilaitensis, Arthrobacter chlorofenolicus, Arthrobacter globiformis y Arthrobacter fenanthrenivorans como el microorganismo clasificado como Arthrobacter; es particularmente preferible Renibacterium salmoninarum como el microorganismo clasificado como Renibacterium; es particularmente preferible Kocuria rhizophila como el microorganismo clasificado como Kocuria; es particularmente preferible Kytococcus sedentarius como el microorganismo clasificado como Kytococcus; es particularmente preferible Cellulomonas fimi como el microorganismo clasificado como Cellulomonas; es particularmente preferible Intrasporangium calvum como el microorganismo clasificado como Intrasporangium; es particularmente preferible Serinicoccus profundi como el microorganismo clasificado como Serinicoccus; es particularmente preferible Frankia alni como el microorganismo clasificado como Frankia; es particularmente preferible Acidothermus cellulolyticus como el microorganismo clasificado como Acidothermus; es particularmente preferible Nakamurella multipartita como el microorganismo clasificado como Nakamurella; es particularmente preferible Geodermatophilus obscurus como el microorganismo clasificado como Geodermatophilus; es particularmente preferible Stackebrandtia nassauensis como el microorganismo clasificado como Stackebrandtia; son particularmente preferibles Streptomyces albus, Streptomyces avermitilis, Streptomyces bingchenggensis, Streptomyces chartreusis, Streptomyces clavuligerus, Streptomyces coelicoflavus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces ghanaensis, Streptomyces griseus, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces lividans, Streptomyces roseosporus, Streptomyces scabiei, Streptomyces sviceus, Streptomyces venezuelae, Streptomyces violaceusniger y Streptomyces viridochromogenes como el microorganismo clasificado como Streptomyces; es particularmente preferible Catenulispora acidiphila como el microorganismo clasificado como Catenulispora; es particularmente preferible Rubrobacter xilanophilus como el microorganismo clasificado como Rubrobacter; es particularmente preferible Conexibacter woesei como el microorganismo clasificado como Conexibacter; son particularmente preferibles Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Bacillus pseudofirmus, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis como el microorganismo clasificado como Bacillus; son particularmente preferibles Geobacillus caldoproteolyticus, Geobacillus
caldoxylosilyticus, Geobacillus debilis, Geobacillus galactosidasius, Geobacillus gargensis, Geobacillus jurassicus, Geobacillus kaustophilus, Geobacillus lituanicus, Geobacillus pallidus, Geobacillus stearothermophilus, Geobacillus stromboliensis, Geobacillus subterraneus, Geobacillus tepidamans, Geobacillus thermocatenulatus, Geobacillus thermodenitrificans, Geobacillus thermoglucosidasius, Geobacillus thermoleovorans, Geobacillus toebii, Geobacillus uzensis, Geobacillus vulcani y Geobacillus zalihae como el microorganismo clasificado como Geobacillus; es particularmente preferible Oceanobacillus iheyensis como el microorganismo clasificado como Oceanobacillus; es particularmente preferible Lysinibacillus sphaericus como el microorganismo clasificado como Lysinibacillus; es particularmente preferible Halobacillus halophilus como el microorganismo clasificado como Halobacillus; es particularmente preferible Aliciclobacillus acidocaldarius como el microorganismo clasificado como Aliciclobacillus; es particularmente preferible Kyrpidia tusci como el microorganismo clasificado como Kyrpidia; son particularmente preferibles Paenibacillus polimyxa, Paenibacillus mucilaginosus y Paenibacillus terrae como el microorganismo clasificado como Paenibacillus; es particularmente preferible Lactobacillus buchneri como el microorganismo clasificado como Lactobacillus; son particularmente preferibles Clostridium acetobutilicum, Clostridium perfringens, Clostridium kluyveri, Clostridium cellulovorans, Clostridium difficile y Clostridium sticklandii como el microorganismo clasificado como Clostridium; son particularmente preferibles Alkaliphilus metalliredigens y Alkaliphilus oremlandii como el microorganismo clasificado como Alkaliphilus; es particularmente preferible Syntrophomonas wolfei como el microorganismo clasificado como Syntrophomonas; es particularmente preferible Syntrophothermus lipocalidus como el microorganismo clasificado como Syntrophothermus; son particularmente preferibles Eubacterium rectale y Eubacterium limosum como el microorganismo clasificado como Eubacterium; es particularmente preferible Desulfitobacterium hafniense como el microorganismo clasificado como Desulfitobacterium; es particularmente preferible Desulfotomaculum reducens como el microorganismo clasificado como Desulfotomaculum; es particularmente preferible Pelotomaculum thermopropionicum como el microorganismo clasificado como
Pelotomaculum; es particularmente preferible Butyrivibrio proteoclasticus como el microorganismo clasificado como Butyrivibrio; es particularmente preferible Roseburia hominis como el microorganismo clasificado como Roseburia; es particularmente preferible Oscillibacter valericigenes como el microorganismo clasificado como Oscillibacter; es particularmente preferible Thermoanaerobacter tengcongensis como el microorganismo clasificado como
Thermoanaerobacter; es particularmente preferible Carboxydothermus hydrogenoformans como el microorganismo clasificado como Carboxydothermus; es particularmente preferible Natranaerobius thermophilus como el microorganismo clasificado como Natranaerobius; son particularmente preferibles Sphingobacterium multivorum, Sphingobacterium spiritivorum, Sphingobacterium alimentarium, Sphingobacterium anhuiense, Sphingobacterium antarcticum, Sphingobacterium bambusae, Sphingobacterium canadense, Sphingobacterium composti, Sphingobacterium daejeonense, Sphingobacterium faecium, Sphingobacterium heparinum, Sphingobacterium kitahiroshimense, Sphingobacterium lactis, Sphingobacterium mizutaii, Sphingobacterium nematocida,
Sphingobacterium piscium, Sphingobacterium shayense, Sphingobacterium siyangense, Sphingobacterium
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thalpophilum y Sphingobacterium wenxiniae como el microorganismo clasificado como Sphingobacterium; son particularmente preferibles Pedobacter steynii, Pedobacter duraquae, Pedobacter metabolipauper, Pedobacter hartonius, Pedobacter heparinus, Pedobacter africanus, Pedobacter agri, Pedobacter alluvius y Pedobacter saltans como el microorganismo clasificado como Pedobacter; es particularmente preferible Haliscomenobacter hydrossis como el microorganismo clasificado como Haliscomenobacter; son particularmente preferibles Porphyromonas gingivalis y Porphyromonas asaccharolytica como el microorganismo clasificado como Porphyromonas; es particularmente preferible Odoribacter splanchnicus como el microorganismo clasificado como Odoribacter; es particularmente preferible Spirosoma linguale como el microorganismo clasificado como Spirosoma; es particularmente preferible Runella slithyformis como el microorganismo clasificado como Runella; son particularmente preferibles Deinococcus radiodurans, Deinococcus geothermalis, Deinococcus deserti, Deinococcus maricopensis, Deinococcus proteolyticus y Deinococcus gobiensis como el microorganismo clasificado como Deinococcus; son particularmente preferibles Thermus thermophilus y Thermus scotoductusis como el microorganismo clasificado como Thermus; son particularmente preferibles Meiothermus ruber y Meiothermus silvanus como el microorganismo clasificado como Meiothermus; es particularmente preferible Oceanithermus profundus como el microorganismo clasificado como Oceanithermus; es particularmente preferible Marinithermus hydrothermalis como el microorganismo clasificado como Marinithermus; es particularmente preferible Gemmatimonas aurantiaca como el microorganismo clasificado como Gemmatimonas; es particularmente preferible Fusobacterium nucleatum como el microorganismo clasificado como Fusobacterium; es particularmente preferible Ilyobacter polytropus como el microorganismo clasificado como Ilyobacter; es particularmente preferible Roseiflexus castenholzii como el microorganismo clasificado como Roseiflexus; es particularmente preferible Herpetosiphon aurantiacus como el microorganismo clasificado como Herpetosiphon; es particularmente preferible Thermomicrobium roseum como el microorganismo clasificado como Thermomicrobium; es particularmente preferible Thermotoga lettingae como el microorganismo clasificado como Thermotoga; son particularmente preferibles Thermosipho melanesiensis y Thermosipho africanus como el microorganismo clasificado como
Thermosipho; es particularmente preferible Fervidobacterium nodosum como el microorganismo clasificado como Fervidobacterium; es particularmente preferible Deferribacter desulfuricans como el microorganismo clasificado como Deferribacter; es particularmente preferible Calditerrivibrio nitroreducens como el microorganismo clasificado como Calditerrivibrio; es particularmente preferible Flexistipes sinusarabici como el microorganismo clasificado como Flexistipes; es particularmente preferible Metallosphaera sedula como el microorganismo clasificado como
Metallosphaera; es particularmente preferible Aeropyrum pernix como el microorganismo clasificado como
Aeropyrum; son particularmente preferibles Pyrobaculum aerophilum, Pyrobaculum islandicum, Pyrobaculum calidifontis y Pyrobaculum neutrophilum como el microorganismo clasificado como Pyrobaculum; es particularmente preferible Caldivirga maquilingensis como el microorganismo clasificado como Caldivirga; es particularmente preferible Vulcanisaeta distributa como el microorganismo clasificado como Vulcanisaeta; es particularmente preferible Acidilobus saccharovorans como el microorganismo clasificado como Acidilobus; es particularmente preferible Haloarcula marismortui como el microorganismo clasificado como Haloarcula; es particularmente preferible Haloquadratum walsbyi como el microorganismo clasificado como Haloquadratum; es particularmente preferible Natronomonas pharaonis como el microorganismo clasificado como Natronomonas; es particularmente preferible Halorubrum lacusprofundi como el microorganismo clasificado como Halorubrum; es particularmente preferible Haloterrigena turkmenica como el microorganismo clasificado como Haloterrigena; es particularmente preferible Natrialba magadii como el microorganismo clasificado como Natrialba; es particularmente preferible Halalkalicoccus jeotgali como el microorganismo clasificado como Halalkalicoccus; es particularmente preferible Halogeometricum borinquense como el microorganismo clasificado como Halogeometricum; son particularmente preferibles Thermoplasma acidophilum y Thermoplasma volcanium como el microorganismo clasificado como Thermoplasma; es particularmente preferible Picrophilus torridus como el microorganismo clasificado como Picrophilus; es
particularmente preferible Ferroplasma acidarmanus como el microorganismo clasificado como Ferroplasma; son particularmente preferibles Archaeoglobus fulgidus y Archaeoglobus veneficus como el microorganismo clasificado como Archaeoglobus; es particularmente preferible Ferroglobus placidus como el microorganismo clasificado como Ferroglobus; es particularmente preferible Polymorphum gilvum como el microorganismo clasificado como Polymorphum; es particularmente preferible Micavibrio aeruginosavorus como el microorganismo clasificado como Micavibrio; es particularmente preferible Simiduia agarivorans como el microorganismo clasificado como Simiduia; es particularmente preferible Leptothrix cholodnii como el microorganismo clasificado como Leptothrix; es
particularmente preferible Thiomonas intermedia como el microorganismo clasificado como Thiomonas; es
particularmente preferible Rubrivivax gelatinosus como el microorganismo clasificado como Rubrivivax; es
particularmente preferible Metilibium petroleiphilum como el microorganismo clasificado como Metilibium; y es particularmente preferible Anaerococcus prevotii como el microorganismo clasificado como Anaerococcus.
Los microorganismos ejemplificados en el presente documento pueden obtenerse de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), National Institute of Technology and Evaluation, Biotechnology Division, Biological Resource Center (NBRC), National Institute of Advanced Industrial Science y Technology, Patent Organism Depository (FERM), o similares.
Procedimiento de síntesis de éster del ácido metacrílico
La producción de éster del ácido metacrílico puede realizarse mediante el siguiente método. Se preparó una disolución añadiendo alcohol o fenol representado por la fórmula 2 y metacrilil-CoA a un disolvente, y luego
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permitiendo que se disolviera o suspendiera. Entonces, se pone en contacto AAT con esta disolución o suspensión, y se permite que metacrilil-CoA y el alcohol o fenol reaccionen mientras se controlan las condiciones tales como temperatura. Por medio de la reacción, se transfiere un grupo metacrílico de metacrilil-CoA al alcohol o fenol de fórmula 2, provocando de ese modo que se forme éster del ácido metacrílico.
La disolución que contiene la metacrilil-CoA y alcohol o fenol representado por la fórmula 2 se prepara normalmente en un medio acuoso tal como una disolución de tampón. En el presente documento, con el fin de provocar que la reacción progrese suavemente, es posible controlar la concentración osmolar y/o fuerza iónica por medio de un regulador de la presión osmótica o similar. Como regulador de la presión osmótica, es suficiente si una sustancia soluble en agua añadida con el objeto de ajustar la presión osmótica de la disolución tal como el interior de la célula para hacerla isotónica o hipertónica, y por ejemplo, es una sal o sacárido, y preferiblemente una sal. La sal es preferiblemente una sal metálica, más preferiblemente una sal de metal alcalino, incluso más preferiblemente un haluro de metal alcalino, y por ejemplo, pueden ejemplificarse cloruro de sodio y cloruro de potasio. El sacárido es preferiblemente un monosacárido u oligosacárido, más preferiblemente un monosacárido o disacárido, y por ejemplo, pueden ejemplificarse glucosa, sacarosa, manitol y similares. El regulador de la presión osmótica se añade preferiblemente a una concentración de al menos 1 mM, y es de manera particularmente preferible para regular para hacerla isotónica o hipertónica en comparación con una disolución dentro de la célula biológica usada.
