CN106062204A - 甲基丙烯酸酯的制造方法及新的甲基丙烯酸酯合成酶 - Google Patents

甲基丙烯酸酯的制造方法及新的甲基丙烯酸酯合成酶 Download PDF

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佐藤荣治
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Abstract

作为利用生物催化剂的甲基丙烯酸酯的制造方法，提供含有如下工序的甲基丙烯酸酯的制造方法：在来自以下植物的醇酰基转移酶存在下，使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A而合成甲基丙烯酸酯，所述植物为选自由属于木犀属(Osmanthus)的植物、属于葡萄属(Vitis)的植物、属于柑橘属(Citrus)的植物、属于榴莲属(Durio)的植物、属于木兰属(Magnolia)的植物及属于果香菊属(Chamaemelum)的植物组成的组中的植物。

Description

甲基丙烯酸酯的制造方法及新的甲基丙烯酸酯合成酶
技术领域
本发明涉及使用了生物催化剂的有机酸酯的制法、特别是甲基丙烯酸酯的制法。更详细而言，涉及使用了具有甲基丙烯酸酯生成能力的醇酰基转移酶的甲基丙烯酸酯的制造方法，进而涉及这些醇酰基转移酶及其利用方法。
背景技术
甲基丙烯酸酯主要用作丙烯酸类树脂的原料，作为涂料、粘接剂、树脂改性剂等领域的共聚单体也有很多需求。作为工业性制法，有若干种方法，已知例如以丙酮及氰化氢为原料的ACH(丙酮氰醇)法、以异丁烯及叔丁醇为原料的直接氧化法。这些化学方式的制造方法依赖于化石原料，此外需要大量的能量。
近年来，从防止地球温暖化及环境保护的观点出发，使用生物质原料代替目前的化石原料作为碳源而制造各种化学制品的技术受到关注。也期待由生物质原料制造甲基丙烯酸酯，但尚未报道使用生物催化剂由生物质原料制造的具体制造例。
例如，提出了利用天然存在的微生物，由糖等天然物质生产作为甲基丙烯酸的前体的2-羟基异丁酸及3-羟基异丁酸的方法(参照专利文献1、2及非专利文献1)。但是，这些方法中，使前体脱水生成甲基丙烯酸的工序依然依赖于化学方法。
另外，虽然已经提出了使用导入有多个酶基因的、非天然存在的重组微生物，由葡萄糖生成甲基丙烯酸的方法，但是这些不过是将已知的酶反应及由此类推的假想酶反应组合，并未进行实际验证(参照专利文献3～5)。特别是，专利文献5虽然例示了具有一般的酯生成活性的多种生物催化剂(水解酶、蜡酯合成酶、醇乙酰转移酶)，但所例示的生物催化剂是否具有甲基丙烯酸酯合成活性尚不明确。
进而，专利文献6公开了在丙烯酰辅酶A和醇的存在下，使水解酶起作用来制造丙烯酸酯的方法。该文献中给出了甲基丙烯酸酯也可以同样制造的启示。但是，若考虑生物催化剂的多样性、底物特异性，则其不过公开了通过一部分水解酶能够制造丙烯酸酯，而结构不同的甲基丙烯酸酯是否能够同样地通过水解酶制造尚不明确。进而，是否能够通过反应机理不同的其它种类的生物催化剂来制造也是完全不明确的。另外，通过专利文献6所述的水解酶合成酯时，可以预想生成的酯直接由于水解活性而被分解，很难认为是有效的制造方法。
另一方面，醇酰基转移酶作为果味(fruity flavor)合成酶而已知。专利文献7鉴定了特定果实中所含的该酶的基因，提出作为果实味道的各种酯的合成方法。但是，关于甲基丙烯酸酯是否能够通过这些酶来合成则没有报道，因此这点并不明确。
如上所述，虽然提出若干方案或者进行了若干研究，但并不存在实际利用酶反应来制造甲基丙烯酸酯的例子，期待建立有效的制造方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2007/110394号小册子
专利文献2:国际公开第2008/145737号小册子
专利文献3:国际公开第2009/135074号小册子
专利文献4:国际公开第2011/031897号小册子
专利文献5:国际公开第2012/135789号小册子
专利文献6:国际公开第2007/039415号小册子
专利文献7:国际公开第00/32789号小册子
专利文献8:日本特开2011－200133号公报
专利文献9:日本特开平5－64589号公报
专利文献10:日本特开平10－337185号
专利文献11:日本特开平10－24867号
非专利文献
非专利文献1:Green Chemistry，2012，14，1942－1948
非专利文献2:Methods in Enzymology，2000，324，73－79
非专利文献3:Botanical Journal of the Linnean Society，2009，161，105－121
非专利文献4:Microbiology，1999，145，2323－2334
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于，提供一种利用生物催化剂的甲基丙烯酸酯的制造方法。另外，本发明的目的在于，提供具有甲基丙烯酸酯合成活性的新的醇酰基转移酶。
用于解决课题的手段
本发明人发现，来自特定植物的醇酰基转移酶具有甲基丙烯酸酯的合成活性，直至完成了本发明。进而，成功地由植物体的悬浊液获得新的醇酰基转移酶，直至完成了本发明。即，本发明如下所述。
[1]一种甲基丙烯酸酯的制造方法，其含有如下工序：在来自以下植物的醇酰基转移酶存在下，使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A而合成甲基丙烯酸酯，所述植物为选自由属于唇形目(Lamiales)的植物、属于葡萄目(Vitales)的植物、属于无患子目(Sapindales)的植物、属于锦葵目(Malvales)的植物、属于木兰目(Magnoliales)的植物及属于菊目(Asterales)的植物组成的组中的植物。
[2]一种甲基丙烯酸酯的制造方法，其含有如下工序：在来自以下植物的醇酰基转移酶存在下，使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A而合成甲基丙烯酸酯，所述植物为选自由属于木犀科(Oleaceae)的植物、属于葡萄科(Vitaceae)的植物、属于芸香科(Rutaceae)的植物、属于锦葵科(Malvaceae)的植物、属于木兰科(Magnoliaceae)的植物及属于菊科(Asteraceae)的植物组成的组中的植物。
[3]一种甲基丙烯酸酯的制造方法，其含有如下工序：在来自以下植物的醇酰基转移酶存在下，使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A而合成甲基丙烯酸酯，所述植物为选自由属于木犀属(Osmanthus)的植物、属于葡萄属(Vitis)的植物、属于柑橘属(Citrus)的植物、属于榴莲属(Durio)的植物、属于木兰属(Magnolia)的植物及属于果香菊属(Chamaemelum)的植物组成的组中的植物。
[4]根据[1]～[3]的甲基丙烯酸酯的制造方法，其中，植物为从木犀(Osmanthusfragrans)、葡萄(Vitis vinifera)、葡萄柚(Citrus x paradisi)、榴莲(Duriozibethinus)、含笑(Michelia figo)及罗马洋甘菊(Chamaemelum nobile)中选择的植物。
[5]一种甲基丙烯酸酯的制造方法，其含有如下工序：在具有以下的(1)～(3)的理化学性质的醇酰基转移酶存在下，使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A而合成甲基丙烯酸酯。
(1)在醇或酚类的存在下，作用于甲基丙烯酰辅酶A而生成甲基丙烯酸酯。
(2)对甲基丙烯酰辅酶A的活性高于对乙酰辅酶A的活性。
(3)对甲基丙烯酰辅酶A的Km值为0.5mM以下。
[6]一种醇酰基转移酶或该酶的组合物，所述醇酰基转移酶具有以下的(1)～(5)的理化学性质。
(1)在醇或酚类的存在下，作用于甲基丙烯酰辅酶A而生成甲基丙烯酸酯。
