JPWO2014038214A1 - メタクリル酸エステルの製造方法 - Google Patents
メタクリル酸エステルの製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(2)メタクリル酸エステルを0.001mM以上蓄積させる(1)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(3)イソブチリル−CoAあるいは3−ヒドロキシイソブチリル−CoAからメタクリリル−CoAを製造する工程をさらに含む、(1)または(2)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(4)イソブチリル−CoAが2−オキソイソ吉草酸から製造されることを特徴とする、(3)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(5)アルコールアシルトランスフェラーゼが植物由来である(1)から(4)のいずれかに記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
(6)植物が、ショウガ(Zingiberales)目、バラ(Rosales)目、ツツジ(Ericales)目、ウリ(Cucurbitales)目、アブラナ(Brassicales)目およびクスノキ(Laurales)目からなる群から選択されるいずれかの目に属するものである(5)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(7)植物が、バショウ(Musaceae)科、バラ(Rosaceae)科、ツツジ(Ericaceae)科、マタタビ(Actinidiaceae)科、ウリ(Cucurbitaceae)科、パパイア(Caricaceae)科およびクスノキ(Lauraceae)科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものである(5)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(8)植物が、バショウ(Musa)属、オランダイチゴ(Fragaria)属、リンゴ(Malus)属、サクラ(Prunus)属、ナシ(Pyrus)属、スノキ(Vaccinium)属、マタタビ(Actinidia)属、キュウリ(Cucumis)属、パパイア(Carica)属およびワニナシ(Persea)属からなる群から選択されるいずれかの属に属するものである(5)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(9)植物が、バショウ属、リンゴ属、サクラ属、ナシ属、スノキ属、マタタビ属、キュウリ属、パパイア属およびワニナシ属からなる群から選択されるいずれかの属に属するものである(5)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(10)植物が、バショウ属、リンゴ属、ナシ属、マタタビ属、キュウリ属、パパイア属およびワニナシ属からなる群から選択されるいずれかの属に属するものである(5)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(11)植物が、バナナ、イチゴ、リンゴ、ウメ、セイヨウナシ、ブルーベリー、キウイ、メロン、パパイアおよびアボカドからなる群から選択されるいずれかである(5)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(12)植物が、バナナ、リンゴ、ウメ、セイヨウナシ、ブリーベリー、キウイ、メロン、パパイアおよびアボカドからなる群から選択されるいずれかである(5)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(13)植物が、バナナ、リンゴ、セイヨウナシ、キウイ、メロン、パパイアおよびアボカドからなる群から選択されるいずれかである(5)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(14)アルコールアシルトランスフェラーゼを発現するように遺伝子導入された遺伝子組換え微生物を用いる(1)〜(13)のいずれかに記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
(15)ロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物を用いてメタクリル酸エステルを製造するメタクリル酸エステルの製造方法。
(16)ロドコッカス属に属し、配列番号31に示す16SrDNAの塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含む16SrDNAを有する微生物を用いる(15)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(17)ロドコッカス属に属する微生物が、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)である(15)又は(16)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(18)ロドコッカス属に属する微生物として、当該微生物の誘導株を用いる(15)又は(16)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(19)ロドコッカス属に属する微生物が、ロドコッカス・エリスロポリスPR−4株又はその誘導株である(18)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(20)誘導株が、以下に示す(a)又は(b)の少なくとも一方の改変を有する遺伝子改変株である(18)のメタクリル酸エステルの製造方法。
(a)分岐鎖ケト酸脱水素酵素遺伝子及び/又はアシルCoAデヒドロゲナーゼ遺伝子の導入による改変。
(b)エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子、3−ヒドロキシイソブチリルCoAヒドロラーゼ遺伝子及び/又は3−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損又は不活化する改変。
(21)誘導株が、アルコールアシルトランスフェラーゼ及び/又はアシルCoAデヒドロゲナーゼ発現用プラスミドを有する(19)又は(20)のメタクリル酸エステルの製造方法。
[メタクリル酸エステル]
本発明において、メタクリル酸エステルとは式1で示される化合物である。式1において、Rは直鎖あるいは分岐の炭素数1〜20の炭化水素基を表す。炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式であってもよく、飽和又は不飽和の環式であってもよい。好ましくは直鎖あるいは分岐鎖の炭素数1〜10の無置換のアルキル基、アラルキル基またはアリール基である。特に好ましくはメチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、n−ペンチル基、イソペンチル基、tert−ペンチル基、n−ヘキシル基、イソヘキシル基、2−ヘキシル基、ジメチルブチル基、エチルブチル基、ヘプチル基、オクチル基、2−エチルヘキシル基の炭素数1〜8のアルキル基、ベンジル基またはフェニル基である。
本発明において、メタクリリル−CoAとは、以下の構造式で示される化合物である。メタクリリル−CoAは、生体内ではバリンの代謝中間体として知られている。本発明で使用するメタクリリル−CoAは公知又は新規な方法で製造したものともできる。その合成方法としては無水メタクリル酸と補酵素Aを有機化学的に合成する方法(Methods in Enzymology. 324, 73−79 (2000))あるいは酵素反応を用いた合成方法が知られている。
本発明におけるメタクリル酸エステルの製造の原料となるアルコールまたはフェノール類は以下の式2で示される化合物である。アルコールまたはフェノール類の構造は、メタクリル酸エステルに対応することから、その構造は、前記式1のRと同じ定義であり、直鎖あるいは分岐の炭素数1〜20の炭化水素基を表す。炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式であってもよく、飽和又は不飽和の環式であってもよい。好ましくは直鎖あるいは分岐の炭素数1〜10の無置換のアルコール、アラルキルアルコールまたはフェノール類であり、特に好ましくはメタノール、エタノール、n−プロパノール、イソプロパノール、n−ブタノール、イソブタノール、sec−ブタノール、tert−ブタノール、n−ペンチルアルコール、イソペンチルアルコール、tert−ペンチルアルコール、n−ヘキシルアルコール、イソヘキシルアルコール、2−ヘキシルアルコール、ジメチルブチルアルコール、エチルブチルアルコール、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、2−エチルヘキシルアルコールの炭素数1〜8のアルキルアルコール、ベンジルアルコールまたはフェノールである。
本発明のアルコールアシルトランスフェラーゼ(以下、AATという)は、アルコールまたはフェノール類にアシル−CoAのアシル基を転移させてエステルを合成する触媒作用を有する酵素である。AATは、種々の果物におけるエステルの生成に関与していると言われている。AATはショウガ目(バナナ)、バラ目(イチゴ、リンゴ、ナシ、モモ)、ウリ目(メロン)、ツツジ目(キウイ)、シソ目(オリーブ)、ナス目(トマト)、ムクロジ目(レモン、マンゴー)等の植物に存在することが知られている。
さらにその中でも、バショウ属、リンゴ属、ナシ属、マタタビ属、キュウリ属、パパイア属又はワニナシ属に属する植物が特に好ましい。
さらに、AATを反応に供するに際しては、前記AATの遺伝子を単離し、例えば一般的な宿主ベクター系に導入し、該ベクター系で形質転換した微生物を利用することも可能である。宿主としては、細菌では大腸菌、Rhodococcus属、Pseudomonas属、Corynebacterium属、Bacillus属、Streptococcus属、Streptomyces属などが挙げられ、酵母ではSaccharomyces属、Candida属、Shizosaccharomyces属、Pichia属、糸状菌ではAspergillus属などが挙げられる。これらの中で、特に大腸菌を用いることが簡便であり、効率もよく好ましい。
