CN109844127A - 突变型酶的制造方法及突变型醇酰基转移酶 - Google Patents

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Abstract

作为用于使目标蛋白在转化体中以活性的可溶性重组蛋白形式表达的高效的方法，提供一种酶的制造方法，所述酶与基准体相比每种重组体的活性得到提高，该方法包含以下的工序：(1)制作表达突变体的重组体的工序，所述突变体具有在基准体的氨基酸序列中1个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列；(2)选择与基准体的活性100％相比显示50％以上的每种重组体的活性的多个突变体的工序；和(3)表达以下突变体的工序，所述突变体为在工序(2)所选择的各个突变体所具有的氨基酸残基被置换的部位中的2个以上部位中、各自对应的氨基酸残基被置换的突变体。

Description

突变型酶的制造方法及突变型醇酰基转移酶
技术领域
本发明涉及突变型酶的制造方法及突变型醇酰基转移酶。更详细而言，涉及用于得到作为高活性的可溶性重组蛋白的醇酰基转移酶等酶的方法等。
背景技术
蛋白质在细胞内完成翻译后折叠成固有的立体结构，从而具有功能。在使用转化体(重组体)表达异种蛋白质时，存在在宿主细胞内不进行蛋白质的正常折叠而形成包涵体的情况。已知包涵体中的蛋白质为丧失了本来活性的无活性型蛋白质，某些情况下是不溶的。一般认为，在与蛋白质的来源种属的细胞内环境(温度、转录速度、翻译速度等)不同的宿主细胞内环境下不能进行该蛋白质的正常折叠是形成包涵体的主要原因。
为了解决该问题进行了以下尝试：在蛋白质中导入突变，从而在重组体中实现与野生型蛋白质同样的正常折叠，获得表达为活性型的突变蛋白。例如，关于来自植物的羟基腈裂解酶，报道了通过导入突变可获得可溶性大幅提高的酶(非专利文献1)。
对与本发明相关的醇酰基转移酶(AAT)进行说明。专利文献1～3中提出了使用醇酰基转移酶(AAT)由利用生物质生成的异丁酰辅酶A、甲基丙烯酰辅酶A来制造异丁酸酯、甲基丙烯酸酯的方法。
羧酸酯类被用作各种工业用化学品、香料、药品等的原料。例如，异丁酸酯主要作为香料用酯类、药品、过氧化物等的原料，是重要的酯化合物。甲基丙烯酸酯主要作为丙烯酸类树脂的原料使用，作为涂料、粘接剂、树脂改性剂等领域的共聚单体也有较多的需求。
近年来，从防止全球变暖及环境保护的观点出发，使用生物质代替以往的化石原料作为碳源来制造各种化学制品的技术受到关注。对于异丁酸酯、甲基丙烯酸酯，也期待由生物质来制造。
作为使用AAT由生物质合成异丁酸酯、甲基丙烯酸酯等酯的方法，考虑了使用微生物重组体的发酵生产，其中，所述微生物重组体导入了由生物质合成异丁酰基辅酶A、甲基丙烯酰辅酶A等辅酶A化合物的基因组以及催化由辅酶A化合物向酯的反应的AAT基因。
但是在重组体中表达AAT时，会有上述的形成包涵体的问题。已知在以大肠杆菌为宿主表达来自植物的AAT时，大部分会表达为无活性的不溶性蛋白质(非专利文献2)。
非专利文献3、4报道了：在使大肠杆菌重组体表达来自苹果的AAT的情况下，仅在使用特定的品系(C43(DE3))时得到可溶性蛋白质，在一般的品系(BL21(DE3)诱导株)的情况下得不到可溶性蛋白质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2015-116141号公报
专利文献2：国际公开2014/038214号
专利文献3：国际公开2014/038216号
非专利文献
非专利文献1：Protein Eng.Des.Sel.(2011)24：607-616.
非专利文献2：Metabolic Engineering(2015)27：20-28.
非专利文献3：FEBS J.(2005)272：3132-3144.
非专利文献4：Phytochemistry(2006)67：658-667.
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，提出了为了抑制包涵体形成而在蛋白质中导入突变、从而在转化体(重组体)中实现与野生型蛋白质同样的正常折叠的方法。但是，在该方法中，如何高效地探索能实现正常折叠的突变成为课题。
因此，本发明的主要目的在于，提供用于使目标蛋白在重组体中以活性的可溶性重组蛋白形式表达的高效的方法。
用于解决课题的技术方案
为了解决上述课题，本发明提供以下的〔1〕～〔25〕。
〔1〕一种酶的制造方法，所述酶与基准体相比，每种重组体的活性得到提高，该方法包含表达突变体的工序，所述突变体具有在基准体的氨基酸序列中2个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列。
〔2〕根据〔1〕的酶的制造方法，其包含以下的工序：
(1)制作表达突变体的重组体的工序，所述突变体具有在基准体的氨基酸序列中1个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列；
(2)选择与基准体的活性100％相比显示50％以上的每种重组体的活性的多个突变体的工序；和
(3)表达以下突变体的工序，所述突变体为在工序(2)所选择的各个突变体所具有的氨基酸残基被置换的部位中的2个以上部位中、各自对应的氨基酸残基被置换的突变体。
〔3〕根据〔1〕或〔2〕的酶的制造方法，其中，上述酶为醇酰基转移酶。
〔4〕根据〔3〕的酶的制造方法，其中，上述基准体的氨基酸序列为序列号1、2、3、64、65及66中的任一者所示的氨基酸序列。
〔5〕根据〔1〕～〔4〕中的任一项的酶的制造方法，其中，上述其它氨基酸残基为丙氨酸或精氨酸。
〔6〕一种突变型醇酰基转移酶，其为与基准体相比活性得到提高的突变型醇酰基转移酶，其具有在基准体的氨基酸序列中1个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列。
〔7〕根据〔6〕的突变型醇酰基转移酶，其包含与序列号1或2所示的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第48位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第150位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第167位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第270位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第274位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(6)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第447位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
〔8〕根据〔6〕的突变型醇酰基转移酶，其包含与序列号64或66所示的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第206位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第209位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第256位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第269位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第322位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
〔9〕根据〔6〕的突变型醇酰基转移酶，其包含与序列号65所示的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第115位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第167位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第179位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第325位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第356位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
〔10〕根据〔6〕～〔9〕中的任一项的突变型醇酰基转移酶，其中，上述其它氨基酸残基为丙氨酸或精氨酸。
〔11〕根据〔7〕～〔10〕中的任一项的突变型醇酰基转移酶，其来自植物。
〔12〕根据〔6〕的突变型醇酰基转移酶，其中，在序列号1或2所示的氨基酸序列中具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)第48位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)第150位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)第167位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)第270位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)第274位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(6)第447位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
〔13〕根据〔6〕的突变型醇酰基转移酶，其中，在序列号64或66所示的氨基酸序列中，具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)第206位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)第209位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)第256位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)第269位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)第322位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
〔14〕根据〔6〕的突变型醇酰基转移酶，其中，在序列号65所示的氨基酸序列中，具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)第115位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)第167位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)第179位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)第325位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)第356位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
〔15〕根据〔12〕～〔14〕中的任一项所述的突变型醇酰基转移酶，其中，上述其它氨基酸残基为丙氨酸或精氨酸。
〔16〕根据〔12〕的突变型醇酰基转移酶，其包含序列号4或7所述的氨基酸序列。
〔17〕根据〔7〕或〔12〕所述的突变型醇酰基转移酶，其还具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)第64位的丙氨酸向缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸的置换；
(2)第117位的赖氨酸向谷氨酰胺的置换；
(3)第248位的缬氨酸向丙氨酸的置换；
(4)第363位的谷氨酰胺向赖氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸的置换。
〔18〕根据〔17〕的突变型醇酰基转移酶，其包含序列号5、6、8～11、13中的任一者所记载的氨基酸序列。
〔19〕一种突变型醇酰基转移酶，其包含与序列号1或2所示的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第64位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸的置换；
(2)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第117位的赖氨酸相当的氨基酸向谷氨酰胺的置换；
(3)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第248位的缬氨酸相当的氨基酸向丙氨酸的置换；
(4)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第363位的谷氨酰胺相当的氨基酸向赖氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸的置换。