(2)对甲基丙烯酰辅酶A的活性高于对乙酰辅酶A的活性。
(3)对异丁酰辅酶A的活性高于对乙酰辅酶A的活性。
(4)对甲基丙烯酰辅酶A的Km值为0.5mM以下。
(5)以甲基丙烯酰辅酶A及正丁醇为底物时，最适pH为8～9。
[7]根据[6]的醇酰基转移酶或该酶的组合物，其来自属于菊目(Asterales)的植物。
[8]根据[7]的醇酰基转移酶或该酶的组合物，其来自属于菊科(Asteraceae)的植物。
[9]根据[8]的醇酰基转移酶或该酶的组合物，其来自属于果香菊属(Chamaemelum)的植物。
[10]根据[9]的醇酰基转移酶或该酶的组合物，其来自罗马洋甘菊(Chamaemelumnobile)。
[11]一种有机酸酯的制造方法，其使用[6]～[10]中任一项的醇酰基转移酶或该酶的组合物。
[12]一种醇酰基转移酶，其来自选自由属于唇形目(Lamiales)的植物、属于葡萄目(Vitales)的植物、属于无患子目(Sapindales)的植物、属于锦葵目(Malvales)的植物、属于木兰目(Magnoliales)的植物及属于菊目(Asterales)的植物组成的组中的植物，且具有在醇或酚类的存在下作用于甲基丙烯酰辅酶A而生成甲基丙烯酸酯的能力。
[13]根据[12]的醇酰基转移酶，其中，上述植物为属于木犀科(Oleaceae)的植物、属于葡萄科(Vitaceae)的植物、属于芸香科(Rutaceae)的植物、属于锦葵科(Malvaceae)的植物、属于木兰科(Magnoliaceae)的植物及属于菊科(Asteraceae)的植物。
[14]根据[13]的醇酰基转移酶，其中，上述植物为属于木犀属(Osmanthus)的植物、属于葡萄属(Vitis)的植物、属于柑橘属(Citrus)的植物、属于榴莲属(Durio)的植物、属于木兰属(Magnolia)的植物及属于果香菊属(Chamaemelum)的植物。
[15]根据[14]的醇酰基转移酶，其中，上述植物为从木犀(Osmanthus fragrans)、葡萄(Vitis vinifera)、葡萄柚(Citrus x paradisi)、榴莲(Durio zibethinus)、含笑(Michelia figo)及罗马洋甘菊(Chamaemelum nobile)中选择的植物。
[16]根据[15]的醇酰基转移酶，其具有以下的(1)～(6)的理化学性质。
(1)在醇或酚类的存在下，作用于甲基丙烯酰辅酶A而生成甲基丙烯酸酯。
(2)对甲基丙烯酰辅酶A的活性高于对乙酰辅酶A的活性。
(3)对异丁酰辅酶A的活性高于对乙酰辅酶A的活性。
(4)对丙酰辅酶A的活性高于对乙酰辅酶A的活性。
(5)对甲基丙烯酰辅酶A的Km值为0.5mM以下。
(6)以甲基丙烯酰辅酶A及正丁醇为底物时，最适pH为8～9。
[17]根据[16]的醇酰基转移酶，其来自属于菊科(Asteraceae)的植物。
[18]根据[17]的醇酰基转移酶，其来自属于果香菊属(Chamaemelum)的植物。
[19]根据[18]的醇酰基转移酶，其来自罗马洋甘菊(Chamaemelum nobile)。
发明的效果
根据本发明，能够利用生物催化剂进行甲基丙烯酸酯的制造。通过将本发明的制造方法和生物体内代谢组合，还能够实现甲基丙烯酸酯的发酵生产。其结果是，与以往的化学制造工艺相比，能够在极大地降低能量、资源及环境负担的条件下制造甲基丙烯酸酯。另外，通过利用本发明的新的酶，能够更高效地制造甲基丙烯酸酯等有机酸酯。
附图说明
图1为示出利用DEAE－TOYOPEARL柱(第2次)进行的纯化(洗脱曲线)的图表。
图2为示出利用Q琼脂糖柱进行的纯化(洗脱曲线)的图表。
图3为示出利用MonoQ 5/50GL柱进行的纯化(洗脱曲线)的图表。
图4为示出利用Superdex 200 10/300GL柱的纯化(洗脱曲线)的图表。
图5为示出来自罗马洋甘菊的AAT的最适pH的测定结果的图表。
图6为示出来自罗马洋甘菊的AAT的底物浓度和反应速度的关系的图表。(A)表示甲基丙烯酰辅酶A的结果、(B)表示乙酰辅酶A的结果。
具体实施方式
以下参照附图说明用于实施本发明的优选方式。需要说明的是。以下所说明的实施方式是示出本发明的代表性实施方式的一个例子，不可基于此对本发明的范围作狭义解释。
1.利用醇酰基转移酶的甲基丙烯酸酯的制造方法
[甲基丙烯酸酯]
本发明中，甲基丙烯酸酯是指式1所示的化合物。式1中，R表示直链或支链的碳数为1～20的烃基。烃基可以是饱和或不饱和的非环式，也可以是饱和或不饱和的环式。优选直链或支链的碳数为1～10的非取代的烷基、芳烷基或芳基。特别优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、正己基、异己基、2－己基、二甲基丁基、乙基丁基、庚基、辛基、2－乙基己基之类的碳数1～8的烷基、苄基或苯基。
CH2＝C(CH3)COO－R (式1)
“甲基丙烯酸”(IUPAC名：2－甲基－2－丙烯酸)是指具有下述式的化合物，还包括其的任意的盐或离子化的形态。作为甲基丙烯酸的盐，可以列举例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐等。
CH2＝C(CH3)COOH
[甲基丙烯酰辅酶A]
本发明中，甲基丙烯酰辅酶A是指以下结构式所示的化合物。已知的是，在生物体内，甲基丙烯酰辅酶A为缬氨酸的代谢中间体。本发明中使用的甲基丙烯酰辅酶A可以是利用公知的或新的方法制造的甲基丙烯酰辅酶A。作为其合成方法，已知通过有机化学方式合成甲基丙烯酸酐和辅酶A的方法(Methods in Enzymology.324，73－79(2000))或使用酶反应合成的方法。
[化学式1]
在本发明中，这些之中可以优选使用以异丁酰辅酶A为原料、在酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.3)(以下称为ACD)的作用下转变得到的甲基丙烯酰辅酶A或在烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)(以下称为ECH)的作用下由3－羟基异丁酰辅酶A转变得到的甲基丙烯酰辅酶A。进而，本发明中使用的甲基丙烯酰辅酶A还可以使用由2－氧代异戊酸经由异丁酰辅酶A而制造的甲基丙烯酰辅酶A。即，本发明的方法中，通过使用由异丁酰辅酶A或3－羟基异丁酰辅酶A制造的甲基丙烯酰辅酶A，利用酶所引起的连续反应而使收率提高并抑制杂质，并且能够在不经由或不副产对生物体毒性强的甲基丙烯酸的条件下直接合成甲基丙烯酸酯。通过上述方法，能够实现利用环境负担小的生物体内连续反应(代谢发酵)而制造甲基丙烯酸酯。
[醇·酚类]
成为本发明中的甲基丙烯酸酯的制造的原料的醇或酚类为以下的式2所示的化合物。由于醇或酚类的结构与甲基丙烯酸酯是对应的，因此其结构的定义与上述式1的R相同，表示直链或支链的碳数为1～20的烃基。烃基可以为饱和或不饱和的非环式，也可以为饱和或不饱和的环式。优选直链或支链的碳数为1～10的非取代的醇、芳烷基醇或酚类，更优选甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、叔戊醇、正己醇、异己醇、2－己醇、二甲基丁醇、乙基丁醇、庚醇、辛醇、2－乙基己醇之类的碳数1～8的烷基醇、苄基醇或酚。特别优选甲醇、乙醇、正丁醇、异丁醇、正己醇。
R－OH (式2)
[醇酰基转移酶]
本发明的醇酰基转移酶(以下称为AAT)是具有如下催化作用的酶，所述催化作用为将酰基辅酶A的酰基转移给醇或酚类而合成酯。据说AAT参与各种水果中的酯的生成。已知AAT存在于姜目(香蕉)、蔷薇目(草莓、苹果、梨、桃)、葫芦目(甜瓜)、茶目(猕猴桃)、唇形目(橄榄)、茄目(番茄)、无患子目(柠檬、芒果)等植物中。
本发明中使用的AAT为来自选自由属于唇形目(Lamiales)、葡萄目(Vitales)、无患子目(Sapindales)、锦葵目(Malvales)、木兰目(Magnoliales)及菊目(Asterales)各目的植物组成的组中的植物的AAT，只要具有以甲基丙烯酰辅酶A与醇或酚类为原料而制造甲基丙烯酸酯的能力，则没有特别限定，对其种类及起源没有限制。