Además, con el objeto de separar el éster del ácido metacrílico así formado, puede añadirse un disolvente orgánico de antemano para hacer que reaccione en un sistema de dos fases. Como disolvente orgánico, por ejemplo, puede usarse un hidrocarburo alifático lineal, ramificado o cíclico, saturado o insaturado, o similar individualmente o mezclando dos o más tipos. Más específicamente, por ejemplo, pueden ejemplificarse disolventes de hidrocarburo (por ejemplo, pentano, hexano, ciclohexano, benceno, tolueno, xileno, etc.), disolventes de hidrocarburo halogenado (por ejemplo, cloruro de metileno, cloroformo, etc.), disolventes de éter (por ejemplo, dietil éter, dipropil éter, dibutil éter, terc-butil metil éter, dimetoxietano, etc.), disolventes de éster (por ejemplo, formiato de metilo, acetato de metilo, acetato de etilo, acetato de butilo, propionato de metilo), y similares. Añadiendo estos disolventes orgánicos, el éster del ácido metacrílico formado migrará a la fase orgánica, y la reacción puede progresar eficazmente.
Las razones molares y concentraciones de metacrilil-CoA y el alcohol o fenol representado por la fórmula 2 en la disolución de reacción son arbitrarias, y no están particularmente limitadas. Además, la cantidad de AAT usada o las condiciones de reacción se determinan según sea apropiado según las materias primas usadas. Habitualmente, la concentración de cada materia prima se ajusta al intervalo del 0,0000001 al 10 % en masa en el caso de metacrilil- CoA, y el alcohol o fenol se añade a una concentración de 0,1 a 1000 veces en moles, preferiblemente de 0,5 a 50 veces en moles, en relación con la metacrilil-CoA usada.
Otras diversas condiciones tales como la temperatura de reacción o el tiempo de reacción se determinan según sea apropiado según las materias primas usadas, la actividad de la enzima, etc., y no están particularmente limitadas; sin embargo, es suficiente normalmente si se permite que reaccionen a de 5 °C a 80 °C durante de 1 hora a 1 semana. A de 10 °C a 70 °C, es preferiblemente durante de 1 a 120 horas, más preferiblemente al menos 3 horas, y 4 o más horas es incluso más preferible. Es preferible seleccionar condiciones mediante las cuales la reacción se completa en tales condiciones. El pH de la disolución de reacción no está particularmente limitado siempre que la reacción progrese eficazmente; sin embargo, por ejemplo, es un intervalo de pH 4 a 10, y preferiblemente de pH 5,5 a 8,5.
Como condiciones ideales para provocar que se recoja éster del ácido metacrílico en al menos 0,001 mM, se prepara de modo que la concentración de metacrilil-CoA en la condición de pH 5,5 a 7,5 esté en el intervalo del 0,000001 al 1 % en masa directa o indirectamente, y el alcohol o fenol se ajusta a una concentración para que sea de 1 a 50 veces en moles en relación con la metacrilil-CoA usada. Entonces, se ajusta la temperatura al intervalo de 20 °C a 40 °C, y se permite la reacción durante al menos 3 horas. También es posible suministrar de manera continua estas materias primas (sustrato) para que estén en los intervalos mencionados anteriormente, y la concentración de acumulación de producto puede elevarse haciendo esto.
La realización de la presente reacción a presión reducida o condiciones de aireación también es eficaz. Es porque, en estas condiciones, el éster del ácido metacrílico así formado puede separarse de manera continua, como resultado de lo cual la reacción puede progresar eficazmente.
En el caso de producir éster del ácido metacrílico usando metacrilil-CoA transformada mediante la acción de ACD con isobutiril-CoA como materia prima o metacrilil-CoA transformada mediante la acción de ECH a partir de 3- hidroxiisobutiril-CoA, es preferible implementarlo mediante ajuste para que esté en el intervalo de estas condiciones. Debe indicarse que la reacción de síntesis de metacrilil-CoA a partir de ACD o ECH puede realizarse mediante un método conocido (por ejemplo, como condiciones de reacción para ACD, las condiciones descritas en Microbiology (1999), 145, págs. 2323-2334). Mediante combinación con aún otra reacción biológica, se hace posible una reacción continua (producción fermentativa) dentro de un organismo para éster del ácido metacrílico.
El éster del ácido metacrílico formado mediante el método de la presente invención puede analizarse cualitativa o cuantitativamente por medio de cromatografía de gases (CG), cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), o
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similar según sea necesario.
El aislamiento del éster del ácido metacrílico a partir de la disolución de reacción puede realizarse mediante un método de purificación individual conocido o una combinación de métodos de purificación conocidos tales como destilación, destilación en capa fina, extracción con disolvente y separación en columna. Además, el éster del ácido metacrílico obtenido puede polimerizarse mediante un método típico, y usarse sin inferioridad en usos convencionales.
El éster del ácido metacrílico obtenido de este modo o polímero del mismo puede reducir notablemente la energía, los recursos y la carga sobre el medio ambiente, y tiene un valor social extremadamente grande como material de baja carga medioambiental en comparación con productos químicos convencionales con productos de petróleo como materiales de partida.
2. Método para producir éster del ácido metacrílico a partir de precursor por microorganismo modificado genéticamente
Microorganismo recombinante que tiene capacidad de formación de éster del ácido metacrílico a partir de precursor
Tal como se mencionó en lo anterior, con la presente invención, también es posible sintetizar éster del ácido metacrílico a partir de un precursor tal como isobutiril-CoA, 3-hidroxiisobutiril-CoA o ácido 2-isovalérico, introduciendo el gen de ACD, gen de ECH, gen de BCKAD o similar según sea necesario en un microorganismo en el que se ha introducido el gen de AAT.
“Precursor” indica un compuesto que puede inducirse a metacrilil-CoA, e indica isobutiril-CoA o 3-hidroxiisobutiril- CoA, y además, la materia de una sustancia inducible a estos dos compuestos. Como sustancia inducible a dos compuestos, por ejemplo, pueden ejemplificarse ácidos tales como ácido 2-oxoisovalérico, ácido isobutírico, ácido 3- hidroxiisobutírico, ácido acético, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido acetoacético, ácido butírico, ácido propiónico, ácido málico, ácido fumárico, ácido cítrico y ácido succínico; aminoácidos tales como valina, alanina, leucina, lisina y ácido glutámico; y sacáridos tales como glucosa, fructosa y xilosa.
Para provocar que se forme éster del ácido metacrílico a partir de estos precursores, también es posible utilizar diversas rutas metabólicas que posee de manera natural el microorganismo huésped. Pueden introducirse genes o hacer que sea deficiente según sea necesario.
(1) Microorganismo huésped
Como microorganismo huésped, no está particularmente limitado siempre que sea un huésped que tenga enzimas para formar metacrilil-CoA a partir del precursor y capacidad de expresión de AAT; sin embargo, con respecto a bacterias, pueden ejemplificarse Rhodococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, etc., con respecto a levaduras, pueden ejemplificarse Saccharomyces, Candida, Shizosaccharomyces y Pichia, y con respecto a hongos filamentosos, puede ejemplificarse Aspergillus, etc.
Un microorganismo del género Rhodococcus es preferible como huésped. El motivo de lo mismo se debe al conocimiento al que se llega confirmando experimentalmente en el transcurso de la presente invención que un microorganismo del género Rhodococcus tiene capacidad de asimilación de valina, y el hallazgo de que, utilizando esta función, es posible aplicarlo a la formación de éster del ácido metacrílico mediante la ruta mostrada en la figura 2.
Por ejemplo, un tipo seleccionado de los siguientes microorganismos puede usarse individualmente, o combinando dos o más tipos. Como microorganismos clasificados como Rhodococcus sp., por ejemplo, pueden ejemplificarse Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus equi, Rhodococcus rhodnii, Rhodococcus corallinus, Rhodococcus rubropertinctus, Rhodococcus coprophilus, Rhodococcus globerulus, Rhodococcus chlorofenolicus, Rhodococcus luteus, Rhodococcus aichiensis, Rhodococcus chubuensis, Rhodococcus maris, Rhodococcus fascines y similares.
Como ejemplo preferido, puede ejemplificarse Rhodococcus erythropolis. Como cepas más preferidas, pueden ejemplificarse Rhodococcus erythropolis cepa PR-4, Rhodococcus erythropolis cepa KA2-5-1, Rhodococcus erythropolis cepa IGTS8, Rhodococcus erythropolis cepa D-1, Rhodococcus erythropolis cepa H-2, Rhodococcus erythropolis cepa N1-36, Rhodococcus erythropolis cepa I-19, Rhodococcus erythropolis cepa ECRD-1, Rhodococcus erythropolis cepa B1, Rhodococcus erythropolis cepa SY-1, Rhodococcus erythropolis cepa UM3, Rhodococcus erythropolis cepa UM9, Rhodococcus equi cepa T09, o similares, y de manera particularmente preferible, puede ejemplificarse Rhodococcus erythropolis cepa PR-4. Además, se incluyen derivados de estas cepas.
Como derivados, se incluyen cepas variantes obtenidas induciendo mutación génica en un microorganismo que tiene capacidad de formación de metacrilil-CoA por medio de un cambio en las condiciones de cultivo (por ejemplo,
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composición del medio, temperatura, etc.), tratamiento químico o físico (por ejemplo, radiación y, etc.), cepas modificadas genéticamente para las que se ha potenciado la actividad del siguiente modo, o la actividad se ha hecho deficiente o se ha reducido.
La potenciación de la actividad indica el nivel de expresión del gen de la enzima (independientemente del origen) que aumenta en el microorganismo basándose en el gen introducido desde fuera de la célula bacteriana en el microorganismo, y además de introducir genes que codifican enzimas desde fuera de la célula bacteriana del microorganismo al interior de la célula bacteriana, incluye potenciar la actividad enzimática como resultado de provocar que el gen de la enzima se exprese altamente potenciando la actividad del promotor del gen de la enzima retenido en el genoma por el microorganismo, o sustituyéndolo por otro promotor, o alternativamente, reduciendo o inactivando la actividad represora del gen de la enzima.
La cepa modificada genéticamente puede ser una cepa modificada a la que se llega realizando modificación genética provocando que la actividad de la enzima que inhibe la reacción de síntesis de metacrilil-CoA se desactive o disminuya. Actividad “deficiente” o “disminuida” indica que la expresión del gen de la enzima se pierde completamente o se reduce en este microorganismo, y además de la sustitución, deleción o inserción que se producen para este gen de la enzima, incluye disminuir la actividad enzimática como resultado de suprimir la expresión del gen de la enzima disminuyendo la actividad del promotor de un gen de la enzima retenido en el genoma por el microorganismo o sustituyéndolo por otro promotor, o alternativamente potenciando o activando la actividad represora de este gen de la enzima. Debe indicarse que etas modificaciones genéticas pueden realizarse siguiendo un método convencional.
Como cepa modificada preferida en el caso de realizar la producción del éster del ácido metacrílico mediante la ruta mostrada en la figura 2, puede ejemplificarse una cepa modificada que tiene al menos una característica de (a) o (b) mostradas a continuación.
(a) La actividad de formación de metacrilil-CoA se potencia por el gen de BCKAD y/o gen de ACD introducidos.
(b) La actividad de formación de metacrilil-CoA se potencia mediante desactivación o inactivación del gen de ECH, gen de 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa y/o gen de ácido 3-hidroxiisobutírico deshidrogenasa. La inactivación o desactivación ser realiza sustituyendo, delecionando o insertando la totalidad del gen o parte de la secuencia de nucleótidos.
(2) Gen insertado
Se hace necesario introducir genes de enzimas respectivos para formar metacrilil-CoA a partir del precursor y el gen de AAT según sea necesario en el huésped. Diversas enzimas que posee de manera natural el microorganismo huésped pueden utilizarse tal cual. Alternativamente, también es posible potencial la actividad por medio de introducción de genes según sea necesario.
Según el huésped y la ruta de síntesis, la enzima para formar metacrilil-CoA a partir del precursor se selecciona según sea apropiado o se optimiza, y no está particularmente limitada; sin embargo, a continuación en el presente documento, los genes de enzimas necesarios para la formación del éster del ácido metacrílico mediante la ruta mostrada en la figura 2 se describirán en detalle usando un microorganismo del género Rhodococcus como huésped.
(2-1) Alcohol aciltransferasa (AAT)
La AAT usada en la presente invención no está particularmente limitada siempre que tenga la capacidad de producir éster del ácido metacrílico con metacrilil-CoA y alcohol o fenol como materias primas, y la clase y el origen de la misma no son de importancia. Una de origen vegetal es preferible como fuente de la enzima, y como fuentes representativas de la misma, pueden ejemplificarse las que se originan a partir de cualquier orden seleccionado del grupo que consiste en los Zingiberales, Rosales, Ericales, Cucurbitales, Brassicales y Laurales mencionados anteriormente.
(2-2) Acil-CoA deshidrogenasa (ACD)
La ACD usada en la presente divulgación no está particularmente limitada siempre que tenga la capacidad de formar metacrilil-CoA a partir de acil-CoA, y la fuente y el tipo de la misma no son de importancia. Son preferibles las derivadas de microorganismos, y son representativas las que se mostraron anteriormente.
Más preferiblemente, se deriva de Rhodococcus erythropolis, y como cepas preferidas, pueden ejemplificarse Rhodococcus erythropolis cepa PR-4, Rhodococcus erythropolis cepa KA2-5-1, Rhodococcus erythropolis cepa IGTS8, Rhodococcus erythropolis cepa D-1, Rhodococcus erythropolis cepa H-2, Rhodococcus erythropolis cepa N1-36, Rhodococcus erythropolis cepa I-19, Rhodococcus erythropolis cepa ECRD-1, Rhodococcus erythropolis cepa B1, Rhodococcus erythropolis cepa SY-1, Rhodococcus erythropolis cepa UM3, Rhodococcus erythropolis
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cepa UM9, Rhodococcus equi cepa T09, o similares, y de manera particularmente preferible, puede ejemplificarse Rhodococcus erythropolis cepa pR-4.
