JP5449142B2 - メタクリル酸又はメタクリルエステルの製造方法 - Google Patents
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Description
IA)3−ヒドロキシイソ酪酸又は3−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートが、炭素源から形成される条件下で、細胞の野生型と比較してより多くの3−ヒドロキシイソ酪酸又は3−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成することができるように細胞の野生型と比較して遺伝的に改変された細胞と、炭素源として、炭水化物、グリセロール、二酸化炭素、メタン、メタノール、L−バリン又はL−グルタメートを含有する栄養培地とを接触する工程を含む方法によって、3−ヒドロキシイソ酪酸を製造し、適宜、3−ヒドロキシイソ酪酸を栄養培地から分離し、及び適宜、3−ヒドロキシイソ酪酸を中和する方法工程であり、その際、3−ヒドロキシイソ酪酸の又は3−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、有利には、前駆体として、メチルマロン酸セミアルデヒドを介して又は3−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Aを介して実施する方法工程、
IB)メタクリル酸、及びで、3−ヒドロキシイソ酪酸を脱水して、メタクリル酸を形成させ、適宜、メタクリル酸をエステル化する方法工程
を含む、メタクリル酸又はメタクリルエステルの製造方法によって提供される。
http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm
の元に詳述されている属に属し、
本発明によって好適である酵母は、
http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm
の元に詳述されている属に属し、
かつ、本発明によって好適である菌は、
http://www.dsmz.de/species/fungi.htm
の元に詳述されているものである。
− メチルマロニル−補酵素Aの、マロン酸メチルへの転化を触媒する酵素E2、
− マロン酸メチルの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素E3、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、3−ヒドロキシイソ酪酸への転化を触媒する酵素E4、
の活性を特徴とすることが好ましい(図2を参照)。
E2は、メチルマロニル−補酵素Aヒドロラーゼ(EC 3.1.2.17)であり、
E3は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.3)又はアルデヒドオキシダーゼ(EC 1.2.3.1)であり、かつ
E4は、3−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.31)又は3−ヒドロキシアシル−補酵素Aデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.35)である
ことが好ましい。
− (R)メチルマロニル−補酵素Aの、(S)メチルマロニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E6、
− (S)メチルマロニル−補酵素Aの、プロピオニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E7、
− プロピオニル−補酵素Aの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素E5、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、3−ヒドロキシイソ酪酸への転化を触媒する酵素E4
の活性を特徴とすることが好ましい(図3を参照)。
E6が、メチルマロニル−補酵素Aエピメラーゼ(EC 5.1.99.1)であり、
E7が、メチルマロニル−補酵素Aデカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.41)であり、
E5が、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.27)であり、かつ
E4が、3−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.31)、又は3−ヒドロキシアシル−補酵素Aデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.35)である
ことが特に好ましい。
− メチルマロニル−補酵素Aの、プロピオニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E7、
− プロピオニル−補酵素Aの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素E5、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、3−ヒドロキシイソ酪酸への転化を触媒する酵素E4
の活性を特徴とすることが好ましい(図4を参照)。
− 3−ヒドロキシイソ酪酸の、3−ヒドロキシブチリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E8、
− 3−ヒドロキシブチリル−補酵素Aの、3−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒する酵素E9
の活性を特徴とすることが、特に好ましい(図5を参照)。
E8が、3−ヒドロキシブチリルCoAヒドロラーゼ(EC 3.1.2.4)であり、かつ
E9が、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼである
ことが、特に好ましい。
− ホスホエノールピルベートの、オキサロ酢酸塩塩への転化を触媒する酵素E10、
− ピルベートの、オキサロ酢酸塩への転化を触媒する酵素E11
の活性を特徴とすることが好ましい(図6を参照)。
E10が、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.31)であり、かつ
E11が、ピルベートカルボキシラーゼ(EC 6.4.1.1)である
ことが、特に好ましい。
− オキサロ酢酸塩の、マレートへの転化を触媒する酵素E12、
− マレートの、フマレートへの転化を触媒する酵素E13、
− フマレートの、スクシネートへの転化を触媒する酵素E14、
− スクシネートの、スクシニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E15
の活性を特徴とすることが好ましい(図7を参照)。
E12が、マレートデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.37)又はマレートキノン酸化レダクターゼ(1.1.99.16)であり、
E13が、フマレートヒドラターゼ(EC 4.2.1.2)であり、
E14が、スクシネートデヒドロゲナーゼ(EC 1.3.99.1もしくはEC 1.3.5.1)又はスクシネートキノン酸化レダクターゼ(1.3.5.1)であり、かつ
E15が、スクシネート補酵素Aリガーゼ(EC 6.2.1.4又はEC 6.2.1.5)である
ことが、特に好ましい。
− オキサロ酢酸塩の、シトレートへの転化を触媒する酵素E16、
− マレートの、オキサロ酢酸塩への転化を触媒する酵素E17、
− スクシニル−補酵素Aの、スクシネートへの転化を触媒する酵素E18、
− オキサロ酢酸塩の、ホスホエノールピルベートへの転化を触媒する酵素E19、
− オキサロ酢酸塩の、ピルベートへの転化を触媒する酵素E20、
− オキサロ酢酸塩の、アスパルテートへの転化を触媒する酵素E21、
− マレートの、ピルベートへの転化を触媒する酵素E22、
− ピルベートの、アセテートへの転化を触媒する酵素E23、
の1つの活性を特徴とすることを証明してもよい。
E16が、シトレートシンターゼ(EC 2.3.3.1又はEC 2.3.3.8)であり、
E17が、マレートオキシダーゼ(EC 1.1.3.3)であり、
E18が、スクシニルCoAヒドロラーゼ(EC 3.1.2.3)であり、
E19が、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.49又は4.1.1.32)であり、
E20が、オキサロ酢酸塩デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.3)であり、
E21が、アスパルテートトランスアミナーゼ(EC 2.6.1.1)であり、
E22が、マレートデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.38、EC 1.1.1.39又はEC 1.1.1.40)であり、
E23が、ピルベートデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.51)である
ことが、特に好ましい。
− オキサロ酢酸塩の、シトレートへの転化を触媒する酵素E16、
− シトレートの、イソシトレートへの転化を触媒する酵素E24、
− イソシトレートの、グリオキサレート及びスクシネートへの転化を触媒する酵素E25、
− グリオキサレートの、マレートへの転化を触媒する酵素E26、
− マレートの、フマレートへの転化を触媒する酵素E13、
− フマレートの、スクシネートへの転化を触媒する酵素E14、
− スクシネートの、スクシニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E15、
の活性を特徴とする、遺伝的に改変された細胞を使用することが好ましい。