用于本发明的AAT可以通过以下方法由上述植物容易地获得。根据需要将组织的适当部位切断，从而可获得。在该切断部位添加含有甲基丙烯酰辅酶A和式2所示的醇或酚类的溶液，振荡并使其反应一定时间。通过利用GC(气相色谱)确认反应液中有无甲基丙烯酸酯，能够对合成活性进行确认。具体而言，例如，将叶、花、花蕾、果肉或果皮切断，在其中添加含有0.01～10mM的甲基丙烯酰辅酶A及2～50倍摩尔量的正丁醇的溶液，在30℃振荡1～10小时。反应结束后，用GC确认有无甲基丙烯酸酯，由此可以获得能够用于本发明的AAT。
作为用于本发明的AAT的酶源，为属于选自唇形目(Lamiales)、葡萄目(Vitales)、无患子目(Sapindales)、锦葵目(Malvales)、木兰目(Magnoliales)及菊目(Asterales)组成的组中的任意目的植物。
作为属于唇形目的植物，优选爵床科(Acanthaceae)、紫葳科(Bignoniaceae)、腺毛草科(Byblidaceae)、荷包花科(Calceolariaceae)、四角果科(Carlemanniaceae)、苦苣苔科(Gesneriaceae)、唇形科(Lamiaceae)、母草科(Linderniaceae)、狐藻科(Lentibulariaceae)、角胡麻科(Martyniaceae)、木犀科(Oleaceae)、列当科(Orobanchaceae)、泡桐科(Paulowniaceae)、胡麻科(Pedaliaceae)、透骨草科(Phrymaceae)、车前科(Plantaginaceae)、戴缨木科(Plocospermataceae)、夷地黄科(Schlegeliaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、密穗草科(Stilbaceae)、四粉草科(Tetrachondraceae)、猩猩茶科(Thomandersiaceae)及马鞭草科(Verbenaceae)的植物。
作为属于葡萄目的植物，优选葡萄科(Vitaceae)的植物。
作为属于无患子目的植物，优选漆树科(Anacardiaceae)、熏倒牛科(Biebersteiniaceae)、橄榄科(Burseraceae)、番苦木科(Kirkiaceae)、楝科(Meliaceae)、白刺科(Nitrariaceae)、芸香科(Rutaceae)、无患子科(Sapindaceae)及苦木科(Simaroubaceae)的植物。
作为属于锦葵目的植物，优选红木科(Bixaceae)、半日花科(Cistaceae)、簇花草科(Cytinaceae)、龙脑香科(Dipterocarpaceae)、锦葵科(Malvaceae)、文定果科(Muntingiaceae)、沙莓科(Neuradaceae)、旋花树科(Sarcolaenaceae)、球萼树科(Sphaerosepalaceae)及瑞香科(Thymelaeaceae)的植物。
作为属于木兰目的植物，优选番荔枝科(Annonaceae)、单室木兰科(Degeneriaceae)、帽花木科(Eupomatiaceae)、舌蕊花科(Himantandraceae)、木兰科(Magnoliaceae)及肉豆蔻科(Myristicacea)的植物。
作为属于菊目的植物，优选假海桐科(Alseuosmiaceae)、雪叶科(Argophyllaceae)、菊科(Asteraceae)、头花草科(Calyceraceae)、桔梗科(Campanulaceae)、海桐科(Goodeniaceae)、睡菜科(Menyanthaceae)、五膜草科(Pentaphragmataceae)、石冬青科(Phellinaceae)、卢梭木科(Rousseaceae)及花柱草科(Stylidiaceae)的植物。
其中，更优选属于木犀科、葡萄科、芸香科、锦葵科、木兰科或菊科的植物。
具体而言，作为属于木犀科的植物，优选木犀属(Osmanthus)及橄榄属(Olea)、素馨属(Jasminum)、连翘属(Forsythia)、丁香属(Syringa)、流苏树属(Chionanthus)、白蜡树属(Fraxinus)及女贞属(Ligustrum)的植物；作为属于马鞭草科的植物，优选美女樱属(Glandularia)的植物；作为属于唇形科的植物，优选鼠尾草属(Salvia)的植物。
作为属于葡萄科的植物，优选葡萄属(Vitis)、蛇葡萄属(Ampelopsis)、乌蔹莓属(Cayratia)、白粉藤属(Cissus)、葡萄瓮属(Cyphostemma)、火筒树属(Leea)、地锦属(Parthenocissus)及崖爬藤属(Tetrastigma)的植物。
作为属于芸香科的植物，优选柑橘属(Citrus)、木橘属(Aegle)、花椒属(Zanthoxylum)、九里香属(Murraya)、芸香属(Ruta)、臭常山属(Orixa)、茵芋属(Skimmia)吴茱萸属(Euodia)、黄檗属(Phellodendron)、波罗尼亚属(Boronia)、山油柑属(Acronychia)、黄皮属(Clausena)、考来木属(Correa)、山小桔属(Glycosmis)及蜜茱萸属(Melicope)的植物；作为属于无患子科的植物，优选荔枝属(Litchi)的植物；作为属于漆树科的植物，优选杧果属(Mangifera)的植物。
作为属于锦葵科的植物，优选榴莲属(Durio)、可可属(Theobroma)、苘麻属(Abutilon)、秋葵属(Abelmoschus)、棉属(Gossypium)、孔雀葵属(Pavonia)、木槿属(Hibiscus)、黄花棯属(Sida)及锦葵属(Malva)的植物。
作为属于木兰科的植物，优选木兰属(Magnolia)的植物。
作为属于菊科的植物，优选属于果香菊属(Chamaemelum)、蓍属(Achillea)、紫锥菊属(Echinacea)、母菊属(Matricaria)、菊蒿属(Tanacetum)、蒲公英属(Taraxacum)、蒿属(Artemisia)、蜂斗菜属(Petasites)、蜡菊属(Helichrysum)、檀香艾属(Santolina)、菜蓟属(Cynara)、水飞蓟属(Silybum)、金盏花属(Calendula)、菊苣属(Cichorium)、红花属(Carthamus)及菊属(Chrysanthemum)的植物。
其中，特别优选属于木犀属、葡萄属、柑橘属、榴莲属、木兰属或果香菊属的植物。
进而，具体而言，作为属于木犀属的植物，优选木犀(银木犀、金木犀、淡黄木犀、白木犀)(Osmanthus fragrans)、柊树(Osmanthus heterophyllus)、厚边木犀(Osmanthusmarginatus)、齿叶木犀(Osmanthus×fortunei)及岛屿木犀(Osmanthus insularis)；作为属于橄榄属的植物，优选油橄榄(Olea europaea)；作为属于鼠尾草属的植物，优选一串红(Salvia splendens)、作为属于美女樱属的植物，优选美女樱(Glandularia x hybrida)。
作为属于葡萄属的植物，优选葡萄(Vitis vinifera、Vitis labrusca)、夏葡萄(Vitis aestivalis)、山葡萄(Vitis coignetiae)及桑叶葡萄(Vitis ficifolia)。
作为属于柑橘属的植物，优选柠檬(Citrus limon)、酢橘(Citrus sudachi)、臭橙(Citrus sphaerocarpa)、葡萄柚(Citrus x paradisi)、柚子(Citrus junos)、莱姆(Citrus aurantifolia)、温州蜜柑(Citrusunshiu)及橙(Citrus sinensis)的植物；作为属于木橘属的植物，优选木橘(Aegle marmelos)的植物；作为属于荔枝属的植物，优选荔枝(Litchi chinensis)的植物；作为属于杧果属的植物，优选芒果(Mangifera indica)。