La secuencia de nucleótidos del gen de ACD derivado de Rhodococcus erythropolis cepa PR-4 se muestra en SEQ ID NO. 33, y la secuencia de aminoácidos codificada por esta secuencia de nucleótidos se muestra en SEQ ID NO. 32. Debe indicarse que se incluyen las secuencias de aminoácidos en las que uno o una pluralidad de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 32 se han sustituido, delecionado o añadido, y también se incluyen genes que codifican proteínas que tienen actividad para formar metacrilil-CoA a partir de acil-CoA en el gen de ACD de la presente divulgación. Además, en el gen de ACD de la presente divulgación, también se incluyen genes que codifican una proteína que tiene actividad para producir éster del ácido metacrílico a partir de acil-CoA que expresa una identidad de al menos el 90 % con la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO. 32, preferiblemente al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 99,5 % e incluso más preferiblemente al menos el 99,9 %.
Además, en el gen de ACD de la presente divulgación, también se incluyen genes que se hibridan en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada por SEQ ID NO. 33, y proteínas codificantes que tienen actividad para formar éster del ácido metacrílico a partir de acil-CoA. Además, en el gen de ACD de la presente divulgación, cuando se calcula usando la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 33, BLAST, etc. (por ejemplo, parámetros por defecto, es decir, configuración inicial), también se incluyen genes que codifican proteínas que tienen actividad para formar éster del ácido metacrílico a partir de acil-CoA y alcohol que consisten en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 90 % y lo más preferiblemente al menos el 95 %. Además, los codones del gen de ACD mencionado anteriormente pueden cambiarse según la frecuencia de uso de codones en el microorganismo usado en la transformación.
Se introduce el ADN que para el gen de AAT y/o gen de ACD mencionados anteriormente en un microorganismo que pertenece a Rhodococcus sp., y se usa para provocar la transcripción/traducción en proteínas en este microorganismo. El ADN introducido en este microorganismo está preferiblemente en la forma incorporada en un vector.
(3) Preparación de un microorganismo recombinante
El ADN que codifica el gen de AAT y/o gen de ACD mencionados anteriormente se introduce en el microorganismo huésped, y se usa para provocar la transcripción/traducción en proteínas en este microorganismo. El ADN introducido en este microorganismo está preferiblemente en la forma incorporada en un vector. En otras palabras, cada gen se incorpora en un vector de expresión que puede expresar la célula huésped, y este se introduce en la célula huésped.
El vector no está limitado particularmente siempre que pueda replicarse de manera autónoma la célula huésped, y retenga el gen de AAT y/o gen de ACD, y es posible usar vectores adecuados a los microorganismos respectivos. Como vector para introducir ADN en un microorganismo que pertenece a Rhodococcus sp., por ejemplo, es posible usar vectores bien conocidos tales como pK1, pK2, pK3 y pK4, así como pSJ034 (se hace referencia a la solicitud de patente japonesa no examinada, publicación n.° HlO-337185), pSJ023 y pSJ002 (se hace referencia a la solicitud de patente japonesa no examinada, publicación n.° H10-24867), y pSJ201 y pLK005 (no se limita a estos). pSJ023 está depositado en el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depository como Rhodococcus rhodochrous transformante ATCC12674/pSJ023 (FERMBP-6232).
La inserción del gen de AAT y/o gen de ACD mencionados anteriormente en el vector puede llevarse a cabo usando tecnología de recombinación génica conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, es posible utilizar un método que usa escisión y ligación por enzimas de restricción, un método que usa topoisomerasa, un kit In Fusion (Takara Bio), y similares. El gen insertado en el vector se inserta sucesivamente en el sentido de 3' de un promotor capaz de regular la transcripción/traducción de proteínas codificadas por los genes respectivos en el organismo huésped. Además, si es necesario, puede añadirse un ligador apropiado tras la inserción. Además, según sea necesario, puede unirse una secuencia de terminador, secuencia de potenciador, secuencia señal de corte y empalme, secuencia señal de adición de poliA, secuencia de unión al ribosoma tal como la secuencia SD o secuencia Kozak, gen marcador de selección, etc. utilizables en el organismo huésped en el que están intentándose introducir genes. Como ejemplo del gen marcador de selección, además de genes resistentes a fármacos tales como gen resistente a ampicilina, gen resistente a tetraciclina, gen resistente a neomicina, gen resistente a kanamicina y gen resistente a cloranfenicol, pueden ejemplificarse genes que confieren biosíntesis intracelular de nutrientes tales como aminoácidos y ácidos nucleicos, o genes que codifican proteínas fluorescentes tales como luciferasa. Acompañando a la inserción, una parte de la secuencia de aminoácidos codificada por el ADN puede sustituirse.
Desde el punto de vista anterior, es particularmente preferible usar pLK005 adquirido realizando un tratamiento de variación sobre pK4 como vector. El gen de AAT o gen de ACD se une/inserta para que esté dispuesto en el sentido de 3' del extremo 3' del promotor de pLK005, y puede construirse un vector de plásmido de expresión que expresa el
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gen de AAT y/o gen de ACD mediante el promotor.
En el vector, puede insertarse cualquier gen seleccionado de la agrupación génica de AAT o la agrupación génica de ACD, y puede insertarse una pluralidad de genes. En el caso de que se use un gen insertado en un vector, la “pluralidad” puede ser la inserción de 2 a 5, de 2 a 4, y preferiblemente 2 o 3 genes. Además, en el caso de que se inserte una pluralidad de genes en un vector, estos genes forman preferiblemente un operón. En el presente documento, “operón” es una unidad de secuencia de ácido nucleico constituida por uno o más genes transcritos bajo el control del mismo promotor.
Los genes mencionados anteriormente, y preferiblemente genes en forma de un vector, se insertan en el microorganismo huésped mediante un método conocido por los expertos en la técnica. El método de introducción del vector recombinante en el organismo huésped no está particularmente limitado siempre que sea un método adecuado para el microorganismo huésped y, por ejemplo, pueden ejemplificarse el método de electroporación, el método de esferoplastos, el método de acetato de litio, el método de fosfato de calcio, el método de lipofección, el método de transferencia por conjugación y similares.
Método para producir éster del ácido metacrílico
El microorganismo recombinante en el que se introducen los genes requeridos tales como el gen de AAT y/o el gen de ACD se pone en contacto con el precursor para producir éster del ácido metacrílico. En el presente documento, “contacto” indica el tratamiento de exposición durante un tiempo fijado del microorganismo y una sustancia (precursor). Más específicamente, el microorganismo se cultiva en un medio acuoso que contiene precursor (materia prima), etc., o se añade un cultivo del microorganismo al medio acuoso que contiene materia prima, y se suspende/se mezcla, para obtener éster del ácido metacrílico en el medio acuoso y/o fase gaseosa. Al hacer esto, no es de importancia si hay proliferación del microorganismo. En este procedimiento, se obtiene una mezcla que contiene microorganismo recombinante y éster del ácido metacrílico.
“Medio acuoso” indica agua o una disolución acuosa con agua como componente principal, y también incluye aquellas en las que se dispersa un líquido/sólido no disuelto. “Fase gaseosa” se refiere a una porción ocupada por gas, vapor, etc. excluyendo una porción ocupada por líquido (medio de cultivo, etc.) en el tanque de cultivo (recipiente de cultivo de microorganismo) o reactor (recipiente en el que se lleva a cabo la reacción). “Cultivo” indica que se obtiene por medio de un cultivo de células bacterianas, caldo, extracto no celular, membrana celular, o similar.
(1) Producción de éster del ácido metacrílico a partir del cultivo
En la presente invención, se realiza la producción de éster del ácido metacrílico provocando que se forme y se acumule éster del ácido metacrílico en células bacterianas en cultivo o en el cultivo cultivando microorganismo recombinante génico al que se le ha introducido el gen de AAT en un medio acuoso que contiene el precursor, y recuperando el éster del ácido metacrílico del cultivo de células bacterianas, cultivo o fase gaseosa del recipiente de cultivo.
El medio de cultivo usado en el cultivo del microorganismo es un medio sólido o medio líquido, que permite proliferación suficiente, que contiene nutrientes que incluyen al menos diversas fuentes de carbono. En el caso de que el precursor pueda utilizarse como fuente de carbono, puede usarse como fuente de carbono.
La concentración de fuente de carbono o precursor en el medio de cultivo no está particularmente limitada siempre que permita la producción de éster del ácido metacrílico. La concentración, por ejemplo, se fija a del 0,05 al 20 % en (p/v), preferiblemente del 0,1 al 15 % en (p/v), y más preferiblemente del 0,2 al 10 % en (p/v). Se usa al menos el 0,2 % en (p/v) porque la productividad de ácido metacrílico de los microorganismos aumenta, y se fija a no más del 10 % en (p/v) porque no se reconoce una mejora drástica en el efecto si se aumenta hasta más de esto.
En la producción de éster del ácido metacrílico mediante cultivo, se añade alcohol o fenol dependiendo del éster del ácido metacrílico objetivo. El alcohol o fenol usado es preferiblemente el mostrado por la fórmula 2.
La concentración de alcohol o fenol en el medio de cultivo no está particularmente limitada siempre que permita que se produzca el éster del ácido metacrílico. La concentración, por ejemplo, se fija a del 0,01 al 20 % en (p/v), preferiblemente del 0,05 al 10% en (p/v) y más preferiblemente del 0,1 al 5% en (p/v). Además, estos también pueden añadirse al medio de cultivo de antemano, o pueden añadirse de manera continua o intermitente dividiéndolos en dos o más apariciones, mientras se realiza el cultivo.
En el medio de cultivo, pueden añadirse fuentes de nitrógeno inorgánico, sales de metales inorgánicas o similares. Como fuentes de nitrógeno inorgánico, por ejemplo, pueden usarse ácidos inorgánicos o ácidos orgánicos de sales de amonio tales como cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio y fosfato de amonio, y similares.
La concentración de fuente de nitrógeno en el medio de cultivo no está particularmente limitada siempre que permita
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que se produzca el éster del ácido metacrílico. La concentración, por ejemplo, se fija a del 0,01 al 10 % en (p/v), preferiblemente del 0,05 al 8 % en (p/v) y más preferiblemente del 0,1 al 4 % en (p/v).
Como sales de metales inorgánicas, por ejemplo, pueden usarse dihidrogenofosfato de potasio, monofosfato de potasio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre, carbonato de calcio, etc.
La concentración de sales inorgánicas en el medio de cultivo no está particularmente limitada siempre que permite que se produzca éster del ácido metacrílico. La concentración, por ejemplo, se fija a del 0,001 al 1,6% en (p/v), preferiblemente del 0,005 al 1,3 % en (p/v) y más preferiblemente del 0,01 al 1 % en (p/v). Se usa al menos el 0,1 % en (p/v) porque la productividad del ácido metacrílico de los microorganismos aumenta, y se fija a no más del 1 % en (p/v) porque no se reconoce una mejora drástica en el efecto incluso si se añade más de esto.
Adicionalmente, se añaden oligoelementos, vitaminas, etc. según sea necesario al medio de cultivo. Además, diversas sustancias orgánicas, sustancias inorgánicas, tensioactivo, agente desespumante comúnmente usado, etc. necesarios en el crecimiento del microorganismo pueden añadirse adicionalmente al medio de cultivo según sea necesario.
La siembra del microorganismo modificado genéticamente en el medio de cultivo puede llevarse a cabo mediante una técnica convencional, conocida. El método de cultivo no está tampoco particularmente limitado, y es posible usar una técnica conocida tal como cultivo en agitación, cultivo aireado y agitado, y cultivo estático.
Las condiciones de cultivo no están particularmente limitadas siempre que el organismo modificado genéticamente crezca y forme éster del ácido metacrílico. El cultivo puede llevarse a cabo en condiciones aerobias o puede llevarse a cabo en condiciones anaerobias.
El pH, la temperatura y el tiempo de cultivo no están particularmente limitados siempre que las condiciones permitan que el microorganismo modificado genéticamente crezca y forme éster del ácido metacrílico. El pH se fija preferiblemente a de 3 a 10, más preferiblemente de 4 a 9 e incluso más preferiblemente de 5 a 8. La temperatura se fija preferiblemente a de 10 °C a 45 °C, más preferiblemente de 15 °C a 40 °C e incluso más preferiblemente de 20 °C a 35 °C. El tiempo de cultivo es preferiblemente de 10 a 1000 horas, más preferiblemente de 15 a 480 horas e incluso más preferiblemente de 20 a 240 horas.
Estas condiciones de cultivo se seleccionan u optimizan apropiadamente para cada cepa para maximizar la razón de rendimiento de éster del ácido metacrílico en relación con la cantidad utilizada de fuente de carbono o precursor. Debe indicarse que el rendimiento del éster del ácido metacrílico puede ajustarse ajustando apropiadamente la cantidad de fuente de carbono y las condiciones de cultivo.
Como condiciones ideales para provocar que se acumule éster del ácido metacrílico en al menos 0,001 mM, en una condición de pH de 5,5 a 7,5, la concentración de fuente de carbono o precursor en el medio de cultivo se mantiene directa o indirectamente a al menos el 0,1 %, la concentración de alcohol o fenoles se mantiene directa o indirectamente a al menos el 0,1 %, la temperatura se ajusta al intervalo de 20 °C a 40 °C, y se permite que reaccione durante al menos 3 horas. Además, es preferible con el fin de obtener una productividad eficaz mantener un estado en el que la concentración de microorganismo en la disolución de cultivo es alta en un intervalo en el que el entorno de la disolución de cultivo no se vuelve inapropiada para la proliferación del microorganismo o las células cultivadas y la razón de células que mueren no aumenta y, por ejemplo, manteniendo en al menos 2 g/l como peso seco, se obtiene una eficacia de producción favorable, y la concentración de acumulación de la producción puede elevarse.
(2) Producción de éster del ácido metacrílico a partir de reacción de microorganismos en reposo
Con el método para producir éster del ácido metacrílico según la presente invención, puede emplearse el siguiente método además del método cultivando microorganismo modificado genéticamente tal como se describió anteriormente. No es necesario que el microorganismo modificado genéticamente tenga actividad reproductora, y puede ponerse en contacto un cultivo precultivado con un medio acuoso que contiene precursor para producir éster del ácido metacrílico por reacción de microorganismos en reposo no acompañada por proliferación sustancial.