E13が、フマレートヒドラターゼ(EC 4.2.1.2)であり、
E14が、スクシネートデヒドロゲナーゼ(EC 1.3.99.1もしくはEC 1.3.5.1)又はスクシネートキノン酸化レダクターゼ(1.3.5.1)であり、
E15が、スクシネート補酵素Aリガーゼ(EC 6.2.1.4又はEC 6.2.1.5)であり、
E16が、シトレートシンターゼ(EC 2.3.3.1又はEC 2.3.3.8)であり、
E24が、アコニテートヒドラターゼ(EC 4.2.1.3)であり、
E25が、イソシトレートリアーゼ(EC 4.1.3.1)であり、かつ
E26が、マレートシンターゼ(EC 2.3.3.9)である
ことが、特に好ましい。
ホスホエノールピルベートからの又はピルベートからのオキサロ酢酸塩の供給が、酵素E10又はE11の活性を増加することによって促進される場合に、グリオキサレートに加えて、イソシトレートリアーゼによるイソシトレートの開裂に対して形成されるスクシネートが、スクシニル−補酵素Aの形成のために使用されてもよい。さらに、オキサロ酢酸塩からスクシネートまでのこの第二経路において、イソシトレートの2−オキソグルタレートへの転化を触媒し、かつ有利にはイソシトレートデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.41又はEC 1.1.1.42)の形をとる、酵素E27の活性を低減することが有利であってよい。有利には、イソシトレートデヒドロゲナーゼは、idh1、idh2、cg7176、cg7176、cg7176、f20d21.16、f12p19.10、t15n1.80、idp1、idp2、idp3、aal022Wp、aer061Cp、idhC、idhM、icdA、icd、idh、icd1、icd2、leuB、citC、citC、cgl0664、leuB2、idh3A、idg3B、idh3G、cg12233、dmel−CG5028、dmel−CG6439、f6p23.14、f23e12.180、f8d20.160、f12e4.20、adl223wp及びafr137cpからなる群から選択される遺伝子によってコードされる酵素の形を取り、その際icdA及びcitCが、特に有利である。
− オキサロ酢酸塩の、シトレートへの転化を触媒する酵素E16、
− シトレートの、イソシトレートへの転化を触媒する酵素E24、
− イソシトレートの、2−オキソグルタレートへの転化を触媒する酵素E27、
− 2−オキソグルタレートの、スクシニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E28
の活性を特徴とする、遺伝的に改変された細胞を使用することが好ましい(図9を参照)。
E16が、シトレートシンターゼ(EC 2.3.3.1又はEC 2.3.3.8)であり、
E24が、アコニテートヒドラターゼ(EC 4.2.1.3)であり、
E27が、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.41又はEC 1.1.1.42)であり、かつ
E28が、2−オキソグルタレートシンターゼ(EC 1.2.7.3)である
ことが、特に好ましい。
− グリセロールの、細胞中への拡散を促進する酵素E29、
− グリセロールの、グリセロール3−リン酸への転化を触媒する酵素E30、
− グリセロール3−リン酸の、ジヒドロキシアセトンリン酸への転化を触媒する酵素E31、
− 硫黄の、硫黄受容体チオレドキシン1への移動を触媒する酵素E32、
− アルコール及びグリセロールの形成でリン脂質の加水分解を触媒する酵素E33、
− リン酸塩と引き替えに、グリセロール3−リン酸の細胞中への輸送を触媒する酵素E34、
− ジヒドロキシアセトンリン酸の、グリセルアルデヒド3−リン酸への転化を触媒する酵素E35、
− グリセルアルデヒド3−リン酸の、1,3−ビスホスホグリセレートへの転化を触媒する酵素E36、
− 1,3−ビスホスホグリセレートの、3−ホスホグリセレートへの転化を触媒する酵素E37、
− 3−ホスホグリセレートの、2−ホスホグリセレートへの転化を触媒する酵素E38、
− 2−ホスホグリセレートの、ホスホエノールピルベートへの転化を触媒する酵素E39、
− ホスホエノールピルベートの、ピルベートへの転化を触媒する酵素E40、
− グリセロールの、ジヒドロキシアセトンへの転化を触媒する酵素E41、
− ジヒドロキシアセトンの、ジヒドロキシアセトンリン酸への転化を触媒する酵素E42
の活性を示すことが有利である。
E29が、有利にはglpF遺伝子によってコードされるアクアグリセロポリン(グリセロール促進剤)であり、
E30が、有利にはglpK遺伝子によってコードされるグリセロールキナーゼ(EC 2.7.1.30)であり、
E31が、グリセロール3−リン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.99.5)、有利にはFAD−依存のグリセロール3−リン酸デヒドロゲナーゼであり、その際グリセロール3−リン酸デヒドロゲナーゼが、有利にはglpA遺伝子、glpB遺伝子、glpC遺伝子又はglpD遺伝子によって、特に有利にはglpD遺伝子によってコードされ、
E32が、glpE遺伝子によってコードされる硫黄トランスフェラーゼであり、
E33が、有利にはglpQ遺伝子によってコードされるグリセロールホスホジエステラーゼ(EC 3.1.4.46)であり、
E34が、有利にはglpT遺伝子によってコードされるグリセロール3−リン酸パーミアーゼであり、
E35が、トリオースホスフェートイソメラーゼ(EC 5.3.1.1)であり、
E36が、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.12)であり、
E37が、ホスホグリセレートキナーゼ(EC 2.7.2.3)であり、
E38が、ホスホグリセレートムターゼ(EC 5.4.2.1)であり、
E39が、エノラーゼ(EC 4.2.1.11)であり、
E40が、ピルベートキナーゼ(EC 2.7.1.40)であり、
E41が、有利にはgldA遺伝子によってコードされるグリセロールデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.6)であり、かつ
E42が、有利にはdhaK遺伝子によってコードされるジヒドロキシアセトンキナーゼ(EC 2.7.1.29)である
ことが、特に好ましい。
− glpG遺伝子又は3925遺伝子、
− glpX遺伝子、
− dhaR遺伝子、ycgU遺伝子又はb1201遺伝子、
− fsa遺伝子、mipB遺伝子、ybiZ遺伝子又はB0825遺伝子、
− talC遺伝子、fsaB遺伝子、yijG遺伝子又はb3946遺伝子。
− α−D−グルコース6−リン酸の、β−D−フルクトース6−リン酸への転化を触媒する酵素E43、
− β−D−フルクトース6−リン酸の、β−D−フルクトース1,6−ビスリン酸への転化を触媒する酵素E44、
− β−D−フルクトース1,6−ビスリン酸の、グリセルアルデヒド3−リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸への転化を触媒する酵素E45、
− グリセルアルデヒド3−リン酸の、1,3−ビスホスホグリセレートへの転化を触媒する酵素E36、
− 1,3−ビスホスホグリセレートの、3−ホスホグリセレートへの転化を触媒する酵素E37、
− 3−ホスホグリセレートの、2−ホスホグリセレートへの転化を触媒する酵素E38、
− 2−ホスホグリセレートの、ホスホエノールピルベートへの転化を触媒する酵素E39、及び
− ホスホエノールピルベートの、ピルベートへの転化を触媒する酵素E40
の活性を特徴とすることが好ましい。
E43が、グルコース6−リン酸イソメラーゼ(EC 5.3.1.9)であり、
E44が、6−ホスホフルクトキナーゼ(EC 2.7.1.11)であり、
E45が、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ(EC 4.1.2.13)であり、
E36が、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.12)であり、
E37が、ホスホグリセレートキナーゼ(EC 2.7.2.3)であり、
E38が、ホスホグリセレートムターゼ(EC 5.4.2.1)であり、
E39が、エノラーゼ(EC 4.2.1.11)であり、かつ
E40が、ピルベートキナーゼ(EC 2.7.1.40)である
ことが、特に好ましい。
− オキサロ酢酸塩の、ホスホエノールピルベートへの添加を触媒する酵素、例えばホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ(EC 4.1.1.49)(DE−A−199 50 409号も参照)、
− ピルベートの、アセテートへの転化を触媒する酵素、例えばピルベートオキシダーゼ(EC 1.2.2.2)(DE−A−199 51 975号も参照)、
− α−D−グルコース6−リン酸の、β−D−フルクトース6−リン酸への転化を触媒する酵素(US 09/396,478号も参照)、
− ピルベートの、ラクテートへの転化を触媒する酵素、例えばl−乳酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.27)又はラクテート−マレートトランスヒドロゲナーゼ(EC 1.1.99.7)、
− ピルベートの、アセチル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素、例えばピルベートデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.51)、
− ピルベートの、アセチルホスフェートへの転化を触媒する酵素、例えばピルベートオキシダーゼ(EC 1.2.3.3)、
− ピルベートの、アセテートへの転化を触媒する酵素、例えばピルベートデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.2.2)、