Magnetospirillum属、Rhodospirillum属、Azospirillum属、Tistrella属、Acidiphilium属、Rhodobacter属、Paracoccus属、Ruegeria属、Jannaschia属、Roseobacter属、Dinoroseobacter属、Pseudovibrio属、Phaeobacter属、Octadecabacter属、Hyphomonas属、Maricaulis属、Hirschia属、Sphingomonas属、Novosphingobium属、Sphingopyxis属、Sphingobium属、Erythrobacter属、Brevundimonas属、Caulobacter属、Phenylobacterium属、Asticcacaulis属、Agrobacterium属、Rhizobium属、Sinorhizobium属、Xanthobacter属、Azorhizobium属、Brucella属、Ochrobactrum属、Mesorhizobium属、Chelativorans属、Aurantimonas属、Bradyrhizobium属、Agromonas属、Rhodopseudomonas属、Nitrobacter属、Methylobacterium属、Rhodomicrobium属、Pelagibacterium属Parvibaculum属、Methylocystis属、Parvularcula属、Burkholderia属、Ralstonia属、Cupriavidus属、Polynucleobacter属、Achromobacter属、Bordetella属、Taylorella属、Pusillimonas属、Comamonas属、Alicycliphilus属、Delftia属、Ramlibacter属、Rhodoferax属、Variovorax属、Polaromonas属、Acidovorax属、Verminephrobacter属、Herminiimonas属、Herbaspirillum属、Collimonas属、Chromobacterium属、Laribacter属、Pseudogulbenkiania属、Nitrosomonas属、Nitrosospira属、Aromatoleum属、Azoarcus属、Dechloromonas属、Thauera属、Azospira (Dechlorosoma)属、Rheinheimera属、Nitrosococcus属、Halorhodospira属、Xanthomonas属、Stenotrophomonas属、Pseudoxanthomonas属、Rhodanobacter属、Francisella属、Cycloclasticus 属、Oceanospirillum属、Hahella属、Halomonas属、Alcanivorax属、Kangiella属、Pseudomonas属、Azotobacter属、Acinetobacter属、Psychrobacter属、Alishewanella属、Alteromonas属、Glaciecola属、Marinobacter属、Marinobacterium属、Saccharophagus属、Shewanella属、Ferrimonas属、Idiomarina属、Colwellia属、Pseudoalteromonas属、Listonella属、Vibrio属、Photobacterium属、Aeromonas属、Oceanimonas属、Salinisphaera属、Legionella属、Coxiella属、Desulfococcus属、Desulfobacterium属、Desulfatibacillum属、Desulfobulbus属、Desulfarculus属、Geobacter属、Syntrophobacter属、Syntrophus属、Desulfomonile属、Bdellovibrio属、Bacteriovorax属、Stigmatella属、Myxococcus属、Anaeromyxobacter属、Sorangium属、Haliangium属、Acidobacterium属、Granulicella属、Ilumatobacter属、Streptosporangium属、Nocardiopsis属、Thermobifida属、Thermomonospora属、Pseudonocardia属、Amycolatopsis属、Saccharomonospora属、Saccharopolyspora属、Thermobispora属、Actinosynnema属、Micromonospora属、Salinispora属、Verrucosispora属、Nocardioides属、Kribbella属、Corynebacterium属、Nocardia属、Rhodococcus属、 Gordonia属、Dietzia属、Mycobacterium属、Amycolicicoccus属、Tsukamurella属、Segniliparus属、Microbacterium属、Micrococcus属、Arthrobacter属、Citricoccus属、Renibacterium属、Kocuria属、Kytococcus属、Cellulomonas属、Intrasporangium属、Serinicoccus属、Frankia属、Acidothermus属、Nakamurella属、Geodermatophilus属、Stackebrandtia属、Streptomyces属Catenulispora属、Rubrobacter属、Conexibacter属、Bacillus属、Geobacillus属、Oceanobacillus属、Lysinibacillus属、Halobacillus属、Alicyclobacillus属、Kyrpidia属、Paenibacillus属Lactobacillus属、Carnobacterium属、Clostridium属、Alkaliphilus属、Syntrophomonas属、Syntrophothermus属、Eubacterium属、Desulfitobacterium属、Desulfotomaculum属、Pelotomaculum属、Butyrivibrio属、Roseburia属、Oscillibacter属、Thermoanaerobacter属、Carboxydothermus属、Natranaerobius属、Sphingobacterium属、Pedobacter属、Haliscomenobacter属、Porphyromonas属、Odoribacter属、Spirosoma属、Runella属、Maribacter属、Deinococcus属、Thermus属、Meiothermus属、Oceanithermus属、Marinithermus属、Gemmatimonas属、Fusobacterium属、Ilyobacter属、Roseiflexus属、Herpetosiphon属、Thermomicrobium属、Thermotoga属、Thermosipho属、Fervidobacterium属、Deferribacter属、Calditerrivibrio属、Flexistipes属、Metallosphaera属、Aeropyrum属、Pyrobaculum属、Caldivirga属、Vulcanisaeta属、Acidilobus属、Haloarcula属、Haloquadratum属、Natronomonas属、Halorubrum属、Haloterrigena属、Natrialba属、Halalkalicoccus属、Halogeometricum属、Thermoplasma属、Picrophilus属、Ferroplasma属、Archaeoglobus属、Ferroglobus属、Polymorphum属、Micavibrio属、Simiduia属、Leptothrix属、Thiomonas属、Rubrivivax属、Methylibium属、Exiguobacterium属およびAnaerococcus属に属する微生物である。
nella basaltis、Shewanella benthica、Shewanella candadensis、Shewanella chilikensis、Shewanella colwelliana、Shewanella corallii、Shewanella decolorationis、Shewanella denitrificans、Shewanella donghaensis、Shewanella fidelis、Shewanella fodinae、Shewanella frigidimarina、Shewanella gaetbuli、Shewanella gelidimarina、Shewanella glacialipiscicola、Shewanella gopherii、Shewanella hafniensis、Shewanella halifaxensis、Shewanella haliotis、Shewanella hanedai、Shewanella japonica、Shewanella kaireitica、Shewanella ivingstonensis、Shewanella loihica、Shewanella marina、Shewanella marinintestina、Shewanella marisflavi、Shewanella morhuae、Shewanella olleyana、Shewanella oneidensis、Shewanella pacifica、Shewanella pealeana、Shewanella pneumatophori、Shewanella profunda、Shewanella putrefaciens、Shewanella sairae、Shewanella schlegeliana、Shewanella sediminis、Shewanella surugensis、Shewanella vesiculosa、Shewanella violacea、Shewanella waksmanii、Shewanella woodyiおよびShewanella xiamenensis、Ferrimonas属に分類される微生物としてはFerrimonas balearica、Idiomarina属に分類される微生物としてはIdiomarina loihiensisおよびIdiomarina baltica、Colwellia属に分類される微生物としてはColwellia