作为属于榴莲属的植物，优选榴莲(Durio zibethinus、Durio testudinarius、Durio kutejensis、Durio oxleyanus、Durio graveolens、Durio dulcis)的植物；作为属于可可属的植物，优选可可(Theobroma cacao)。
作为属于木兰属的植物，优选含笑(Magnolia figo)、台湾含笑(Magnoliacompressa)、黄玉兰(Magnolia champaca)、紫玉兰(Magnolia liliiflora)、日本辛夷(Magnolia kobus)、厚朴(Magnolia obovata及Magnolia laevifolia)。
作为属于果香菊属的植物，优选罗马洋甘菊(Chamaemelum nobile及Chamaemelumfuscatum)。
其中，特别优选木犀、葡萄、葡萄柚、榴莲、含笑或罗马洋甘菊。
需要说明的是，在直接使用植物作为酶源而进行合成反应时，在以碳数为1～2的醇为底物时，特别是使用属于葡萄属或榴莲属的植物是更为优选的(参照后述实施例的“表1”)。
本发明中，植物的分类是按照APG植物分类体系第3版(Botanical Journal ofthe Linnean Society，2009，161，105121)进行的。
本发明中，将AAT供于反应时，只要显示出上述催化剂活性则对其使用形态没有特别限定，也可以直接使用含有AAT的生物组织或其处理物。作为这样的生物组织，可以使用植物体整体、植物器官(例如果实、叶、花瓣、茎、种子等)、植物组织(例如果实表皮、果肉等)。作为生物组织的处理物，可以列举从生物组织中提取的AAT的粗酶液或纯化酶等。
对纯化AAT的方法没有特别限定，优选通过以下方法进行分离。将上述植物的具有AAT活性的组织破碎后，悬浮于Tris－HCl缓冲液、磷酸缓冲液等缓冲液中。对该粗酶液，单独使用酶的纯化中常用的(1)基于沉淀的分级、(2)各种色谱、(3)基于透析、超滤等的低分子物质的除去方法等，或将这些方法适当组合而用。
纯化AAT的具体优选方式如下。将生物组织用液氮等冻结并磨碎后，用5倍量的含有DTT(二硫苏糖醇)及甘油等的Tris－HCl缓冲液提取。然后，将粗酶提取液供于离子交换色谱，将其非吸附部分回收，从而获得酶提取液。对几种调制粗酶提取液的方法进行了研究，结果明确了：根据该方法，能够排除植物中所含的多酚的影响，稳定且高效地获得酶提取液。另外还明确了：利用硫酸铵等进行沉淀的分级方式会诱发酶活性的丧失。
对于获得的酶提取液，通过使用离子交换色谱、凝胶过滤柱等，能够高效地纯化酶蛋白。
基于所纯化的AAT蛋白，通过基因工程手法能够获得基因信息。通过公知方法对该基因信息进行分离或全合成，将其导入常见的宿主载体系统，通过用该载体系统转化的微生物表达候选蛋白，能够用于本发明的甲基丙烯酸酯的制造。
[适合制造甲基丙烯酸酯的AAT的酶学性质]
本发明的AAT在醇或酚类的存在下作用于甲基丙烯酰辅酶A而催化生成甲基丙烯酸酯的反应。AAT优选在以甲基丙烯酰辅酶A为底物时具有高反应性的AAT。具体而言，优选对甲基丙烯酰辅酶A的活性高于对乙酰辅酶A的活性、且对甲基丙烯酰辅酶A的Km值为0.5mM以下的AAT。根据具有这样的性质的AAT，能够选择性良好地生产甲基丙烯酸酯。
(1)底物特异性
作为本发明中优选的AAT，在以对甲基丙烯酰辅酶A的反应性为基准时，至少对乙酰辅酶A的反应性低即可。更具体而言，将以正丁醇为底物时对甲基丙烯酰辅酶A的反应性设为100％时，本发明的优选的AAT优选对乙酰辅酶A的反应性为同等以下，更优选为50％以下，进而优选为40％以下。或将以正己醇为底物时对甲基丙烯酰辅酶A的反应性设为100％时，优选对乙酰辅酶A的反应性为同等以下、更优选为70％以下，进而优选为50％以下。
(2)对甲基丙烯酰辅酶A的亲和性
本发明的AAT优选对甲基丙烯酰辅酶A的亲和性高。对底物的亲和性可以通过米氏常数(Km)来进行评价。对甲基丙烯酰辅酶A的Km为按照后述实施例测定、计算而获得的值。
作为本发明优选的AAT的对甲基丙烯酰辅酶A的Km值，为对乙酰辅酶A的Km值以下即可，优选为0.5mM以下，更优选为0.2mM以下，进而优选为0.1mM以下，特别优选为0.05mM以下。通过亲和性高，即使作为原料的甲基丙烯酰辅酶A的浓度低的情况下，也能够进行上述催化反应，能够更高效地制造甲基丙烯酸酯。
[AAT活性表达用重组微生物]
进而，在将AAT供于反应时，还可以将上述AAT的基因分离并导入例如常见的宿主载体系统，而利用用该载体系统转化的微生物。作为宿主，若为细菌，可以列举大肠杆菌、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Baci11us)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)等，若为酵母，可以列举酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、裂殖酵母属(Shizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)，若为丝状真菌，可以列举曲霉菌属(Aspergillus)等。其中，特别是利用大肠杆菌简便且效率也高，故而优选。
已经公开了若干种这些植物的AAT基因。可以基于该信息制作DNA探针，例如制作用于PCR的引物并进行PCR，从而分离该基因。另外，还可以通过常规方法对AAT基因的碱基序列进行全合成。关于这些基因信息为己知的AAT是否具有甲基丙烯酸酯的合成活性，可以通过上述方法同样地确认。另一方面，对于基因信息尚不明确的AAT，可以纯化AAT，基于其蛋白质通过基因工程手法获得基因信息。
本发明中，作为优选的AAT基因，只要是来自选自由属于唇形目(Lamiales)、葡萄目(Vitales)、无患子目(Sapindales)、锦葵目(Malvales)、木兰目(Magnoliales)及菊目(Asterales)的各目的植物组成的组中的植物、且其翻译产物具有生成甲基丙烯酸酯的能力，则没有特别限定，可以从上述AAT酶源中适当选择。
需要说明的是，在本发明中，AAT基因还含有编码如下蛋白的基因，所述蛋白含有在野生型的氨基酸序列中置换、缺失或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，且具有由甲基丙烯酰辅酶A和醇生成甲基丙烯酸酯的活性。
这里，“数个”是指1～40个、优选1～20个、更优选10个以下。为了在基因中导入变异，可以通过Kunkel法、Gapped duplex法等公知手法，使用利用位点特异性突变诱导法的变异导入用试剂盒、例如QuikChangeTM Site－Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司)、GeneTailorTM Site－Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司)、TaKaRaSite－Directed Mutagenesis System(Mutan－K、Mutan－Super Express Km等：宝生物公司)等。或者，也可以人工合成具有含有变异的序列的整个基因。
本发明中，DNA的碱基序列的确认可以通过利用惯用的方法进行序列确定来进行。例如，还可以基于桑格(Sanger)法使用适当的DNA测序仪对序列进行确认。
另外，本发明中，AAT基因还含有编码如下蛋白的基因，所述蛋白与由野生型的氨基酸序列构成的蛋白显示90％以上、优选95％以上、更优选99.5％以上、进而优选99.9％以上的同源性，且具有由甲基丙烯酰辅酶A和醇生成甲基丙烯酸酯的活性。