− ピルベートの、ホスホエノールピルベートへの転化を触媒する酵素、例えばホスホエノールピルベートシンターゼ(EC 2.7.9.2)又はピルベート、フォスフェートジキナーゼ(EC 2.7.9.1)、
− ピルベートの、アラニンへの転化を触媒する酵素、例えばアラニントランスアミナーゼ(2.6.1.2)又はアラニン−オキソ−酸トランスアミラーゼ(EC 2.6.1.12)、及び/又は
− ピルベートをアセトラクテートへ転化する酵素、例えばアセトヒドロキシ酸シンターゼ(EC 2.2.1.6)
の活性を低減することが好まれてよい。
− L−グルタメートの、2−オキソグルタレートへの転化を触媒する酵素E46、
− 2−オキソグルタレートの、スクシニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E28
の活性を特徴とすることが、有利である(図10を参照)。
E46が、グルタメートシンターゼ(EC 1.4.1.13もしくはEC 1.4.1.14)、グルタメートデヒドロゲナーゼ(EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3もしくはEC 1.4.1.4)、又はアスパルテートトランスアミナーゼ(EC 2.6.1.1又はEC 2.6.1.2)であり、かつ
E28が、2−オキソグルタレートシンターゼ(EC 1.2.7.3)である
ことが、特に好ましい。
− アセチル−補酵素Aの、マロニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E47、
− マロニル−補酵素Aの、マロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素E48、
− マロン酸セミアルデヒドの、3−ヒドロキシプロピオネートへの転化を触媒する酵素E49、
− 3−ヒドロキシプロピオネートの、3−ヒドロキシプロピオニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E50、
− 3−ヒドロキシピロピオニル−補酵素Aの、アクリロイル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E51、
− アクリロイル−補酵素Aの、プロピオニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E52、
− プロピオニル−補酵素Aの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素E5、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、3−ヒドロキシイソブチレートへの転化を触媒する酵素E4
の活性を特徴とすることが、特に好ましい(図11及び12を参照)。
E4が、3−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.31)又は3−ヒドロキシアシル−補酵素Aデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.35)であり、
E5が、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.27)であり、
E47が、マロニル−補酵素デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.9)、マロネート−補酵素Aトランスフェラーゼ(EC 2.8.3.3)、メチルマロニル−補酵素Aカルボキシトランスフェラーゼ(EC 2.1.3.1)又はアセチル−補酵素Aカルボキシラーゼ(EC 6.4.1.2)であり、
E48が、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.18)であり、
E49が、3−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.59)であり、
E50が、3−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Aヒドロラーゼ(EC 3.1.2.4)であり、
E51が、エノイル−補酵素Aヒドラターゼ(EC 4.2.1.17)であり、かつ
E52が、アシル−補酵素Aデヒドロゲナーゼ(EC 1.3.99.3)である
ことが、特に好ましい。
− アセチル−補酵素Aの、マロニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E47、
− マロニル−補酵素Aの、マロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素E48、
− マロン酸セミアルデヒドの、3−ヒドロキシプロピオネートへの転化を触媒する酵素E49、
− 3−ヒドロキシプロピオネートの、3−ヒドロキシプロピオニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E50、
− 3−ヒドロキシプロピオニル−補酵素Aの、アクリロイル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E51、
− アクリロイル−補酵素Aの、プロピオニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E52、
− プロピオニル−補酵素Aの、(S)−メチルマロニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E7、
− (S)−メチルマロニル−補酵素Aの、(R)−メチルマロニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E6、
− (R)−メチルマロニル−補酵素Aの、マロン酸メチルへの転化を触媒する酵素E2、
− マロン酸メチルの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素E3、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、3−ヒドロキシイソブチレートへの転化を触媒する酵素E4
の活性を特徴とすることが、特に好ましい(図13及び14を参照)。
− アセチル−補酵素Aの、マロニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E47、
− マロニル−補酵素Aの、マロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素E48、
− マロン酸セミアルデヒドの、3−ヒドロキシプロピオネートへの転化を触媒する酵素E49、
− 3−ヒドロキシプロピオネートの、3−ヒドロキシプロピオニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E50、
− 3−ヒドロキシプロピオニル−補酵素Aの、アクリロイル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E51、
− アクリロイル−補酵素Aの、プロピオニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E52、
− プロピオニル−補酵素Aの、メチルマロニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E7、
− メチルマロニル−補酵素Aの、マロン酸メチルへの転化を触媒する酵素E2、
− マロン酸メチルの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素E3、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、3−ヒドロキシイソブチレートへの転化を触媒する酵素E4、
の活性を特徴とすることが、特に好ましい(図15及び16を参照)。
− 2つのアセチル−補酵素A単位の、アセトアセチル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E53、
− アセトアセチル−補酵素Aの、3−ヒドロキシブタノイル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E54、
− 3−ヒドロキシブタノイル−補酵素Aの、クロトニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E55、
− クロトニル−補酵素Aの、ブチリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E56、
− ブチリル−補酵素Aの、エチルマロニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E57、
− エチルマロニル−補酵素Aの、メチルスクシニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E58、
− メチルスクシニル−補酵素Aの、イソブチリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E59、
− イソブチリル−補酵素Aの、メタクリリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E60、
− メタクリリル−補酵素Aの、3−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E61、
− 3−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Aの、3−ヒドロキシイソブチレートへの転化を触媒する酵素E8
の活性を特徴とすることが、好まれてよい。
− 2つのアセチル−補酵素A単位の、アセトアセチル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E53、