psychrerythraea、Pseudoalteromonas属に分類される微生物としてはPseudoalteromonas haloplanktis、Pseudoalteromonas atlanticaおよびPseudoalteromonas tunicata、Listonella属に分類される微生物としてはListonella anguillara、Listonella anguillarumおよびListonella pelagia、Vibrio属に分類される微生物としてはVibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus、Vibrio harveyi、Vibrio furnissii、Vibrio tubiashii、Vibrio sinaloensis、Vibrio rotiferianus、Vibrio orientalis、Vibrio harveyi、Vibrio coralliilyticus、Vibrio caribbenthicus、Vibrio brasiliensisおよびVibrio alginolyticus、Photobacterium属に分類される微生物としてはPhotobacterium profundum、Aeromonas属に分類される微生物としてはAeromonas hydrophila、Aeromonas salmonicidaおよびAeromonas veronii、Salinisphaera属に分類される微生物としてはSalinisphaera shabanensis、Legionella属に分類される微生物としてはLegionella pneumophilaおよびLegionella longbeachae、Coxiella属に分類される微生物としてはCoxiella burnetii、Desulfococcus属に分類される微生物としてはDesulfococcus oleovorans、Desulfobacterium属に分類される微生物としてはDesulfobacterium autotrophicum、Desulfatibacillum属に分類される微生物としてはDesulfatibacillum alkenivorans、Desulfobulbus属に分類される微生物としてはDesulfobulbus propionicus、Desulfarculus属に分類される微生物としてはDesulfarculus baarsii、Geobacter属に分類される微生物としてはGeobacter metallireducens、Geobacter uraniireducensおよびGeobacter bemidjiensis、Syntrophobacter属に分類される微生物としてはSyntrophobacter fumaroxidans、Syntrophus属に分類される微生物としてはSyntrophus aciditrophicus、Desulfomonile属に分類される微生物としてはDesulfomonile tiedjei、Bdellovibrio属に分類される微生物としてはBdellovibrio bacteriovorusおよびBdellovibrio exovorus、Bacteriovorax属に分類される微生物としてはBacteriovorax marinus、Stigmatella属に分類される微生物としてはStigmatella aurantiaca、Myxococcus属に分類される微生物としてはMyxococcus xanthusおよびMyxococcus fulvus、Anaeromyxobacter属に分類される微生物としてはAnaeromyxobacter dehalogenans、Sorangium属に分類される微生物としてはSorangium cellulosum、Haliangium属に分類される微生物としてはHaliangium ochraceum、Acidobacterium属に分類される微生物としてはAcidobacterium capsulatum、Granulicella属に分類される微生物としてはGranulicella tundricola、Ilumatobacter属に分類される微生物としてはIlumatobacter coccineum、Streptosporangium属に分類される微生物としてはStreptosporangium roseum、Nocardiopsis属に分類される微生物としてはNocardiopsis dassonvillei、Thermobifida属に分類される微生物としてはThermobifida fusca、Thermomonospora属に分類される微生物としてはThermomonospora curvata、Pseudonocardia属に分類される微生物としてはPseudonocardia dioxanivorans、Amycolatopsis属に分類される微生物としてはAmycolatopsis mediterranei、Saccharomonospora属に分類される微生物としてはSaccharomonospora viridisおよびSaccharomonospora xinjiangensis、Saccharopolyspora属に分類される微生物としてはSaccharopolyspora erythraeaおよびSaccharopolyspora spinosa、Thermobispora属に分類される微生物としてはThermobispora bispora、Actinosynnema属に分類される微生物としてはActinosynnema mirum、Micromonospora属に分類される微生物としてはMicromonospora aurantiaca、Salinispora属に分類される微生物としてはSalinispora tropicaおよびSalinispora arenicola、Verrucosispora属に分類される微生物としてはVerrucosispora maris、Kribbella属に分類される微生物としてはKribbella flavida、Corynebacterium属に分類される微生物としてはCorynebacterium jeikeium、Corynebacterium urealyticumおよびCorynebacterium kroppenstedtii、Nocardia属に分類される微生物としてはNocardia farcinica、Nocardia brasiliensisおよびNocardia cyriacigeorgica、Rhodococcus属に分類される微生物としてはRhodococcus rhodochrous、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus equi、Rhodococcus rhodnii、Rhodococcus corallinus、Rhodococcus rubropertinctus、Rhodococcus coprophilus、Rhodococcus globerulus、Rhodococcus chlorophenolicus、Rhodococcus luteus、Rhodococcus aichiensis、Rhodococcus chubuensis、Rhodococcus marisおよびRhodococcus fascines、Gordonia属に分類される微生物としてはGordonia bronchialis、Gordonia neofelifaecisおよびGordonia terrae、Dietzia属に分類される微生物としてはDietzia cinnamea、Mycobacterium属に分類される微生物としてはMycobacterium tuberculosis、Mycobacterium bovis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium avium、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium ulcerans、Mycobacterium vanbaalenii、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium abscessus、Mycobacterium marinu、Mycobacterium massiliense、Mycobacterium phlei、Mycobacterium thermoresistibile、Mycobacterium tusciae、Mycobacterium xenopiおよびMycobacterium rhodesiae、Amycolicicoccus属に分類される微生物としてはAmycolicicoccus subflavus、Tsukamurella属に分類される微生物としてはTsukamurella paurometabola、Segniliparus属に分類される微生物としてはSegniliparus rotundus、Microbacterium属に分類される微生物としてはMicrobacterium testaceum、Micrococcus属に分類される微生物としてはMicrococcus luteus、Arthrobacter属に分類される微生物としてはArthrobacter arilaitensis、Arthrobacter chlorophenolicus、Arthrobacter globiformisおよびArthrobacter phenanthrenivorans、Renibacterium属に分類される微生物としてはRenibacterium salmoninarum、Kocuria属に分類される微生物としてはKocuria rhizophila、Kytococcus属に分類される微生物としてはKytococcus sedentarius、Cellulomonas属に分類される微生物としてはCellulomonas fimi、Intrasporangium属に分類される微生物としてはIntrasporangium calvum、Serinicoccus属に分類される微生物としてはSerinicoccus profundi、Frankia属に分類される微生物としてはFrankia alni、Acidothermus属に分類される微生物としてはAcidothermus cellulolyticus、Nakamurella属に分類される微生物としてはNakamurella