〔20〕根据〔19〕中的任一项的突变型醇酰基转移酶，其来自植物。
〔21〕一种突变型醇酰基转移酶，其在序列号1或2所示的氨基酸序列中具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)第64位的丙氨酸向缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸的置换；
(2)第117位的赖氨酸向谷氨酰胺的置换；
(3)第248位的缬氨酸向丙氨酸的置换；
(4)第363位的谷氨酰胺向赖氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸的置换。
〔22〕根据〔21〕的突变型醇酰基转移酶，其包含序列号3、5、6、8～11、13中的任一者所记载的氨基酸序列。
〔23〕一种载体，其表达〔6〕～〔20〕中的任一项的醇酰基转移酶。
〔24〕一种转化体，其导入有〔23〕的载体。
另外，本发明在另一方面中还提供以下的[1]～[24]。
[1]一种制造与基准体相比每种重组体的活性得到提高的酶的方法，其包含以下的工序。
(1)制作表达突变体的重组体的工序，所述突变体具有在基准体的氨基酸序列中1个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列。
(2)选择与基准体相比显示50％以上的每种重组体的活性的突变体的工序。
(3)表达以下突变体的工序，所述突变体为在工序(2)所选择的各个突变体所具有的导入了氨基酸置换的部位中的2个以上部位中、导入了各自对应的氨基酸置换的突变体。
[2]根据[1]的制造方法，其中，上述酶为醇酰基转移酶。
[3]根据[2]的制造方法，其中，上述基准体的氨基酸序列为序列号1、序列号2或序列号3所示的氨基酸序列。
[4]根据[1]～[3]中的任一项的制造方法，其中，上述其它氨基酸残基为丙氨酸或精氨酸。
[5]一种与基准体相比每种重组体的活性得到提高的酶的制造方法，其包含表达突变体的工序，所述突变体具有在基准体的氨基酸序列中1个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列。
[6]根据[5]的制造方法，其中，上述酶为醇酰基转移酶。
[7]根据[6]的制造方法，其中，上述基准体的氨基酸序列为序列号1、序列号2或序列号3所示的氨基酸序列。
[8]根据[5]～[7]中的任一项的制造方法，其中，上述其它氨基酸残基为丙氨酸或精氨酸。
[9]一种突变型醇酰基转移酶，其包含与序列号1所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换。
(1)在与序列号1所示的氨基酸序列的比对中，与第48位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(2)在与序列号1所示的氨基酸序列的比对中，与第150位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(3)在与序列号1所示的氨基酸序列的比对中，与第167位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(4)在与序列号1所示的氨基酸序列的比对中，与第270位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(5)在与序列号1所示的氨基酸序列的比对中，与第274位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(6)在与序列号1所示的氨基酸序列的比对中，与第447位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
[10]根据[9]的突变型醇酰基转移酶，其中，上述其它氨基酸残基为丙氨酸或精氨酸。
[11]一种突变型醇酰基转移酶，其在序列号1所示的氨基酸序列中、具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换。
(1)第48位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(2)第150位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(3)第167位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(4)第270位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(5)第274位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(6)第447位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
[12]根据[11]的突变型醇酰基转移酶，其中，上述其它氨基酸残基为丙氨酸或精氨酸。
[13]根据[11]的突变型醇酰基转移酶，其包含序列号4或7所述的氨基酸序列。
[14]根据[11]的突变型醇酰基转移酶，其还具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换。
(1)第64位的丙氨酸向缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸的置换。
(2)第117位的赖氨酸向谷氨酰胺的置换。
(3)第248位的缬氨酸向丙氨酸的置换。
(4)第363位的谷氨酰胺向赖氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸的置换。
[15]根据[14]的突变型醇酰基转移酶，其包含序列号5、6、8～11、13中的任一者所记载的氨基酸序列。
[16]一种突变型醇酰基转移酶，其包含与序列号1所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换。
(1)在与序列号1所示的氨基酸序列的比对中，与第64位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸的置换。
(2)在与序列号1所示的氨基酸序列的比对中，与第248位的缬氨酸相当的氨基酸向丙氨酸的置换。
(3)在与序列号1所示的氨基酸序列的比对中，与第363位的谷氨酰胺相当的氨基酸向赖氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸的置换。
(4)在与序列号1所示的氨基酸序列的比对中，与第117位的赖氨酸相当的氨基酸向谷氨酰胺的置换。
[17]一种突变型醇酰基转移酶，其在序列号1所示的氨基酸序列中、具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换。
(1)第64位的丙氨酸向缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸的置换。
(2)第117位的赖氨酸向谷氨酰胺的置换。
(3)第248位的缬氨酸向丙氨酸的置换。
(4)第363位的谷氨酰胺向赖氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸的置换。
[18]根据[17]的突变型醇酰基转移酶，其包含序列号3、5、6、8～11、13中的任一者所记载的氨基酸序列。
[19]一种载体，其表达[9]～[18]的醇酰基转移酶。
[20]一种转化体，其导入有[19]的载体。
[21]一种制造与基准体相比每种重组体的活性得到提高的来自植物的酶的方法，其包含以下工序：
(1)制作表达突变体的非植物细胞重组体的工序，所述突变体具有在基准体的氨基酸序列中1或2个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列；
(2)测定上述突变体的每种重组体的酶活性的工序；
(3)选择与基准体相比显示50％以上的每种重组体的活性的突变体的工序；和
(4)在上述非植物细胞中表达以下突变体的工序，所述突变体为在工序(3)所选择的各个突变体所具有的导入了氨基酸置换的部位中的2个以上部位中、导入了各自对应的氨基酸置换的突变体。
[22]根据[21]的制造方法，其中，上述酶为来自苹果的醇酰基转移酶。
[23]根据[21]或[22]的制造方法，其中，上述非植物细胞为大肠杆菌细胞。
[24]根据[21]～[23]中的任一项的制造方法，其中，上述其它氨基酸残基为丙氨酸或精氨酸。
在本发明的突变型酶的制造方法中，“基准体”是指成为以下置换的导入对象的酶，所述置换为1个以上的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。利用本发明的制造方法得到的突变型酶的氨基酸序列仅在1个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基这一点上与基准体的氨基酸序列不同。基准体不限于天然型(野生型)的酶，也可以是在野生型的酶的氨基酸序列中导入有一个以上的氨基酸置换的突变型的酶。另外，基准体还可以是具有具有以下氨基酸序列的突变型酶：在野生型酶的氨基酸序列中插入或添加有一个以上的氨基酸的氨基酸序列、或从野生型酶的氨基酸序列中缺失了一个以上的氨基酸的氨基酸序列。通过以这些突变型的酶为基准体、进而导入1或2个以上的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换，由此可以得到提高了活性的突变型酶。
发明的效果
根据本发明，可提供用于使目标蛋白在重组体中以活性的可溶性重组蛋白形式表达的高效的方法。
附图说明
图1是示出来自序列号1(苹果)、序列号12(苹果)、序列号61(梨)、序列号62(枇杷)及序列号63(柿子)的AAT的氨基酸序列的比对的图。
图2是示出来自序列号66(番茄(野生种))、序列号67(番茄(栽培种))、序列号68(马铃薯)、序列号69(辣椒)及序列号70(烟草)的AAT的氨基酸序列的比对的图。
图3是示出来自序列号65(草莓)、序列号71(智利草莓)、序列号72(野草莓)及序列号73(玫瑰)的AAT的氨基酸序列的比对的图。
图4是示出对重组体测定AAT活性的结果的图表，所述重组体表达将苹果AAT的15个半胱氨酸一个一个地置换为丙氨酸而制作的15种突变体。纵轴中，将表达不具有半胱氨酸置换的基准体(pAAT116)的重组体的活性设为1，以与其的相对值来示出单位菌体重量的AAT活性。
图5：图上段是示出对重组体测定单位菌体重量的AAT活性的结果的图表，所述重组体表达以下突变体：在苹果野生型AAT中导入了4重突变的突变体(pAAT021)、在苹果野生型AAT中导入了半胱氨酸6置换的突变体(pAAT024)、在苹果野生型AAT中导入了4重突变和半胱氨酸6置换的突变体(pAAT025)、在苹果野生型AAT中导入了4重突变和Cys150Arg的突变体(pAAT155)、在苹果野生型AAT中导入了4重突变和半胱氨酸6置换(其中，150位为Cys150Arg)的突变体(pAAT154)。纵轴中，将表达不具有4重突变及半胱氨酸置换的基准体(pAAT116)的重组体的活性设为1，以与其的相对值来示出AAT活性。图下段为含有突变体的细胞提取液的可溶性级分和不溶性级分的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图像。
图6：图上段是示出对重组体测定单位菌体重量的AAT活性的结果的图表，所述重组体表达以下突变体：在苹果野生型AAT中导入了4重突变的突变体(pAAT021)、在苹果野生型AAT中导入了4重突变和半胱氨酸6置换的突变体(pAAT025)、在苹果野生型AAT中导入了4重突变和半胱氨酸5置换的突变体(pAAT151)、在苹果野生型AAT中导入了4重突变和半胱氨酸4置换的突变体(pATM017、pATM018、pATM019、pATM021)。纵轴中，将表达不具有4重突变及半胱氨酸置换的基准体(pAAT116)的重组体的活性设为1，以与其的相对值来示出AAT活性。图下段为含有突变体的细胞提取液的可溶性级分和不溶性级分的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图像。
图7：图上段是示出对重组体测定单位菌体重量的AAT活性的结果的图表，所述重组体为表达将番茄AAT的8个半胱氨酸一个一个地置换为丙氨酸而制作的8种突变体的重组体、以及表达在番茄野生型AAT中导入了半胱氨酸5置换的突变体(pAAT164)的重组体。纵轴中，将表达基准体(pAAT032)的重组体的活性设为1，以与其的相对值来示出AAT活性。图下段为含有突变体的细胞提取液的可溶性级分和不溶性级分的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图像。
图8：图上段是示出对重组体测定单位菌体重量的AAT活性的结果的图表，所述重组体是表达将草莓AAT的9个半胱氨酸一个一个地置换为丙氨酸而制作的9种突变体的重组体、以及表达在草莓野生型AAT中导入有半胱氨酸5置换的突变体(pAAT037)的重组体。纵轴中，将表达基准体(pAAT033)的重组体的活性设为1，以与其的相对值来示出AAT活性。图下段为含有突变体的细胞提取液的可溶性级分和不溶性级分的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图像。
具体实施方式
以下对用于实施本发明的优选方式进行说明。需要说明的是，以下说明的实施方式表示的是本发明的代表性实施方式的一例，并非由此对本发明的范围作限定性解释。