− アセトアセチル−補酵素Aの、3−ヒドロキシブチリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E54、
− 3−ヒドロキシブチリル−補酵素Aの、クロトニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E55、
− クロトニル−補酵素Aの、エチルマロニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E62、
− エチルマロニル−補酵素Aの、メチルスクシニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E58、
− メチルスクシニル−補酵素Aの、メサコニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E63、
− メサコニル−補酵素Aの、β−メチルマリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E64、
− β−メチルマリル−補酵素Aの、グリオキシレート及びプロピオニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E65
の活性を特徴とすることが好ましくてよい(図17を参照)。
E53が、β−ケトチオラーゼ(EC 2.3.1.9)であり、
E54が、アセトアセチル−補酵素Aレダクターゼ(EC 1.1.1.36)であり、
E55が、エノイル−補酵素Aヒドラターゼ(EC 4.2.1.17)であり、
E62が、クロトニル−補酵素Aデカルボキシラーゼであり、
E58が、エチルマロニル−補酵素Aムターゼ(EC 5.4.99.2)であり、
E63が、メチルスクシニル−補酵素Aデヒドロゲナーゼであり、
E64が、メサコニル−補酵素Aヒドラターゼであり、かつ
E65が、β−メチルマリル/L−マリル−補酵素Aリアーゼである
ことが、特に好ましい。
− メタンの、メタノールへの転化を触媒する酵素E67、
− メタノールの、ホルムアルデヒドへの転化を触媒する酵素E68、
− ホルムアルデヒドの、5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸塩への転化を触媒する酵素E69、
− 5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸塩の、5−メチレンテトラヒドロ葉酸塩への転化を触媒する酵素E70、
− 5−メチレンテトラヒドロ葉酸塩の、アセチル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E71
の活性を特徴とすることが好まれてよい。
E67が、メタンモノオキシゲナーゼ(EC 1.14.13.25)であり、
E68が、メタノールデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.244)であり、
E69が、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.27)であり、
E70が、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(EC 1.5.1.20)であり、
E71が、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.99.2)である
ことが、特に好ましい。
− ベータ−アラニンの、ベータ−アラニル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E72、
− ベータ−アラニル−補酵素Aの、アクリリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E73、
− アクリリル−補酵素Aの、メチルマロニル−補酵素Aへの転化(又はクロトニル−補酵素Aの、エチルマロニル−補酵素Aへの転化)を触媒する酵素E62、
− メチルマロニル−補酵素Aの、マロン酸メチルへの転化を触媒する酵素E2、
− マロン酸メチルの、メチルマロン酸セミアルデヒドへの転化を触媒する酵素3、
− メチルマロン酸セミアルデヒドの、3−ヒドロキシイソ酪酸への転化を触媒する酵素E4
の活性を特徴とする場合に、特に好ましい(図18を参照)。
E72が、補酵素Aトランスフェラーゼ(EC 2.8.3.1)又は補酵素Aシンターゼ、有利には補酵素Aトランスフェラーゼであり、
E73が、ベータ−アラニル−補酵素Aアンモニア−リアーゼ(EC 4.3.1.6)であり、
E62が、クロトニル−補酵素Aデカルボキシラーゼであり、
E2が、メチルマロニル−補酵素Aヒドロラーゼ(EC 3.1.2.17)であり、
E3が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.3)又はアルデヒドオキシダーゼ(EC 1.2.3.1)であり、かつ
E4が、3−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.31)又は3−ヒドロキシアシル−補酵素Aデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.35)である
ことが、特に有利である。
本発明による方法の第三の特定の実施態様の特に好ましい変異体によって、酵素E2又は酵素E2及びE3が、配列表番号03において示されるようなDNA配列によってコードされ、かつ酵素E62が、配列表番号05において示されるようなDNA配列によってコードされる場合に、その野生型と比較して増加された酵素E2及びE62、又は酵素E2、E3及びE62の少なくとも1つの活性を特徴とする、遺伝的に改変された細胞が使用される。本記載内容において、それらの2つの酵素の増加された活性が、細胞中で、配列表番号04及び配列表番号06を有するポリペプチドを過剰発現することによって達せられる場合に、それぞれ、配列表番号04及び配列表番号06において示されるようなアミノ酸配列との、少なくとも50%、有利には少なくとも55%、より有利には少なくとも60%、より有利には少なくとも65%、及び最も有利には70%の同一性を有するアミノ酸配列が好ましい。本記載内容において、それら2つのDNA配列は、細胞のゲノム中へ組み込まれ、或いは細胞の中にベクター上で存在してよい。
− その野生型と比較して増加された、ピルベートの、オキサロ酢酸塩への転化を触媒する酵素E11、又はホスホエノールピルベートの、オキサロ酢酸塩への転化を触媒する酵素E74の活性、しかし有利には、ピルベートの、オキサロ酢酸塩への転化を触媒する酵素E11、及び
− アスパルテートの、ベータ−アラニンへの転化を触媒する酵素E75の増加された活性
も特徴とする場合に有利であってよい。
− ピルベートの、2−アセトラクテートへの転化を触媒する酵素E76、
− 2−アセトラクテートの、2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの転化を触媒する酵素E77、
− 2,3−ジヒドロキシイソバレレートの、2−オキソイソバレレートへの転化を触媒する酵素E78、
− 2−オキソイソバレレートの、イソブチリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E79、
− イソブチリル−補酵素Aの、メタクリリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E60、
− メタクリリル−補酵素Aの、3−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E61、
− 3−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Aの、3−ヒドロキシイソブチレートへの転化を触媒する酵素E8
の活性を特徴とする、遺伝的に改変された細胞を使用することが好ましい(図19を参照)。
E8が、3−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Aヒドロラーゼ(EC 3.1.2.4)であり、
E76が、アセトラクテートシンターゼ(EC 2.2.1.6)であり、
E77が、ジヒドロキシイソバレレートデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.86)であり、
E78が、2,3−ジヒドロキシイソバレレートデヒドラターゼ(EC 4.2.1.9)であり、
E79が、2−オキソイソバレレートデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.25又はEC 1.2.4.4)であり、
E60が、アシル−補酵素Aデヒドロゲナーゼ(EC 1.3.99.3)、ブチリル−補酵素Aデヒドロゲナーゼ(EC 1.3.99.2)又は2−メチルアシル−補酵素Aデヒドロゲナーゼ(EC 1.3.99.12)であり、かつ
E61が、エノイル−補酵素Aデヒドラターゼ(EC 4.2.1.17)である
ことが、特に好ましい。
− L−バリンの、2−オキソイソバレレートへの転化を触媒する酵素E80、
− 2−オキソイソバレレートの、イソブチリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E79、
− イソブチリル−補酵素Aの、メタクリリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E60、
− メタクリリル−補酵素Aの、3−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Aへの転化を触媒する酵素E61、
− 3−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Aの、3−ヒドロキシイソブチレートへの転化を触媒する酵素E8
の活性を特徴とすることが好ましい(図20を参照)。