进而，本发明中，AAT基因还包括如下基因，所述基因与具有和野生型的碱基序列互补的碱基序列的多聚核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有由甲基丙烯酰辅酶A和醇生成甲基丙烯酸酯的活性的蛋白。作为上述严格条件，可以列举例如：将固定有DNA的尼龙膜在含有6×SSC(1×SSC为在1升水中溶解氯化纳8.76g、柠檬酸钠4.41g而成的溶液)、1％SDS、100μg/ml鱼精DNA、0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯基吡咯烷酮、0.1％Ficoll的溶液中于65℃与探针一起保温20小时而进行杂交的条件，但并非仅限于此。本领域技术人员可以在这样的缓冲液的盐浓度、温度等条件的基础上考虑其它的探针浓度、探针长度、反应时间等各项条件来设定杂交的条件。作为杂交后的洗涤条件，可以列举例如“2×SSC、0.1％SDS、42℃”、“1×SSC、0.1％SDS、37℃”，作为更严格的条件，可以列举例如“1×SSC、0.1％SDS、65℃”、“0.5×SSC、0.1％SDS、50℃”等条件。
关于杂交法的详细步骤，可以参照Molecular Cloning，A Laboratory Manual2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)))、Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons(1987－1997))等。
进而，本发明中，AAT基因还包括如下基因，所述基因由使用BLAST等(例如默认值，即初始设定的参数)计算时与野生型的碱基序列具有80％以上、更优选90％以上、最优选95％以上的同源性的碱基序列构成，且编码具有由甲基丙烯酰辅酶A和醇生成甲基丙烯酸酯的活性的蛋白质。另外，上述AAT基因的密码子可以根据转化中使用的微生物宿主的密码子使用频率进行转变。
这里，序列的“同源性”是指：在为碱基序列时，按照欲比较的2个碱基序列的碱基尽量多地达到一致的方式将两个碱基序列对齐，将一致的碱基数除以全部碱基数而得的值以百分率表示。进行上述对齐时，根据需要，在进行比较的2个序列的一者或两者中适当插入间隔。这样的序列的对齐化可以使用例如BLAST、FASTA、CLUSTALW等公知的程序来进行。在插入间隔时，上述全部碱基数为将1个间隔作为1个碱基计数时的碱基数。这样计数获得的全部碱基数在进行比较的2个序列间不同的情况下，同源性(％)通过用一致的碱基数除以较长的序列的全部碱基数而算出。关于氨基酸序列的同源性也同样。
在甲基丙烯酸酯合成反应中，可以直接使用对上述重组微生物进行培养而获得的培养液，或者使用通过离心分离等收集菌体的操作从该培养液获得的菌体或其处理物等。作为菌体处理物，可以列举用丙酮、甲苯等处理过的菌体、冷冻干燥菌体、菌体破碎物、将菌体破碎而获得的无细胞提取物、从这些之中提取酶而获得的粗酶或纯化酶等。
导入了AAT基因的微生物中，还可以根据需要导入ACD基因、ECH基因、BCKAD(2－氧代异戊酸脱氢酶)基因等，由异丁酰辅酶A、3－羟基异丁酰辅酶A或2－氧代异戊酸等的前体而合成甲基丙烯酸酯。
“前体”是指能够衍生为甲基丙烯酰辅酶A的化合物，表示异丁酰辅酶A或3－羟基异丁酰辅酶A、进而能够衍生为这2种化合物的物质。
能够衍生为2种化合物的物质可列举出例如2－氧代异戊酸、异丁酸、3－羟基异丁酸、乙酸、丙酮酸、乳酸、乙酰乙酸、丁酸、丙酸、苹果酸、富马酸、柠檬酸及琥珀酸等酸，缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸及谷氨酸等氨基酸类，葡萄糖、果糖及木糖等糖类等。
为了由这些前体生成甲基丙烯酸酯，还可以直接利用宿主微生物本来具有的各种代谢系统。还可以根据需要进行基因的导入或敲除。
2.甲基丙烯酸酯的合成工序
甲基丙烯酸酯的制造可以按照以下的方法进行。在溶剂中添加甲基丙烯酰辅酶A及式2表示的醇或酚类，使其溶解或悬浮。然后，使AAT与该溶液或悬浊液接触，在控制温度等条件的同时使甲基丙烯酰辅酶A与醇或酚类反应。通过上述反应，将甲基丙烯酰辅酶A的甲基丙烯酰基转移给式2的醇或酚类而生成甲基丙烯酸酯。
含有甲基丙烯酰辅酶A及式2表示的醇或酚类的溶液，通常用缓冲液等水性介质来调制。这里，为了使反应顺利进行，可以用渗透压调节剂等对摩尔渗透压浓度和/或离子强度进行控制。作为渗透压调节剂，只要是出于调节为相对于细胞内部等的溶液的渗透压为等渗或高渗的目的而添加的水溶性物质即可，例如为盐或糖类，优选为盐。作为盐，优选为金属盐，更优选为碱金属盐，进一步优选为碱金属卤化物，可以列举例如氯化钠、氯化钾。作为糖类，优选为单糖类或寡糖类，更优选为单糖类或二糖类，可以列举例如葡萄糖、蔗糖、甘露醇等。渗透压调节剂优选以1mM以上的浓度进行添加，特别优选调节为与所使用的生物细胞内的溶液相比为等渗或高渗。
另外，出于将生成的甲基丙烯酸酯分离的目的，还可以预先添加有机溶剂，以2相体系进行反应。作为有机溶剂，可以单独使用例如直链状、支链状或环状的、饱和或不饱和的脂肪族烃、饱和或不饱和的芳香族烃等，或将它们的2种以上混合使用。具体而言，可以列举例如烃系溶剂(例如戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯、二甲苯等)、卤化烃系溶剂(例如二氯甲烷、氯仿等)、醚系溶剂(例如乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、叔丁基甲基醚、二甲氧基乙烷等)、酯系溶剂(例如甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸甲酯)等。通过预先添加这些有机溶剂，生成的甲基丙烯酸酯进入有机相，有时反应能够高效进行。
反应液中的甲基丙烯酰辅酶A及式2表示的醇或酚类的摩尔比、浓度是任意的，没有特别限定。另外，AAT的使用量或反应条件可以根据使用的原料适当确定。通常，关于各原料的浓度，为甲基丙烯酰辅酶A时，设定在0.0000001～10质量％的范围，醇或酚类则按照相对于所使用的甲基丙烯酰辅酶A为0.1～1000倍摩尔、优选为0.5～500倍摩尔的浓度进行添加。
此外的反应温度或反应时间等各种条件可以根据所使用的原料、酶的活性等适当确定，没有特别限定，通常5～80℃使其反应1小时～1周即可。优选在10～70℃反应1～120小时，更优选1小时以上，进而优选3小时以上。关于反应液的pH，只要反应高效地进行就没有特别限定，例如为pH4～10的范围，优选5.0～9.0。温度、时间及反应液的pH等优选选择反应可完成的条件。
作为合适条件，在pH5.5～9.0的条件下按照使甲基丙烯酰辅酶A的浓度直接或间接地达到0.000001～1质量％的范围方式来调制，醇或酚类的浓度则按照相对于所使用的甲基丙烯酰辅酶A达到1～500倍摩尔的方式来调整。然后，将温度调制到20～40℃的范围使其反应1小时以上。对于这些原料(底物)，还可以连续地进行供给以使其达到上述范围，通过这种方式能够提高产物的累积浓度。
在减压下或通气条件下实施本反应也是有效的。这是由于在上述条件下，可以连续地将生成的甲基丙烯酸酯分离，其结果是，有时反应能够高效进行。
在使用以异丁酰辅酶A为原料通过ACD的作用转变成的甲基丙烯酰辅酶A或由3－羟基异丁酰辅酶A通过ECH的作用转变成的甲基丙烯酰辅酶A来制造甲基丙烯酸酯时，也优选调整至上述条件的范围而实施。需要说明的是，通过ACD或ECH合成甲基丙烯酰辅酶A的反应可以根据公知的方法来实施(例如，作为ACD的反应条件，可以是Microbiology(1999)，145，2323－2334记载的条件)。进而，通过与其他生物反应组合，能够实现甲基丙烯酸酯在生物体内的连续反应(发酵生产)。
3.甲基丙烯酸酯的回收
培养基中或反应液中生成的甲基丙烯酸酯及其生成量可以使用高效液相色谱及LC－MS等常规方法来检测、测定。另外，挥发到培养容器或反应容器的气相部(顶空部)的甲基丙烯酸酯及其生成量可以使用气相色谱等常规方法检测、测定。
甲基丙烯酸酯从反应液中的分离可以根据需要将过滤、离心分离、真空浓缩、离子交换或吸附色谱、溶剂提取、蒸馏及结晶等公知的操作适当组合而进行。另外，获得的甲基丙烯酸酯可以通过常规方法聚合，毫不逊色地用于以往的用途。
如此获得的甲基丙烯酸酯及其聚合物能够极大地降低对能量、资源及环境的负担，与以石油制品为起始原料的以往的化学制造品相比，作为一种环境负担低的材料具有非常大的社会价值。