multipartita、Geodermatophilus属に分類される微生物としてはGeodermatophilus obscurus、Stackebrandtia属に分類される微生物としてはStackebrandtia nassauensis、Streptomyces属に分類される微生物としてはStreptomyces albus 、Streptomyces avermitilis、Streptomyces bingchenggensis、Streptomyces chartreusis、Streptomyces clavuligerus、Streptomyces coelicoflavus、Streptomyces coelicolor、Streptomyces ghanaensis、Streptomyces griseus、Streptomyces hygroscopicus、Streptomyces lividans、Streptomyces roseosporus、Streptomyces scabiei、Streptomyces sviceus、Streptomyces venezuelae、Streptomyces violaceusnigerおよびStreptomyces viridochromogenes、Catenulispora属に分類される微生物としてはCatenulispora acidiphila、Rubrobacter属に分類される微生物としてはRubrobacter xylanophilus、Conexibacter属に分類される微生物としてはConexibacter woesei、Bacillusに分類される微生物としてはBacillus thuringiensis、Bacillus megaterium、Bacillus pseudofirmus、Bacillus clausii、Bacillus cereus、Bacillus subtilisおよびBacillus thuringiensis、Geobacillus属に分類される微生物としてはGeobacillus caldoproteolyticus、Geobacillus caldoxylosilyticus、Geobacillus debilis、Geobacillus galactosidasius、Geobacillus gargensis、Geobacillus jurassicus、Geobacillus kaustophilus、Geobacillus lituanicus、Geobacillus pallidus、Geobacillus stearothermophilus、Geobacillus stromboliensis、Geobacillus subterraneus、Geobacillus tepidamans、Geobacillus thermocatenulatus、Geobacillus thermodenitrificans、Geobacillus thermoglucosidasius、Geobacillus thermoleovorans、Geobacillus toebii、Geobacillus uzensis、Geobacillus vulcani、Geobacillus zalihae、Oceanobacillus属に分類される微生物としてはOceanobacillus iheyensis、Lysinibacillus属に分類される微生物としてはLysinibacillus sphaericus、Halobacillus属に分類される微生物としてはHalobacillus halophilus、Alicyclobacillus属に分類される微生物としてはAlicyclobacillus acidocaldarius、Kyrpidia属に分類される微生物としてはKyrpidia tusci、Paenibacillus属に分類される微生物としてはPaenibacillus polymyxa、Paenibacillus mucilaginosusおよびPaenibacillus terrae、Lactobacillus属に分類される微生物としてはLactobacillus buchneri、Clostridium属に分類される微生物としてはClostridium acetobutylicum、Clostridium perfringens、Clostridium kluyveri、Clostridium cellulovorans、Clostridium difficileおよびClostridium sticklandii、Alkaliphilus属に分類される微生物としてはAlkaliphilus metalliredigensおよびAlkaliphilus oremlandii、Syntrophomonas属に分類される微生物としてはSyntrophomonas wolfei、Syntrophothermus属に分類される微生物としてはSyntrophothermus lipocalidus、Eubacterium属に分類される微生物としてはEubacterium rectaleおよびEubacterium limosum、Desulfitobacterium属に分類される微生物としてはDesulfitobacterium hafniense、Desulfotomaculum属に分類される微生物としてはDesulfotomaculum reducens、Pelotomaculum属に分類される微生物としてはPelotomaculum thermopropionicum、Butyrivibrio属に分類される微生物としてはButyrivibrio proteoclasticus、Roseburia属に分類される微生物としてはRoseburia hominis、Oscillibacter属に分類される微生物としてはOscillibacter valericigenes、Thermoanaerobacter属に分類される微生物としてはThermoanaerobacter tengcongensis、Carboxydothermus属に分類される微生物としてはCarboxydothermus hydrogenoformans、Natr
anaerobius属に分類される微生物としてはNatranaerobius thermophilus、Sphingobacterium属に分類される微生物としては、Sphingobacterium multivorum、Sphingobacterium spiritivorum、Sphingobacterium alimentarium、Sphingobacterium anhuiense、Sphingobacterium antarcticum、Sphingobacterium bambusae、Sphingobacterium canadense、Sphingobacterium composti、Sphingobacterium daejeonense、Sphingobacterium faecium、Sphingobacterium heparinum、Sphingobacterium kitahiroshimense、Sphingobacterium lactis、Sphingobacterium mizutaii、Sphingobacterium nematocida、Sphingobacterium piscium、Sphingobacterium shayense、Sphingobacterium siyangense、Sphingobacterium thalpophilumおよびSphingobacterium wenxiniae、Pedobacter属に分類される微生物としては、Pedobacter steynii 、Pedobacter duraquae、Pedobacter metabolipauper、Pedobacter hartonius、Pedobacter heparinus Pedobacter africanus、Pedobacter agri、Pedobacter alluviusおよびPedobacter saltans、Haliscomenobacter属に分類される微生物としてはHaliscomenobacter hydrossis、Porphyromonas属に分類される微生物としてはPorphyromonas gingivalisおよびPorphyromonas asaccharolytica、Odoribacter属に分類される微生物としてはOdoribacter splanchnicus、Spirosoma属に分類される微生物としてはSpirosoma linguale、Runella属に分類される微生物としてはRunella slithyformis、Deinococcus属に分類される微生物としてはDeinococcus radiodurans、Deinococcus geothermalis、Deinococcus deserti、Deinococcus maricopensis、Deinococcus proteolyticusおよびDeinococcus gobiensis、Thermus属に分類される微生物としてはThermus thermophilusおよびThermus scotoductus、Meiothermus属に分類される微生物としてはMeiothermus ruberおよびMeiothermus silvanus、Oceanithermus属に分類される微生物としてはOceanithermus profundus、Marinithermus属に分類される微生物としてはMarinithermus hydrothermalis、Gemmatimonas属に分類される微生物としてはGemmatimonas aurantiaca、Fusobacterium属に分類される微生物としてはFusobacterium nucleatum、Ilyobacter属に分類される微生物としてはIlyobacter polytropus、Roseiflexus属に分類される微生物としてはRoseiflexus castenholzii、Herpetosiphon属に分類される微生物としてはHerpetosiphon aurantiacus、Thermomicrobium属に分類される微生物としてはThermomicrobium roseum、Thermotoga属に分類される微生物としてはThermotoga lettingae、Thermosipho属に分類される微生物としてはThermosipho melanesiensisおよびThermosipho