E8は、3−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Aヒドロラーゼ(EC 3.1.2.4)であり、
E60は、アシル−補酵素Aデヒドロゲナーゼ(EC 1.3.99.3)、ブチリル−補酵素Aデヒドロゲナーゼ(EC 1.3.99.2)又は2−メチルアシル−補酵素Aデヒドロゲナーゼ(EC 1.3.99.12)であり、
E61は、エノイル−補酵素Aヒドラターゼ(EC 4.2.1.17)であり、
E79は、2−オキソイソバレレートデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.25又はEC 1.2.4.4)であり、かつ
E80は、アミノ酸トランスフェラーゼ(EC 2.6.1.42)である
ことが、特に好ましい。
− E1〜E4、
− E1、E4、E5、E6及びE7、
− E1、E4、E5及びE7、
− E4、E5及びE47〜E52、
− E2〜E4、E6、E7及びE47〜E52、
− E2〜E4、E7及びE47〜E52、
− E8及びE53〜E61、
− E8、E53〜E55、E58及びE62〜E64、
− E2〜E3、E62、E72及びE73、
− E8、E60、E61及びE76〜E79又は
− E8、E60、E61、E79及びE80
の活性を増加する工程を含む方法によって得られてよく、その際酵素活性を増加することは、有利には、初めに記載された方法によって実施される。
IIA)前記の方法による3−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの製造工程、
IIB)3−ヒドロキシイソ酪酸の形成及び、適宜、3−ヒドロキシイソ酪酸の中和、及び/又は3−ヒドロキシイソ酪酸の分離での、3−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの開裂工程、
IIC)3−ヒドロキシイソ酪酸を脱水してメタクリル酸を形成し、適宜、メタクリレート又はメタクリル酸をエステル化する工程
を含む、メタクリル酸又はメタクリルエステルを製造する方法によって提供される。
IIIA)前記の方法によるメタクリル酸の製造工程、
IIIB)メタクリル酸の遊離基重合工程、
を含む、ポリメタクリル酸又はポリメタクリルエステルを製造する方法によっても提供され、その際、適宜、遊離基重合反応の前又は後に、少なくとも1部分、メタクリル酸のカルボキシル基をエステル化することができる。
実施例1
本発明は、炭素源としてL−バリンから出発する、前駆体として3−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Aを及び中間体としてイソブチリル−補酵素Aを介して3−ヒドロキシイソ酪酸を製造することができる組換え細胞に関して、実施例1において説明される。本発明に従って、この細胞を、メタクリル酸の製造のために使用してよい。このために、酵素EC 2.6.1.42及びEC 1.2.4.4(それぞれの場合においてシュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruglnosa)から)、並びに3つの酵素EC 1.3.99.12、EC 4.2.1.17及びEC 3.1.2.4(アシネトバクター・カルコアセチカスから)を含有するクラスターを、大腸菌BL21(DE3)中で過剰発現した。
最初に、1.2.4.4及び2.6.1.42の断片を、表4において詳述されている、配列表番号15〜配列表番号18において示されるようなプライマーを使用して、シュードモナス・アエロギノーサからの全DNAから開始するPCRによって増幅した。
ベクターpCDFDuet−1(ストレプトマイシン耐性/スペクチノマイシン耐性を特徴とする)を、EcoRI/SalIによって開裂し、同様にPCR断片2.6.1.42を開裂し、そして従って得られた制限を、一昼夜T4リガーゼと連結した。これは、ベクターpCDFDuet::2.6.1.42をもたらした。
ベクターpCR2.1−TOPOを使用して、断片2.6.1.42又は断片1.2.4.4を含有するクローニングベクターの製造を、製造者の説明書において記載されているように実施した。大腸菌DH5α細胞を、得られたクローニングベクターpCR2.1−TOPO::1.2.4.4及びpCR2.1−TOPO::2.6.1.42で形質転換した。pCR2.1−TOPOベクターが、カナマイシン耐性及びアンピシリン耐性を特徴とするために、その形質転換株を、2枚のAXI及びKXIプレート(20及び40μl)上で培養した。得られたクローンのプラスミドを、単離しそして消化した:
pCR2.1−TOPO::1.2.4.4 BgIII+KpnI
断片サイズ2313bp
pCR2.1−TOPO::2.6.1.42 EcoRI+SalI
断片サイズ958bp。
ベクターpCDFDuet::2.6.1.42及びベクターpCR2.1−TOPO::1.2.4.4を、BgIII/KpnIで消化した。
菌株ATCC 33304アシネトバクター・カルコアセチカスを、全DNAの単離のために培養した(HH寒天培地又は培地)。全DNAを、Qiagen社製のDNEasyキット(L1及びL2)によって、及び工程i)培養物1mlの遠心分離、ii)H2O200μlのペレットへの添加、iii)10分間95℃での加熱、iv)遠心分離(10分、13000rpm)、及びv)PCRのための上清の取り除きの方法を含む方法によって、単離した。
大腸菌BL21(DE3)を、プラスミドpET101/D−TOPO::V−ClusterAca及びpCDF−Duet::2.6.1.42−1.2.4.4で形質転換した(LB spec./amp培地上に培養した)。得られた細胞は、L−バリンを含有する栄養培地中で、L−バリンを3−ヒドロキシイソ酪酸に転化することができた。対照的に、細胞の野生型(大腸菌BL21(DE3))は、3−ヒドロキシイソ酪酸の検出可能な量をかかる栄養培地中で形成することができなかった。
この実施例において、遺伝子をコードするDNAを単離し、そしてその遺伝子を、大腸菌中で過剰発現した。該DNAは、酵素E2の活性と酵素E3の活性との双方を有する酵素をコードした。
スルフォロバス・トコダイを、少ない培養液量(40〜200ml)で、75℃及びpH3.0で、振盪(150rpm)しながら増殖した。その成長は、578nm(OD578nm)で、光学密度を測定することによって測光法で観察した。改変されたスルフォロバス培地を使用した(Brock et al.,Archives of Microbiology 84,54〜68頁,1972年;Suzuki et al.,Extremophiles,6,39〜44頁,2002年によって記載されているように改変した)。使用したエネルギー源及び炭水化物源は、酵母抽出物、カザミノ酸及びグルコースであった。その培地は、次の成分からなった:基本培地、グルコース原液、鉄限度規準液及び微量元素原液。0.3〜0.5(対数期)のOD578nmで、細胞を回収した。その遠心分離を、Sorvall遠心分離機(SS34ローター)中で、15分間9000rpmで実施した。その細胞ペレットを、直接、DNA抽出のために使用した。
基本培地。KH2PO4(0.28g/l)、(NH4)2SO4(1.3g/l)、MgSO4x7 H2O(0.25g/l)、CaCl2x6H2O(0.07g/l)、酵母抽出物(1g/l)、及びカザミノ酸(1g/l)。オートクレーブ処理前に、そのpHを、H2SO4を使用して3.0にした。
グルコース原液(100×)。グルコース(100g/l)。その溶液を、濾過滅菌した。
鉄限度規準液(1000x)。FeCl3x6 H2O(20g/l)。その溶液を、濾過滅菌した。
微量元素原液(1000×)。MnCl2x4 H2O(1.8g/l)、Na2B4O7×10 H2O(4.5g/l)、ZnSO4x7 H2O(220mg/l)、CuCl2x2 H2O(50mg/l)、Na2MoO4x2 H2O(30mg/l)、VOSO4x5 H2O(30mg/l)、CoCl2x6 H2O(8.4mg/l)。それぞれの成分を、蒸留したH2O中で連続して溶解し、そのpHをHClを使用して3.0にし、そしてその溶液を濾過滅菌した。
ゲノムDNAを、Murray及びThompson(Nucleic Acid Research,8,4321〜4325頁,1980年)の方法によって単離した。このために、新たに回収した細胞10〜50mg(生体量)を、1.5mlエッペンドルフ反応管中へ秤量し、そしてTE緩衝液570ml(10mM Tris/HCl(pH8.0)、1mM NaEDTA)中で再懸濁した。10%(w/v)SDS溶液(ドデシル硫酸ナトリウム溶液)30μl及びプロテイナーゼK3μl(20μg/μl)を添加し、そしてその混合物を1時間52℃でインキュベートした。その後、5M NaCl溶液100μl及び予熱した10%(w/v)臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)溶液80μl(0.7M NaCl中で10%(w/v)CTAB)を添加した。10分間65℃でインキュベートした後、CTAB、細胞壁断片及びタンパク質の複合体を、クロロホルム/イソ−アミルアルコール(24:1(v/v))780μlで抽出し、15分間14000rpmで遠心沈澱した。その水性の上相を、新しいエッペンドルフ反応管中に移し、そしてその抽出を繰り返した。 水性相が色素を有さなくなった後に、それを100%イソプロパノール400μlの層で覆った。2つの相を注意深く混合することによって、染色体DNAは、境界面で沈澱した。そして、引き延ばしたパスツールピペットでDNAを取り出すことが可能であり、そして70%エタノール200μlで洗浄した。遠心分離(5分、14000rpm)後に、その上清を分注し、そしてDNAを、2時間室温で乾燥し、そして最終的にTE緩衝液100μl中で溶解した。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51,263〜273頁,1986年)を、実施例2において得られたゲノムスルフォロバス・トコダイDNAから、標的目的でマロニル−CoAレダクターゼ遺伝子を増幅するために使用した。これは、サーモサイクラー(thermocycler)(Biometra、Goettingen)で実施した。