4.新的AAT及使用其进行的有机酸酯的制造
以下，对作为本发明的一个方面的新的AAT及使用其进行的有机酸酯的制造进行详细说明。
本发明的AAT是在醇或酚类的存在下作用于酰基辅酶A而催化生成有机酸酯的反应的酶。
本发明中的酶组合物只要含有具有甲基丙烯酸酯的合成活性的AAT即可，没有特别限定，可以列举含有AAT的生物组织或其处理物、由生物组织提取的AAT粗酶液或纯化酶等。进而，可以例示出培养上述基因重组生物而获得的培养液、由该培养液获得的菌体或其处理物、由这些提取酶而获得的粗酶或纯化酶等。
(1)底物特异性
作为本发明的AAT，对作为底物的甲基丙烯酰辅酶A、丙酰辅酶A及异丁酰辅酶A具有高反应性。即，对甲基丙烯酰辅酶A、丙酰辅酶A及异丁酰辅酶A的活性高于对乙酰辅酶A的活性。更具体而言，将以正丁醇为底物时对甲基丙烯酰辅酶A的反应性设为100％时，本发明的AAT对丙酰辅酶A及异丁酰辅酶A的反应性为同等程度，且对乙酰辅酶A的反应性为其以下、更优选为50％以下、进而优选为40％以下。进而，相对于这3种底物(甲基丙烯酰辅酶A、丙酰辅酶A及异丁酰辅酶A)，对丁酰辅酶A及己酰辅酶A的反应性与乙酰辅酶A同样地低，为50％以下。
(2)对甲基丙烯酰辅酶A的亲和性
本发明的AAT对甲基丙烯酰辅酶A的亲和性高。对底物的亲和性可以通过米氏常数(Km)来进行评价。对甲基丙烯酰辅酶A的Km为按照后述实施例测定、计算而获得的值。
作为本发明的AAT的对甲基丙烯酰辅酶A的Km值，为对乙酰辅酶A的Km值以下，优选为0.5mM以下，更优选为0.2mM以下，进而优选为0.1mM以下，特别优选为0.05mM以下。通过亲和性高，即使作为原料的甲基丙烯酰辅酶A的浓度低的情况下，也能够进行上述催化反应，能够更高效地制造甲基丙烯酸酯。
(3)最适反应pH
本发明的AAT在各pH下的反应性可以在pH6～10.5的比较宽的范围内确认到。作为该反应的最适pH，在7～9的范围内。更具体而言，在8～9附近，特别是在使用pH8.5的三(三羟基甲基氨基甲烷)－盐酸缓冲液时显示最高的活性。
(4)来源
本发明的AAT可以从选自上述的属于唇形目的植物、属于葡萄目的植物、属于无患子目的植物、属于锦葵目的植物、属于木兰目的植物及属于菊目的植物组成的组中的植物中分离。优选来自属于菊科的植物。进而优选来自属于果香菊属的植物。特别优选来自罗马洋甘菊。
如上所述，具有优异特性的本发明的AAT作为碳数3～4的饱和或不饱和的有机酸酯的合成酶极为有用。即，根据本发明的AAT，即使原料中存在作为杂质的乙酰辅酶A时，也能够选择性地生成目标有机酸酯。因此，该酶在预期存在杂质或担心存在杂质的用途(利用生物质原料等进行酯的发酵生产等)中具有优异效果。
实施例
以下通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明的范围不受这些实施例的范围限定。
[实施例1：利用木犀进行的甲基丙烯酸丁酯的合成]
将1g切碎的金木犀(Osmanthus fragrans)叶量取到20ml容积的GC顶空用瓶(23×75mm、National Scientific制)中。加入1ml底物溶液(50mM Tris－HCl(pH8.5)、正丁醇40mM、甲基丙烯酰基辅酶A 0.125mM)并密闭，于30℃反应12小时。反应结束后，加入10μl作为内标的10mM 2－己酮后，通过SPME(固相微萃取)法用GC－MS对产物进行分析。SPME中使用Carboxen/PDMS(75um、Fused Silica、西格玛奥德里奇公司制)，在30℃吸附10分钟。
GC―MS分析条件
柱：TC－70(内径0.25mm×60m、0.25μm、GL Sciences公司)
柱温：50℃·5min→7.5℃/min→200℃·10min
载气：氦
流量：1.13ml/min
进样(Inject)：250℃
另外，使用0.1mM甲基丙烯酸丁酯溶液(50mM Tris－HCl、pH8.5)来确认利用金木犀叶进行的甲基丙烯酸酯的水解反应。反应在30℃进行12小时。
甲基丙烯酸酯的量是通过内标法制作标准曲线而算出的。通过相同的容量及容器调制各浓度的标准溶液，加入10μl作为内标的10mM 2－己酮，然后通过SPME法及GC－MS进行分析(n＝3)。产物的确认通过将保留时间及质谱图与标品进行比较而进行。另外，同时进行了空白试验(无底物)，确认没有甲基丙烯酸丁酯生成。将结果示于表1。确认通过金木犀生成0.7μM的甲基丙烯酸丁酯。
[表1]
实施例 植物 产物 生成浓度(μM)
1 金木犀(叶) 甲基丙烯酸丁酯 0.7
2 葡萄(果实) 甲基丙烯酸甲酯 0.8
3 葡萄(果实) 甲基丙烯酸丁酯 9.0
4 葡萄柚(果实) 甲基丙烯酸己酯 0.3
5 榴莲(果实) 甲基丙烯酸乙酯 6.7
6 榴莲(果实) 甲基丙烯酸丁酯 14
7 含笑(叶) 甲基丙烯酸丁酯 4.4
7 含笑(花芽) 甲基丙烯酸丁酯 0.4
8 果香菊(叶) 甲基丙烯酸丁酯 6.7
将金木犀叶的甲基丙烯酸丁酯的分解活性示于表2。确认甲基丙烯酸丁酯显著减少，暗示来自金木犀的AAT的作用下的甲基丙烯酸酯产生速度超过该植物组织中含有的酯分解酶等引起的甲基丙烯酸酯分解速度。
[表2]
实施例 植物 供试酯 残存比例(％)
1 金木犀(叶) 甲基丙烯酸丁酯 1.8
2 葡萄(果实) 甲基丙烯酸甲酯 ＜1
3 葡萄(果实) 甲基丙烯酸丁酯 29
5 榴莲(果实) 甲基丙烯酸乙酯 7.8
6 榴莲(果实) 甲基丙烯酸丁酯 9.4
7 含笑(叶) 甲基丙烯酸丁酯 ＜1
7 含笑(花芽) 甲基丙烯酸丁酯 ＜1
8 果香菊(叶) 甲基丙烯酸丁酯 ＜1
[实施例2：利用葡萄进行的甲基丙烯酸甲酯的合成]
将1g的带着皮一起切碎的葡萄(红提：Vitis vinifera)果实量取到瓶中。加入0.5ml底物溶液(50mM Tris-HCl(pH8.5)、甲醇40mM、甲基丙烯酰基辅酶A10mM)，密闭后，在30℃反应12小时。与实施例1同样实施分析，确认生成0.8μM的甲基丙烯酸甲酯(表1)。
另外，使用0.1mM甲基丙烯酸甲酯溶液(50mM Tris-HCl、pH8.5)确认甲基丙烯酸酯的水解反应。反应在30℃进行3小时。将结果示于表2。
[实施例3：利用葡萄进行的甲基丙烯酸丁酯的合成]
使用正丁醇来代替甲醇，除此以外与实施例2同样实施。其结果是，确认生成9.0μM的甲基丙烯酸丁酯。也与实施例2同样地确认了甲基丙烯酸酯的水解反应。
[实施例4：利用葡萄柚进行的甲基丙烯酸己酯的合成]
将2g摘出的葡萄柚(Citrus x paradisi)果实的果瓤量取到瓶中。加入0.5ml底物溶液(50mM Tris－HCl(pH8.5)、正己醇40mM、甲基丙烯酰基辅酶A10mM)，密闭后，在30℃反应12小时。与实施例1同样实施分析，确认生成0.3μM的甲基丙烯酸己酯。
[实施例5：利用榴莲进行的甲基丙烯酸乙酯的合成]
将1g切碎的榴莲(Durio zibethinus)果实量取到瓶中。加入0.5ml底物溶液(50mMTris－HCl(pH8.5)、乙醇40mM、甲基丙烯酰基辅酶A 0.125mM)，密闭，在30℃反应3小时。与实施例1同样实施分析，确认生成6.7μM的甲基丙烯酸乙酯。
另外，使用0.1mM甲基丙烯酸乙酯溶液(50mM Tris－HCl、pH8.5)确认甲基丙烯酸酯的水解反应。反应在30℃进行3小时。将结果示于表2。
[实施例6：利用榴莲进行的甲基丙烯酸丁酯的合成]
使用正丁醇代替乙醇，除此以外与实施例5同样实施。其结果是，确认生成14μM的甲基丙烯酸丁酯。也与实施例5同样地确认了甲基丙烯酸酯的水解反应。
[实施例7：利用含笑进行的甲基丙烯酸丁酯的合成]
分别将1g及0.5g的切碎的含笑(Magnolia figo)的叶及花芽量取到瓶中。加入1ml底物溶液(50mM Tris－HCl(pH8.5)、正丁醇40mM、甲基丙烯酰基辅酶A 0.125mM)，密闭，在30℃反应12小时。与实施例1同样实施分析，确认分别生成4.4μM及0.4μM的甲基丙烯酸丁酯。