1.突变型酶的制造方法
本发明涉及一种与基准体相比每种重组体的活性得到提高的酶的制造方法，其包含表达突变体的工序，所述突变体具有在基准体的氨基酸序列中2个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列。
具体而言，本发明的突变型酶的制造方法的特征在于，包含以下的工序(1)～(3)。
(1)制作表达突变体的重组体的工序，所述突变体具有在基准体的氨基酸序列中1个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列。
(2)选择与基准体的活性100％相比显示50％以上的每种重组体的活性的多个突变体的工序。
(3)表达以下突变体的工序，所述突变体为在工序(2)所选择的各个突变体所具有的氨基酸残基被置换的部位中的2个以上部位中、各自对应的氨基酸残基被置换的突变体。
[酶]
就本发明的突变型酶的制造方法而言，作为对象的酶优选为在种属不同于该酶的来源种属的宿主中表达基准体时、会在转化体(重组体)中形成包涵体的酶。就本发明的突变型酶的制造方法而言，作为对象的酶例如可以为来自植物的、当在大肠杆菌等非植物细胞中表达基准体时会在重组体细胞中制成包涵体的酶。
作为酶的例子，没有特别限定，可列举：醇酰基转移酶(AAT)等转移酶类；脱氢酶、氧化酶、加氧酶等氧化还原酶类；酯酶、腈水解酶、酰胺酶等水解酶类；消旋酶、差向异构酶、变位酶等异构酶类；酰基辅酶A合成酶、DNA连接酶等连接酶类；腈水合酶、羟基腈裂解酶、解氨酶(ammonialyase)等裂解酶类等。
作为酶的来源，可列举动物、植物、丝状菌、酵母、古细菌、真细菌，只要具有上述的特征则没有特别限定。
作为本发明的AAT的来源，可列举例如属于选自由以下的目组成的组中的任意目的植物：姜目(Zingiberales)、蔷薇目(Rosales)、杜鹃花目(Ericales)、葫芦目(Cucurbitales)、十字花目(Brassicales)、樟目(Laurales)、禾本目(Poales)、棕榈目(Arecales)、天门冬目(Asparagales)、虎耳草目(Saxifragales)、石竹目(Caryophyllales)、葡萄目(Vitales)、金虎尾目(Malpighiales)、酢浆草目(Oxalidales)、豆目(Fabales)、无患子目(Sapindales)、锦葵目(Malvales)、桃金娘目(Myrtales)、毛茛目(Ranunculales)、茄目(Solanales)、唇形目(Lamiales)、龙胆目(Gentianales)及菊目(Asterales)。这些中，优选姜目(Zingiberales)、蔷薇目(Rosales)、杜鹃花目(Ericales)、葫芦目(Cucurbitales)、十字花目(Brassicales)及樟目(Laurales)。
作为属于姜目的植物，优选芭蕉科(Musaceae)以及姜科(Zingiberaceae)的植物；作为属于蔷薇目的植物，优选蔷薇科(Rosaceae)以及桑科(Moraceae)的植物；作为属于杜鹃花目的植物，优选杜鹃花科(Ericaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、柿树科(Ebenaceae)以及山茶科(Theaceae)的植物；作为属于葫芦目的植物，优选葫芦科(Cucurbitaceae)的植物；作为属于十字花目的植物，优选番木瓜科(Caricaceae)以及十字花科(Brassicaceae)的植物；作为属于樟目的植物，优选樟科(Lauraceae)的植物；作为属于禾本目的植物，优选凤梨科(Bromeliaceae)以及禾本科(Poaceae)的植物；作为属于棕榈目的植物，优选槟榔科(Arecaceae)的植物；作为属于天门冬目的植物，优选兰科(Orchidaceae)以及鸢尾科(Iridaceae)的植物；作为属于虎耳草目的植物，优选茶藨子科(Grossulariaceae)的植物；作为属于石竹目的植物，优选石竹科(Caryophyllaceae)的植物；作为属于葡萄目的植物，优选葡萄科(Vitaceae)的植物；作为属于金虎尾目的植物，优选金虎尾科(Malpighiaceae)、西番莲科(Passifloraceae)、大戟科(Euphorbiaceae)以及杨柳科(Salicaceae)的植物；作为属于酢浆草目的植物，优选酢浆草科(Oxalidaceae)的植物；作为属于豆目的植物，优选豆科(Fabaceae)的植物；作为属于无患子目的植物，优选芸香科(Rutaceae)、无患子科(Sapindaceae)以及漆树科(Anacardiaceae)的植物；作为属于锦葵目的植物，优选锦葵科(Malvaceae)的植物；作为属于桃金娘目的植物，优选千屈菜科(Lythraceae)、柳叶菜科(Onagraceae)以及桃金娘科(Myrtaceae)的植物；作为属于毛茛目的植物，优选毛茛科(Ranunculaceae)以及罂粟科(Papaveraceae)的植物；作为属于茄目的植物，优选茄科(Solanaceae)的植物；作为属于唇形目的植物，优选木犀科(Oleaceae)、马鞭草科(Verbenaceae)以及唇形科(Lamiaceae)的植物；作为属于龙胆目的植物，优选夹竹桃科(Apocynaceae)的植物；作为属于菊目(Asterales)的植物，优选菊科(Asteraceae)的植物。也可以利用上述植物的近缘种。在它们之中，进一步优选属于芭蕉科(Musaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、番木瓜科(Caricaceae)以及樟科(Lauraceae)的植物。
具体而言，作为属于芭蕉科的植物，优选芭蕉(Musa)属的植物；作为属于姜科(Zingiberaceae)的植物，优选姜属(Zingiber)的植物；作为属于蔷薇科的植物，优选草莓(Fragaria)属、苹果(Malus)属、李(Prunus)属、梨(Pyrus)属、枇杷(Eriobotrya)属、木瓜(Chaenomeles)属、悬钩子(Rubus)属以及蔷薇(Rosa)属的植物；作为属于桑科(Moraceae)的植物，优选无花果(Ficus)属的植物；作为属于杜鹃花科的植物，优选越桔(Vaccinium)属的植物；作为属于猕猴桃科的植物，优选猕猴桃(Actinidia)属的植物；作为属于柿树科的植物，优选柿树(Diospyros)属的植物；作为属于山茶科的植物，优选山茶(Camellia)属的植物；作为属于葫芦科的植物，优选黄瓜(Cucumis)属以及西瓜(Citrullus)属的植物；作为属于番木瓜科的植物，优选番木瓜(Carica)属以及美洲番木瓜(Vasconcellea)属的植物；作为属于十字花科的植物，优选拟南芥(Arabidopsis)属的植物；作为属于樟科的植物，优选鳄梨(Persea)属的植物；作为属于凤梨科的植物，优选凤梨属(Ananas)的植物；作为属于禾本科的植物，优选稻(Oryza)属、小麦(Triticum)属、大麦(Hordeum)属、玉蜀黍(Zea)属、高粱(Sorghum)属以及短柄草(Brachypodium)属的植物；作为属于棕榈科的植物，优选椰子(Cocos)属的植物；作为属于兰科的植物，优选万代兰(Vanda)属的植物；作为属于鸢尾科的植物，优选鸢尾(Iris)属的植物；作为属于茶藨子科的植物，优选醋栗(Ribes)属的植物；作为属于石竹科的植物，优选石头花属(Gypsophila)的植物；作为属于葡萄科的植物，优选葡萄(Vitis)属的植物；作为属于金虎尾科的植物，优选金虎尾(Malpighia)属的植物；作为属于西番莲科的植物，优选西番莲(Passiflora)属的植物；作为属于大戟科的植物，优选蓖麻(Ricinus)属的植物；作为属于杨柳科的植物，优选杨属(Populus)的植物；作为属于酢浆草科的植物，优选杨桃(Averrhoa)属的植物；作为属于豆科的植物，优选苜蓿(Medicago)属、羽扇豆(Lupinus)属、大豆(Glycine)属以及蝶豆(Clitoria)属的植物；作为属于芸香科的植物，优选柑橘(Citrus)属以及木橘(Aegle)属的植物；作为属于无患子科的植物，优选荔枝(Litchi)属的植物；作为属于漆树科的植物，优选芒果(Mangifera)属的植物；作为属于锦葵科的植物，优选榴莲(Durio)属以及可可(Theobroma)属的植物；作为属于千屈菜科的植物，优选石榴(Punica)属的植物；作为属于柳叶菜科的植物，优选克拉花(Clarkia)属的植物；作为属于桃金娘科的植物，优选番石榴(Psidium)属的植物；作为属于毛茛科的植物，优选类叶升麻(Actaea)属的植物；作为属于罂粟科的植物，优选罂粟(Papaver)属的植物；作为属于茄科的植物，优选茄(Solanum)属、辣椒(Capsicum)属、烟草(Nicotiana)属以及碧冬茄(Petunia)属的植物；作为属于木犀科的植物，优选木犀榄属(Olea)属的植物；作为属于马鞭草科的植物，优选马鞭草(Glandularia)属的植物；作为属于唇形科的植物，优选鼠尾草(Salvia)属的植物；作为属于夹竹桃科的植物，优选萝芙木(Rauvolfia)属以及长春花(Catharanthus)属的植物；作为属于菊科的植物，优选果香菊(Chamaemelum)属的植物。其中，更优选属于芭蕉属、草莓属、苹果属、李属、梨属、越桔属、猕猴桃属、黄瓜属、番木瓜属或鳄梨属的植物。
进而，其中特别优选属于芭蕉属、苹果属、梨属、枇杷属、柿树属、猕猴桃属、黄瓜属、番木瓜属或鳄梨属的植物。
进而，具体而言，作为属于芭蕉属的植物，特别优选香蕉(Musa x paradisiaca)、芭蕉(Musa basjoo)、红蕉(Musa coccinea)以及小果野蕉(Musa acuminata)；作为属于姜属的植物，特别优选姜(Zingiber officinale)；作为属于草莓属的植物，特别优选草莓(Fragaria x ananassa)(以下有时也简单记载“草莓”。)、弗州草莓(Fragariavirginiana)、智利草莓(Fragaria chiloensis)以及野草莓(Fragaria vesca)；作为属于苹果属的植物，特别优选苹果(Malus pumila、Malus domestica、Malus baccata)、垂丝海棠(Malus halliana)、多花海棠(Malus floribunda)以及海棠果(Malus prunifolia)；作为属于李属的植物，特别优选梅子(Prunus mume)、欧洲甜樱桃(Prunus avium)、桃(Prunuspersica)、杏(Prunus armeniaca)、扁桃(Prunus dulcis)、李(Prunus salicina)以及欧洲李(Prunus domestica)；作为属于梨属的植物，特别优选西洋梨(Pyrus communis)、梨(Pyrus pyrifolia)、豆梨(Pyrus calleryana)、野生西洋梨(Pyrus pyraster)以及白梨(Pyrus x bretschneideri)；作为属于枇杷属的植物，特别优选枇杷(Eriobotryajaponica)；作为属于木瓜属的植物，特别优选木瓜(Chaenomeles sinensis)；作为属于悬钩子属的植物，特别优选覆盆子(Rubus idaeus)以及黑莓(Rubus fruticosus)；作为属于蔷薇属的植物，特别优选玫瑰(Rosa rugosa)；作为属于无花果属的植物，特别优选无花果(Ficus carica)；作为属于越桔属的植物，特别优选蓝莓(Vaccinium corymbosum、Vaccinium angustifolium)、欧洲越橘(Vaccinium myrtillus)、越橘(Vaccinium vitis-idaea)以及红莓苔子(Vaccinium oxycoccos)；作为属于猕猴桃属的植物，特别优选猕猴桃(Actinidia chinensis、Actinidia deliciosa)、软枣猕猴桃(Actinidia arguta)、山梨猕猴桃(Actinidia rufa)以及葛枣猕猴桃(Actinidia polygama)；作为属于柿树属的植物，特别优选柿(Diospyros kaki)；作为属于山茶属的植物，特别优选茶树(Camelliasinensis)；作为属于黄瓜属的植物，特别优选黄瓜(Cucumis sativus)、甜瓜(Cucumismelo)、西印度瓜(Cucumis anguria)以及刺角瓜(Cucumis metulifer)；作为属于西瓜属的植物，特别优选西瓜(Citrullus lanatus)；作为属于番木瓜属的植物，特别优选番木瓜(Carica papaya)；作为属于美洲番木瓜属的植物，特别优选山地番木瓜(Vasconcelleacundinamarcensis)；作为属于拟南芥属的植物，特别优选拟南芥(Arabidopsis thaliana)以及琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)；作为属于鳄梨属的植物，特别优选鳄梨(Perseaamericana)；作为属于凤梨属的植物，特别优选菠萝(Ananas comosus)；作为属于禾本属的植物，特别优选水稻(Oryza sativa)；作为属于小麦属的植物，特别优选小麦(Triticumaestivum)；作为属于大麦属的植物，特别优选大麦(Hordeum vulgare)；作为属于玉蜀黍属的植物，特别优选玉蜀黍(Zea