La concentración del precursor usado en la reacción de microorganismos en reposo puede ser la misma que el caso mencionado anteriormente de producción de éster del ácido metacrílico a partir de cultivo. El alcohol o fenol usado en la reacción de microorganismos en reposo y la concentración del mismo puede ser la misma que el caso mencionado anteriormente de producción de éster del ácido metacrílico mediante cultivo.
Pueden añadirse sales de metales inorgánicas, etc. a la disolución de reacción. Como sales de metales inorgánicas, por ejemplo, pueden usarse dihidrogenofosfato de potasio, monofosfato de potasio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre, carbonato de calcio, etc.
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La concentración de sales inorgánicas en la disolución de reacción no está particularmente limitada siempre que permita que se produzca éster del ácido metacrílico. La concentración, por ejemplo, se fija a del 0,0001 al 2 % en (p/v), preferiblemente del 0,0003 al 1,3 % en (p/v) y más preferiblemente del 0,001 al 1 % en (p/v).
Adicionalmente, se añaden oligoelementos, vitaminas, etc. según sea necesario a la disolución de reacción. Además, diversas sustancias orgánicas, sustancias inorgánicas, tensioactivo, agente desespumante comúnmente usado, etc. necesarios en la reacción pueden añadirse adicionalmente a la disolución de reacción según sea necesario.
En la reacción de microorganismos en reposo, la disolución de cultivo de microorganismo modificado genéticamente precultivado se usa tal cual, o se usan células bacterianas recuperadas mediante filtración, centrifugación o similar. El cultivo recuperado se resuspende en una disolución tampón apropiada o similar, y puede usarse estableciendo en cualquier concentración de bacterias. Para la disolución tampón o similar, se usa una disolución salina normal, disolución tampón de fosfato de potasio, disolución tampón de tris-ácido clorhídrico, disolución tampón de glicina- hidróxido de sodio, disolución tampón de ácido bórico-hidróxido de sodio, o similar.
Además, en la reacción de microorganismos en reposo, también puede usarse el producto procesado del cultivo recuperado (por ejemplo, homogeneizado, enzima en bruto, enzima purificada, etc.). Además, puede fijarse a un portador apropiado mediante un método conocido, y este producto de fijación puede usarse en la reacción.
Las condiciones de reacción no están particularmente limitadas siempre que se forme éster del ácido metacrílico. La reacción puede llevarse a cabo en condiciones aerobias o puede llevarse a cabo en condiciones anaerobias. El método de reacción tampoco está particularmente limitado, y puede usarse una técnica bien conocida tal como reacción de agitación, reacción aireada y agitada y reacción estática.
El pH, la temperatura y el tiempo de reacción no están particularmente limitados siempre que las condiciones puedan formar éster del ácido metacrílico. El pH se fija preferiblemente a de 3 a 10, más preferiblemente de 4 a 9 e incluso más preferiblemente de 5 a 8. La temperatura se fija preferiblemente a de 10 °C a 45 °C, más preferiblemente de 15 °C a 40 °C e incluso más preferiblemente de 20 °C a 35 °C. El tiempo de reacción es preferiblemente de 5 a 180 horas, más preferiblemente de 10 a 150 horas e incluso más preferiblemente de 15 a 120 horas.
Estas condiciones de reacción se seleccionan u optimizan apropiadamente para cada cepa para maximizar la razón de rendimiento del éster del ácido metacrílico. Debe indicarse que el rendimiento del éster del ácido metacrílico puede ajustarse ajustando apropiadamente las condiciones de reacción.
Como condiciones ideales para provocar que se acumule éster del ácido metacrílico en 0,001 mM, en una condición de pH de 5,5 a 7,5, la concentración de fuente de carbono o precursor en el medio de cultivo se mantiene directa o indirectamente a al menos el 0,1 %, la concentración de alcohol o fenoles se mantiene directa o indirectamente a al menos el 0,1 %, la temperatura se ajusta al intervalo de 20 °C a 40 °C y se permite que reaccionen durante al menos 3 horas. Además, mantener un estado en el que la concentración de microorganismo en la disolución de reacción es alta es preferible para obtener una productividad eficaz, y por ejemplo, manteniendo en al menos 2 g/l como peso seco, se obtiene una eficacia de producción favorable, y puede mejorarse la concentración de acumulación de producto.
En el método para producir éster del ácido metacrílico según la presente invención, la producción mencionada anteriormente de éster del ácido metacrílico a partir del cultivo y la producción de éster del ácido metacrílico a partir de la reacción de microorganismos en reposo pueden llevarse a cabo mediante combinación según sea apropiado. Combinando los dos métodos, se hace posible una producción más eficaz de éster del ácido metacrílico.
(3) Recuperación de éster del ácido metacrílico
El éster del ácido metacrílico formado en el medio de cultivo o la disolución de reacción y la cantidad formada del mismo pueden detectarse y medirse usando un método común tal como de cromatografía de líquidos de alta resolución y CLEM. Además, el éster del ácido metacrílico volatilizado en la fase gaseosa del recipiente de cultivo o recipiente de reacción (parte de espacio de cabeza) y la cantidad formada del mismo puede detectarse y medirse usando un método común tal como cromatografía de gases.
El éster del ácido metacrílico puede separarse y purificarse a partir del medio de cultivo o la disolución de reacción usando una combinación apropiada, según sea necesario, de operaciones bien conocidas tales como filtración, centrifugación, concentración a vacío, cromatografía de intercambio iónico o adsorción, extracción con disolvente, destilación y cristalización.
Ejemplos
A continuación en el presente documento, aunque la presente invención se explicará específicamente por medio de
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ejemplos.
Ejemplo 1: Síntesis de metacrilato de isobutilo
Se retiró la piel de un plátano, se cortó el sarcocarpio a un grosor de aproximadamente 1 milímetro con una cuchilla y se dividió esto adicionalmente en cuatro. Se añadieron dos gramos de plátano cortado, 2 ml de una disolución que contiene metacrilil-CoA 2,3 mM y 0,35 M de KCl y 5 |il de alcohol isobutílico a un matraz de 100 ml. Se selló y se permitió que reaccionara a 30 °C. Se recogió la mezcla de reacción que contenía metacrilato de isobutilo formado tras 1, 2 o 3 horas en un matraz de 100 ml con un espacio de cabeza de 150 |il, y se realizó el análisis con las condiciones de CG a continuación. Los resultados del mismo se muestran en la tabla 1.
[Tabla 1]
Cantidad generada de metacrilato de isobutilo
- Tiempo
- Cantidad generada de metacrilato de isobutilo (mM)
- 1
- 0,19
- 2
- 0,38
- 3
- 0,45
Condiciones de análisis de CG Columna: DB-WAX, 30 m * 0,32 mm
Temperatura de la columna: 50 °C 5 min -> 5 °C/min -> 100 °C (15 min en total)
Gas portador: He
Inyección: 200 °C sin división (tiempo de muestreo 1 min)
Detección: 250 °C FID Volumen de inyección: 150 |il
Debe indicarse que la concentración de éster del ácido metacrílico se calculó ajustando una disolución acuosa de una concentración inicial conocida, colocando 2 ml de la misma disolución acuosa en un matraz de 100 ml, y tras incubar durante 30 min a 30 °C, recogiendo el espacio de cabeza mediante el mismo método, sometiendo a análisis de CG y preparando una curva de calibración.
Ejemplo 2: Síntesis de metacrilato de butilo
Excepto por usar alcohol n-butílico en lugar de alcohol isobutílico, se realizó de manera similar al ejemplo 1. Los resultados del mismo se muestran en la tabla 2.
[Tabla 2]
Cantidad generada de metacrilato de butilo
- Tiempo
- Cantidad generada de metacrilato de butilo (mM)
- 2
- 0,20
- 5,5
- 0,30
Ejemplo 3: Síntesis 2 de metacrilato de butilo
Se añadieron dos gramos de un trozo de planta mostrada en la tabla 3, 2 ml de una disolución que contenía 2,3 mM de metacrilil-CoA y KCl 0,35 M y 10 |il de alcohol n-butílico a un matraz de 100 ml. Se selló y se permitió que reaccionara a 30 °C. Se realizó el análisis del éster del ácido metacrílico de manera similar al ejemplo 1. Los resultados del mismo se muestran en la tabla 3.
[Tabla 3]
Cantidad generada de metacrilato de butilo
- Planta
- Parte usada Tiempo de Cantidad generada de
- reacción metacrilato de butilo (mM)
- Fresa
- Sarcocarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 3 0,010
- Kiwi
- Sarcocarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 5 0,012
- Manzana
- Pericarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 5 0,016
- Melón
- Sarcocarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 6 0,015
- Pera
- Pericarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 4 0,013
- Papaya
- Pericarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 4 0,027
- Aguacate
- Pericarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 6 0,035
- Arándano
- Pericarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 6 0,009
- Prunus mume
- Pericarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 4 0,002
Ejemplo 4: Síntesis de metacrilato de etilo
Se añadieron dos gramos de un trozo de planta mostrada en la tabla 4, 2 ml de una disolución que contenía 2,3 mM 5 de metacrilil-CoA y KCl 0,35 M y 6,4 |il de alcohol etílico a un matraz de 100 ml. Se selló y se permitió que reaccionara a 30 °C. El análisis del éster del ácido metacrílico se realizó de manera similar al ejemplo 1. Los resultados del mismo se muestran en la tabla 4.
[Tabla 4]
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Cantidad generada de metacrilato de etilo
- Planta
- Parte usada Tiempo de reacción Cantidad generada de metacrilato de etilo (mM)
- Manzana
- Pericarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 5 0,110
- Papaya
- Pericarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 6 0,003
- Aguacate
- Pericarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 6 0,006
Ejemplo 5: Síntesis de metacrilato de etilo 15
Se añadieron dos gramos de un trozo de planta mostrada en la tabla 5, 2 ml de una disolución que contenía 2,3 mM de metacrilil-CoA y KCl 0,35 M y 4,4 |il de alcohol metílico a un matraz de 100 ml. Se selló y se permitió que reaccionara a 30 °C. El análisis del éster del ácido metacrílico se realizó de manera similar al ejemplo 1. Los resultados del mismo se muestran en la tabla 5.
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[Tabla 5]
Cantidad generada de metacrilato de metilo
- Planta
- Parte usada Tiempo de reacción Cantidad generada de metacrilato de metilo (mM)
- Manzana
- Pericarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 5 0,043
- Papaya
- Pericarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 6 0,004
- Aguacate
- Pericarpio cortado hasta un grosor de aproximadamente 1 milésima de pulgada 6 0,007
Ejemplo de referencia 1: Preparación de una célula competente
Se inoculó E. coli JM109 en 1 ml de medio LB (Bacto-triptona al 1 %, extracto de levadura Bacto al 0,5 %, NaCl al 0,5 %), se precultivó aeróbicamente a 37 °C durante 5 horas, se añadieron 0,4 ml del cultivo a 40 ml de medio SOB 30 (Bacto-triptona al 2 %, extracto de levadura Bacto al 0,5 %, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgSO41 mM, MgCh 1 mM), y se cultivó a 18 °C durante 20 horas. Tras recoger este cultivo mediante centrifugación, se añadieron 13 ml de una
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disolución de TF enfriada (PIPES-KOH 20 mM (pH 6,0), KCl 200 mM, CaCl2 10 mM, MnCl2 40 mM), y se dejó reposar durante 10 minutos a 0 °C. Posteriormente, tras volver a centrifugar para eliminar el sobrenadante, se suspendió la E. coli precipitada en 3,2 ml de disolución de TF fría, se añadieron a la misma 0,22 ml de dimetilsulfóxido, y se dejó reposar durante 10 minutos a 0 °C para preparar una célula competente.
Ejemplo 6: Preparación de E. coli recombinante con gen de AAT introducido derivado de planta
Se encomendó la síntesis de los genes de AAT derivados de plantas mostrados en SEQ ID NO: 2, 4 y 6 a Takara Bio Inc. AAT de manzana (MpAAT1): secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1), secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2)
AAT de fresa (SAAT): secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3), secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 4)
AAT de fresa (VAAT): secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5), secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 6)
Se insertaron estos segmentos génicos sintetizados en el vector pMD19, y se denominaron respectivamente pAAT001 a 003. (Tabla 6). Con estos pAAT001 a 003 como moldes, se prepararon fragmentos de ADN que codificaban AAT por medio del método de PCR, diseñando un oligonucleótido para que fuera una forma en la que se añadió un sitio de reconocimiento por endonucleasas de restricción que permite una fácil introducción en un vector de expresión.
Cebador de oligonucleótido
MMA-044: 5'-GTTTGCACGCCTGCCGTTCGACG-3' (SEQ ID NO. 11)
MMA-045: 5'-CGGTACGCGCGGATCTTCCAGAG-3' (SEQ ID NO. 12)
Composición de la disolución de reacción Agua esterilizada 22 |il
2 x PrimeSTAR (fabricado por Takara Bio) 25 |il
Cebador directo 1 |il
Cebador inverso 1 |il
ADN genómico 1 |il
Cantidad total 50 |il
Ciclo de temperatura
30 ciclos de reacción a 98 °C 10 segundos, 55 °C 15 segundos y 72 °C 150 segundos.
Se purificó una banda de producto de amplificación obtenido mediante el kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN). Se digirió el ADN purificado respectivo con la enzima de restricción PagI (sitio de reconocimiento de escisión incluido en el cebador directo) y Sse8387I (sitio de reconocimiento de escisión incluido en el cebador inverso). Se realizó la separación mediante electroforesis en gel de agarosa, se cortó la banda diana del gel y se realizó la purificación. En la purificación, usando un kit de purificación de gel/PCR (fabricado por FAVORGEN), se eluyó con 30 ml de agua estéril.