5’−ATTATCCCATGGGGAGAACATTAAAAGC−3’
("順方向プライマー";NcoI開裂部位に下線を引く;配列表番号21)及び
5’−CGGGATCCTTACTTTTCAATATATCC−3’
("逆方向プライマー";BamHI開裂部位に下線を引く;配列表番号22)。
スルフォロバス・トコダイからのマロニル−補酵素Aレダクターゼ遺伝子をクローンするために、実施例3において増幅された遺伝子を、"pCR T7 Topo TA Expression Kit"(Invitrogen、Karlsruhe)を使用して、ベクターpCR T7/CT−Topo(Invitrogen、Karlsruhe)で非特異的にクローンした。これを、製造者の説明書に従って行った。
マロニル−補酵素Aレダクターゼ遺伝子を含有する発現ベクターを発生するために、実施例4において得られた単離されたクローニングベクターを、制限酵素NcoI及びBamHIで制限消化した。このために、プラスミドDNA(それぞれ、組み込まれたマロニル−補酵素Aレダクターゼ遺伝子を有する発現ベクターpTrc99A及びpCR T7/CT−Topoベクター)25〜27μlを、反応緩衝液(10×)5μl及び制限酵素(10U/μl;Fermentas、St. Leon−Rot)2〜3μlと完全に混合した。反応混合液を蒸留したH2Oで50μlにし、そして5時間、製造者によって指定された温度でインキュベートした。エタノール沈澱を、さらに使用する前に実施した。このために、DNAを、100%エタノール3容量及び3M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.3)0.1容量と混合し、そして2時間又は一昼夜、−80℃でインキュベートした。遠心分離工程(20分、14000rpm、4℃、エッペンドルフ卓上遠心機)後に、その上清を注意深く取り除き、そしてDNAを、70%(v/v)エタノール3容量で洗浄した。室温で10分インキュベーションした後に、その混合液を、再度遠心分離(10分、14000rpm、4℃、エッペンドルフ卓上遠心機)し、そしてその上清を捨てた。そしてDNAを、1時間室温で乾燥し、続いてH2O又はTE緩衝液(10mM Tris/HCl(pH8.0)、1mM NaEDTA)の所望の容量で処理した。
ライゲーション緩衝液(10×):0.5M Tris/HCl、pH7.6、100mM MgCl2、0.5mg/ml BSA、濾過滅菌、室温で貯蔵
5mM ATP(アデノシントリホスフェート)常に新たな滅菌蒸留したH2O中で作る
50mM DTE(ジチオエリトリトール)常に新たなライゲーション緩衝液中で作る。
一昼夜培養した培養液5mlを、大腸菌Rosetta2細胞の単一コロニーから開始して増殖した。翌朝、LB培地(Sambrook et, al., "Molecular Cloning:A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989年)50mlを、この培養液の0.5〜1.0mlで播種した。1.5〜2時間のインキュベーション(37℃、振盪(180rpm))後に、0.6のOD578nmに達した。その細胞を、10分間氷上で冷却し、そして続いて5分間5000rpmで、及び4℃で遠心沈澱した(GSAローター、Sorvall遠心機)。その上清を捨て、そして細胞ペレットを、冷却した0.1M CaCl2溶液2.7ml中で再懸濁した。滅菌した50%(v/v)グリセロール2.3mlの添加後に、細胞懸濁液を、1.5mlエッペンドルフ反応管中で一部(それぞれ場合において300μl)に分けた。コンピテントセルを、すぐに液体窒素中で冷凍し、そして続いて−80℃で貯蔵した。
実施例6において得られた大腸菌株を、細胞粉砕によって粉砕した。粉砕した細胞を、15分間85℃で加熱した。この熱沈澱中に、非熱耐性酵素は凝固し、そして沈澱した。標的タンパク質が熱耐性であるため、これは上清中に残留する。マロニル−補酵素Aレダクターゼ活性を測定するために、その上清を、TM緩衝液(50mM Tris/Cl、1mM MgCl2、pH8.1)中で1:50で希釈した。希釈又は未希釈(メチルマロニル−補酵素Aレダクターゼ活性を検出するため)の上清30μlを、HIPS緩衝液(0.5mM NADPHを含有する100mM HEPES/NaOH、5mM MgCl2、1mMジチオエリトリトール)500μlに分注した。
本発明は、炭素源としてグルコースから開始する、前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドを介して3−ヒドロキシイソ酪酸を製造することができる組換え細胞によって、メタクリル酸の製造に基づいて実施例3においてさらに説明される。このために、とりわけ、酵素メチルマロニル−補酵素Aムターゼ(E1)及び3−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ(E4)を、C. glutamicum ATCC13032中で過剰発現した。
DNA操作は、Sambrook, J. et al.(1989年), "Molecular Cloning:a laboratory manual"、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkにおいて記載されている標準方法を使用した。DNAの増幅を、SAWADY Pwo−DNAポリメラーゼ(Peqlab Biotechnologie, Eriangen, Germany)又はPlatinum Pfx−DNAポリメラーゼ(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)を使用して実施した。特に指定されない限り、ポリメラーゼを、製造者の説明書によって使用した。PCR増幅及び制限開裂部位の導入のためのオリゴヌクレオチドを、MWG−Biotech(Ebersberg, Germany)から得た。改変菌株を、TaqポリメラーゼREADYMIX(Sigma, Taufkirchen, Germany)を使用したコロニーPCR及びプラスミド精製によって同定した。DNA断片を精製し、そしてMinElute Gel Extraction Kit (Quiagen, Hilden, Germany)を使用して、製造者の説明書によって単離した。プラスミドDNAを、Qiaprep spin Miniprep Kit(Quiagen, Hilden, Germany)によって単離した。構築された全てのプラスミドを、制限解析及び続くシーケンスによって照合した。
pcg1859−57_vorwaerts(配列表番号23):
5’−cggtcgacaaggagatatagataTGACTGATCTCACAAAGACTGC−3’
及び
pcg1857−59_rueckwaerts(配列表番号24):
5’−cTTAGGCTTTGTCGAACGCCTCC−3’
(ゲノム配列に対する相補的な配列を、大文字で示す)。
サーマス・サーモフィルス(TTHA0237)3−ヒドロキシイソ酪酸脱水酵素(3HIBDH)の遺伝子を、C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮に入れて合成した。最適な遺伝子(配列表番号25)のコンドン使用頻度を、ベクターpGA4(pGA4_3HIBDH、図22)中に合成した。pGA4_3HIBDHベクターを、エンドヌクレアーゼKpnI及びEcl136IIによって消化し、その結果として、3HIBDH遺伝子を、既にT7プロモーターの機能的発現制御下でスルフォロバス・トコダイのメチルマロニル−補酵素Aムターゼから誘導された配列を有し、かつ制限酵素BamHI(続く充填(filling−in)反応で)及びKpnIによって直線化されている、ベクターpGA5_MMCoAR中に連結した。得られたベクターpGA5_MMCoAR_3HIBDHを、図23に示す。
C. glutamlcum ATCC13032のコンピテントセルを、Tauch et al.(Curr Microblol.2002年,45:362〜367)において記載されているように製造した。pEKEx2MCM_cgl及びpEC−XT99A_3HIBDH_varIIMMCoARのDNAを、エレクトロポレーションによって導入し、そして形質転換体を、カナマイシン50mg/l及びテトラサイクリン5mg/lを補った、Merck(Darmstadt, Germany)からのブレインハート寒天上で選択した(Liebl et al. FEMS Microblol Lett., 1989年, 53:299〜303)。プラスミドDNAを、形質転換体から単離し、そして制限消化によって特徴付けられた。この方法において、C. glutamlcumのpEKEx2MCM cgl/pEC−XT99A_3HIBDH_varIIMMCoARを得た。
C. glutamicumのpEKEx2MCM_cgl/pEC−XT99A_3HIBDH_varIIMMCoARの単コロニーを、カナマイシン15μg/l及びテトラサイクリン5μg/lを含有するコンピテント培地(ブレインハート培地)25ml中で播種するために使用し、そして30℃及び220rpmで一昼夜培養した。その野生型を、対照として、抗生物質無しで培養した。
20g (NH4)2SO4
5g 尿素
1g K2HPO4
1g KH2PO4
42g MOPS
1ml MgSO4×7H2O(25g/100ml、滅菌濾過した)
1ml CaCl2×2H2O(1.32g/100ml、滅菌濾過した)。
1g FeSO4×7H2O
1g MnSO4×H2O
0.1g ZnSO4×7H2O
0.02g CuSO4
0.002g NiCl2×6H2O。