mays)；作为属于高粱属的植物，特别优选高粱(Sorghumbicolor)；作为属于短柄草属的植物，特别优选二穗短柄草(Brachypodium distachyon)；作为属于椰子属的植物，特别优选椰子(Cocos nucifera)；作为属于万代兰属的植物，特别优选万代兰(Vanda hybrid cultivar)；作为属于鸢尾属的植物，特别优选荷兰鸢尾(Irisx hollandica)；作为属于醋栗属的植物，特别优选黑加仑(黑醋栗)(Ribesnigrum)；作为属于石头花属的植物，特别优选石头花(Gypsophila paniculata、Gypsophila elegans)；作为属于葡萄属的植物，特别优选葡萄(Vitis vinifera、Vitis labrusca)；作为属于金虎尾属的植物，特别优选西印度樱桃(Malpighia glabra)；作为属于西番莲属的植物，特别优选西番莲(Passiflora edulis)；作为属于蓖麻属的植物，特别优选蓖麻(Ricinuscommunis)；作为属于杨属的植物，特别优选欧洲大叶杨(Populus trichocarpa)；作为属于杨桃属的植物，特别优选杨桃(Averrhoa carambola)；作为属于苜蓿属的植物，特别优选蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)；作为属于羽扇豆属的植物，特别优选羽扇豆(白羽扇豆)(Lupinus albus)；作为属于大豆属的植物，特别优选大豆(Glycine max)；作为属于蝶豆属的植物，特别优选蝶豆(Clitoria ternatea)；作为属于芸香属的植物，特别优选柠檬(Citrus limon)、酢橘(Citrus sudachi)、臭橙(Citrussphaerocarpa)、葡萄柚(Citrus xparadisi)、日本柚子(Citrus junos)、来檬(Citrus aurantifolia)、温州蜜柑(Citrusunshiu)以及橙子(Citrus sinensis)；作为属于木橘属的植物，特别优选木橘(Aeglemarmelos)；作为属于荔枝属的植物，特别优选荔枝(Litchi chinensis)；作为属于芒果属的植物，特别优选芒果(Mangifera indica)；作为属于榴莲属的植物，特别优选榴莲(Durio zibethinus)；作为属于可可属的植物，特别优选可可(Theobroma cacao)；作为属于石榴属的植物，特别优选石榴(Punica granatum)；作为属于克拉花属的植物，特别优选仙女扇(fairy fans)(Clarkia breweri)以及红丝带(Red ribbons)(Clarkia concinna)；作为属于番石榴属的植物，特别优选番石榴(Psidium guajava)；作为属于类叶升麻属的植物，特别优选黑升麻(Actaea racemosa)；作为属于罂粟属的植物，特别优选罂粟(Papaversomniferum)、东方罂粟(Papaver orientale)以及大红罂粟(Papaver bracteatum)；作为属于茄属的植物，特别优选番茄(Solanum Pennellii、Solanum lycopersicum)以及马铃薯(Solanum tuberosum)；作为属于辣椒属的植物，特别优选辣椒(Capsicum annuum)以及黄灯笼辣椒(Capsicum chinense)；作为属于烟草属的植物，特别优选烟草(Nicotianatabacum、Nicotiana attenuata)；作为属于碧冬茄属的植物，特别优选矮牵牛(Petunia xhybrida)；作为属于木犀榄属的植物，特别优选油橄榄(Olea europaea)；作为属于马鞭草属的植物，特别优选美女樱(Glandularia x hybrida)；作为属于鼠尾草属的植物，特别优选一串红(Salvia splendens)；作为属于萝芙木属的植物，特别优选印度萝芙木(Rauvolfia serpentina)；作为属于长春花属的植物，特别优选长春花(Catharanthusroseus)；作为属于果香菊属的植物，特别优选罗马甘菊(Chamaemelum nobile)。
就本发明的突变型酶的制造方法而言，作为对象的酶特别可列举来自苹果、番茄、草莓、梨、枇杷、柿子、甜瓜、香蕉、番木瓜、克拉花(サンジソウ)、葡萄、猕猴桃及果香菊等植物的AAT，其中优选来自苹果、番茄、草莓、梨、枇杷及柿子的AAT。
关于苹果AAT，将在本发明的突变型酶的制造方法中可成为“基准体”的酶的氨基酸序列的例子示于序列号1～3。序列号1示出野生型AAT的氨基酸序列。野生型苹果AAT在氨基酸序列中具有15个半胱氨酸。序列号2为野生型AAT的氨基酸序列中的第2位的甲硫氨酸被置换为赖氨酸的突变型AAT(M2K型AAT)的氨基酸序列。序列号3为野生型AAT的氨基酸序列中的第64位的丙氨酸被置换为缬氨酸、第248位的缬氨酸被置换为丙氨酸、第363位的谷氨酰胺被置换为赖氨酸、第117位的赖氨酸被置换为谷氨酰胺的突变型AAT的氨基酸序列(该突变型AAT与野生型AAT相比为高活性)。
关于番茄AAT，将在本发明的突变型酶的制造方法中可成为“基准体”的酶的氨基酸序列的例子示于序列号64、66。序列号66示出番茄(野生种)野生型AAT的氨基酸序列。序列号64为野生型AAT的氨基酸序列中的第2位的丙氨酸被置换为赖氨酸的突变型AAT(A2K型AAT)的氨基酸序列。
关于草莓AAT，将在本发明的突变型酶的制造方法中可成为“基准体”的酶的氨基酸序列的例子示于序列号65。序列号65为野生型AAT的氨基酸序列。
[工序(1)]
本工序为制作表达突变体的重组体的工序，所述突变体具有在基准体的氨基酸序列中1个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列。
在本工序中制作多个表达突变体的重组体，所述突变体具有在基准体的氨基酸序列中1或2个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列。例如，当基准体的氨基酸序列中存在N个半胱氨酸时，可以制作N种将各半胱氨酸置换为半胱氨酸以外的氨基酸的突变体。另外，例如当基准体的氨基酸序列中存在N个半胱氨酸时，可以制作N(N-1)/2种将任意两个半胱氨酸置换为半胱氨酸以外的氨基酸的突变体。
1个突变体中所置换的半胱氨酸的个数可以为1或2个以上，最多为小于存在于基准体的氨基酸序列中的半胱氨酸的总数。1个突变体中所置换的半胱氨酸的个数优选为1。在所制作的多个突变体之间，所置换的半胱氨酸的个数可以相同也可以不同。置换半胱氨酸的氨基酸只要为半胱氨酸以外的氨基酸即可，没有特别限定，例如可以设为丙氨酸或精氨酸。
编码突变体的氨基酸序列的DNA可以通过利用以往公知的基因工程学方法向编码基准体的氨基酸序列的DNA中导入突变来制作。所制作的编码突变体的氨基酸序列的DNA被重组到以往通用的表达载体中。
突变体的表达可以通过将表达载体用以往公知的方法导入到宿主细胞中来进行。
宿主细胞没有特别限定，作为细菌，可列举大肠杆菌、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)等，作为酵母，可列举酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、裂殖酵母属(Shizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)，作为丝状菌，可列举曲霉菌属(Aspergillus)等。这些中，特别是使用大肠杆菌简便、效率也高，因此优选。
根据需要，可以测定工序(1)中制作的突变体各自的每种重组体的酶活性。
突变体的每种重组体的酶活性的测定可以如下进行：由导入了含有编码突变体的氨基酸序列的DNA的表达载体的一定量的重组体，制备含有突变体的细胞提取液或细胞破碎液，测定细胞提取液等中的酶活性。可以通过将酶反应的底物与细胞提取液等混合并用色谱等公知的手段检测反应产物的生成量，由此来测定酶活性。
[工序(2)]
本工序为选择与基准体的活性100％相比显示50％以上的每种重组体的活性的多个突变体的工序。这里，“突变体的每种重组体的活性与基准体的活性100％相比为50％以上”是指：被由一定量的重组体表达的突变体催化的反应产物的量起因于该突变体的高的活性和可溶性，并且在同一条件下达到由相同量的重组体表达的基准体催化而得的反应产物的量的50％以上。
例如，在工序(1)中，当基准体的氨基酸序列中存在10个半胱氨酸而将各半胱氨酸置换为半胱氨酸以外的氨基酸、从而制作10种突变体时，在与基准体的活性100％相比显示50％以上的每种重组体的活性的突变体存在5种的情况下。则选择这5种突变体。
可以认为：存在于基准体的氨基酸序列中的半胱氨酸中的、当在突变体中被置换为其它氨基酸时也维持一定的酶活性的半胱氨酸，其对基准体的正常的蛋白质折叠的贡献较小，反而可能在使来源种属不同的宿主细胞表达基准体时形成过多的二硫键而妨碍正常的蛋白质折叠。
就突变体的选择基准而言，与基准体的活性100％相比显示50％以上的每种重组体的活性为大致的指标，也可以选择与基准体的活性100％相比显示更高的活性、例如60％以上、优选为70％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上、最优选为100％以上的每种重组体的活性的基准体。
[工序(3)]
本工序为表达以下突变体的工序，所述突变体为在工序(2)所选择的各个突变体所具有的氨基酸残基被置换的部位中的2个以上部位中、各自对应的氨基酸残基被置换的突变体的工序。
例如，在上述的、基准体的氨基酸序列中存在10个半胱氨酸的例子中，存在与基准体的活性100％相比显示50％以上的每种重组体的活性的5种突变体，因此表达具有这5种突变体各自所具有的突变部位(共5处)中的2处以上的突变部位(2处以上的半胱氨酸置换为其它氨基酸)的突变体。优选表达具有3处以上的突变部位的突变体，更优选表达具有4处以上的突变部位的突变体，进一步优选表达具有全部突变部位的突变体。
如上所述，存在于基准体的氨基酸序列中的半胱氨酸中的、当在突变体被置换为其它氨基酸时也维持一定的酶活性的半胱氨酸，其在使来源种属不同的宿主细胞中表达基准体时可能妨碍正常的蛋白质折叠。可以认为：将这些半胱氨酸全部置换为其它氨基酸的突变体在来源种属不同的宿主细胞中表达时也进行正常的或接近正常的折叠，由此与在该宿主细胞中表达的基准体相比为高活性、高可溶性。
在本工序的突变体中置换半胱氨酸的氨基酸优选与工序(2)中所选择的突变体中的置换半胱氨酸的氨基酸相同，但也可以不同。有时通过对置换半胱氨酸的氨基酸的种类进行各种变更，可以使重组体的活性进一步提高。
编码本工序的突变体的氨基酸序列的DNA，也可以通过利用以往公知的基因工程学的方法向编码基准体的氨基酸序列的DNA中导入突变来制作。所制作的编码突变体的DNA与工序(1)同样地被重组到以往通用的表达载体中并转染宿主细胞、进行表达。
2.突变型醇酰基转移酶I
本发明还提供用上述的突变型酶的制造方法得到的突变型AAT。
本发明的突变型AAT为一种突变型醇酰基转移酶，其为与基准体相比活性得到提高的突变型醇酰基转移酶，其具有在基准体的氨基酸序列中1个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的突变型AAT的特征在于，在基准体的氨基酸序列中具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换。基准体可以是野生型苹果AAT(序列号1)、野生型苹果AAT的氨基酸序列中的第2位的甲硫氨酸被置换为赖氨酸的突变型AAT(序列号2、苹果M2K型)或野生型苹果AAT的氨基酸序列中的第64位的丙氨酸被置换为缬氨酸、第248位的缬氨酸被置换为丙氨酸、第363位的谷氨酰胺被置换为赖氨酸、第117位的赖氨酸被置换为谷氨酰胺的突变型AAT(序列号3)。
(1)第48位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(2)第150位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(3)第167位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(4)第270位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(5)第274位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(6)第447位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
在本发明的突变型AAT中，优选将第48位、第150位、第167位、第270位、第274位及第447位的各半胱氨酸中的2个以上进行组合并置换，更优选将3个以上进行组合并置换，进一步优选将4个以上进行组合并置换，特别优选将5个以上进行组合并置换，最优选将全部进行组合并置换。置换半胱氨酸的氨基酸为半胱氨酸以外的氨基酸即可，没有特别限定，可以设为例如丙氨酸或精氨酸。特别是通过将第150位的半胱氨酸置换为精氨酸，由此能够进一步提高突变型AAT的活性。
作为本发明的突变型AAT，具体可列举以苹果M2K型AAT(序列号2)为基准体而制作的包含序列号4或7所记载的氨基酸序列的突变型AAT。具有序列号4的氨基酸序列的突变型AAT为将苹果M2K型AAT(序列号2)的第48位、第150位、第167位、第270位、第274位及第447位的半胱氨酸全部置换为丙氨酸的AAT。另外，具有序列号7的氨基酸序列的突变型AAT为将第48位、第167位、第270位、第274位及第447位的半胱氨酸置换为丙氨酸且将第150位的半胱氨酸置换为精氨酸的AAT。