africanus、Fervidobacterium属に分類される微生物としてはFervidobacterium nodosum、Deferribacter属に分類される微生物としてはDeferribacter desulfuricans、Calditerrivibrio属に分類される微生物としてはCalditerrivibrio nitroreducens、Flexistipes属に分類される微生物としてはFlexistipes sinusarabici、Metallosphaera属に分類される微生物としてはMetallosphaera sedula、Aeropyrum属に分類される微生物としてはAeropyrum pernix、Pyrobaculum属に分類される微生物としてはPyrobaculum aerophilum、Pyrobaculum islandicum、Pyrobaculum calidifontisおよびPyrobaculum neutrophilum、Caldivirga属に分類される微生物としてはCaldivirga maquilingensis、Vulcanisaeta属に分類される微生物としてはVulcanisaeta distributa、Acidilobus属に分類される微生物としてはAcidilobus saccharovorans、Haloarcula属に分類される微生物としてはHaloarcula marismortui、Haloquadratum属に分類される微生物としてはHaloquadratum walsbyi、Natronomonas属に分類される微生物としてはNatronomonas pharaonis、Halorubrum属に分類される微生物としてはHalorubrum lacusprofundi、Haloterrigena属に分類される微生物としてはHaloterrigena turkmenica、Natrialba属に分類される微生物としてはNatrialba magadii、Halalkalicoccus属に分類される微生物としてはHalalkalicoccus jeotgali、Halogeometricum属に分類される微生物としてはHalogeometricum borinquense、Thermoplasma属に分類される微生物としてはThermoplasma acidophilumおよびThermoplasma volcanium、Picrophilus属に分類される微生物としてはPicrophilus torridus、Ferroplasma属に分類される微生物としてはFerroplasma acidarmanus、Archaeoglobus属に分類される微生物としてはArchaeoglobus fulgidusおよびArchaeoglobus veneficus、Ferroglobus属に分類される微生物としてはFerroglobus placidus、Polymorphum属に分類される微生物としてはPolymorphum gilvum、Micavibrio属に分類される微生物としてはMicavibrio aeruginosavorus、Simiduia属に分類される微生物としてはSimiduia agarivorans、Leptothrix属に分類される微生物としてはLeptothrix cholodnii、Thiomonas属に分類される微生物としてはThiomonas intermedia、Rubrivivax属に分類される微生物としてはRubrivivax gelatinosus、Methylibium属に分類される微生物としてはMethylibium petroleiphilum、Anaerococcus属に分類される微生物としてはAnaerococcus prevotiiが特に好ましい。
メタクリル酸エステルの製造は、以下の方法で行うことができる。溶媒にメタクリリル−CoA及び式2で表されるアルコールまたはフェノール類を添加して溶液を調製し、溶解又は懸濁させる。そして、この溶液又は懸濁液に、AATを接触させ、温度等の条件を制御しながらメタクリリル−CoAとアルコールまたはフェノール類とを反応させる。前記反応により、メタクリリル−CoAのメタクリル基を式2のアルコールまたはフェノール類に転移させて、メタクリル酸エステルを生成させる。
前述のように本発明では、AAT遺伝子を導入した微生物に必要に応じてACD遺伝子、ECH遺伝子、BCKAD遺伝子等を導入して、イソブチリル−CoA、3−ヒドロキシイソブチリル−CoAあるいは2−オキソイソ吉草酸等の前駆体からメタクリル酸エステルを合成することも可能である。
2化合物へ誘導可能な物質とは例えば、2−オキソイソ吉草酸、イソ酪酸、3−ヒドロキシイソ酪酸、酢酸、ピルビン酸、乳酸、アセト酢酸、酪酸、プロピオン酸、リンゴ酸、フマル酸、クエン酸およびコハク酸等の酸、バリン、アラニン、ロイシン、リジンおよびグルタミン酸等のアミノ酸類、グルコース、フルクトースおよびキシロース等の糖類などが挙げられる。
これら前駆体からメタクリル酸エステルを生成させるには宿主微生物が本来有する各種代謝系をそのまま利用することも可能である。必要に応じて遺伝子を導入あるいは欠損させることもできる。
宿主微生物としては、前記前駆体からのメタクリリル−CoAを生成させるための酵素群およびAATの発現能力を有する宿主であれば特に制限はないが、細菌では、Rhodococcus属、Pseudomonas属、Corynebacterium属、Bacillus属、Streptococcus属、Streptomyces属などが挙げられ、酵母ではSaccharomyces属、Candida属、Shizosaccharomyces属、Pichia属、糸状菌ではAspergillus属などが挙げられる。
(a)BCKAD遺伝子及び/又はACD遺伝子が導入されたことにより、メタクリリル−CoA生成活性が強化されている。
(b)ECH遺伝子、3−ヒドロキシイソブチリルCoAヒドロラーゼ遺伝子及び/又は3−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠損又は不活化により、メタクリリル−CoA生成活性が強化されている。欠損又は不活化は、遺伝子の全部又は塩基配列の一部に置換、欠失もしくは挿入により行う。
前記前駆体からメタクリリル−CoAを生成させるための酵素群の各遺伝子およびAAT遺伝子を必要に応じて宿主へ導入することが必要となる。宿主微生物が本来有する各種酵素はそのまま利用することも可能である。あるいは必要に応じて遺伝子導入により活性の強化することも可能である。
本発明において使用するAATは、メタクリリル−CoAとアルコールまたはフェノール類を原料にメタクリル酸エステルを製造する能力を有するものであれば、特に限定されず、その種類及び起源を問わない。植物由来のものが好ましく、代表的なものとして、上述のショウガ目、バラ目、ツツジ目、ウリ目、アブラナ目およびクスノキ目からなる群から選択されるいずれかの目に属に由来するものが挙げられる。
本発明において使用するACDは、アシルCoAからメタクリリル−CoAを生成する能力を有するものであれば、特に限定されず、その由来及び種類を問わない。微生物由来のものが好ましく、代表的なものとして、前記に示すとおりである。
上記AAT遺伝子及び/又はACD遺伝子をコードするDNAを宿主微生物に導入して、当該微生物内でタンパク質に転写翻訳させて使用する。当該微生物に導入されるDNAは、ベクターに組み込まれた形態にあることが好ましい。すなわち、各遺伝子を前記宿主細胞で発現可能な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入する。
AAT遺伝子及び/又はACD遺伝子等の必要な遺伝子を導入した組換え微生物を前記前駆体と接触させ、メタクリル酸エステルを製造する。ここで、「接触」とは、微生物と物質(前駆体)を一定時間曝露処理することを意味する。具体的には、微生物を前駆体(原料)等を含む水性媒体中で培養すること、あるいは原料を含む水性媒体に微生物の培養物を添加し、懸濁混合し、水性媒体中及び/又は気相中にメタクリル酸エステルを得る。その際、微生物の増殖があっても構わない。該工程では、組換え微生物と、メタクリル酸エステルと、を含有する混合物が得られる。
本発明において、メタクリル酸エステルの製造は、AAT遺伝子が導入された遺伝子組換え微生物を、前記前駆体を含む水性媒体中で培養することによって培養菌体又は培養物中にメタクリル酸エステルを生成蓄積させ、該培養菌体又は培養物又は培養容器気相部からメタクリル酸エステルを回収することにより行われる。
本発明に係るメタクリル酸エステルの製造方法では、上述のように、遺伝子組換え微生物の培養による方法の他に以下の方法も採用できる。遺伝子組換え微生物が増殖能を有していてもいなくてもよく、予め培養した培養物を前駆体を含む水性媒体に接触させ、実質的に増殖を伴わない休止菌体反応によりメタクリル酸エステルを産生させることもできる。
この他、反応液には、微量金属、ビタミンなどが必要に応じて添加される。また、必要に応じて反応に必要な各種の有機物、無機物、界面活性剤あるいは通常用いられる消泡剤などを反応液中に追添加することができる。
培地中又は反応液中に生成したメタクリル酸エステル及びその生成量は、高速液体クロマトグラフィー及びLC−MSなどの通常の方法を用いて検出し、測定することができる。また、培養容器又は反応容器の気相部(ヘッドスペース部)に揮発したメタクリル酸エステル及びその生成量は、ガスクロマトグラフィーなどの通常の方法を用いて検出し、測定することができる。
メタクリル酸エステルは、ろ過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換又は吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出、蒸留及び結晶化などの周知の操作を必要に応じて適宜組み合わせて用いることにより、培地又は反応液中から分離・精製できる。
バナナの皮を取り除き、果肉をカッターで約1ミリ厚さにスライスし、さらにそれを4分割した。スライスしたバナナ2g、2.3mMメタクリリル−CoAおよび0.35MKClを含む溶液2mlおよび5μlイソブチルアルコールを100mlフラスコに順に加えた。密閉し、30℃で反応させた。1、2または3時間後の生成したメタクリル酸イソブチルを含む反応混合物を、100mlフラスコのヘッドスペース150μlを採取して以下のGC条件にて分析を行った。その結果を表1に示す。
カラム:DB−WAX, 30m×0.32mm