Se mezclaron el ADN purificado (5 |il), vector pTrc99A digerido con NcoI y Sse8387I (1 |il), agua destilada (4 |il) y disolución I (kit de ligación de ADN ver. 2 (Takara Bio)) (10 ml), y se ligó el vector con el producto de amplificación de PCR incubando durante 12 horas a 16 °C.
A 200 |il de la célula competente preparada mediante el método del ejemplo de referencia 1, se le añadieron 10 |il de la disolución de ligación mencionada anteriormente y se dejó reposar a 0 °C durante 30 minutos, seguido por conferir choque térmico a 42 °C durante 30 segundos y enfriamiento hasta 0 °C durante 2 minutos, tras lo cual se añadió 1 ml de medio de cultivo SOC (glucosa 20 mM, Bacto-triptona al 2 %, extracto de levadura Bacto al 0,5 %, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgSO41 mM, MgCh 1 mM) y se cultivó con agitación a 37 °C durante 1 hora.
Tras cultivar, se inocularon 100 |il de medio de cultivo en agar nutriente LBAmp (medio de cultivo LB que contenía ampicilina 100mg/l, agar al 1,5%), y se cultivaron adicionalmente a 37 °C. Se cultivó una pluralidad de colonias transformantes hechas crecer sobre agar nutriente durante la noche a 37 °C en 1,5 ml de medio de cultivo LBAmp
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(medio de cultivo LB que contenía ampicilina 100 mg/l), y tras la cosecha, se preparó ADN de plásmido usando un kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN).
Para el ADN de plásmido respectivo recombinante obtenido, se confirmó la secuencia de nucleótidos del mismo usando un kit CEQ DTCS Quick Start y analizador de ADN CEQ 2000XL de secuenciador fluorescente (ambos de Beckman Coulter, EE. UU.), y se denominaron plásmido pAAT101 a pAAT103 (tabla 6).
Para los vectores pET16b, se introdujo el gen de AAT mediante operaciones similares, y se denominaron los plásmidos obtenidos pAAT201 a pAAT203 (tabla 6). Sin embargo, puesto que no existe el sitio Sse8387I en pET16b, se preparó de antemano uno en el que se había insertado un ligador que incluía la secuencia de escisión Sse8387I en el sitio BamHI de pET16b, y se usó este como vector.
Se introdujeron los plásmidos pAAT101 a pAAT103 en la cepa JM109 para obtener JM109 recombinante/pAAT101 a pAAT103. Se introdujeron los plásmidos pAAT201 a pAAT203 en la cepa BL21 (DE3) para obtener BL21 (DE3) recombinante/pAAT201 a pAAT203.
[Tabla 6]
Plásmido para la expresión del gen de AAT derivado de plantas
- SEQ ID NO
- Origen vegetal (nombre del gen) Plásmido molde Plásmido de expresión
- pTrc99A
- pET16b
- 2
- Manzana (MpAAT1) pAAT001 pAAT101 pAAT201
- 4
- Fresa (SAAT) pAAT002 pAAT102 pAAT202
- 6
- Fresa (VAAT) pAAT003 pAAT103 pAAT203
Ejemplo 7: Preparación de extracto libre de células a partir de E. coli recombinante que expresa el gen de AAT
(1) Cultivo de E. coli recombinante usando pTrc99A como vector
Se inocularon las E. coli recombinantes JM109/pAAT101 a pAAT103 obtenidas en el ejemplo 6 en 1 ml de un medio de cultivo LB que contenía 100 |ig/ml de ampicilina, y se realizó el precultivo a 37 °C durante 7 horas. Se tomó el caldo en 0,1 ml, se añadió a 100 ml del mismo medio de cultivo (ampicilina 100 |ig/ml, MIPTG 1 m contenido) y se cultivo con agitación a 37 °C durante 15 horas. Se recuperó la célula bacteriana por medio de centrifugación (3700 x g, 10 min, 4 °C) del caldo obtenido, y tras lavar con una disolución de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,0), se suspendió en la misma disolución de tampón. Se usó JM109/pTrc99A como cepa de referencia.
(2) Cultivo de E. coli recombinante usando pET16b como vector
Se inocularon las E. coli recombinantes BL21 (DE3)/pAAT201 a pAAT203 obtenidas en el ejemplo 6 en 1 ml de un medio de cultivo LB que contenía 100 |ig/ml de ampicilina, y se realizó el precultivo a 37 °C durante 14 horas. Se tomó el caldo en 0,1 ml, se añadió a 100 ml del mismo medio de cultivo (ampicilina 100 |ig/ml), y tras cultivar con agitación a 37 °C hasta que la DO se hizo de 0,3, se añadió IPTG de modo que la concentración final se hizo de 1 mM y se cultivó adicionalmente con agitación durante varias horas. Se recuperó la célula bacteriana por medio de centrifugación (3700 xg, 10 min, 4 °C) del caldo obtenido, y tras lavar con una disolución de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,0), se suspendió para que tuviese una DO=6 (630 nm) en la misma disolución de tampón. Se usó BL21 (DE3)/pET16b como cepa de referencia.
(3) Preparación de extracto libre de células
Se preparó un extracto libre de células de la suspensión de células bacterianas obtenida. Usando un homogeneizador ultrasónico VP-15S (Taitec, Japón), se realizó la homogeneización durante 1 minuto al tiempo que se mantenía la suspensión de células bacterianas en hielo en condiciones de control de salida 4, CICLO DE TRABAJO del 40%, PULSO, CRONÓMETRO = modo B 10 s. A continuación, se realizó la centrifugación (10 000 x g, 5 minutos, 4 °C), y se recogió 1 ml del sobrenadante obtenido (extracto libre de células).
Ejemplo 8: Síntesis de metacrilato de butilo usando extracto libre de células recombinante para el gen de AAT
Se realizó la siguiente reacción usando extracto libre de células preparado mediante el método descrito en el ejemplo 7. Se inició la reacción añadiendo 0,2 ml de extracto libre de células a una botella de muestra de 10 ml con un tapón (para CG) en la que se colocaron 0,8 ml de una disolución de metacrilil-CoA y alcohol de modo que la concentración final de la disolución de reacción era metacrilil-CoA 7 mM y n-butanol 40,5 mM. Se incubó la botella de muestra con un tapón a 30 °C durante de 1 a 5 horas para provocar la reacción.
Se analizó el gas en el espacio de cabeza de la botella de muestra con un tapón de manera similar al ejemplo 1. Los
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resultados se muestran en la tabla 7.
[Tabla 7]
Formación de metacrilato de butilo usando recombinante para el gen AAT
- Recombinante
- Cantidad generada (mM)
- 1 hora
- 3 horas 5 horas
- JM109/pAAT102
- 0,001 0,003 0,004
- JM109/pAAT103
- 0 0,001 0,002
- BL21 (DE3)/pAAT201
- 0,003 0,014 0,026
- BL21 (DE3)/pET6b
- 0 0 0
Ejemplo 9A: Síntesis de éster del ácido metacrílico usando extracto libre de células recombinante para el gen de AAT
Se llevó a cabo la reacción de manera similar al ejemplo 8 usando metanol, etanol o n-butanol como alcohol, y usando el derivado de BL21 (DE3)/pAAT201 (manzana) en el extracto libre de células. Los resultados de análisis del producto tras 5 horas se muestran en la tabla 8.
[Tabla 8]
Generación de éster del ácido metacrílico usando recombinante para el gen de AAT
- Recombinante
- Cantidad generada tras 5 horas (mM)
- Metacrilato de metilo
- Metacrilato de etilo Metacrilato de butilo
- BL21 (DE3)/pAAT201
- 0,021 0,045 0,091
Ejemplo 9B: Síntesis 2 de éster del ácido metacrílico usando extracto libre de células recombinante para el gen de AAT
Usando isobutanol, butanol, alcohol bencílico o alcohol 2-etilhexílico, se llevó a cabo la siguiente reacción con el extracto libre de células de BL21 (DE3)/pAAT201 (manzana) obtenido en el ejemplo 7.
Se inició la reacción añadiendo 0,2 ml de extracto libre de células a una botella de muestra de 10 ml con un tapón (para CG) en la que se colocaron 0,8 ml de una disolución que contenía metacrilil-CoA y alcohol de modo que la concentración final de la disolución de reacción era metacrilil-CoA 1 mM y n-butanol 40 mM.
Se incubó la botella de muestra con un tapón a 30 °C durante de 1 a 5 horas para provocar la reacción. Tras la finalización de la reacción, se añadió 1 ml de acetonitrilo y se mezcló con la disolución de reacción en la botella de muestra con un tapón. Posteriormente, tras la filtración usando un filtro de jeringa DISMIC/tamaño de poro de 0,45 |im (fabricado por ADVANTEC), se proporcionó para el análisis de HPLC. Los resultados de análisis del producto tras 5 horas se muestran en la tabla 9.
Síntesis de ésteres del ácido metacrílico (metacrilato de isobutilo, metacrilato de fenilo, metacrilato de bencilo, metacrilato de 2-etilhexilo) usando recombinante para el gen de AAT
[Tabla 9]
- Recombinante
- Cantidad generada tras 5 horas (mM)
- Metacrilato de isobutilo
- Metacrilato de fenilo Metacrilato de bencilo Metacrilato de 2- etilhexilo
- BL21 (DE3)/pAAT201
- 0,009 0,001 0,17 0,31
Condiciones de análisis de HPLC Dispositivo: Waters 2695
Columna: Shiseido CAPCELL PAK C18 UG120 5 |im Fase móvil: MeOH al 65 %, ácido fosfórico al 0,2 % Velocidad de flujo: 0,25 ml/min Temperatura de la columna: 35 °C
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Detección: UV 210 nm Volumen de inyección: 10 |il
Ejemplo 10: Preparación de E. coli recombinante en la que se introdujo el gen de ACD
Preparación de recombinante de alta expresión con clonación de gen homólogo de ACD de Pseudomonas aeruginosa PAO1
(1) Preparación de ADN genómico de Pseudomonas aeruginosa PAO1
Se inoculó la cepa de Pseudomonas aeruginosa PAO1 (NBRC106052) hecha crecer en agar nutriente LB (Bacto- triptona al 1 %, extracto de levadura Bacto al 0,5 %, NaCl al 0,5 %, agar al 1,5 %) en 10 ml de medio de cultivo líquido LB (Bacto-triptona al 1 %, extracto de levadura Bacto al 0,5 %, NaCl al 0,5 %), y se realizó cultivo con agitación a 37 °C durante 15 horas. Tras la finalización del cultivo, se recuperó la célula bacteriana por medio de centrífuga a partir de 2 ml del caldo, y se prepararon 100 ml de ADN genómico usando el kit de purificación de ADN genómico Wizard (Promega KK).
(2) Clonación del vector de expresión
El ADN genómico obtenido se convirtió en un molde, y se preparó un fragmento de ADN que incluía un gen que se suponía que codificaba ACD por medio del método de PCR para que fuera una forma en la que se añadió un sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción que permite una fácil introducción en un vector de expresión.
Cebador de oligonucleótido
MMA-003: 5'-GACCCATGGATTTCGACCTCACCGAAGAAC-3' (SEQ ID NO. 13)
MMA-004: 5'-GCCCTGCAGGATGCGATGGTTCGCGGCGTTC-3'(SEQ ID NO. 14)
Composición de la disolución de reacción Agua esterilizada 22 |il
2 x PrimeSTAR (fabricado por Takara Bio) 25 |il
MMA-003 (SEQ ID NO. 13) 1 |il
MMA-004 (SEQ ID NO. 14) 1 |il
ADN genómico 1 |il
Cantidad total 50 |il
Ciclo de temperatura
30 ciclos de reacción a 98 °C 10 segundos, 55 °C 15 segundos y 72 °C 150 segundos
Se purificó una banda de aproximadamente 1,2 kb del producto de amplificación obtenido mediante un kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN). Se digirió el ADN purificado con la enzima de restricción NcoI (sitio de reconocimiento de escisión incluido en el oligonucleótido MMA-003) y Sse8387I (sitio de reconocimiento de escisión incluido en el oligonucleótido MMA-004), y se purificó por medio de extracción con fenol/extracción con cloroformo/precipitación con etanol. Se mezclaron el ADN purificado (5 |il), vector pTrc99A digerido con NcoI y Sse8387I (1 |il), agua destilada (4 |il) y disolución I (kit de ligación de ADN ver. 2 (Takara Bio)) (10 |il), y se ligó el vector con producto de amplificación de PCR mediante incubación durante 12 horas a 16 °C.
A 200 |il de la célula competente preparada mediante el método del ejemplo de referencia 1, se le añadieron 10 |il de la disolución de ligación mencionada anteriormente y se dejó reposar a 0 °C durante 30 minutos, seguido por conferir choque térmico a 42 °C durante 30 segundos y enfriamiento hasta 0 °C durante 2 minutos, tras lo cual se añadió 1 ml de medio de cultivo SOC (glucosa 20 mM, Bacto-triptona al 2 %, extracto de levadura Bacto al 0,5 %, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgSO41 mM, MgCh 1 mM) y se cultivó con agitación a 37 °C durante 1 hora.
Tras cultivar, se inocularon 200 |il de medios de cultivo en agar nutriente LBAmp (medio de cultivo LB que contenía ampicilina 100mg/l, agar al 1,5%), y se cultivó adicionalmente a 37 °C. Se cultivó una pluralidad de colonias de
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organismos transgénicos cultivados sobre agar nutriente durante la noche a 37 °C en 1,5 ml de medio de cultivo LBAmp (medio de cultivo LB que contenía ampicilina 100 mg/l), y tras la cosecha, se recuperó ADN de plásmido usando un instrumento Flexi Prep (fabricado por Amersham Biosciences).
(3) Transformación
Para el ADN de plásmido recombinante obtenido, se confirmó la secuencia de nucleótidos del mismo usando un kit CEQ DTCS Quick Start y analizador de ADN CEQ 2000XL de secuenciador fluorescente (ambos de Beckman Coulter, EE. UU.), y se denominó plásmido pMMA002. Se transformó la cepa de E. coli JM109 usando el plásmido pMMA002 para preparar un recombinante en el que se había introducido el gen de ACD (SEQ ID NO. 8). La secuencia de aminoácidos se muestra mediante SEQ ID NO. 7.