作为本发明的突变型AAT的其它具体例子，还可列举以突变型AAT(序列号3)为基准体而制作的包含序列号5、6、8～11、13中的任一者所记载的氨基酸序列的突变型AAT。将序列号5、6、8～11、13的氨基酸序列中的突变及半胱氨酸置换的导入位置示于[表1]。
[表1]
在上述表中，第64位的丙氨酸也可以设为异亮氨酸或苏氨酸。另外，第363位的谷氨酰胺也可以设为脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸。这些情况下，也能得到高活性的突变型AAT。
另外，本发明的突变型AAT的特征在于，在基准体的氨基酸序列中具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换。基准体可以是番茄(野生种)野生型AAT(序列号66)、番茄(野生种)野生型AAT的氨基酸序列中的第2位的丙氨酸被置换为赖氨酸的突变型AAT(序列号64、番茄(野生种)A2K型)。
(1)第206位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)第209位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)第256位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)第269位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)第322位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
在本发明的突变型AAT中，优选将206位、第209位、第256位、第269位及第322位的各半胱氨酸中的2个以上进行组合并置换，更优选将3个以上进行组合并置换，进一步优选将4个以上进行组合并置换，最优选将全部进行组合并置换。置换半胱氨酸的氨基酸为半胱氨酸以外的氨基酸即可，没有特别限定，可以设为例如丙氨酸或精氨酸。
进而，本发明的突变型AAT的特征在于，在基准体的氨基酸序列中具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换。基准体可以是包含序列号65所示的氨基酸序列的野生型草莓AAT。
(1)第115位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)第167位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)第179位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)第325位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)第356位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
在本发明的突变型AAT中，优选将第115位、第167位、第179位、第325位及第356位的各半胱氨酸中的2个以上进行组合并置换，更优选将3个以上进行组合并置换，进一步优选将4个以上进行组合并置换，最优选将全部进行组合并置换。置换半胱氨酸的氨基酸为半胱氨酸以外的氨基酸即可，没有特别限定，可以设为例如丙氨酸或精氨酸。
根据本发明，还提供一种突变型AAT，其包含与序列号1的苹果野生型AAT或序列号2的苹果M2K型AAT的氨基酸序列具有70％以上、优选为80以上、更优选为90％以上、特别优选为95％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换。
(1)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第48位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(2)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第150位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(3)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第167位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(4)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第270位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(5)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第274位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
(6)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第447位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
在本发明的突变型AAT中，优选将第48位、第150位、第167位、第270位、第274位及第447位的各半胱氨酸中的2个以上进行组合并置换，更优选将3个以上进行组合并置换，进一步优选将4个以上进行组合并置换，特别优选将5个以上进行组合并置换，最优选将全部进行组合并置换。置换半胱氨酸的氨基酸为半胱氨酸以外的氨基酸即可，没有特别限定，可以设为例如丙氨酸或精氨酸。特别是通过将第150位的半胱氨酸置换为精氨酸，因此能够进一步提高突变型AAT的活性。
另外，根据本发明，还提供一种突变型AAT，其包含与序列号66的番茄(野生种)AAT或序列号64的番茄(野生种)A2K型AAT的氨基酸序列具有70％以上、优选为80以上、更优选为90％以上、特别优选为95％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换。
(1)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第206位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第209位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第256位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第269位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第322位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
在本发明的突变型AAT中，可以优选将第206位、第209位、第256位、第269位及第322位的各半胱氨酸中的2个以上进行组合并置换，更优选将3个以上进行组合并置换，进一步优选将4个以上进行组合并置换，最优选将全部进行组合并置换。置换半胱氨酸的氨基酸为半胱氨酸以外的氨基酸即可，没有特别限定，可以设为例如丙氨酸或精氨酸。
而且，根据本发明还提供一种突变型AAT，其包含与序列号65的草莓野生型AAT的氨基酸序列具有70％以上、优选为80以上、更优选为90％以上、特别优选为95％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换。
(1)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第115位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第167位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第179位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第325位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第356位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
在本发明的突变型AAT中，可以优选将第115位、第167位、第179位、第325位及第356位的各半胱氨酸中的2个以上进行组合并置换，更优选将3个以上进行组合并置换，进一步优选将4个以上进行组合并置换，最优选将全部进行组合并置换。置换半胱氨酸的氨基酸为半胱氨酸以外的氨基酸即可，没有特别限定，可以设为例如丙氨酸或精氨酸。
关于成为导入半胱氨酸置换的对象的AAT的氨基酸序列，为了能够与序列号1的苹果野生型AAT或序列号2的苹果M2K型AAT的氨基酸序列、序列号66的番茄(野生种)野生型AAT或序列号64的番茄(野生种)A2K型AAT的氨基酸序列、或序列号65的草莓野生型AAT的氨基酸序列进行比对，优选包含与序列号1、2、64、65或66的氨基酸序列具有50％以上、60％以上、70％以上、优选为80以上、更优选为90％以上、特别优选为95％以上的序列同源性的氨基酸序列。比对通过将两序列排列为使欲比较的2个序列的氨基酸残基尽可能多地一致的方式来进行。排列时，根据需要在进行比较的2个序列的一者或两者中适当地插入间隙。这种序列的排列例如可以使用BLAST、FASTA、CLUSTALW等熟知的程序来进行。
另外，成为导入半胱氨酸置换的对象的AAT的氨基酸序列与序列号1、2、64、65、66的氨基酸序列的序列同源性如下得到：进行比对，将一致的氨基酸数除以总氨基酸数而得到。在插入间隙的情况下，上述总氨基酸数为将一个间隙记作一个氨基酸残基而得的残基数。当如上计数得到的总氨基酸数在进行比较的2个序列间不同时，将一致的氨基酸数除以较长的序列的总氨基酸数来算出同源性(％)。
可以认为：包含与序列号1的苹果野生型AAT或序列号2的苹果M2K型AAT的氨基酸序列具有高序列同源性的氨基酸序列的AAT，其很可能保有在序列号1的苹果野生型AAT或序列号2的苹果M2K型AAT的氨基酸序列中可观察到的第48位、第150位、第167位、第270位、第274位及第447位的半胱氨酸，通过将这些半胱氨酸置换为其它氨基酸，则能够在各种AAT(优选为来自植物的各种AAT)中得到高活性的突变体。
例如，作为与序列号1的苹果野生型AAT显示88％的序列同源性的AAT，有来自苹果属的不同亚种的包含序列号12所示的氨基酸序列的苹果AAT。在序列号1的苹果野生型AAT的氨基酸序列中可观察到的半胱氨酸中的第48位、第150位、第167位、第270位、第274位及第447位的半胱氨酸在序列号12所示的氨基酸序列中均保守。
另外，作为与序列号1的苹果野生型AAT显示91％的序列同源性的AAT，有包含序列号61所示的氨基酸序列的梨AAT。在序列号1的苹果野生型AAT的氨基酸序列中可观察到的半胱氨酸中的第48位、第150位、第167位、第270位及第274位的半胱氨酸在序列号61所示的氨基酸序列中均保守。
另外，作为与序列号1的苹果野生型AAT显示91％的序列同源性的AAT，有包含序列号62所示的氨基酸序列的枇杷AAT。在序列号1的苹果野生型AAT的氨基酸序列中可观察到的半胱氨酸中的第48位、第150位、第167位、第270位、第274位及第447位的半胱氨酸的半胱氨酸在序列号62所示的氨基酸序列中均保守。
而且，作为与序列号1的苹果野生型AAT显示90％的序列同源性的AAT，有包含序列号63所示的氨基酸序列的柿子AAT。在序列号1的苹果野生型AAT的氨基酸序列中可观察到的半胱氨酸中的第150位、第167位、第270位、第274位及第447位的半胱氨酸的半胱氨酸在序列号63所示的氨基酸序列中均保守。
将序列号1、12、61～63的氨基酸序列的比对示于图1。
另外，可以认为：包含与序列号66的番茄(野生种)野生型AAT或序列号64的番茄(野生种)A2K型AAT的氨基酸序列具有高的序列同源性的氨基酸序列的AAT，其很可能保有在番茄(野生种)野生型AAT或番茄(野生种)A2K型AAT的氨基酸序列中可观察到的第206位、第209位、第256位、第269位及第322位的半胱氨酸，通过将这些半胱氨酸置换为其它氨基酸，则能够在各种AAT(优选为来自植物的各种AAT)中得到高活性的突变体。
例如，作为与序列号66的番茄(野生种)野生型AAT显示93％的序列同源性的AAT，有来自番茄(栽培种)的包含序列号67所示的氨基酸序列的番茄AAT。在番茄(野生种)野生型AAT的氨基酸序列中可观察到的半胱氨酸中的第209位、第256位、第269位及第322位的半胱氨酸在序列号67所示的氨基酸序列中均保守。
另外，作为与序列号66的番茄(野生种)野生型AAT显示84％的序列同源性的AAT，有包含序列号68所示的氨基酸序列的马铃薯AAT。在番茄(野生种)野生型AAT的氨基酸序列中可观察到的半胱氨酸中的第206位、第209位、第256位、第269位及第322位的半胱氨酸在序列号68所示的氨基酸序列中均保守。
另外，作为与序列号66的番茄(野生种)野生型AAT显示78％的序列同源性的AAT，有包含序列号69所示的氨基酸序列的辣椒AAT。在番茄(野生种)野生型AAT的氨基酸序列中可观察到的半胱氨酸中的第206位、第209位、第269位及第322位的半胱氨酸在序列号69所示的氨基酸序列中均保守。