另外，使用0.01mM甲基丙烯酸丁酯溶液(50mM Tris－HCl、pH8.5)确认了甲基丙烯酸酯的水解反应。反应在30℃进行12小时。将结果示于表2。
[实施例8：利用罗马洋甘菊进行的甲基丙烯酸丁酯的合成]
将0.5g切碎的罗马洋甘菊(Chamaemelum nobile)叶量取到瓶中。加入0.5ml底物溶液(50mM Tris－HCl(pH8.5)、正丁醇40mM、甲基丙烯酰基辅酶A 0.125mM)，密闭，在30℃反应12小时。与实施例1同样实施分析，确认生成6.7μM的甲基丙烯酸丁酯。
另外，使用0.1mM甲基丙烯酸丁酯溶液(50mM Tris－HCl、pH8.5)确认甲基丙烯酸酯的水解反应。反应在30℃进行3小时。将结果示于表2。
[实施例9：来自罗马洋甘菊的AAT的纯化]
只要没有特别声明，则酶的纯化在4℃以下的温度进行。各级分的AAT活性的测定是以正丁醇及甲基丙烯酰辅酶A为底物、使用GC进行分析的。
(1)粗酶液的调制
将罗马洋甘菊(Chamaemelum nobile)叶38g在液氮中粉末化。将粉末悬浮于190ml的提取用缓冲液(10％甘油、5mM二硫苏糖醇(DTT)、5％聚乙烯基吡咯烷酮、250mMTris－HCl(pH7.5))，通过4层纱布而过滤。将滤液在15,000g下离心分离15分钟，获得粗酶溶液。
(2)AAT活性测定法
在2ml容积的螺口瓶(National Scientific制自动进样瓶)中调制500μl反应液(50mM Tris－HCl(pH8.0)、40mM正丁醇、0.12mM甲基丙烯酰辅酶A)。加入以下的(3)～(6)各阶段的纯化酶，密闭，在30℃反应1小时。
反应后加入50μl作为内标的10mM 2－己酮，用200μl辛烷进行溶剂提取。将8μl的通过离心分离而得的分离液注入GC，测定通过酶反应而生成的甲基丙烯酸丁酯。甲基丙烯酸酯的量是通过内标法制作标准曲线而算出的。
GC分析条件
柱：DB－WAX(内径0.25mm×60m、0.5μm、安捷伦科技有限公司)
柱温：115℃·5min→40℃/min→200℃·2min
载气：氦
检测：FID
进样(Inject)温度：230℃
检测(Detect)温度：250℃
(3)利用DEAE－TOYOPEARL柱的纯化(2次)
将粗酶溶液供于用含有10％甘油及2mM DTT的250mMTris－HCl(pH8.0)缓冲液平衡后的DEAE－TOYOPEARL柱(20ml)。按照常规回收级分，相对于含有10％甘油及2mM DTT的20mMTris－HCl(pH8.0)缓冲液(以下称为缓冲液B)进行透析。
进而，将透析级分再次供于用缓冲液B平衡后的DEAE－TOYOPEARL柱(10ml)。用缓冲液B充分洗涤后，使缓冲液B的氯化钠的浓度从0M直线上升到0.3M，进行浓度梯度洗脱。需要说明的是，将每5.5ml洗脱液作为一个级分。将洗脱曲线示于图1。将获得的AAT活性级分回收，相对于缓冲液B进行透析。图中，“AAT活性”(白色圆点)是将在1分钟内提供1μmol的酯的酶量设为1U。另外，“蛋白质浓度”(黑色圆点)是使用以牛血清白蛋白作为标准品的Bio－Rad protein assay Kit(Bio－Rad，USA)来测定的。
(4)利用Q琼脂糖柱的纯化
将所获得的透析后的AAT活性级分供于用缓冲液B平衡后的Q琼脂糖柱(10ml)。用缓冲液B充分洗涤后，使缓冲液B的氯化钠的浓度从0M直线上升到0.3M，进行浓度梯度洗脱。需要说明的是，将每5.5ml洗脱液作为一个级分。将洗脱曲线示于图2。将获得的AAT活性级分回收，相对于含有2mM DTT的20mMTris－HCl(pH8.0)缓冲液(以下称为缓冲液C)进行透析。
(5)利用MonoQ 5/50GL柱的纯化
将通过Q琼脂糖柱获得的透析后的AAT活性级分供于用缓冲液C平衡后的MonoQ 5/50GL柱(1mL)。使缓冲液C的氯化钠的浓度从0M直线上升到0.5M，进行浓度梯度洗脱。将洗脱曲线示于图3。将获得的AAT活性级分回收，用Amicon Ultra－0.5mL离心式过滤器进行浓缩。需要说明的是，利用该柱进行的纯化是使用AKTA Explorer 10S(通用医疗集团(GEHealthcare))、在流速0.5ml/分钟的条件下将每5.5ml作为一个级分。
(6)利用Superdex 200 10/300GL柱的纯化
将通过MonoQ 5/50GL柱获得的AAT活性浓缩级分供于用含有0.3M氯化钠的缓冲液C平衡后的Superdex 200 10/300GL柱。利用该柱进行的纯化是使用AKTA Explorer 10S、在流速0.5ml/分钟的条件下将每0.5ml作为一个级分。将洗脱曲线示于图4。将获得的AAT活性级分回收，相对于缓冲液B进行透析。
(7)各纯化阶段总结
将各纯化阶段的酶组合物的收量、活性示于表3。通过总计5次的柱分离，获得活性纯化至209倍、为201mU/mg的AAT。
[表3]
[实施例10：来自罗马洋甘菊的AAT的底物特异性]
使用利用实施例9记载的MonoQ 5/50GL柱获得的纯化级分，评价AAT的底物特异性。
在2ml容积的螺口瓶中，调制反应液(50mM Tris－HCl(pH8.5)、40mM醇、0.12mM酰基辅酶A)，加入纯化级分，使其达到500μl。密闭，在30℃反应1小时。
反应后，加入50μl作为内标的10mM 2－己酮，用200μl辛烷或己烷进行溶剂提取。将8μl的通过离心分离而得的分离液注入GC，测定通过酶反应而生成的酯。酯的量是通过内标法制作标准曲线而算出的。关于利用GC测定的条件，除了使柱温(参照表4)根据每个测定对象酯适当变更以外，与实施例9同样。由于利用该柱时，与正丁醇的峰分离不充分，因此丙酸正丁酯的定量按照实施例1记载的GC―MS分析条件(其中，温度条件变更为80℃1分钟→10℃/分钟→200℃5分钟)通过绝对标准曲线法而实施。
[表4]
将结果示于表5。将甲基丙烯酸丁酯的比活性设为100％，以相对活性值来表示。
[表5]
＊N.D.＝检测不到、N.T.＝未实施
[实施例11：来自罗马洋甘菊的AAT的最适pH]
使用利用实施例9记载的MonoQ 5/50GL柱获得的纯化级分，评价最适pH。
使用乙酸缓冲液、PIPES(哌嗪－1,4－双(2－乙磺酸))缓冲液、Tris(三羟甲基氨基甲烷)－盐酸缓冲液或甘氨酸－氢氧化钠缓冲液，调制组成为40mM正丁醇及0.12mM甲基丙烯酰辅酶A的反应液。任一缓冲液中，缓冲液浓度均设为50mM。在各反应液中加入纯化级分500μl，密闭，在30℃反应1小时。
反应后，通过与实施例9同样的GC分析，测定通过酶反应而生成的甲基丙烯酸丁酯。将结果示于图5。图中，圆形记号表示乙酸缓冲液的结果、四角形记号表示PIPES缓冲液的结果、三角型记号表示三(三羟基甲基氨基甲烷)－盐酸缓冲液的结果、菱形记号表示甘氨酸－氢氧化钠缓冲液的结果。最适pH为8～9。
[实施例12：来自罗马洋甘菊的AAT的Km]
使用利用实施例9记载的MonoQ 5/50GL柱获得的纯化级分，测定对甲基丙烯酰辅酶A及乙酰辅酶A的Km值。在50mM Tris－HCl(pH8.5)缓冲液中加入纯化级分、40mM正己醇及各浓度的甲基丙烯酰辅酶A或乙酰辅酶A，调制500μl的反应液，密闭，在30℃反应2小时。
反应后，通过与实施例10同样的GC分析，测定通过酶反应而生成的酯。将结果示于图6。将速率常数(Km)代入Michaelis－Menten式，使用HULINKS公司制的KaleidaGraph软件进行计算。其结果是，计算出对甲基丙烯酰辅酶A的Km值为0.041mM、对乙酰辅酶A的Km值为0.711mM。

Claims (4)

1.一种甲基丙烯酸酯的制造方法，其含有如下工序：在来自以下植物的醇酰基转移酶存在下，使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A而合成甲基丙烯酸酯，所述植物是选自由属于木犀属(Osmanthus)的植物、属于葡萄属(Vitis)的植物、属于柑橘属(Citrus)的植物、属于榴莲属(Durio)的植物、属于木兰属(Magnolia)的植物及属于果香菊属(Chamaemelum)的植物组成的组中的植物。