Ejemplo 11: Preparación de extracto libre de células a partir de E. coli recombinante que expresa el gen de ACD
Se inoculó E. coli JM109/pMMA002 recombinante en la que se había introducido el gen de ACD (SEQ ID NO. 8) obtenido en el ejemplo 10 en 1 ml de un medio de cultivo LB que contenía ampicilina 100 |ig/ml, y se realizó el precultivo a 37 °C durante 7 horas. Se tomó el caldo en 0,1 ml, se añadió a 100 ml del mismo medio de cultivo (ampicilina 100 |ig/ml, MIPTG 1 m contenido) y se cultivó con agitación a 37 °C durante 15 horas. Se recuperó la célula bacteriana por medio de centrifugación (3700 * g, 10 min, 4 °C) del caldo obtenido, y tras lavar con una disolución de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,0), se suspendió para que tuviese una Do=6 (630 nm) en la misma disolución de tampón. Se usó JM109/pTrc99A como cepa de referencia.
A partir de la suspensión de células bacterianas obtenida, se preparó 1 ml de extracto libre de células tal como sigue. Usando un homogeneizador ultrasónico VP-15S (Taitec, Japón), se realizó la homogeneización durante 1 minuto mientras se mantenía en hielo en condiciones de control de salida 4, CICLO DE TRABAJO DEL 40 %, CRONÓMETRO DE PULSO = modo B 10 s. A continuación, se realizó la centrifugación (10 000 *g, 5 minutos, 4 °C), y se recogió el sobrenadante obtenido como extracto libre de células.
Ejemplo 12: Preparación de metacrilato de butilo a partir de isobutiril-CoA usando fragmento vegetal y extracto libre de células recombinantes modificado genéticamente para ACD
(1) Reacción de síntesis de metacrilil-CoA con isobutiril-CoA como sustrato mediante extracto libre de células recombinantes modificado genéticamente para ACD
A 1,84 ml de una disolución que contenía metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazinio 6 mM, flavina adenina dinucleótido 0,4 mM e isobutiril-CoA 1 mM en una disolución de tampón fosfato de sodio 100 mM (pH 8,0), se añadieron 0,16 ml de extracto libre de células que tenía actividad de ACD obtenido en el ejemplo 10 para preparar 2 ml de disolución de reacción. Se permitió que reaccionaran a 37 °C durante 30 minutos, y se realizó el análisis en las condiciones de HPLC mostradas a continuación. Como resultado de los mismos, el pico de isobutiril-CoA desapareció, confirmando de ese modo la formación de metacrilil-CoA.
Condiciones de análisis de HPLC
Columna: Inertsil ODS-3V, 4,6 mm * 250 mm
Fase móvil: MeOH al 30 %, H3PO4 50 mM, pH 5,7
Velocidad de flujo: 1,0 ml/min
Temperatura de la columna: 35 °C
Detección: UV 254 nm
Volumen de inyección: 10 |il
Se diluyó la disolución de reacción 10 veces con fase móvil y se midió.
(2) Síntesis de metacrilato de butilo mediante la adición de alcohol n-butílico y fragmento vegetal a disolución de reacción de síntesis de metacrilil-CoA
Se retiró la piel de un plátano, se cortó el sarcocarpio con una cuchilla hasta un grosor de aproximadamente 1 milímetro, y se dividió esto adicionalmente en cuatro. A un matraz de 50 ml, se le añadieron 1 g del plátano cortado, 0,9 ml de la disolución de reacción de síntesis de metacrilil-CoA, 0,1 ml de disolución de KCl 3,5 M y 5 ml de alcohol n-butílico, se selló y entonces se permitió que reaccionaran a 30 °C durante 2 horas. Tras realizar análisis del éster del ácido metacrílico de manera similar al ejemplo 1, se formaron 0,015 mM de metacrilato de butilo.
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Ejemplo 13: Preparación de E. coli recombinante en la que se introdujo el gen de ECH
(1) Preparación de ADN genómico de Rhodococcus bacterium
Se inoculó la cepa de Rhodococcus erythropolis PR4 (NBRC100887) en medio de cultivo de agar nutriente LB en 10 ml de medio de cultivo LB, y se realizó cultivo con agitación a 30 °C durante 36 horas. Tras la finalización del cultivo, se recuperó la célula bacteriana por medio de centrífuga a partir de 2 ml del caldo, y se adquirieron 100 |il de ADN genómico de manera similar al ejemplo 10.
(2) Clonación del vector de expresión
El ADN genómico obtenido se convirtió en un molde, y se preparó un fragmento de ADN que incluía un gen de secuencia de nucleótidos que se suponía que codificaba ECH por medio del método de PCR para que fuera una forma en la que se añadió un sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción que permite una fácil introducción en un vector de expresión.
Cebador de oligonucleótido:
MMA-031: 5'-GGTCATGACCGACTTCAACACCATCATCCTC-3' (SEQ ID NO. 15)
MMA-032: 5'-GGCCTGCAGGTTCAGCTGTTCGAAAGTTCAGCGC-3' (SEQ ID NO. 16)
Se realizó PCR de manera similar al ejemplo 10, y se digirió el ADN obtenido con la enzima de restricción BspHI (sitio de reconocimiento de escisión incluido en el oligonucleótido MMA-031) y Sse8387I (sitio de reconocimiento de escisión incluido en el oligonucleótido MMA-032). Tras la escisión, se realizaron las mismas operaciones que en el ejemplo 6 para adquirir el ADN de plásmido diana en el que se incorporó el gen de ECH (SEQ ID NO. 10), y entonces se denominó plásmido pMMA011. La secuencia de aminoácidos se muestra mediante SEQ ID NO. 9.
(3) Transformación
Se transformó la cepa de E. coli JM109 usando el plásmido pMMA011 para preparar E. coli recombinante para la expresión del gen de ECH.
Ejemplo 14: Síntesis de metacrilato de butilo a partir de 3-hidroxiisobutiril-CoA usando extracto libre de células de E. coli recombinantes para la expresión del gen de ECH y extracto libre de células recombinantes para el gen de AAT
(1) Preparación de líquido con células rotas que tiene actividad de ECH
Se inoculó la E. coli JM109/pMA011 recombinante en la que se había introducido el gen de ECH obtenido en el ejemplo 13 en un medio de cultivo LB que contenía 2 ml de ampicilina 100 |ig/ml, y se realizó el precultivo a 37 °C durante 24 horas. Se tomó el caldo en 0,1 ml, se añadió a 100 ml del mismo medio de cultivo (ampicilina 100 |ig/ml, MIPTG 1 m contenido), y se cultivó con agitación a 37 °C durante 15 horas. Se recuperó la célula bacteriana por medio de centrifugación (3700 x g, 10 min, 4 °C) del caldo obtenido, y tras lavar dos veces con una disolución de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,0), se diluyó para que tuviese una DO=6 (630 nm) en la misma disolución de tampón.
A partir de la suspensión de células bacterianas obtenida, se preparó 1 ml de líquido con células rotas del siguiente modo. Usando un homogeneizador ultrasónico Sonifier 250D (Branson, EE. UU.), se homogeneizó durante 5 minutos mientras se mantenía en hielo en condiciones de amplitud: 15 %/encendido: 1 s, apagado: 1 s.
(2) Reacción de síntesis de metacrilil-CoA usando líquido con células rotas de E. coli recombinante para la expresión del gen de ECH
A la mezcla preparada mezclando 0,2 ml de disolución de tampón tris-HCl 0,5 M (pH 7,4), 0,4 ml de disolución acuosa de 3-hidroxiisobutiril-CoA 1,2 mM y 1,2 ml de agua, se le añadieron 0,2 ml de líquido con células rotas que tenía actividad enoil-CoA hidratasa obtenido del modo anterior para preparar 2 ml de disolución de reacción. Se permitió que reaccionara a 37 °C durante 30 minutos, y se realizó el análisis en las condiciones de HPLC mostradas en el ejemplo 12. Como resultado del mismo, se confirmó la formación de metacrilil-CoA.
(3) Síntesis de metacrilato de butilo usando extracto libre de células recombinante para el gen de AAT
A una botella de muestra de 10 ml, se le añadieron 0,4 ml de la disolución de reacción de síntesis de metacrilil-CoA, 0,1 ml de disolución de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,5) y 0,2 ml de agua, se le añadieron adicionalmente 0,1 ml de disolución de n-butanol 0,4 M y 0,2 ml de líquido con células rotas con AAT de manzana (MpAAT) preparado de manera similar al ejemplo 7, se selló y entonces se permitió que reaccionaran a 30 °C durante 3 horas. Tras realizar análisis de éster del ácido metacrílico de manera similar al ejemplo 1, se formaron 0,001 mM de metacrilato de butilo.
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Ejemplo 15: Preparación de recombinante de alta expresión con clonación del gen de BCKAD, preparación de extracto libre de células y análisis de expresión de proteína
La preparación de plásmido de expresión con clonación génica y la preparación de recombinante se realizaron de manera similar al ejemplo 10. Se convirtió ADN genómico de la cepa de Pseudomonas aeruginosa PAO1 en un molde, y se preparó un fragmento de ADN que incluía todo el operón génico que codifica el gen del complejo BCKAD por medio del método de PCR usando el cebador mostrado a continuación. Se digirió el fragmento obtenido mediante la enzima de restricción BspHI y Sse8387I, y se insertó en el vector pTrc99A de manera similar al ejemplo 10 para obtener el plásmido recombinante (pWA108).
Cebadores de oligonucleótido:
MAA-15: 5'-GGCCTGTCATGAGTGATTACGAGCCG-3' (SEQ ID NO. 17)
MAA-16: 5'-CGGCCCTGCAGGTTCGCGGGAATCAGATGTGC-3' (SEQ ID NO. 18)
Se cultivó la E. coli JM109/pWA108 recombinante obtenida del modo anterior de manera similar al ejemplo 10. Sin embargo, en el caso del presente recombinante, puesto que se reconoció una alta expresión de proteína incluso sin realizar la adición de IPTG basándose en los resultados preliminares, se realizó sin la adición de IPTG. Se realizó la preparación de extracto libre de células de manera similar al ejemplo 11.
Ejemplo 16: Medición de la actividad del extracto libre de células de recombinante de alta expresión del gen de BCKAD
Se midió la actividad de BCKAD a partir de la generación de isobutiril-CoA con ácido 2-oxoisovalérico como sustrato del siguiente modo.
A 0,7 ml de una disolución que contenía concentraciones finales de MgCh 1 mM, pirofosfato de tiamina 0,2 mM, CoA-Sh 1 mM y DDT 2 mM en una disolución de tampón fosfato de sodio 100 mM (pH 7,0), se le añadieron 0,2 ml del extracto libre de células obtenido en el ejemplo 15 para constituir 0,9 ml. Tras añadir 0,1 ml (concentración final de 4 mM) de sal de calcio de ácido 2-oxoisovalérico a esto y hacer reaccionar a 37 °C durante 30 minutos, se realizó ultrafiltración usando un instrumento Centricut Super Mini W-10 (Kurabo Industries Ltd ). Se detuvo la reacción realizando desproteinización, y se realizó el análisis mediante HPLC en las siguientes condiciones. Como resultado de lo mismo, se reconoció la formación de isobutiril-CoA 0,83 mM con JM109/pWA108.
Condiciones de análisis de HPLC
Columna: Inertsil ODS-3V, 4,6 mm * 250 mm
Fase móvil: MeOH al 35 %, H3PO4 50 mM, pH 5,7
Velocidad de flujo: 1,0 ml/min
Temperatura de la columna: 35 °C
Detección: UV 254 nm (210 nm)
Volumen de inyección: 10 |il (disolución de reacción diluida 10 veces con fase móvil y medida)
Ejemplo 17: Síntesis de metacrilil-CoA (figura 1) a partir de ácido 2-oxoisovalérico mediante mezcla de extracto libre de células de recombinante de alta expresión del gen de BCKAD y recombinante que expresa el gen de ACD
A 0,6 ml de una disolución que contenía concentraciones finales de MgCh 1 mM, pirofosfato de tiamina 0,2 mM, CoA-SH 1 mM, DDT 2 mM, nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) 2 mM, flavina adenina dinucleótido (FAD) 0,04 mM y valina 2 mM en una disolución de tampón fosfato de sodio 100 mM (pH 7,0), se le añadieron 0,1 ml de cada uno de los extractos libres de células (JM109/pMMA002 y JM109/pWA108) obtenidos mediante los métodos del ejemplo 11 y ejemplo 15 respectivamente para constituir 0,8 ml. Tras añadir 0,1 ml de sal de calcio de ácido 2- oxoisovalérico (concentración final de 4 mM) a esto y hacer reaccionar a 37 °C durante 30 minutos, se confirmó la formación de isobutiril-CoA mediante HPLC, y se añadió 0,1 ml de metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazinio (concentración final de 6 mM) y se permitió que reaccionaran adicionalmente durante 3 horas. Tras la reacción, se realizó ultrafiltración usando un instrumento Centricut Super Mini W-10 (Kurabo Industries Ltd.). Se detuvo la reacción realizando desproteinización, y se realizó el análisis mediante HPLC. Como resultado de lo mismo, se reconoció la formación de metacrilil-CoA 0,2 mM.
Ejemplo de referencia 2: Preparación de PR4KS receptora de transferencia por conjugación
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Se modificó Rhodococcus erthropolis PR4 (NITE Biological Resource Center; número de depósito: NBRC 100887) mediante el método descrito en la solicitud de patente japonesa no examinada, publicación n.° 2011-200133 para preparar un derivado que presenta resistencia a cloranfenicol 120 mg/l y que carece de gen resistente a kanamicina, y se denominó cepa PR4KS.