而且，作为与序列号66的番茄(野生种)野生型AAT显示74％的序列同源性的AAT，有包含序列号70所示的氨基酸序列的烟草AAT。在番茄(野生种)野生型AAT的氨基酸序列中可观察到的半胱氨酸中的第206位、第209位及第322位的半胱氨酸在序列号70所示的氨基酸序列中均保守。
将序列号66～70的氨基酸序列的比对示于图2。
另外，可以认为：包含与序列号65的草莓野生型AAT的氨基酸序列具有高的序列同源性的氨基酸序列的AAT，其很可能保有在草莓野生型AAT的氨基酸序列中可观察到的第115位、第167位、第179位、第325位及第356位的半胱氨酸，通过将这些半胱氨酸置换为其它氨基酸，则能够在各种AAT(优选为来自植物的各种AAT)中得到高活性的突变体。
例如，作为与序列号65的草莓野生型AAT具有94％的序列同源性的AAT，有包含序列号71所示的氨基酸序列的智利草莓AAT。在草莓野生型AAT的氨基酸序列中可观察到的半胱氨酸中的第115位、第167位、第179位、第325位及第356位的半胱氨酸在序列号71所示的氨基酸序列中均保守。
例如，作为与序列号65的草莓野生型AAT具有91％的序列同源性的AAT，有包含序列号72所示的氨基酸序列的野草莓AAT。在草莓野生型AAT的氨基酸序列中可观察到的半胱氨酸中的第115位、第167位、第179位、第325位及第356位的半胱氨酸在序列号71所示的氨基酸序列中均保守。
例如，作为与序列号65的草莓野生型AAT具有67％的序列同源性的AAT，有包含序列号73所示的氨基酸序列的玫瑰AAT。在草莓野生型AAT的氨基酸序列中可观察到的半胱氨酸中的第167位、第325位及第356位的半胱氨酸在序列号73所示的氨基酸序列中均保守。
将序列号65、71～73的氨基酸序列的比对示于图3。
3.突变型醇酰基转移酶II
另外，本发明还提供一种突变型AAT，其是对苹果野生型AAT或苹果M2K型AAT的氨基酸序列中的第64位的丙氨酸、第248位的缬氨酸、第363位的谷氨酰胺、第117位的赖氨酸进行了置换而得的。该突变型AAT与野生型AAT相比显示高的活性和可溶性。
即，本发明的突变型AAT的特征在于，在序列号1或2所示的氨基酸序列中具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换。
(1)第64位的丙氨酸向缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸的置换。
(2)第117位的赖氨酸向谷氨酰胺的置换。
(3)第248位的缬氨酸向丙氨酸的置换。
(4)第363位的谷氨酰胺向赖氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸的置换。
在本发明的突变型AAT中，优选将第64位的丙氨酸、第117位的赖氨酸、第248位的缬氨酸、第363位的谷氨酰胺中的2个以上进行组合并置换，更优选将3个以上进行组合并置换，最优选将全部进行组合并置换。
作为本发明的突变型AAT，具体可列举包含序列号3、5、6、8～13中的任一者所记载的氨基酸序列的突变型醇酰基转移酶(参照表1)。
可以认为：上述的通过苹果突变型AAT中的突变导入而实现的高活性化也能适用于包含与序列号1的苹果野生型AAT或序列号2的苹果M2K型AAT的氨基酸序列具有高的序列同源性的氨基酸序列的各种AAT(优选为来自各种植物的AAT)。
因此，本发明提供一种突变型AAT，其包含与序列号1的苹果野生型AAT或序列号2的苹果M2K型AAT的氨基酸序列具有70％以上、优选为80以上、更优选为90％以上、特别优选为95％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换。
(1)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第64位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸的置换。
(2)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第117位的赖氨酸相当的氨基酸向谷氨酰胺的置换。
(3)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第248位的缬氨酸相当的氨基酸向丙氨酸的置换。
(4)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第363位的谷氨酰胺相当的氨基酸向赖氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸的置换。
在本发明的突变型AAT中，优选将与第64位的丙氨酸相当的氨基酸残基、与第117位的赖氨酸相当的氨基酸残基、与第248位的缬氨酸相当的氨基酸残基、与第363位的谷氨酰胺相当的氨基酸残基中的2个以上进行组合并置换，更优选将3个以上进行组合并置换，最优选将全部进行组合并置换。
在序列号1的苹果野生型AAT或序列号2的苹果M2K型AAT的氨基酸序列中可观察到的第117位的赖氨酸、第248位的缬氨酸及第363位的谷氨酰胺在序列号12、61、62、63所示的氨基酸序列中均保守。因此可以认为：通过将这些氨基酸分别置换为异亮氨酸或苏氨酸；谷氨酰胺；丙氨酸；赖氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸，由此能够在各种AAT(优选为来自植物的AAT、特别优选为来自苹果属的各种植物的AAT)中得到高活性的突变体。关于成为导入氨基酸置换的对象的AAT的氨基酸序列，为了能够与序列号1的苹果野生型AAT或序列号2的苹果M2K型AAT的氨基酸序列进行比对，优选包含与序列号1或2的氨基酸序列具有50％以上、60％以上、70％以上、优选为80以上、更优选为90％以上、特别优选为95％以上的序列同源性的氨基酸序列。
4.载体·转化体
本发明的突变型AAT及插入有编码突变型AAT的DNA的表达载体可以使用以往公知的基因工程学方法来制作。
载体只要能在宿主细胞中自主复制即可，可以使用适合于宿主细胞的载体。突变型AAT基因向载体的插入可以使用本领域技术人员已知的基因重组技术来进行。例如，可以利用使用限制酶酶切和连接试剂盒的方法、使用拓朴异构酶的方法、In Fusion试剂盒(宝生物)等。插入载体中的基因可以连接、插入至能够在宿主细胞中调节各基因所编码的蛋白质的转录翻译的启动子的下游。另外，插入时，如有需要，可以添加适当的接头。另外，还可以根据需要连接欲导入基因的宿主生物中可利用的终止子序列、增强子序列、剪接信号序列、poly A添加信号序列、SD序列或Kozak序列等核糖体结合序列、选择标记基因等。作为选择标记基因的例子，可列举氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等耐药基因以及氨基酸、核酸等营养素的细胞内生物合成相关基因、或编码荧光素酶等荧光蛋白的基因等。也可以随着插入而对DNA所编码的氨基酸序列的一部分进行置换。
载体可通过本领域技术人员已知的方法导入到宿主细胞中而用于转化体的制作。作为向宿主细胞导入载体的方法，只要是适合于宿主细胞的方法则没有特别限定，可列举例如：电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法、接合转移法等。
宿主细胞没有特别限定，作为细菌，可列举大肠杆菌、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)等，酵母中可列举酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、裂殖酵母属(Shizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)，丝状菌中可列举曲霉菌属(Aspergillus)等。这些中，特别是使用大肠杆菌简便、效率也高，因此优选。
实施例
[参考例1：苹果AAT(MpAAT1)基因表达质粒pAAT012·pAAT115·pAAT116的制作]
制作了3种表达苹果AAT(MpAAT1)基因的质粒。
质粒pAAT012含有野生型苹果AAT(序列号1)。
质粒pAAT115含有改造苹果AAT，所述改造苹果AAT将野生型苹果AAT的第2位的氨基酸由甲硫氨酸置换为缬氨酸。
质粒pAAT116含有改造苹果AAT(序列号2)，所述改造苹果AAT将野生型苹果AAT的第2位的氨基酸由甲硫氨酸置换为赖氨酸。
首先合成了优化为大肠杆菌密码子的野生型苹果AAT基因(序列号14)(委托DNA2.0公司)。将AAT基因插入表达载体(pJexpress404)并命名为pAAT012。
通过以下的方法将AAT基因从具有T7启动子的表达载体(pJexpress404)转移到具有trc启动子的表达载体(pTrc99A)。
使用引物MMA-156、MMA-163并以pAAT012为模板进行PCR反应，来扩增含有AAT基因的片段。此时为了导入NcoI限制酶位点，将AAT基因的第2位的密码子ATG(Met)变换为GTG(Val)。
引物MMA-156(序列号15)：
引物MMA-163(序列号16)：
将扩增产物用Gel/PCR Purification Kit(FAVORGEN公司制)纯化，将其作为插入片段。将预先用限制酶NcoI及Sse8387I切断后的载体pTrc99A和插入片段混合，用In-Fusion HD Cloning Kit进行连接。
将反应液在50℃孵育15分钟后，在冰上冷却，用于大肠杆菌JM109株的转化。将大肠杆菌转化体用含有氨苄青霉素100mg/L的LB培养基(LBAmp培养基)进行液体培养，用Miniprep Kit(QIAGEN公司)制备目标质粒pAAT115。
插入到pAAT115中的苹果AAT基因的基因产物的第2位的氨基酸残基为缬氨酸，已知通过将第2位的氨基酸残基置换为赖氨酸或精氨酸等来提高蛋白质表达量的例子(日本特开2008-61547号公报)。因此，如下所述地进行AAT基因的第2位的密码子的变换。
首先，将pAAT115用NcoI和SmaI切断，制备含有约5.1kb的载体区域的片段。
使用引物MMA-166、MMA-169并以pAAT115为模板进行PCR反应，来扩增含有AAT基因的片段(约400bp)，用上述的方法纯化，得到插入片段。
引物MMA-166(序列号17)：
引物MMA-169(序列号18)：
将含有载体区域的片段和插入片段用In-Fusion HD Cloning Kit进行连接后，供于大肠杆菌JM109株的转化。对大肠杆菌转化体(重组体)进行液体培养，由此制备目标质粒pAAT116。pAAT116中，AAT基因的第2位的密码子GTG(Val)已被置换为AAA(Lys)。
[实施例1：高活性苹果AAT的制造]
(1)表达半胱氨酸残基被置换为丙氨酸残基的突变体的重组体的制作
参考例1中制作的质粒pAAT116中的苹果AAT基因所编码的蛋白质中存在15个半胱氨酸。委托合成(Genscript公司)了各半胱氨酸被置换为丙氨酸的15种质粒(表2)。
[表2]
用[表2]示出的16种质粒转化大肠杆菌JM109株。将大肠杆菌转化体接种于含有氨苄青霉素的LB(1％Bacto胰蛋白胨、0.5％Bacto酵母提取物、1％NaCl)培养基，在37℃下进行7小时前培养。取0.1ml培养液，加入到100ml的相同培养基(含1mM IPTG)中，在37℃下振荡培养15小时。从培养液中回收菌体，用50mM磷酸-钠缓冲液(pH7.0)洗涤后，悬浮于相同缓冲液。
(2)含有突变体的细胞提取液的制备
将得到的菌体悬浮液调整到OD630为10。用超声波处理来破碎细胞，通过离心分离除去菌体及膜级分，由此制备细胞提取液。
(3)含有突变体的细胞提取液的AAT活性测定
向含有甲基丙烯酰辅酶A 1mM和正丁醇40mM的反应液0.8ml中加入0.2ml的细胞提取液，开始丁酸酯的生成反应。反应在10ml容量的带隔垫的样品瓶(GC用)中进行。将样品瓶在30℃孵育1～2小时使反应进行。反应结束后，在样品瓶中的反应液中添加、混合1ml的乙腈。然后，用注射器式过滤器DISMIC(孔径0.45μm、ADVANTEC公司制)过滤后，供于HPLC分析。
HPLC分析条件：
装置：Waters 2695
色谱柱：Shiseido CAPCELL PAK C18 UG120 5μm
流动相：65％MeOH、0.2％磷酸
流量：0.25ml/min
柱温：35℃
检测：UV210nm
注入量：10μL
将结果示于图4。得到8个与由pAAT116表达的基准体的活性100％相比显示50％以上的每种重组体的AAT活性的突变体，其中，由pAAT116C48A、pAAT116C150A、pAAT116C167A、pAAT116C270A、pAAT116C274A及pAAT116C447A表达的突变体与由pAAT116表达的基准体的活性100％相比显示70％以上的每种重组体的AAT活性。因此制作了将这6个突变体所具有的全部氨基酸置换C48A、C150A、C167A、C270A、C274A及C447A均进行了导入的突变体。需要说明的是，这里，“AAT活性”是指催化由辅酶A化合物生成酯的活性。另外，“突变体的每种重组体的AAT活性与基准体的活性100％相比为50％以上”是指：由一定量的大肠杆菌重组体表达的突变体所催化的酯的生成量起因于该突变体的高的活性和可溶性，并且在同一条件下达到由大肠杆菌重组体表达的基准体所催化生成的酯量的50％以上。
(4)表达6个半胱氨酸残基被置换为丙氨酸残基的突变体的重组体的制作
委托合成(Genscript公司)了第48位、第150位、第167位、第270位、第274位及第447位的半胱氨酸全部被置换为丙氨酸的AAT基因，插入到载体pTrc99A中而获得质粒pAAT024。