2.一种甲基丙烯酸酯的制造方法，其含有如下工序：在来自下述植物的醇酰基转移酶存在下，使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A而合成甲基丙烯酸酯，所述植物是选自金木犀、葡萄、葡萄柚、榴莲、含笑及罗马洋甘菊组成的组中的植物。
3.一种来自属于果香菊属(Chamaemelum)的植物的醇酰基转移酶或该酶的组合物，具有以下的(1)～(5)的理化学性质，
(1)在醇或酚类的存在下，作用于甲基丙烯酰辅酶A而生成甲基丙烯酸酯，
(2)对甲基丙烯酰辅酶A的活性高于对乙酰辅酶A的活性，
(3)对异丁酰辅酶A的活性高于对乙酰辅酶A的活性，
(4)对甲基丙烯酰辅酶A的Km值为0.05mM以下，
(5)以甲基丙烯酰辅酶A及正丁醇为底物时，最适pH为8～9。
4.一种有机酸酯的制造方法，其使用权利要求3所述的醇酰基转移酶或该酶的组合物。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201619827D0 (en) 2016-11-23 2017-01-04 Lucite Int Uk Ltd Process for the production of methyl methacrylate
EP3760725A4 (en) 2018-03-02 2021-05-05 Mitsubishi Chemical Corporation PROCESS FOR THE MANUFACTURE OF 3-HYDROXYISOBUTYRIC ACID ESTER AND METHACRYLIC ACID ESTER

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000032789A1 (en) * 1998-12-02 2000-06-08 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro-Dlo) Fruit flavour related genes and use thereof
WO2005090586A1 (en) * 2004-03-19 2005-09-29 Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited Biocatalytic manufacturing of (meth)acrylylcholine or 2-(n,n-dimethylamino)ethyl (meth)acrylate
WO2007039415A1 (en) * 2005-09-19 2007-04-12 Ciba Specialty Chemicals Holding Inc. Biocatalytic manufacturing of (meth)acrylic esters
WO2012135789A2 (en) * 2011-04-01 2012-10-04 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing methacrylic acid and methacrylate esters and methods related thereto
CN104619851A (zh) * 2012-09-10 2015-05-13 三菱丽阳株式会社 甲基丙烯酸酯的制造方法
CN104769123A (zh) * 2012-09-10 2015-07-08 三菱丽阳株式会社 甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3142349B2 (ja) 1991-03-04 2001-03-07 輝彦 別府 複合プラスミドベクターおよび形質転換微生物
JP3355939B2 (ja) 1996-07-10 2002-12-09 三菱自動車工業株式会社 車両用エンジンのアンダーカバー
JPH10248578A (ja) 1997-03-05 1998-09-22 Nitto Chem Ind Co Ltd ロドコッカス属細菌用発現ベクター
JPH10337185A (ja) 1997-06-06 1998-12-22 Mitsubishi Rayon Co Ltd アスパルターゼ活性を有する新規なタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子ｄｎａ
DE102006017760A1 (de) 2006-03-24 2007-09-27 Ufz-Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle Gmbh Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren
CA2688292C (en) 2007-06-01 2015-01-27 Evonik Roehm Gmbh A process for preparing methacrylic acid or methacrylic esters
BRPI0911759A2 (pt) 2008-05-01 2019-09-24 Genomatica Inc microorganismo para a produção de ácido metacrílico
MX2012003025A (es) 2009-09-09 2012-06-27 Genomatica Inc Microorganismos y metodos para la co-produccion de isopropanol con alcoholes, dioles y acidos primarios.
JP2011200133A (ja) 2010-03-24 2011-10-13 Mitsubishi Rayon Co Ltd 遺伝的に改変された微生物の製造方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000032789A1 (en) * 1998-12-02 2000-06-08 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro-Dlo) Fruit flavour related genes and use thereof
WO2005090586A1 (en) * 2004-03-19 2005-09-29 Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited Biocatalytic manufacturing of (meth)acrylylcholine or 2-(n,n-dimethylamino)ethyl (meth)acrylate
WO2007039415A1 (en) * 2005-09-19 2007-04-12 Ciba Specialty Chemicals Holding Inc. Biocatalytic manufacturing of (meth)acrylic esters
WO2012135789A2 (en) * 2011-04-01 2012-10-04 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing methacrylic acid and methacrylate esters and methods related thereto
CN104619851A (zh) * 2012-09-10 2015-05-13 三菱丽阳株式会社 甲基丙烯酸酯的制造方法
CN104769123A (zh) * 2012-09-10 2015-07-08 三菱丽阳株式会社 甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法

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