前記の実施例4によって製造した3−ヒドロキシイソ酪酸の溶液5ml(0.2g/l)に、撹拌しながらNaOH(0.06mg)を添加した。その溶液を、撹拌しながらインキュベートし、そして185〜195℃で減圧(300torr)下で還流濃縮した。さらに、5ml中で3−ヒドロキシイソ酪酸0.5mgを、1時間毎に、5時間にわたって添加した。その溶液は、メタクリレートを重合から防ぐために、p−メトキシフェノール0.4質量%を含有した。反応を、インキュべーションの24時間後に止めた。3−ヒドロキシイソ酪酸のメタクリレートへの転化は、約90%であった。メタクリル酸を、反応混合液から蒸留によって除去した。
本発明を、前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドを介して、及び中間体としてアクリロイル−補酵素Aを介して3−ヒドロキシイソ酪酸を製造することができる組換え大腸菌細胞によって、メタクリル酸の製造に基づく実施例4においてさらに説明する。
最初に、K. pneumoniae GDRFの2つのサブユニットをコードする遺伝子gdrA(別名:ORF4)及びgdrB(別名:ORF2b)を、PCRによって増幅した。使用した鋳型は、菌株K. pneumoniae DSM2026の染色体DNAであった。
orf4fw(配列表番号26):
5’−TGAAGATCCTAGGAGGTTTAAACATATGCCGTTAATAGCCGGGATTG−3’
orf4Salrv(配列表番号27):
5’−TATATAGTCGACTTAATTCGCCTGACCGGCCAG−3’;
(SalI認識配列に下線をした)。
orf2bPcifw(配列表番号28):
5’−TATATAACATGTCGCTTTCACCGCCAGGC−3’
(PciI認識配列に下線をした)
orf2bbrv(配列表番号29):
5’−CATATGTTTAAACCTCCTAGGATCTTCAGTTTCTCTCACTTAACGGGCAGG−3’。
orf2bNcofw(配列表番号30):
5’−TATATACCATGGCGCTTTCACCGCCAGGC−3’
(NcoI認識配列に下線した)
orf4Salrv(配列表番号31):
5’−TATATAGTCGACTTAATTCGCCTGACCGGCCAG−3’
(SalI認識配列に下線をした)。
K. pneumoniae GDの3つのサブユニットを、自然に、単一オペロン中で形成した(遺伝子gldA、gldB及びgldC)。これらを、鋳型としてK. pneumoniae DSM2026の染色体DNAを再度使用して、PCRによって増幅した。
KpGDNdefw(配列表番号32):
5’−TATATACATATGAAAAGATCAAAACGATTTGCAGTACTGG−3’
(NdeI認識配列に下線をした)
KpGDSalrv(配列表番号33):
5’−TATATAGTCGACTTAGCTTCCTTTACGCAGCTTATGC−3’
(SalI認識配列に下線をした)。
1228_ald_fp(配列表番号34):
5’−AAAACATATGAATTTTCATCATCTGGCTTACTGG−3’
(NdeI認識配列に下線をした)及び
1228_ald_rp(配列表番号35):
5’−AAAACATATGTATATTTCCTTCTTTCAGGCCTCCAGGCTTATCCAGATG−3’
(NdeI認識配列に下線をした)。
ccr−fw(配列表番号36):
5’−GGAGGCAACCATGGCCCTCGACGTGCAGAG−3’
(NcoI認識配列に下線をした)及び
ccr−rev(配列表番号37):
5’−GAGACTTGCGGATCCCTCCGATCAGGCCTTGC−3’
(BamHI認識配列に下線をした)
を使用してPCRによって増幅した。そのPCR生成物を、NcoI/BamHI断片によってNcoI/BamHI−切断ベクターpET3d(Merck、Germany)中に連結して、プラスミドpTE13を製造した。
1228_Cau_pcs_fp(71)(配列表番号38):
5’−AAAACATATGATCGACACTGCGCCCCTTGC−3’
(NdeI認識配列に下線をした)及び
1228_Cau_pcs_rp(74)(配列表番号39):
5’−AAGACGTCCTACCGCTCGCCGGCCGTCC−3’
(AatII認識配列に下線をした)
を使用してPCRによって増幅した。その単位複製配列を、ゲル抽出によって精製し、そして、NdeI/AatIIでの消化を介して、対応する切断ベクターpCDFDuet−1_Rs_ccr中に連結して、プラスミドpCDFDuet−1_Rs_ccr_Cau_pcs(10472bp)を製造した。
最初に、S. tokodail mcr遺伝子の変異体を、コリネバクテリウム・グルタミクム(St_mcr_oCg)のコドン使用頻度を有する系列中で合成した。その合成を、GeneArt、Germanyで実施し、そして人工遺伝子St_mcr_oCgを、プラスミドpGA4_MMCoAR_ST(配列表番号40)の形で提供した。pGA4_MMCoAR_ST DNAを、オリゴヌクレオチド
1228_MMCoAR_fp(配列表番号41):
5’−AACCATGGGCCGCACCCTGAAGG−3’
(NcoI認識配列に下線をした)及び
1228_MMCoAR_rp(配列表番号42)
5’−AAGGATCCTTACTTTTCGATGTAGCCCTTTTCC−3’
(BamHI認識配列に下線をした)
を使用して、人工遺伝子St_mcr_oCgを増幅するためにPCR鋳型として使用した。
1228_Tth_HIBDH_fp(配列表番号44):
5’−AAAACATATGGAAAAGGTGGCATTCATCG−3’
(NdeI認識配列に下線をした)及び
1228_Tth_HIBDH_rp(配列表番号45):
5’−AAAAGATCTTTAGCGGATTTCCACACCGCC−3’
(BglII認識配列に下線をした)
を使用して、人工遺伝子Tth_HIBDH_oCgを増幅するために、PCR鋳型として使用した。
前記のe)において記載されているプラスミド輸送大腸菌株を、改変したM9培地(6.8g/l Na2HPO4x2H2O;3g/l KH2PO4;0.5g/l NaCl;1g/l NH4Cl;1.25g/l 酵母抽出物;1%(v/v)グリセロール;15mg/l CaCl2x2H2O;250mg/l MgSO4x7H2O;1%(v/v)Gibco MEM ビタミン溶液;41.9g/l MOPS)中で培養した。その培地を、アンピシリン(25μg/ml)、クロラムフェニコール(17μg/ml)、カナマイシン(15μg/ml)及びストレプトマイシン(25μg/ml)で補った。全体の培養(予備培養及び本培養)を37℃で温度制御した振盪器中で実施した。その菌株を、最初に培地5ml中で一昼夜培養した。続いて、緩衝液を使用して100mlフラスコ中で培地20mlを、1:20の比で一昼夜培養した物から播種し、そしてさらに培養した。約0.8のOD600で、コバラミン6μM及びIPTG1μMを添加し、そしてその培養物をさらに4時間インキュベートした。その後、細胞懸濁液2.5mlを取り出し、そして−20℃で解析するまで貯蔵した。
前記のf)において記載されている方法によって製造した3−ヒドロキシイソ酪酸の濃縮溶液5ml(0.2g/l)に、撹拌しながらNaOH(0.06mg)を添加した。その溶液を、撹拌しながらインキュベートし、そして185〜195℃で減圧(300torr)下で還流濃縮した。さらに、5ml中での3−ヒドロキシイソ酪酸0.5mgを、1時間毎に、5時間にわたって添加した。その溶液は、メタクリレートを重合から防ぐために、p−メトキシフェノール0.4質量%を含有した。その反応を、インキュベーションの24時間後に止めた。3−ヒドロキシイソ酪酸のメタクリレートへの転化は、約90%であった。メタクリル酸を、反応混合液から蒸留によって除去した。
Claims (9)
- メタクリル酸又はメタクリルエステルの製造方法であって、
IA)3−ヒドロキシイソ酪酸又は3−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートが、炭素源から形成される条件下で、アミノ酸トランスフェラーゼ、2−オキソイソバレレートデヒドロゲナーゼ、2−メチルアシル−補酵素Aデヒドロゲナーゼ、エノイル−補酵素Aヒドラターゼ及び3−ヒドロキシイソブチリル−補酵素Aヒドロラーゼを過剰発現した細胞と、炭素源としてL−バリンを含有する栄養培地とを接触する方法工程、又はメチルマロニル−補酵素Aムターゼ及び3−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼを過剰発現した細胞と、炭素源としてグルコースを含有する栄養培地とを接触する方法工程、又はグリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼのための再活性化因子、プロピオニル−補酵素Aシンターゼ、クロトニル−補酵素Aカルボキシラーゼ/レダクターゼ、マロニル−CoAレダクターゼ及び3−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼを過剰発現した細胞と、炭素源としてグリセロールを含有する栄養培地とを接触する方法工程を含む方法によって3−ヒドロキシイソ酪酸を製造し、3−ヒドロキシイソ酪酸を栄養培地から分離し、かつ3−ヒドロキシイソ酪酸を中和する方法工程、
IB)3−ヒドロキシイソ酪酸を脱水してメタクリル酸を形成させ、メタクリル酸をエステル化する方法工程
を含む方法。 - 3−ヒドロキシイソ酪酸の、又は3−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、前駆体としてメチルマロン酸セミアルデヒドを介して実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記の細胞が、中間体としてスクシニル−補酵素Aを介して、3−ヒドロキシイソ酪酸又は3−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成することができる、請求項2に記載の方法。
- 前記の細胞が、中間体としてプロピオニル−補酵素Aを介して、3−ヒドロキシイソ酪酸又は3−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成することができる、請求項2に記載の方法。