カラム温度:50℃・5min→5℃/min→100℃(計15min)
キャリアガス:He
Inject:200℃ スプリットレス(サンプリングタイム1min)
Detect:250℃ FID 注入量:150μl
イソブチルアルコールの代わりにn−ブチルアルコールを用いた以外は実施例1と同様に実施した。その結果を表2に示す。
表3に示す植物片を2g、2.3mMメタクリリル−CoAおよび0.35M KClを含む溶液2mlおよび10μlのn−ブチルアルコールを100mlフラスコに順に加えた。密閉し、30℃で反応させた。メタクリル酸エステルの分析は実施例1と同様に実施した。その結果を表3に示す。
表4に示す植物片を2g、2.3mM メタクリリル−CoAおよび0.35M KClを含む溶液2mlおよび6.4μl エチルアルコールを100mlフラスコに順に加えた。密閉し、30℃で反応させた。メタクリル酸エステルの分析は実施例1と同様に実施した。その結果を表4に示す。
表5に示す植物片を2g、2.3mMメタクリリル−CoAおよび0.35M KClを含む溶液2mlおよび4.4μl メチルアルコールを100mlフラスコに順に加えた。密閉し、30℃で反応させた。メタクリル酸エステルの分析は実施例1と同様に実施した。その結果を表5に示す。
大腸菌JM109株をLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、0.5%NaCl)1mLに接種し37℃、5時間好気的に前培養し、この培養物 0.4mLをSOB培地40mL(2%バクトトリプトン、0.5%バクトイ−ストエキス、10mM NaCl、2.5mM KCl、1mM MgSO4、1mM MgCl2)に加え、18℃で20時間培養した。この培養物を遠心分離により集菌した後、冷却したTF溶液(20mM PIPES−KOH(pH6.0)、200mM KCl、10mM CaCl2、40mM MnCl2)を13mL加え、0℃で10分間放置した。その後、再度遠心し、上澄を除いた後、沈殿した大腸菌を冷TF溶液3.2mLに懸濁し、0.22mLのジメチルスルフォキシドを加え0℃で10分間放置し、コンピテントセルを作製した。
配列番号2、4及び6に示される植物由来AAT遺伝子をタカラバイオ株式会社で委託合成した。
リンゴAAT(MpAAT1):アミノ酸配列(配列番号1)、塩基配列(配列番号2)
イチゴAAT(SAAT):アミノ酸配列(配列番号3)、塩基配列(配列番号4)
イチゴAAT(VAAT):アミノ酸配列(配列番号5)、塩基配列(配列番号6)
MMA−044:5’−GTTTGCACGCCTGCCGTTCGACG−3’(配列番号11)
MMA−045:5’−CGGTACGCGCGGATCTTCCAGAG−3’(配列番号12)
滅菌水 22 μL
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μL
Forward primer 1 μL
Reverse primer 1 μL
ゲノムDNA 1 μL
総量 50 μL
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 150秒の反応を30サイクル
(1)pTrc99Aをベクターとして用いた大腸菌組換え体の培養
実施例6で得られた大腸菌組換え体JM109/pAAT101〜pAAT103を1mlの100μg/mlアンピシリンを含むLB培地に植菌し、37℃にて7時間前培養を行った。培養液を0.1ml取り、100mlの同培地(100μg/mlアンピシリン、1mMIPTG含有)に加え、37℃にて15時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離(3,700×g、10分間、4℃)により菌体を回収し、10mMリン酸−ナトリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。対照株としてJM109/pTrc99Aを用いた。
実施例6で得られた大腸菌組換え体BL21(DE3)/pAAT201〜pAAT203を1mLの100μg/mLアンピシリンを含むLB培地に植菌し、37℃にて14時間前培養を行った。培養液を0.1mL取り、100mLの同培地(100μg/mLアンピシリン)に加え、37℃にてODが0.3になるまで振盪培養した後、終濃度が1mMになるようにIPTGを添加し更に数時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離(3,700×g、10分間、4℃)により菌体を回収し、10mMリン酸−ナトリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、同緩衝液にOD6(630nm)になるよう懸濁した。対照株としてBL21(DE3)/pET16bを用いた。
得られた菌体懸濁液から細胞抽出液を調製した。超音波破砕機VP−15S(タイテック、日本)を用いて、出力コントロ−ル4、DUTY CYCLE 40%、PULS、TIMER=Bモ−ド10sの条件で菌体懸濁液を氷冷しながら1分間破砕した。次に遠心分離を行い(10,000×g、5分間、4℃)、得られた上清(細胞抽出液)1mlを採取した。
実施例7に記載された方法で調製された細胞抽出液を用いて以下の反応を行った。反応液の終濃度が7mMメタクリリル−CoAと40.5mMn−ブタノールとなるようにメタクリリル−CoAとアルコールの溶液が0.8ml入った10ml容量のセプタム付サンプル瓶(GC用)に、0.2mlの細胞抽出液を添加することにより反応を開始した。セプタム付サンプル瓶を30℃で1〜5時間インキュベートして反応させた。
アルコールとして、メタノール、エタノールまたはn−ブタノールを用い、細胞抽出液に、BL21(DE3)/pAAT201(リンゴ)由来のものを用いて、実施例8と同様にして反応を行った。表8に5時間後の生成物の分析結果を示した。
アルコールとして、イソブタノール、フェノール、ベンジルアルコールまたは2−エチルヘキシルアルコールを用い、実施例7で得られたBL21(DE3)/pAAT201(リンゴ)の細胞抽出液で以下の反応を行った。
セプタム付サンプル瓶を30℃で1〜5時間インキュベートして反応させた。反応終了後、セプタム付サンプル瓶中の反応液に1mLのアセトニトリルを添加しよく混和した。その後、シリンジフィルターDISMIC/穴径0.45μm(ADVANTEC社製)を用いて濾過後、HPLC分析に供した。表9に5時間後の生成物の分析結果を示した。
装置:Waters 2695
カラム:Shiseido CAPCELL PAK C18 UG120 5μm
移動相:65%MeOH, 0.2%リン酸
流量:0.25ml/min
カラム温度:35℃
検出:UV 210 nm
注入量:10μL
Pseudomonas aeruginosa PAO1からのACDホモログ遺伝子のクローニングと高発現組換え体の作製
(1)Pseudomonas aeruginosa PAO1からのゲノムDNAの調製
LB寒天培地(1%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、0.5%NaCl、1.5%寒天)上で生育させたPseudomonas aeruginosa PAO1株(NBRC106052)を10mlのLB液体培地(1%バクトトリプトン、0.5%バクトイ−ストエキス、0.5%NaCl)に植菌し、37℃にて15時間振盪培養を行った。培養終了後、2mlの培養液より菌体を遠心により回収し、Wizard Genomic DNA Purification Kit(プロメガ株式会社)を用いてゲノムDNA100μlを取得した。
得られたゲノムDNAを鋳型にして、ACDをコードすることが推定された遺伝子を含むDNA断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようPCR法により調製した。
MMA−003: 5’− GACCCATGGATTTCGACCTCACCGAAGAAC −3’ (配列番号13)
MMA−004: 5’− GCCCTGCAGGATGCGATGGTTCGCGGCGTTC −3’(配列番号14)
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
MMA−003(配列番号13) 1 μl
MMA−004(配列番号14) 1 μl
ゲノムDNA 1 μl
総量 50 μl
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 150秒の反応を30サイクル
得られた組換えプラスミドDNAについて、その塩基配列をCEQ DTCS Quick Start Kitおよび蛍光シ−ケンサCEQ 2000XL DNA Analysis(いずれもBECKMAN COULTER、米国)を用いて確認し、プラスミドpMMA002と命名した。プラスミドpMMA002を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、ACD遺伝子(配列番号8)が導入された組換え体を作製した。アミノ酸配列は、配列番号7で示される。
実施例10で得られたACD遺伝子(配列番号8)が導入された大腸菌組換え体JM109/pMMA002を1mlの100μg/mlアンピシリンを含むLB培地に植菌し、37℃にて7時間前培養を行った。培養液を0.1ml取り、100mlの同培地(100μg/mlアンピシリン、1mMIPTG含有)に加え、37℃にて15時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離(3,700×g、10分間、4℃)により菌体を回収し、10mMリン酸−ナトリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、同緩衝液にOD6(630nm)になるよう懸濁した。対照株としてJM109/pTrc99Aを用いた。
(1)ACD遺伝子組換え体細胞抽出液による、イソブチリル−CoAを基質としたメタクリリル−CoA合成反応:
100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)中に6mMの1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチル硫酸塩、0.4mMのフラビンアデニンジヌクレオチドおよび1mMのイソブチリル−CoAを含む溶液1.84mlに、実施例10で得られたACD活性を有する細胞抽出液0.16mlを加え、反応液2mlに調整した。37℃で30分間反応させ、以下に示すHPLC条件にて分析を行った。その結果、イソブチリル−CoAのピークは消失し、メタクリリル−CoAの生成を確認した。