通过上述的方法制备含有突变体的细胞提取液并测定细胞提取液的AAT活性。进而，将细胞提取液(可溶性级分)、以及通过离心分离从细胞提取液中分离出的不溶性级分(菌体及膜级分)用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，由此检测重组体AAT蛋白的条带。
将结果示于图5。图中，纵轴将由pAAT116表达的基准体的AAT活性设为1来示出单位菌体重量的AAT活性。与基准体的活性相比，由pAAT024表达的突变体的每种重组体的AAT活性显示为约5倍。另外，与基准体相比，由pAAT024表达的突变体更多地存在于可溶性级分中。由该结果可知，通过将第48位、第150位、第167位、第270位、第274位及第447位的半胱氨酸置换为丙氨酸，提高了AAT的可溶性，每种重组体的活性提高。
[参考例2：利用了AAT-氯霉素(CAT)融合蛋白的高可溶性突变体的筛选]
为了获得苹果AAT的高可溶性突变体，首先制作AAT基因的随机突变文库。然后，制作含有在突变型AAT基因上连接有氯霉素(CAT)抗性基因的突变AAT-CAT融合基因的表达质粒文库，从用这些转化而得的大肠杆菌转化体中以氯霉素抗性为指标进行高可溶性AAT的筛选。如果AAT蛋白的可溶性提高则AAT-氯霉素融合蛋白的可溶性也提高，结果是大肠杆菌转化体的氯霉素抗性提高。具体而言，按照以下的步骤进行。
(1)随机突变基因文库的制作
使用GeneMorph II Random Mutagenesis Kit(STRATAGENE公司)和引物MMA-185、MMA-157并以pAAT116为模板进行PCR，由此得到扩增片段(1.4Kb)。
引物MMA-185(序列号19)：
引物MMA-157(序列号20)：
将扩增片段用限制酶BspHI及SpeI处理，通过琼脂糖凝胶电泳将片段分离后，使用Gel/PCR Purification Kit(FAVORGEN公司)由凝胶中进行提取，将其作为随机突变基因文库(突变AAT(M2K)基因文库)。
(2)含有AAT-CAT融合基因的表达质粒pAAT113的制作
质粒载体pSTV28N的制作
作为CAT基因，使用来自质粒载体pSTV28(宝生物)的CAT基因。该CAT基因中存在NcoI限制酶位点，但由于会在此后的文库制作中产生不便，因而将作为NcoI位点的序列变换为不会被NcoI切断的序列。通过以质粒pSTV28为模板的PCR反应按照下述来进行变换。
正向引物MMA-152(序列号21)：
反向引物MMA-153(序列号22)：
向PCR反应液12.5μl中添加DpnI 0.5μl，在37℃孵育1小时，使用处理后的反应液转化大肠杆菌JM109株。由大肠杆菌转化体制备质粒并命名为pSTV28N。
表达AAT-CAT融合基因的质粒pAAT113的制作
以参考例1中记载的质粒pAAT012为模板，使用引物MMA-156、157PCR扩增AAT基因片段，然后进行纯化。
引物MMA-156(序列号23)：
引物MMA-157(序列号24)：
以pSTV28N为模板，使用引物MMA-159、160通过PCR扩增CAT基因片段，然后进行纯化。
引物MMA-159(序列号25)：
引物MMA-160(序列号26)：
将AAT基因片段和CAT基因片段、以及预先用NcoI和Sse8387I切断的载体pTrc99A混合，用In-Fusion HD Cloning Kit将3种片段连接。使用反应液转化大肠杆菌JM109株。由大肠杆菌转化体制备质粒并命名为pAAT113。pAAT113中的AAT基因的第2位的氨基酸为缬氨酸。
表达AAT(V2K)-CAT融合基因的质粒pAAT117的制作
将pAAT113中的AAT基因的第2位的氨基酸从缬氨酸变换为赖氨酸，而制作质粒pAAT117。氨基酸的置换按照参考例1中的由pAAT115制作pAAT116来进行。
(3)突变AAT-CAT融合基因质粒文库的制作
将pAAT113用NcoI和SpeI切断后，进行SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase)处理。用琼脂糖凝胶电泳和Gel/PCR Purification Kit(FAVORGEN公司)纯化DNA片段。将DNA片段和上述(1)中得到的随机突变基因文库用DNA ligation kit ver.2(宝生物)进行连接。使用反应液转化大肠杆菌JM109株。
将大肠杆菌转化体在LBAmp琼脂培养基上培养，回收约12,000个菌落并制备菌体悬浮液。取菌体悬浮液的一部分并且用Mini prep Kit(QIAGEN公司)制备质粒，作为突变AAT(M2K)-CAT融合基因质粒文库。
(4)以氯霉素抗性为指标的高可溶性AAT的筛选、以及突变位置的鉴定
使用上述(3)中得到的突变AAT(M2K)-CAT融合基因质粒文库转化大肠杆菌JM109株。将大肠杆菌转化体的培养液涂布于含有30mg/l氯霉素和0.4mM IPTG的LB琼脂培养基，在37℃培养一夜。对得到的菌落进行液体培养，制备质粒。对质粒中的AAT基因序列进行分析而鉴定突变位置(表3)。
[表3]
突变位置 质粒名
1 Q363K pAAT119
2 K117Q pAAT120
3 A64V pAAT121
4 G297D pAAT122
5 D415N pAAT123
6 V248A pAAT124
7 Q408H pAAT125
8 F4L pAAT126
9 L7F pAAT127
10 G220D pAAT128
11 N411S pAAT129
12 S3G pAAT130
13 Q440H pAAT131
14 P87R pAAT132
15 Q231E pAAT133
16 S232N pAAT134
(5)导入了所鉴定的突变的突变体的AAT活性评价
制作表达导入了[表3]所示的突变的突变体的质粒(表4)。
首先以pAAT116为模板且使用下述的[表4]所示的引物组进行PCR。向反应液中添加DpnI 1μl，在37℃孵育1小时。用DpnI处理液转化大肠杆菌JM109株。由大肠杆菌转化体制备含有突变型AAT基因的质粒。
[表4]
用[表4]所示的质粒转化大肠杆菌JM109株，通过实施例1中记载的方法测定大肠杆菌转化体的细胞破碎液的AAT活性。在[表5]中示出结果。表中，活性值通过将由pAAT116表达的基准体的活性设为1的相对值来示出。
[表5]
N.T.：未测定
确认到通过导入A64V、V248A及Q363K的突变从而AAT活性提高。K117Q的突变也显示出一定的活性提高。虽然表中未示出，但在将第64位的丙氨酸置换为异亮氨酸或苏氨酸的情况下、以及在将第363位的谷氨酰胺置换为脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸的情况下，与由pAAT116表达的基准体的活性相比也都确认到120％以上的活性。
然后制作A64V、K117Q、V248A及Q363K的4重突变体。
(6)4重突变体的制作及活性评价
委托合成(Genscript公司)具有A64V、K117Q、V248A及Q363K的4处突变的AAT基因，插入到载体pTrc99A中而获得质粒pAAT021。用质粒pAAT021转化大肠杆菌JM109株，通过实施例1中记载的方法测定大肠杆菌转化体的细胞破碎液的AAT活性。
将结果示于图5。相对于由pAAT116表达的基准体，4重突变体显示出约6倍的活性。
[实施例2：半胱氨酸6置换4重突变体的制作及活性评价]
委托合成(Genscript公司)AAT的第48位、第150位、第167位、第270位、第274位及第447位的半胱氨酸全部被置换为丙氨酸且具有A64V、K117Q、V248A及Q363K的4处突变的AAT基因，插入到载体pTrc99A中而获得质粒pAAT025。用质粒pAAT025转化大肠杆菌JM109株，通过实施例1所述的方法测定大肠杆菌转化体的细胞破碎液的AAT活性。
将结果示于图5。相对于由pAAT021表达的基准体(4重突变体)，半胱氨酸6置换4重突变体显示出约2.8倍的每种重组体的活性。
[实施例3：半胱氨酸6置换4重突变重组体的制作及活性评价2]
制作在质粒pAAT021(4重突变体)中将AAT的第150位的半胱氨酸置换为精氨酸的质粒pAAT155、在pAAT025(半胱氨酸6置换4重突变体)中将AAT的第150位的半胱氨酸置换为精氨酸的质粒pAAT154。
质粒pAAT155含有AAT的第150位的半胱氨酸被置换为精氨酸且具有A64V、K117Q、V248A及Q363K的4重突变的突变型AAT基因。
质粒pAAT154含有AAT的第48位、第167位、第270位、第274位及第447位的半胱氨酸全部被置换为丙氨酸、第150位的半胱氨酸被置换为精氨酸且具有A64V、K117Q、V248A及Q363K的4重突变的突变型AAT基因。
氨基酸的置换按照参考例1中的由pAAT115制作pAAT116来进行。PCR反应使用引物MMA-380、MMA-381且将模板设为pAAT021或pAAT025来进行。
引物MMA-380(序列号59)：
引物MMA-381(序列号60)：
用质粒pAAT155、pAAT154转化大肠杆菌JM109株，通过实施例1中记载的方法测定大肠杆菌转化体的细胞破碎液的AAT活性。另外，将细胞提取液(可溶性级分)、以及通过离心分离从细胞提取液中分离出的不溶性级分(菌体及膜级分)用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，由此检测重组体AAT蛋白的条带。
将结果示于图5。与由pAAT021表达的基准体(4重突变体)相比，由pAAT155、pAAT154表达的重组体分别显示出约3.7倍、约5倍的每种重组体的AAT活性。另外，与表达基准体的重组体相比，表达pAAT155、pAAT154的重组体中，更多的蛋白质存在于可溶性级分中。由该结果可知，特别是通过第150位的半胱氨酸置换为精氨酸，进一步提高了基准体的可溶性，进一步提高了活性。
[实施例4：半胱氨酸4～5置换4重突变体的制作及活性评价]
委托合成(Genscript公司)AAT的第48位、第150位、第167位、第270位、第274位及第447位的6个半胱氨酸中的5个或4个被置换为丙氨酸且具有A64V、K117Q、V248A及Q363K的4处突变的AAT基因，插入到载体pTrc99A中而获得[表6]所示的质粒。用各质粒转化大肠杆菌JM109株，通过实施例1中记载的方法测定大肠杆菌转化体的细胞破碎液的AAT活性。
[表6]
将结果示于图6。图表纵轴将由pAAT116表达的基准体的活性设为1来示出单位菌体重量的AAT活性。与由pAAT021表达的基准体(4重突变体)相比，半胱氨酸5置换4重突变体、及半胱氨酸4置换4重突变体均显示出更高的可溶性及每种重组体的活性。
[实施例5：高活性番茄AAT的制造]
(1)表达半胱氨酸残基被置换为丙氨酸残基的突变体的重组体的制作
委托合成(Genscript公司、以下同样)表达番茄AAT(SpAAT)基因的质粒pAAT032。pAAT032含有番茄(野生种)野生型AAT(序列号66)的第2位的氨基酸从丙氨酸被置换为赖氨酸的番茄(野生种)A2K型AAT(序列号64)。该基因所编码的蛋白质中存在8个半胱氨酸。委托合成各半胱氨酸被置换为丙氨酸的8种质粒(表7)。
[表7]
用[表7]所示的9种质粒转化大肠杆菌JM109株。
(2)含有突变体的细胞提取液的AAT活性测定
与实施例1同样地培养大肠杆菌转化体，回收菌体，制备细胞提取液，测定AAT活性。将结果示于图7。
得到5个突变体(由pATM104、pATM105、pATM106、pATM107、pATM108表达的突变体)，它们显示出与由pAAT032表达的基准体的活性100％相比为50％以上的每种重组体的AAT活性。
(3)表达5个半胱氨酸残基被置换为丙氨酸残基的突变体的重组体的制作
委托合成含有突变体的质粒pAAT164，所述突变体导入有上述5个突变体所具有的全部氨基酸置换C206A、C209A、C256A、C269A及C322A。将测定AAT活性的结果示于图7。
与基准体的活性相比，由pAAT164表达的突变体的每种重组体的AAT活性显示为约3倍。另外，与基准体相比，由pAAT164表达的突变体更多地存在于可溶性级分中。由该结果可知，通过将第206位、第209位、第256位、第269位及第322位的半胱氨酸置换为丙氨酸，从而提高了AAT的可溶性，每种重组体的活性提高。
[实施例6：高活性草莓AAT的制造]
(1)表达半胱氨酸残基被置换为丙氨酸残基的突变体的重组体的制作
委托合成表达草莓AAT(SAAT)基因(序列号65)的质粒pAAT033。该基因所编码的蛋白质中存在9个半胱氨酸。委托合成各半胱氨酸被置换为丙氨酸的9种质粒(表8)。
[表8]
用[表8]所示的10种质粒转化大肠杆菌JM109株。
(2)含有突变体的细胞提取液的AAT活性测定
与实施例1同样地培养大肠杆菌转化体，回收菌体，制备细胞提取液，测定AAT活性。将结果示于图8。
得到7个突变体(由pATM202、pATM203、pATM204、pATM205、pATM206、pATM207、pATM208表达的突变体)，它们与由pAAT033表达的基准体的活性100％相比显示50％以上的每种重组体的AAT活性。
(3)表达5个半胱氨酸残基被置换为丙氨酸残基的突变体的重组体的制作
委托合成含有突变体的质粒pAAT037，所述突变体导入有上述7个突变体所具有的氨基酸置换中的C115A、C167A、C179A、C325A及C356A。将测定AAT活性的结果示于图8。
与基准体的活性相比，由pAAT037表达的突变体的每种重组体的AAT活性显示为约1.7倍。由该结果可知，通过将第115位、第167位、第179位、第325位及第356位的半胱氨酸置换为丙氨酸，由此提高了每种重组体的活性。
序列表自由文字
序列号1：苹果野生型AAT(Mp-AAT1_apple)