- 前記の細胞が、中間体としてアクリロイル−補酵素Aを介して、3−ヒドロキシイソ酪酸又は3−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成することができる、請求項2に記載の方法。
- 3−ヒドロキシイソ酪酸の、又は3−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートの形成が、前駆体として3−ヒドロキシブチリル−補酵素Aを介して実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記の細胞が、中間体としてイソブチリル補酵素Aを介して、3−ヒドロキシイソ酪酸又は3−ヒドロキシイソ酪酸を基礎とするポリヒドロキシアルカノエートを形成することができる、請求項6に記載の方法。
- 前記の細胞が、該細胞中で、請求項1に記載の少なくとも1つの酵素の活性を増加する方法工程を含む、遺伝的に改変された細胞を製造するための方法によって得られる、請求項1に記載の方法。
- ポリメタクリル酸又はポリメタクリルエステルを製造するための方法であって、
IIIA)請求項1から8までのいずれか1項に記載の方法によるメタクリル酸の製造工程、
IIIB)メタクリル酸の遊離基重合工程、
を含み、その際、遊離基重合反応の前又は後に、少なくとも1部分のメタクリル酸のカルボキシル基又はメタクリレートのカルボキシレート基をエステル化することができる方法。
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US9102958B2 (en) | 2011-12-16 | 2015-08-11 | Invista North America S.á.r.l. | Methods of producing 6-carbon chemicals via CoA-dependent carbon chain elongation associated with carbon storage |
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DE102013000602A1 (de) | 2013-01-16 | 2014-07-17 | Evonik Industries Ag | Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure |
CN104718292B (zh) | 2013-01-24 | 2019-09-10 | 三井化学株式会社 | 导入了二氧化碳固定循环的微生物 |
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CA2905602A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sarah M. Hoyt | Flash evaporation for product purification and recovery |
WO2014145343A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Opx Biotechnologies, Inc. | Bioproduction of chemicals |
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CN106795483A (zh) | 2013-07-19 | 2017-05-31 | 嘉吉公司 | 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法 |
US11408013B2 (en) | 2013-07-19 | 2022-08-09 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
BR112016000541B1 (pt) | 2013-08-01 | 2023-01-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | Método para produção de metacrilil-coa e conversão de metacrilil-coa em ácido metacrílico ou éster metacrilato |
CN105705650A (zh) * | 2013-08-28 | 2016-06-22 | 英威达技术有限责任公司 | 用于生物合成异丁烯酸盐的方法 |
KR20160108546A (ko) | 2014-03-07 | 2016-09-19 | 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 | 메타크릴산에스테르의 제조 방법 및 신규 메타크릴산에스테르 합성 효소 |
WO2015176026A1 (en) | 2014-05-15 | 2015-11-19 | Invista North America S.á.r.l. | Methods of producing 6-carbon chemicals using 2,6-diaminopimelate as precursor to 2-aminopimelate |
BR112016029394A2 (pt) | 2014-06-16 | 2017-10-17 | Invista Tech Sarl | métodos, reagentes e células para biossintetizar composto |
US9957535B2 (en) | 2014-06-16 | 2018-05-01 | Invista North America S.A.R.L. | Methods, reagents and cells for biosynthesizing compounds |
EP3155112A1 (en) | 2014-06-16 | 2017-04-19 | Invista Technologies S.à.r.l. | Process for producing glutarate and glutaric acid methyl ester |
CN106795537A (zh) | 2014-06-16 | 2017-05-31 | 英威达技术有限责任公司 | 用于生物合成化合物的方法、试剂和细胞 |
DE102014213016A1 (de) * | 2014-07-04 | 2016-01-07 | Evonik Röhm Gmbh | Dehydratisierung von alpha-substituierten Carbonsäuren in Gegenwart von Wasser bei hohen Drücken |
EP2993228B1 (en) | 2014-09-02 | 2019-10-09 | Cargill, Incorporated | Production of fatty acid esters |
AU2016265751A1 (en) | 2015-05-19 | 2017-12-14 | Lucite International Uk Limited | Process for the biological production of methacrylic acid and derivatives thereof |
DE102016212497B4 (de) | 2015-07-13 | 2024-04-25 | Sk Innovation Co., Ltd. | Mutanter Mikroorganismus, der ein Gen umfasst, das Methylmalonyl-CoA-Reductase codiert, und seine Verwendung |
AU2016340470B2 (en) | 2015-10-23 | 2019-10-03 | Mitsubishi Chemical Corporation | Biological production of methyl methacrylate |
KR102547252B1 (ko) * | 2016-01-08 | 2023-06-23 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 유기물질 기상탈수반응 원료의 제조방법 |
WO2018144701A2 (en) | 2017-02-02 | 2018-08-09 | Cargill Incorporated | Genetically modified cells that produce c6-c10 fatty acid derivatives |
GB201808424D0 (en) | 2018-05-23 | 2018-07-11 | Lucite Int Uk Ltd | Methods for producing BMA and MMA using genetically modified microorganisms |
Family Cites Families (5)
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EP1186592A1 (en) * | 2000-09-11 | 2002-03-13 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Ltd. | Production of methacrylates |
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JP2005336110A (ja) * | 2004-05-27 | 2005-12-08 | Mitsubishi Chemicals Corp | (メタ)アクリル酸および(メタ)アクリル酸エステルの製造方法 |
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