カラム:Inertsil ODS−3V,4.6mm×250mm
移動相:30% MeOH,50mM H3PO4,pH5.7
流量:1.0ml/min カラム温度:35℃ 検出:UV 254nm
注入量10μl 反応溶液を移動相で10倍希釈し測定。
バナナの皮を取り除き、果肉をカッターで約1ミリ厚さにスライスし、さらにそれを4分割した。スライスしたバナナ1g、前記メタクリリル−CoA合成反応液0.9ml、3.5M KCl溶液0.1mlおよび5μlのn−ブチルアルコールを50mlフラスコに加え、密閉し、30℃で2時間反応させた。実施例1と同様にメタクリル酸エステルの分析を実施したところ、0.015mMのメタクリル酸ブチルが生成していた。
(1)Rhodococcus属細菌からのゲノムDNAの調製
LB寒天培地培地上で生育させたRhodococcus erythropolis PR4株(NBRC100887)を10mLのLB液体培地に植菌し、30℃にて36時間振盪培養を行った。培養終了後、2mLの培養液より菌体を遠心により回収し、実施例10と同様にしてゲノムDNA100μLを取得した。
得られたゲノムDNAを鋳型にして、ECH遺伝子をコ−ドすることが推定された塩基配列を含むDNA断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようPCR法により調製した。
MMA−031: 5’−GGTCATGACCGACTTCAACACCATCATCCTC −3’ (配列番号15)
MMA−032: 5’−GGCCTGCAGGTTCAGCTGTTCGAAAGTTCAGCGC −3’(配列番号16)
プラスミドpMMA011を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、ECH遺伝子発現大腸菌組換え体を作製した。
(1)ECH活性を有する細胞破砕液の調製
実施例13で得られたECH遺伝子が導入された大腸菌組換え体JM109/pMMA011を2mlの100μg/mlアンピシリンを含むLB培地に植菌し、37℃にて24時間前培養を行った。培養液を0.1ml取り、100mlの同培地(100μg/mlアンピシリン、1mMIPTG含有)に加え、37℃にて24時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離(3,700×g、10分間、4℃)により菌体を回収し、10mMリン酸−ナトリウム緩衝液(pH7.0)で2回洗浄した後、同緩衝液にOD6(630nm)となるように希釈した。
0.5Mのトリス塩酸緩衝液(pH7.4)0.2ml、1.2mMの3−ヒドロキシイソブチリル−CoA水溶液0.4mlおよび1.2mlの水を混合したものに、上記のようにして得られたエノイルCoAヒドラターゼ活性を有する細胞破砕液0.2mlを加え、反応液2mlに調整した。37℃で30分間反応させ、実施例12示すHPLC条件にて分析を行った。その結果、メタクリリル−CoAの生成を確認した。
10ml容サンプル瓶に前記メタクリリル−CoA合成反応液0.4ml、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)0.1mlおよび0.2mlの水を加え、さらに0.4Mn−ブタノール溶液0.1mlおよび実施例7と同様に調製したリンゴAAT(MpAAT)細胞破砕液0.2mlを加え、密閉し、30℃で3時間反応させた。実施例1と同様にメタクリル酸エステルの分析を実施したところ、0.001mMのメタクリル酸ブチルが生成していた。
遺伝子のクローニングと発現プラスミドの作製および組換え体の作製は、実施例10と同様にして行った。Pseudomonas aeruginosa PAO1株のゲノムDNAを鋳型にして、BCKAD複合体遺伝子をコードする遺伝子オペロン全体を含むDNA断片を、以下に示すプライマーを用いてPCR法により調製した。得られた断片を制限酵素BspHIとSse8387Iにより消化し、実施例10と同様にしてベクターpTrc99Aに挿入して組換えプラスミド(pWA108)を得た。
MAA−15:5’−GGCCTGTCATGAGTGATTACGAGCCG−3’(配列番号17)
MAA−16:5’−CGGCCCTGCAGGTTCGCGGGAATCAGATGTGC−3’(配列番号18)
BCKAD活性は、以下のように2−オキソイソ吉草酸を基質としたイソブチリル−CoAの生成により測定した。
カラム:Inertsil ODS−3V,4.6mm×250mm
移動相:35%MeOH,50mMH3PO4,pH5.7
流量:1.0ml/min カラム温度:35℃ 検出:UV254nm(210nm)
注入量:10μl(反応溶液を移動相で10倍希釈し測定)
100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中に終濃度がそれぞれ1mMMgCl2、0.2mMチアミンピロリン酸、1mMCoA−SH、2mMDTT、2mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、0.04mMフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、2mMバリンを含む溶液0.6mLに、実施例11及び実施例15の方法で得られた細胞抽出液(JM109/pMMA002及びJM109/pWA108)各0.1mLを加え、0.8mLとした。これに2−オキソイソ吉草酸カルシウム塩0.1mL(終濃度4mM)を加え37℃で30分間反応後、HPLCによりイソブチリル−CoAの生成を確認するとともに、0.1mLの1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチル硫酸塩(終濃度6mM)を加え更に3時間反応させた。反応後、セントリカット超ミニW−10(倉敷紡績株式会社)を用いた限外濾過を行った。除タンパク質を行うことにより反応を停止させ、HPLCによる分析を行った。その結果、0.2mMのメタクリリル−CoAの生成が認められた。
ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)PR4(製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門;受託番号:NBRC 100887)を特開2011‐200133号公報に記載の方法により改変し、120mg/Lのクロラムフェニコールに耐性を示し、且つカナマイシン耐性遺伝子を欠失した誘導株を作製し、PR4KS株と命名した。
PR4KS株のLigDホモログ遺伝子(accession no: YP_002767969)を標的遺伝子とした。LigDホモログ遺伝子周辺配列を含む約5.4 kbのDNAをPCRにより増幅後、特開2011‐200133号公報に記載された、sacB遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子の下流且つ同方向に導入されたプラスミドベクターpK19mobsacB1にクローニングし、プラスミドpTJ001を得た。PCR条件は以下の通りである。
GB−138: 5’− GGCCTGCAGGTACCGATCATCACCATCGGTGTC −3’ (配列番号19)
GB−139: 5’− GGTCTAGACTGAGCAGTGTTCCAATGCG −3’(配列番号20)
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
GB−138(配列番号19) 1 μl
GB−139(配列番号20) 1 μl
PR4KSゲノム(50 ng/μl) 1 μl
総量 50 μl
98℃ 10秒、55℃ 10秒及び72℃ 120秒の反応を35サイクル
GB−140: GAGGAAATGGTCACAGGGCGAGAATAGGTTG (配列番号21)
GB−141: GCCCTGTGACCATTTCCTCATTGTGCTGG (配列番号22)
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
GB−140(配列番号21) 1 μl
GB−141(配列番号22) 1 μl
pTJ001 1 μl
総量 50 μl
98℃ 10秒、50度 10秒及び72℃ 180秒の反応を30サイクル
大腸菌(Escherichia coli)S17−1λpirをpTJ002により形質転換したものをドナーとし、参考例2の方法により得られたPR4KSをレシピエントとして、特開2011‐200133号公報に記載の方法と同様に接合伝達を行い、相同組換えによって生じた13株のLigDホモログ遺伝子欠失誘導株を得た。前記欠失誘導株から1株を選び、PR4KSΔligD誘導株と命名した。
(1)pLK005の取得と解析
pK4(特開平5−64589号公報参照)を用いて、上記エレクトロポレーション法によりロドコッカス sp N775(独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 寄託番号FERM BP−961)を形質転換した。得られた形質転換体を10mlのMYK培地に植菌し、30℃にて1日培養した。これをクリーンベンチ内で紫外線を照射することにより変異処理を行った。変異処理を行った培養液を50〜400μg/mlのカナマイシンを含むMYK寒天培地に塗布し、30℃にて3日間培養した。
プラスミドpSJ034は、特開平10−337185号公報記載の方法によりプラスミドpSJ023から作製したものである。pSJ034には3カ所のEcoRI制限酵素部位が存在するが、このうちの1カ所をSpeI部位に変換したプラスミドpSJ040を作製した。作製方法は、pSJ034を制限酵素EcoRIにより部分分解し、タカラBluntingキットを用いて切断個所の平滑化を行った。SpeIリンカーの存在下でライゲーション反応を行い、反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換した。形質転換体を培養後、プラスミドを抽出し、SpeIリンカーが挿入されたプラスミドを選別した。pSJ034の3つのEcoRI部位のうち、カナマイシン耐性遺伝子の下流に存在するEcoRI部位にSpeIリンカーが挿入されたものをpSJ040と命名した。