序列号2：苹果M2K型AAT
序列号3：在苹果M2K型中导入了4重突变的AAT
序列号4：在苹果M2K型中导入了半胱氨酸6置换的AAT
序列号5：在苹果M2K型中导入了4重突变和半胱氨酸6置换的AAT
序列号6：在苹果M2K型中导入了4重突变和Cys150Arg的AAT
序列号7：在苹果M2K型中导入了4重突变和半胱氨酸6置换(其中，第150位为Cys150Arg)的AAT
序列号8：在苹果M2K型中导入了4重突变和半胱氨酸5置换的AAT
序列号9：在苹果M2K型中导入了4重突变和半胱氨酸4置换的AAT
序列号10：在苹果M2K型中导入了4重突变和半胱氨酸4置换的AAT
序列号11：在苹果M2K型中导入了4重突变和半胱氨酸4置换的AAT
序列号12：来自苹果AAT的氨基酸序列(Md-AAT2_apple)
序列号13：在苹果M2K型中导入了4重突变和半胱氨酸4置换的AAT
序列号14：优化为大肠杆菌密码子的野生型苹果AAT基因
序列号15：引物MMA-156
序列号16：引物MMA-163
序列号17：引物MMA-166
序列号18：引物MMA-169
序列号19：引物MMA-185
序列号20：引物MMA-157
序列号21：引物MMA-152
序列号22：引物MMA-153
序列号23：引物MMA-156
序列号24：引物MMA-157
序列号25：引物MMA-159
序列号26：引物MMA-160
序列号27：引物MMA-207
序列号28：引物MMA-208
序列号29：引物MMA-215
序列号30：引物MMA-216
序列号31：引物MMA-217
序列号32：引物MMA-218
序列号33：引物MMA-219
序列号34：引物MMA-220
序列号35：引物MMA-221
序列号36：引物MMA-222
序列号37：引物MMA-223
序列号38：引物MMA-224
序列号39：引物MMA-225
序列号40：引物MMA-226
序列号41：引物MMA-241
序列号42：引物MMA-242
序列号43：引物MMA-243
序列号44：引物MMA-244
序列号45：引物MMA-229
序列号46：引物MMA-230
序列号47：引物MMA-231
序列号48：引物MMA-232
序列号49：引物MMA-245
序列号50：引物MMA-246
序列号51：引物MMA-233
序列号52：引物MMA-234
序列号53：引物MMA-239
序列号54：引物MMA-240
序列号55：引物MMA-237
序列号56：引物MMA-238
序列号57：引物MMA-235
序列号58：引物MMA-236
序列号59：引物MMA-380
序列号60：引物MMA-381
序列号61：来自梨的AAT的氨基酸序列
序列号62：来自枇杷的AAT的氨基酸序列
序列号63：来自柿子的AAT的氨基酸序列
序列号64：番茄(野生种)A2K型AAT
序列号65：草莓野生型AAT的氨基酸序列
序列号66：番茄(野生种)野生型AAT的氨基酸序列
序列号67：来自番茄(栽培种)的AAT的氨基酸序列
序列号68：来自马铃薯的AAT的氨基酸序列
序列号69：来自辣椒的AAT的氨基酸序列
序列号70：来自烟草的AAT的氨基酸序列
序列号71：来自智利草莓的AAT的氨基酸序列
序列号72：来自野草莓的AAT的氨基酸序列
序列号73：来自玫瑰的AAT的氨基酸序列

Claims (22)

1.一种酶的制造方法，所述酶与基准体相比，每种重组体的活性得到提高，该方法包含表达突变体的工序，所述突变体具有在基准体的氨基酸序列中2个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的酶的制造方法，其包含以下的工序：
(1)制作表达突变体的重组体的工序，所述突变体具有在基准体的氨基酸序列中1个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列；
(2)选择与基准体的活性100％相比显示50％以上的每种重组体的活性的多个突变体的工序；和
(3)表达以下突变体的工序，所述突变体为在工序(2)所选择的各个突变体所具有的氨基酸残基被置换的部位中的2个以上部位中、各自对应的氨基酸残基被置换的突变体。
3.根据权利要求1或2所述的酶的制造方法，其中，所述酶为醇酰基转移酶。
4.根据权利要求3所述的酶的制造方法，其中，所述基准体的氨基酸序列为序列号1、2、3、64、65及66中的任一者所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1～4中的任一项所述的酶的制造方法，其中，所述其它氨基酸残基为丙氨酸或精氨酸。
6.一种突变型醇酰基转移酶，其为与基准体相比活性得到提高的突变型醇酰基转移酶，其具有在基准体的氨基酸序列中1个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的突变型醇酰基转移酶，其包含与序列号1或2所示的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第48位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第150位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第167位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第270位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第274位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(6)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第447位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
8.根据权利要求6所述的突变型醇酰基转移酶，其包含与序列号64或66所示的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第206位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第209位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第256位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第269位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)在与序列号64或66所示的氨基酸序列的比对中，与第322位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
9.根据权利要求6所述的突变型醇酰基转移酶，其包含与序列号65所示的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第115位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第167位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第179位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第325位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)在与序列号65所示的氨基酸序列的比对中，与第356位的半胱氨酸相当的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
10.根据权利要求6～9中的任一项所述的突变型醇酰基转移酶，其中，所述其它氨基酸残基为丙氨酸或精氨酸。
11.根据权利要求6所述的突变型醇酰基转移酶，其中，在序列号1或2所示的氨基酸序列中具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)第48位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)第150位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)第167位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)第270位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)第274位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(6)第447位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
12.根据权利要求6所述的突变型醇酰基转移酶，其中，在序列号64或66所示的氨基酸序列中，具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)第206位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)第209位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)第256位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)第269位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)第322位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
13.根据权利要求6所述的突变型醇酰基转移酶，其中，在序列号65所示的氨基酸序列中，具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)第115位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(2)第167位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(3)第179位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(4)第325位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换；
(5)第356位的半胱氨酸向其它氨基酸残基的置换。
14.根据权利要求11～13中的任一项所述的突变型醇酰基转移酶，其中，所述其它氨基酸残基为丙氨酸或精氨酸。
15.根据权利要求11所述的突变型醇酰基转移酶，其包含序列号4或7所述的氨基酸序列。
16.根据权利要求7或11所述的突变型醇酰基转移酶，其还具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)第64位的丙氨酸向缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸的置换；
(2)第117位的赖氨酸向谷氨酰胺的置换；
(3)第248位的缬氨酸向丙氨酸的置换；
(4)第363位的谷氨酰胺向赖氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸的置换。
17.根据权利要求16所述的突变型醇酰基转移酶，其包含序列号5、6、8～11、13中的任一者所记载的氨基酸序列。
18.一种突变型醇酰基转移酶，其包含与序列号1或2所示的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第64位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸的置换；
(2)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第117位的赖氨酸相当的氨基酸向谷氨酰胺的置换；
(3)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第248位的缬氨酸相当的氨基酸向丙氨酸的置换；
(4)在与序列号1或2所示的氨基酸序列的比对中，与第363位的谷氨酰胺相当的氨基酸向赖氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸的置换。
19.一种突变型醇酰基转移酶，其在序列号1或2所示的氨基酸序列中具有选自以下的氨基酸置换中的一种以上的氨基酸置换：
(1)第64位的丙氨酸向缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸的置换；
(2)第117位的赖氨酸向谷氨酰胺的置换；
(3)第248位的缬氨酸向丙氨酸的置换；
(4)第363位的谷氨酰胺向赖氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸的置换。
20.根据权利要求19所述的突变型醇酰基转移酶，其包含序列号3、5、6、8～11、13中的任一者所记载的氨基酸序列。
21.一种载体，其表达权利要求6～20中的任一项所述的醇酰基转移酶。
22.一种转化体，其导入有权利要求21所述的载体。
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