Más específicamente, con el fin de potenciar la resistencia a cloranfenicol, se elevó gradualmente la concentración de cloranfenicol en un medio de cultivo MYK (polipeptona al 0,5 %, extracto de bact.-levaduras al 0,3 %, extracto de malta al 0,3 %, KH2PO4 al 0,2 %, K2HPO4 al 0,2 %) por etapas partiendo de 10 mg/ml hasta 120 mg/ml, mientras se inducía la mutación espontánea subcultivando la cepa PR4, obteniendo de ese modo la cepa RhCmSR-09 derivada que tenía resistencia a 120 mg/ml de cloranfenicol.
A continuación, se mezcló la cepa RhCmSR-09 mencionada anteriormente a una razón 1:1 con E. coli que retenía el plásmido pKM043 para la introducción de deficiencia de gen resistente a kanamicina descrita en la solicitud de patente japonesa no examinada, publicación n.° 2011-200133, luego se cultivó, y tras introducir pKM043 en la cepa RhCmSR-09 mediante transferencia por conjugación, se cultivó en agar nutriente MYK que contenía sulfato de kanamicina 200 mg/l y cloranfenicol 50 mg/l (polipeptona al 0,5 %, extracto de bact.-levaduras al 0,3 %, extracto de malta al 0,3 %, KH2PO4 al 0,2 %, K2HPO4 al 0,2 %, agar al 1,5 %), obteniendo de ese modo una cepa recombinante homóloga en la que se había introducido pKM043 en el genoma de la cepa RhCmSR-09. Se cultivó la cepa recombinante homóloga en agar nutriente MYK que contenía sacarosa al 10 %, mediante lo cual se obtuvo una cepa derivada que surgía como cepa sensible a kanamicina entre las colonias obtenidas, es decir cepa PR4KS derivada con variación de deficiencia de gen resistente a kanamicina.
Ejemplo de referencia 3: Preparación de plásmido para deficiencia génica con clonación del gen homólogo de LigD
Se estableció el gen homólogo de LigD (n.° de registro: YP_002767969) de la cepa PR4KS como gen diana. Tras la amplificación de aproximadamente 5,4 kb de ADN que incluía la secuencia que rodeaba al gen homólogo de LigD por medio de PCR, se clonó en el vector de plásmido pK19mobsacB1 en el que se había introducido el gen de sacB en el sentido de 3' y en la misma orientación del gen resistente a kanamicina, descrito en la solicitud de patente japonesa no examinada, publicación n.° 2011-200133, obteniendo de ese modo el plásmido pTJ001. Las condiciones de PCR fueron las siguientes.
Cebadores
GB-138: 5'-GGCCTGCAGGTACCGATCATCACCATCGGTGTC-3' (SEQ ID NO. 19)
GB-139: 5'-GGTCTAGACTGAGCAGTGTTCCAATGCG-3' (SEQ ID NO. 20)
Composición de la disolución de reacción Agua esterilizada 22 |il
2 x PrimeSTAR (fabricado por Takara Bio) 25 |il
GB-138 (SEQ ID NO. 19) 1 |il
GB-139 (SEQ ID NO. 20) 1 |il
Genoma de PR4KS (50 ng/|il) 1 |il
Cantidad total 50 |il
Ciclo de temperatura
35 ciclos de reacción a 98 °C 10 segundos, 55 °C 15 segundos y 72 °C 120 segundos
Se preparó el plásmido para pTJ002 con deficiencia de gen homólogo de LigD en el que se delecionó la longitud completa de la secuencia homóloga de LigD dentro de pTJ001 (aproximadamente 2,3 kb) y solo se permitió que permanecieran las secuencias en el sentido de 5' y en el sentido de 3' del gen homólogo de LigD (se remite a la figura 3). Se amplificó la secuencia dentro de pTJ001 usando los cebadores GB-140 y GB-141, que incluyen la secuencia circundante del codón de iniciación y la secuencia circundante del codón de terminación del gen homólogo de LigD seleccionado como diana, respectivamente, y que se diseñaron para que se extendieran en la dirección en sentido de 5' del codón de iniciación y en la dirección en el sentido de 3' del codón de terminación, respectivamente, con el fin de obtener el producto de PCR que no incluye el gen homólogo de LigD. Se transformó la cepa de E. coli JM109 mediante el producto de PCR obtenido para preparar ADN circular como pTJ002. Las
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condiciones de PCR son tal como sigue.
Cebadores
GB-140: GAGGAAATGGTCACAGGGCGAGAATAGGTTG (SEQ ID NO. 21)
GB-141: GCCCTGTGACCATTTCCTCATTGTGCTGG (SEQ ID NO. 22)
Composición de la disolución de reacción Agua esterilizada 22 |il
2 x PrimeSTAR (fabricado por Takara Bio) 25 |il
GB-140 (SEQ ID NO. 21) 1 |il
GB-141 (SEQ ID NO. 22) 1 |il
pTJ001 1 |il
Cantidad total 50 |il
Ciclo de temperatura
30 ciclos de reacción a 98 °C 10 segundos, 50 °C 10 segundos y 72 °C 180 segundos
Tras la finalización de la PCR, tras la realización de la confirmación del fragmento mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,7% usando 1 |il de muestra, se reconoció la amplificación del fragmento. En el procedimiento de producción de plásmido pTJ002 mencionado anteriormente, se usó un kit de purificación de ADN genómico Wizard (fabricado por Promega) en la extracción del genoma de la cepa PR4, se usó un kit de purificación de gel/PCR (fabricado por FAVORGEN) en la purificación del fragmento de ADN digerido con la enzima de restricción y el producto de PCR, se usó un kit de ligación de ADN <Mighty Mix> (fabricado por Takara Bio) en la unión de ADN y se usó un kit QIAprep miniprep (fabricado por QIAGEN) en la extracción del plásmido.
Ejemplo de referencia 4: Preparación de cepa de PR4KS derivada deficiente en gen homólogo de LigD
Con el producto mediante la transformación de E. coli (Escherichia coli) S17-1 Xpir por medio de pTJ002 como donador, y la PR4KS obtenida mediante el método del ejemplo de referencia 2 como receptor, se realizó transferencia por conjugación de manera similar al método descrito en la solicitud de patente japonesa no examinada, publicación n.° 2011-200133 para obtener 13 cepas de la cepa derivada deficiente en gen homólogo de LigD producida mediante recombinación homóloga. Se seleccionó una cepa de las cepas derivadas deficientes, y se denominó PR4KSAligD.
Ejemplo de referencia 5: Preparación del plásmido pLK005 para Rhodococcus bacterium y plásmido pSJ201 de expresión de nitrilo hidratasa usando el mismo
(1) Adquisición y análisis de pLK005
Usando pK4 (se remite a la solicitud de patente japonesa no examinada, publicación n.° H5-64589), se transformó Rhodococcus sp N775 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depository, número de depósito FERM BP-961) mediante el método de electroporación mencionado anteriormente. Se inoculó el transformante obtenido en 10 ml de medio de cultivo MYK, y se cultivó a 30 °C durante 1 día. Se realizó un tratamiento de variación exponiendo esto a luz ultravioleta en una mesa de laboratorio limpia. Se aplicó el líquido de cultivo en el que se realizó el tratamiento de variación a agar nutriente MYK que contenía kanamicina de 50 a 400 |ig/ml, y se cultivó a 30 °C durante 3 días.
Se cultivó respectivamente la pluralidad de colonias que aparecen sobre el agar nutriente en medio de cultivo MYK, y se recuperaron los plásmidos de los transformantes. Usando el plásmido recuperado, se transformó de nuevo Rhodococcus sp N775, y se investigó si la resistencia a la kanamicina del transformante mejora. Como resultado de lo mismo, se reconocieron varias cepas de transformante para las que la resistencia a la kanamicina mejoró claramente.
Tras investigar las secuencias de nucleótidos de plásmidos para los que se reconoció que la resistencia a la kanamicina mejoraba, se reconoció que se produce un cambio en la secuencia en la región en el sentido de 5' del gen resistente a kanamicina de pK4 (solapamiento de secuencia de 8 nucleótidos GTTGTAGG). Este plásmido para
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(2) Preparación de pSJ040
El plásmido pSJ034 es un plásmido preparado a partir del plásmido pSJ023 mediante el método descrito en la solicitud de patente japonesa no examinada, publicación n.° H10-337185. En pSJ034, aunque están presentes tres sitios de enzimas de restricción EcoRI, se preparó el plásmido pSJ040 en el que uno de estos se transformó en un sitio Spel. Específicamente, se descompuso parcialmente pSj034 usando la enzima de restricción EcoRI. Se convirtió el sitio escindido en extremo romo usando el kit Blunting de Takara y luego se realizó una reacción de ligación en presencia del ligador Spel. Se transformó la cepa de E. coli JM109 usando la disolución de reacción. Tras cultivar el transformante, se extrajo el plásmido, y se separó el plásmido en el que se había insertado el ligador Spel. El plásmido en el que se insertó el ligador Spel, entre los tres sitios EcoRI de pSJ034, en el sitio EcoRI presente en el sentido de 3' del gen resistente a kanamicina, se denominó pSJ040.
(3) Ensamblaje de pSJ201
Se digirió pLK005 con HindIII para preparar un fragmento de aproximadamente 2,1 kb. Por otro lado, se digirió pSJ040 con HindIII para preparar un fragmento de aproximadamente 9,8 kb. Usando estos dos fragmentos, se realizó la reacción de ligación, y se transformó la cepa de E. coli JM109 usando la disolución de reacción. Tras cultivar el transformante, se extrajo el plásmido y se confirmó la secuencia de nucleótidos del mismo, como resultado de lo cual un plásmido que mantenía la secuencia mutada (duplicación de GTTGTAGG) derivada de pLK005, y que tenía por lo demás la misma secuencia que pSJ040, se denominó pSJ201.
Ejemplo de referencia 6: Preparación de la cepa derivada deficiente en el gen de RE_acd1/RE_echA/RE_hchA/RE_mmsB de la cepa derivada PR4KSAligD
(1) Preparación del plásmido para la deficiencia génica usando el método In Fusion
Se realizó la preparación de un plásmido para deficiencia génica por medio de un kit de clonación In-Fusion HD (fabricado por Takara Bio) en el que el gen de RE_acd1/RE_echA/RE_hchA/RE_mmsB de la cepa PR4KS era el gen diana (se remite a la figura 4).
El ADN de las secuencias en el sentido de 5' y en el sentido de 3' del gen diana se amplificó mediante PCR. Las condiciones de PCR fueron tal como sigue.
Cebadores para el fragmento 1
MMA-061: CGACTCTAGAGGATCGCTCAGTACATCTACGAGAC (SEQ ID NO. 23)
MMA-062: AGTGTGAGGAAAGTGTTCCGATCAGTTCAT (SEQ ID NO. 24)
Cebadores para el fragmento 2
MMA-063: CACTTTCCTCACACTCGTCGAGAGTATGAG (SEQ ID NO. 25)
MMA-064: CGGTACCCGGGGATCAGCGCGACGAACAACGAGAC (SEQ ID NO. 26)
Composición de la disolución de reacción
Molde (ADN genómico de tipo natural de PR4) 1 |il
2 x premezcla PrimeSTAR Max (fabricado por Takara Bio) 25 |il
Cebador Fw (20 |iM) 1 |il
Cebador Rv (20 |iM) 1 |il
Agua desionizada 22 |il
Cantidad total 50 |il
Ciclo de temperatura
30 ciclos de reacción a 98 °C 10 segundos, 60 °C 10 segundos y 72 °C 120 segundos
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Tras la finalización de la PCR, tras realizar la confirmación del fragmento mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,7% usando 1 |il de muestra, se reconoció la amplificación del fragmento. Usando un kit de extracción de gel/PCR (fabricado por FAVORGEN), se realizó la sustitución del tampón en el producto de PCR (fragmento 1 y fragmento 2), y se usó en la reacción mediante el kit de clonación In-Fusion HD mostrado a continuación.
(2) Unión del fragmento diana con el vector mediante el kit de clonación In-Fusion HD y transformación
Se realizó la unión del fragmento y el vector mencionados anteriormente usando el kit de clonación In-Fusion HD. Las condiciones de reacción fueron tal como sigue.
Composición de la disolución de reacción
5 x premezcla de enzima In-Fusion HD 2 |il
Fragmento de vector 1,5 |il
Fragmento de ADN 1 1 |il
Fragmento de ADN 2 2 |il
Agua desionizada 3,5 |il
Cantidad total 10 |il
Tras incubar la disolución de reacción mencionada anteriormente a 50 °C durante 15 minutos, se enfrió en hielo, y se usó en la transformación de la cepa de E. coli JM109. Se realizó la selección de transformante de E. coli con agar nutriente LB que contenía sulfato de kanamicina 50 mg/l (a continuación en el presente documento, agar nutriente LB Km 50). Se preparó el plásmido a partir del transformante obtenido usando un kit Mini prep (QIAGEN) para obtener el plásmido diana. Se realizó la confirmación del plásmido investigando el tamaño de fragmento tras el tratamiento con la enzima de restricción XbaI, y la secuencia de la región de unión del fragmento de inserto y vector. El plásmido diana se denominó pMMA302.
(3) Preparación de cepa derivada recombinante homóloga de la cepa derivada PR4KSAligD y cepa derivada deficiente en el gen
A 20 |il de la célula competente de la cepa PR4KSAligD, se le añadieron 1 |il de pMMA302, y se incubó en hielo durante 10 minutos. Se desplazó toda la cantidad de la disolución incubada mencionada anteriormente a una cubeta de electroporación enfriada con hielo (0,1 cm), se aplicó un alto voltaje de 1,5 kV (200 Q), se añadieron inmediatamente 600 |il de medio de cultivo líquido LB y se dejó reposar a 30 °C durante 6 horas. En el agar nutriente LB que contenía sulfato de kanamicina 10 mg/l (a continuación en el presente documento, agar nutriente LB Km 10), se propagaron 200 |il y se cultivaron a 30 °C durante 4 días. Se sembró en estrías la colonia hecha crecer sobre el agar nutriente LB Km10, y tras cultivar durante 4 días, se realizó PCR de la colonia según las condiciones mostradas a continuación y se realizó la confirmación de la cepa derivada recombinante homóloga.