pLK005をHindIIIで切断し、約2.1kbの断片を調製した。一方、pSJ040をHindIIIで切断し、約9.8kbの断片を調製した。これらの2断片を用いてライゲーション反応を行い、反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換した。形質転換体を培養後、プラスミドを抽出し、その塩基配列を確認した結果、pLK005由来の変異配列(GTTGTAGGの重複)を持ち、それ以外はpSJ040と同様の配列を有するプラスミドをpSJ201と命名した。
(1)In Fusion法を用いた遺伝子欠失用プラスミドの作製
PR4KS株のRE_acd1/RE_echA/RE_hchA/RE_mmsB遺伝子を標的遺伝子としたIn−Fusion HD Cloning kit(タカラバイオ社製)による遺伝子欠失用プラスミドの作製を行った(図4参照)。
MMA−061: CGACTCTAGAGGATCGCTCAGTACATCTACGAGAC (配列番号23)
MMA−062: AGTGTGAGGAAAGTGTTCCGATCAGTTCAT (配列番号24)
断片2用プライマー
MMA−063: CACTTTCCTCACACTCGTCGAGAGTATGAG (配列番号25)
MMA−064: CGGTACCCGGGGATCAGCGCGACGAACAACGAGAC (配列番号26)
鋳型(PR4 wild typeゲノムDNA) 1μl
2×PrimeSTAR Max Premix(TAKARA社製) 25μl
Fw Primer(20 μM) 1μl
Rv Primer(20 μM) 1μl
D.W. 22μl
Total 50μl
98℃ 10秒、60℃ 10秒及び72℃ 120秒の反応を30サイクル
In−Fusion HD Cloning Kitを用い、上記断片とベクターの連結を行った。反応条件は以下の通りである。
5x In−Fusion HD Enzyme Premix 2μl
ベクター断片 1.5μl
DNA断片1 1μl
DNA断片2 2μl
D.W. 3.5μl
Total 10μl
PR4KSΔligD株コンピテントセル20μlに pMMA302を1μl添加し、氷上で10分間インキュベートした。インキュベートした上記溶液を氷冷したエレクトロポレーションキュベット(0.1cm)に全量移し、1.5kV (200Ω)の高電圧をかけ、直ちに600μlのLB液体培地を加え、30℃にて6時間静置した。200μlをカナマイシン硫酸塩10mg/Lを含むLB寒天培地(以下、LB Km10寒天培地)に撒き30℃にて4日間培養した。生育したコロニーをLB Km10寒天培地にストリークし、4日間培養した後、以下に示した条件によりコロニーPCRを行い相同組換え誘導株の確認を行った。
MMA−069: GCGCATCTACAAGGAAGAGATC(配列番号27)
MMA−070: GCGACGCTCATCGAGATCTC(配列番号28)
鋳型 4.0μl
2×MightyAmpBuffer(TAKARA社製) 5.0μl
Fw Primer(20 μM) 0.25μl
Rv Primer(20 μM) 0.25μl
D.W. 0.3μl
MightyAmpDNAPolymerase(TAKARA社製)0.2μl
Total 10.0μl
98℃ 10秒、68℃ 180秒の反応を30サイクル
ロドコッカス属に属する微生物においてACD及び/又はAATを発現させるためのプラスミドを作製した。
RE_acd1遺伝子発現用プラスミドpMMA401のRE_acd1遺伝子の下流に、MpAAT1遺伝子発現用プラスミドpAAT301を鋳型にしてPCR反応により得られた「ニトリラーゼプロモーター+MpAAT1遺伝子」断片を挿入した。
プライマー
MMA−133(Sse−ProFw): TGACCTGCAGGTGCACTCCGCTGCGACATGTATCGA (配列番号29)
MMA−131(Sse−001Rv): ACTCTAGCCTGCAGGTCATTGACTAGTTGATCTAAGGTTGTTACA (配列番号30)
鋳型(pAAT301) 1μl
2×PrimeSTAR Max Premix(TAKARA社製)10μl
Fw Primer(10 μM) 0.6μl
Rv Primer(10 μM) 0.6μl
D.W. 7.8μl
Total 20μl
98℃ 5秒、60℃ 5秒、72℃ 45秒の反応を30サイクル
PCR増幅断片 40μl
10×Mバッファー 5μl
0.1% BSA 4μl
Sse8387I(TAKARA社製) 1μl
Total 50μl
pMMA401(ベクター) 3μl
10×Mバッファー 4μl
0.1% BSA 4μl
AP 1μl
Sse8387I(Promega社製) 1μl
D.W. 27μl
Total 40μl
pMMA401 1μl
挿入断片 2μl
Ligation Mix(TAKARA社製) 3μl
Total 6μl
参考例6の(3)で得られたDMA008株を、プラスミドpACDAAT1、pACDAAT2、pACDAAT3、pACDAAT4、pACDAAT6、及びpACDAAT8によりそれぞれ形質転換した。得られた組換え体(DMA008/pACDAAT1、DMA008/pACDAAT2、DMA008/pACDAAT3、DMA008/pACDAAT4、DMA008/pACDAAT6及びDMA008/pACDAAT8)を用いて休止菌体反応によりメタクリル酸エステルの製造を行った。また、コントロールとして、DMA008/pLK005を用いた。
OD630=10 菌体 (終濃度)
5.0g/l 2−オキソイソ吉草酸(終濃度)
40mM アルコール(終濃度)
50mM リン酸バッファー/pH7.5(終濃度)
参考例6の(3)で得られたDMA008株を、プラスミドpACDAAT1によりそれぞれ形質転換した。得られた組換え体(DMA008/pACDAAT1)を用いて休止菌体反応によりメタクリル酸エステルの製造を行った。また、コントロールとして、DMA008/pLK005を用いた。実施例19記載の方法を用いて、組換え体の培養を行い菌体を得た。
OD630=10 菌体 (終濃度)
5.0g/l 2−オキソイソ吉草酸(終濃度)
40mM アルコール(終濃度)
50mM リン酸バッファー/pH7.5(終濃度)
実施例6と同様にして酵母由来AAT遺伝子発現プラスミドを作製し(表12)、これらを用いて大腸菌を形質転換しAAT発現組換え体を得た。
配列番号12:MMA−045
配列番号13:MMA−003
配列番号14:MMA−004
配列番号15:MMA−031
配列番号16:MMA−032
配列番号17:MAA−15
配列番号18:MAA−16
配列番号19:GB−138
配列番号20:GB−139
配列番号21:GB−140
配列番号22:GB−141
配列番号23:MMA−061
配列番号24:MMA−062
配列番号25:MMA−063
配列番号26:MMA−064
配列番号27:MMA−069
配列番号28:MMA−070
配列番号29:MMA−133
配列番号30:MMA−131
Claims (11)
- アルコールアシルトランスフェラーゼの存在下、メタクリリル−CoAにアルコールまたはフェノール類を作用させて、メタクリル酸エステルを合成する工程を含むメタクリル酸エステルの製造方法。
- メタクリル酸エステルを0.001mM以上蓄積させる請求項1記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
- イソブチリル−CoAあるいは3−ヒドロキシイソブチリル−CoAからメタクリリル−CoAを製造する工程をさらに含む、請求項1または2記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
- イソブチリル−CoAが2−オキソイソ吉草酸から製造されることを特徴とする、請求項3記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
- アルコールアシルトランスフェラーゼが植物由来である請求項1から4のいずれか1項に記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
- 植物が、ショウガ(Zingiberales)目、バラ(Rosales)目、ツツジ(Ericales)目、ウリ(Cucurbitales)目、アブラナ(Brassicales)目およびクスノキ(Laurales)目からなる群から選択されるいずれかの目に属するものである請求項5記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
- 植物が、バショウ(Musaceae)科、バラ(Rosaceae)科、ツツジ(Ericaceae)科、マタタビ(Actinidiaceae)科、ウリ(Cucurbitaceae)科、パパイア(Caricaceae)科およびクスノキ(Lauraceae)科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものである請求項5記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
- 植物が、バショウ(Musa)属、オランダイチゴ(Fragaria)属、リンゴ(Malus)属、サクラ(Prunus)属、ナシ(Pyrus)属、スノキ(Vaccinium)属、マタタビ(Actinidia)属、キュウリ(Cucumis)属、パパイア(Carica)属およびワニナシ(Persea)属からなる群から選択されるいずれかの属に属するものである請求項5記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
- 植物が、バナナ、イチゴ、リンゴ、ウメ、セイヨウナシ、ブルーベリー、キウイ、メロン、パパイアおよびアボカドなる群から選択されるいずれかである請求項5記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
- アルコールアシルトランスフェラーゼを発現するように遺伝子導入された遺伝子組換え微生物を用いる請求項1〜9のいずれか1項に記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
- アルコールアシルトランスフェラーゼを発現するように遺伝子導入された遺伝子組換え微生物にロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物を用いる請求項10記載のメタクリル酸エステルの製造方法。
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