Cebadores
MMA-069: GCGCATCTACAAGGAAGAGATC (SEQ ID NO. 27)
MMA-070: GCGACGCTCATCGAGATCTC (SEQ ID NO. 28)
Composición de la disolución de reacción Molde 4,0 |il
2 x tampón Mighty Amp (fabricado por Takara) 5,0 |il Cebador Fw (20 |im) 0,25 |il Cebador Rv (20 |im) 0,25 |il Agua desionizada 0,3 |il
ADN polimerasa Mighty Amp (fabricado por Takara) 0,2 |il Total 10,0 |il
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Ciclo de temperatura
30 ciclos de reacción a 98 °C 10 segundos, y 68 °C 180 segundos
La colonia que se reconoció que era una cepa derivada recombinante homóloga se suspendió en 200 |il de medio de cultivo LB, se propagaron 100 |il sobre agar nutriente LB + sacarosa al 10 % y se cultivó durante 3 días. A partir de las colonias hechas crecer, se seleccionaron las que se volvieron sensibles a kanamicina, y se confirmó la deficiencia del gen diana para estas mediante PCR de colonia. Como resultado de lo mismo, se obtuvo una cepa en la que los cuatro genes de RE_acdl, RE_echA, RE_hchA y RE_mmsB se habían delecionado de la cepa derivada PR4KSAligD, y se denominó cepa DMA008.
Ejemplo 18: Preparación de plásmido para la coexpresión de ACD y AAT en microorganismo que pertenece al género Rhodococcus
Se preparó un plásmido para expresar ACD y/o AAT en microorganismos que pertenecen al género Rhodococcus.
Se insertó un fragmento de “promotor de nitrilasa + gen de MpAAT1” obtenido mediante reacción PCR con el plásmido pAAT301 para la expresión génica de MpAAT1 como molde en el sentido de 3' del gen de RE_acd1 del plásmido pMMA401 para la expresión génica de RE_acd1.
Se realizó la amplificación del fragmento de “promotor de nitrilasa + gen de MpAAT1” tal como sigue.
Cebadores
MMA-133 (Sse-ProFw): TGACCTGCAGGTGCACTCCGCTGCGACATGTATCGA (SEQ ID NO. 29)
MMA-131 (Sse-001Rv): ACTCTAGCCTGCAGGTCATTGACTAGTTGATCTAAGGTTGTTACA (SEQ ID NO. 30) Composición de la reacción PCR Molde (pAAT301) 1 |il
2 x premezcla PrimeSTAR Max (fabricado por Takara) 10 |il
Cebador Fw (10 |iM) 0,6 |il
Cebador Rv (10 |iM) 0,6 |il
Agua desionizada 7,8 |il
Total 20 |il
Ciclo de temperatura
30 ciclos de reacción a 98 °C 5 segundos, 60 °C 5 segundos y 72 °C 45 segundos
El fragmento de “promotor de nitrilasa + gen de MpAAT1” obtenido de este modo se trató con la enzima de restricción Sse8387I. Por otro lado, tras el tratamiento con Sse8387I, se realizó el tratamiento con SAP también sobre pMMA401. Se purificaron estos fragmentos de ADN usando un kit de purificación de gel/PCR (fabricado por FAVORGEN) tras realizar electroforesis en gel de agarosa 0,7 %. Las condiciones de reacción del tratamiento con enzimas de restricción y las condiciones de ligación fueron tal como sigue.
Composición de reacción del tratamiento con enzimas de restricción (fragmento de AAT)
Fragmento amplificado por PCR 40 |il
10xM tampón 5 |il
BSA al 0,1 % 4 |il
Sse8387I (fabricado por Takara) 1 |il Total 50 |il
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Composición de reacción del tratamiento con enzimas de restricción (fragmento de vector)
pMMA401 (vector) 3 |il
10xM tampón 4 |il
BSA al 0,1 %4 |il
AP 1 |il
Sse8387I (fabricado por Promega) 1 |il Agua desionizada 27 |il Total 40 |il
Composición de la reacción de ligación
pMMA401 1 |il
Fragmento de inserto 2 |il
Mezcla de ligación (fabricado por Takara) 3 |il
Total 6 |il
Se realizó la transformación de la cepa de E. coli JM109 usando una disolución de reacción de ligación mezclada en la composición mencionada anteriormente. Se extrajo el plásmido del transformante obtenido. Tras el tratamiento con la enzima de restricción Sse8387I, se realizó electroforesis en agarosa, y se confirmó que estaba insertándose un fragmento del tamaño diana. Se confirmó que era el plásmido diana a partir del análisis de la secuencia de nucleótidos de la región de unión del fragmento de inserto del plásmido obtenido, y se denominó el presente pACDAAT1.
Se preparó un total de seis plásmidos para la coexpresión de ACD y AAT de diferentes secuencias (pACDAAT2, paCdAaT3, pACDAAT4, pACDAAT6 y pACDAAT8) usando la misma técnica que la técnica mencionada anteriormente (se remite a la figura 5).
Ejemplo 19: Producción de metacrilato de butilo a partir de recombinante que coexpresa ACD y AAT
Se transformó la cepa DMA008 obtenida en (3) del ejemplo de referencia 6 mediante los plásmidos pACDAAT1, pACDAAT2, pACDAAT3, pACDAAT4, pACDAAT6 y pACDAAT8, respectivamente. Usando los recombinantes obtenidos (DMA008/pACDAAT1, DMA008/pACDAAT2, DMA008/pACDAAT3, DMA008/pACDAAT4, DMA008/pACDAAT6 y DMA008/pACDAAT8), se realizó la producción de éster del ácido metacrílico mediante la reacción de microorganismos en reposo. Además, se usó DMA008/pLK005 como control.
A 2 ml de medio de cultivo líquido LB Km 10 (tubo de ensayo Wassermann), se le inoculó 1 asa de inoculación, y se cultivó durante 2 días a 30 °C con un agitador rotatorio (180 rpm) en condiciones aerobias (precultivo). A 100 ml de LB Km 10 (100 ml de medio de cultivo/matraz de tres bocas de 500 ml), se les inoculó 1 ml de caldo previo, y se realizó el cultivo durante 3 días a 30 °C en un agitador rotatorio (230 rpm) en condiciones aerobias (cultivo principal).
Tras el cultivo principal, se transfirieron 40 ml del caldo principal a un tubo cónico de 50 ml, y se centrifugó (12 000 rpm, 10min), para obtener la célula bacteriana. Usando esta célula bacteriana, se realizó la reacción a continuación. A una botella de muestra de vidrio de 10 ml, se le añadió 1 ml de disolución de reacción para llevar a cabo la reacción durante 18 horas a 30 °C en un agitador rotatorio (180 rpm) en condiciones aerobias.
Composición de la disolución de reacción
DO630 = 10 células bacterianas (concentración final)
Ácido 2-oxoisovalérico 5,0 g/l (concentración final)
Alcohol 40 mM (concentración final)
Tampón fosfato de sodio 50 mM/pH 7,5 (concentración final)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Se usó n-butanol como alcohol.
Tras la reacción, se añadió 1 ml de acetonitrilo a la disolución de reacción y se mezcló bien, seguido por filtración usando un filtro de jeringa DISMIC/tamaño de poro de 0,45 |im (fabricado por ADVANTEC), y luego se analizó con el análisis de HPLC descrito en el ejemplo 9B. Los resultados de análisis del producto tras 18 horas se muestran en la tabla 10.
Formación de metacrilato de butilo a partir de recombinante que coexpresa ACD y AAT [Tabla 10]
- Recombinante
- Cantidad generada de metacrilato de butilo (mM)
- DMA008/pLK005
- 0
- DMA008/pACDAAT1
- 7,51
- DMA008/pACDAAT2
- 2,06
- DMA008/pACDAAT3
- 4,34
- DMA008/pACDAAT4
- 0,46
- DMA008/pACDAAT6
- 2,18
- DMA008/pACDAAT8
- 0,52
Ejemplo 20: Producción de éster del ácido metacrílico a partir de recombinante que coexpresa ACD y AAT
Se transformó la cepa DMA008 obtenida en (3) del ejemplo de referencia 6 mediante el plásmido pACDAAT1, respectivamente. Usando el recombinante obtenido (DMA008/pACDAAT1), se realizó la producción de éster del ácido metacrílico mediante la reacción de microorganismos en reposo. Además, se usó DMA008/pLK005 como control. Usando el método descrito en el ejemplo 19, se llevó a cabo el cultivo del recombinante para obtener la célula bacteriana.
Composición de la disolución de reacción
DO630 = 10 células bacterianas (concentración final)
Ácido 2-oxoisovalérico 5,0 g/l (concentración final) 40 mM Alcohol (concentración final) 50 mM
Tampón fosfato de sodio 50 mM/pH 7,5 (concentración final)
Se usaron n-butanol, isobutanol y alcohol 2-etilhexílico como alcohol.
Tras la reacción, se añadió 1 ml de acetonitrilo a la disolución de reacción y se mezcló bien, seguido por filtración usando un filtro de jeringa DISMIC/tamaño de poro de 0,45 |im (fabricado por ADVANTEC), y luego se analizó con el análisis de HPLC descrito en el ejemplo 9B. Los resultados de análisis del producto tras 18 horas se muestran en la tabla 11.
Formación de éster del ácido metacrílico a partir de recombinante que coexpresa ACD y AAT [Tabla 11]
- Recombinante
- Cantidad generada (mM)
- Metacrilato de butilo
- Metacrilato de isobutilo Metacrilato de 2-etilhexilo
- DMA008/pLK005
- 0 0 0
- DMA008/pACDAAT1
- 0,01 0,006 0,02
Ejemplo comparativo 1: Reacción de síntesis de éster del ácido metacrílico a partir de extracto libre de células recombinante para el gen de AAT derivado de levaduras
Se prepararon plásmidos que expresaban el gen de AAT derivados de levaduras de manera similar al ejemplo 6 (Tabla 12), y se transformó E. coli usando estos para obtener recombinante que expresa AAT.
Plásmido de expresión del gen de AAT derivado de levaduras
[Tabla 12]
SEQ ID NO | Nombre del gen | Plásmido molde | Plásmido de expresión
Claims (8)
1.
10
2.
3. 15
4.
20 5.
6.
25
7.
30
8.
35
9.
40 10.
Método para producir éster del ácido metacrílico que comprende:
una etapa de producir metacrilil-CoA a partir de isobutiril-CoA o 3-hidroxiisobutiril-CoA, y una etapa de sintetizar éster del ácido metacrílico provocando que un alcohol o fenol que tiene la fórmula R-OH actúe sobre metacrilil-CoA en presencia de una alcohol aciltransferasa, en la que R representa un grupo hidrocarbonado C1-20 lineal o ramificado de un tipo no cíclico saturado o insaturado o de un tipo cíclico saturado o insaturado.
Método para producir éster del ácido metacrílico según la reivindicación 1, en el que el éster del ácido metacrílico se acumula en al menos 0,001 mM.
Método para producir éster del ácido metacrílico según la reivindicación 1 o 2, en el que la isobutiril-CoA se produce a partir de ácido 2-oxoisovalérico.
Método para producir éster del ácido metacrílico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la alcohol aciltransferasa es de origen vegetal.
Método para producir éster del ácido metacrílico según la reivindicación 4, en el que la planta pertenece a cualquier orden seleccionado del grupo que consiste en Zingiberales, Rosales, Ericales, Cucurbitales, Brassicales y Laurales.
Método para producir éster del ácido metacrílico según la reivindicación 4, en el que la planta pertenece a cualquier familia seleccionada del grupo que consiste en Musaceae, Rosaceae, Ericaceae, Actinidiaceae, Cucurbitaceae, Caricaceae y Lauraceae.
Método para producir éster del ácido metacrílico según la reivindicación 4, en el que la planta pertenece a cualquier género seleccionado del grupo que consiste en Musa, Fragaria, Malus, Prunus, Pyrus, Vaccinium, Actinidia, Cucumis, Carica y Persea.
Método para producir éster del ácido metacrílico según la reivindicación 4, en el que la planta es una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en plátano, fresa, manzana, Prunus mume, Pyrus communis, arándano, kiwi, melón, papaya y aguacate.
Método para producir éster del ácido metacrílico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, usando un microorganismo modificado genéticamente al que se le ha transferido un gen para expresar alcohol aciltransferasa.
Método para producir éster del ácido metacrílico según la reivindicación 9, usando un microorganismo que pertenece al género Rhodococcus como microorganismo modificado genéticamente al que se le ha transferido un gen para expresar alcohol aciltransferasa.
SCoA
SCoA
ester del acido
metacrilil-coA
3-hidroxibutiril-CoA
metacnlico
SCoA
ester del acido
metacrml-CoA
ácido 2-oxoisova éneo
isobutiri -CoA
metacrilico
pTJ002
8,8 kpb
KmR
En el sentido de 3’ de homologo de LigD
1 sacB
En el sentido de 5 de homologo de LigD
origen rep
F G.4
secuencia en el
sacB Km'
sacB Knf
sentido de 3 del
secuencia en e
gen diana
sentido de 5 del
E-f
Lt":
gen diana
priV
oriv
plásmido que destruye el gen
fiamnl
BamHI
plásmido
(pK19sacB1)
gen diana
Producto de
Fw1: están contenidas la secuencia en el sentido de 5 de BamHI en el vector y la secuencia de 1 kb
en el sentido de 5 del gen diana
PCR 1
(fragmento 1)
Rvi: están contenidas las secuencias circundantes de 5 y 3 del gen diana
Producto de
Fvv2: están contenidas las secuencias circundantes de 5 y 3 del gen diana
PCR 2
Rv2: están contenidas la secuencia de 1 kg en el sentido de 3 del gen diana y la secuencia
(fragmento 2)
en el sentido de 5' de BamHI
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