WO2013152408A2 - Composições e métodos para modificar a expressão de genes de interesse - Google Patents

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WO2013152408A2
WO2013152408A2 PCT/BR2013/000110 BR2013000110W WO2013152408A2 WO 2013152408 A2 WO2013152408 A2 WO 2013152408A2 BR 2013000110 W BR2013000110 W BR 2013000110W WO 2013152408 A2 WO2013152408 A2 WO 2013152408A2
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Juliana DANTAS DE ALMEIDA
Leila Maria GOMES BARROS
Mauro CARNEIRO
Alan CARVALHO ANDRADE
Felipe RODRIGUES DA SILVA
Luiz Filipe PROTASIO PEREIRA
Michelle GUITTON COTTA
Mirian Therezinha SOUZA DA EIRA
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Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária - Embrapa -
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology. More specifically the invention relates to a specific promoter for the expression of genes of interest in fruit endosperm.
  • the invention further describes DNA constructs containing the promoter of the invention operably linked to a heterologous and / or endogenous gene. Further, the invention relates to the use of these constructs in the form of expression vectors, recombinant vectors and in transgenic plants, plant cells or protoplasts.
  • the invention further describes a method using such promoter-containing constructs for the production of transgenic plants, plant cells or protoplasts.
  • the expression of the transgene only in the part of interest allows the accumulation of the exogenous transcript only in the fruit, favoring the implementation of strategies aimed at increasing the added value, the generation of cultivars more adapted to environmental stress, pathogens and pests. pesticides, as well as plants with high nutritional value and high therapeutic value.
  • the present invention is a novel alternative for expression systems in plant organisms that can be used for the generation of new cultivars and breeding programs. The invention aims to increase the economic, social and environmental and biosafety benefits associated with genetic transformation.
  • Literature data indicate an evolution in the application of genetic transformation according to the emergence of several generations of transgenics.
  • the first and second generation of transgenic plants used constitutive promoters such as. the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV 35S) promoter (Odell, JT, Nagy, F. & Chua, NH. 1985 Identification of DNA sequences required for the activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature, v. 313, p.
  • CaMV 35S Cauliflower Mosaic Virus
  • promoters of genes found in the Agrobacterium tumefaciens T-DNA such as the nopaline synthase gene promoter (Bevan, MW, Barnes, WM & Chilton, MD 1983) Structure and transcription of the nopaline syntase region of T-DNA gene, Nucleic Acids Research, v. 11, no. 2, pp. 369-385) and gene promoters encoding highly conserved proteins involved in the vital processes of virtually all organisms such as ubiquitin (Toki S Takamatsu S., Nojiri C, Ooba S., Anzai H., Iwata M., Christensen AH, Quail PH & Uchimiya H.
  • ubiquitin Toki S Takamatsu S., Nojiri C, Ooba S., Anzai H., Iwata M., Christensen AH, Quail PH & Uchimiya H.
  • Obtaining and making available promoters capable of limiting temporal and / or spatial gene expression may be one of the ways to balance the benefits of transgenics and their restrictions.
  • Promoter is a set of transcription control modules, organized around the RNA polymerase II enzyme initiation site (Potenza, C.; Aleman, L. & Sengupta-Gopalan, C. 2004. Targeting transgene expression in research, agricultural, and environmental applications: Promoters used in plant transformation (In Vitro Cellular Development Biological-Plant v. 40, p.1-22) which contain specific sequences recognized by proteins involved in transcription. Different classes of promoters have been described in the literature, based on their expression profile. These include constitutive promoters, which are active in all tissues and at all stages of organism development, such as CaMV35S (Odell, JT, Nagy, F. & Chua, NH. 1985.
  • Tissue / organ-specific promoters promote expression of their correlate gene only in their tissue / target organ as fruit (Atkinson RG, Bolitho KM, Wright MA, Iturriagagoitia-Bueno T., Reid SJ & Ross GS 1998 Apple ACC- oxidase and polygalacturonase: ripening-specific gene expression and promoter analysis in transgenic tomato Plant Mol Biol. Oct; 38 (3): 449-60), seed-grain (Paine JA, Shipton CA, Chaggar S., Howells RM, Kennedy J.
  • tissue-specific promoters described for plants, such as seed-specific expression (WO8903887), tuber (as mentioned in US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323: 1330), leaves (as mentioned in US20030175783, Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12: 579-589), stem (as mentioned in US20030175783, Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633) , vascular tissues (as mentioned in US20030175783, Peleman et al., 1989 Gene 84: 359-369 and Schmulling et al.
  • seed-specific expression WO8903887
  • tuber as mentioned in US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323: 1330
  • leaves as mentioned in US20030175783, Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12: 579-589
  • a promoter isolated from coffee (Coffea ssp) specific to the fruit endosperm.
  • Endosperm is the consumed part of the grain of great economic interest, and the ability to express a protein of interest specifically in endosperm is useful in introducing characteristics related to nutritional quality, organoleptic characteristics, advantages in the postharvest phase.
  • promoters used to obtain commercial transgenics are often constitutive and promote transgene expression in all plant tissues and at all stages of development. This feature causes energy loss in the plant, as metabolic waste occurs in the production of a protein in quantities and places where it is unnecessary and can lead to decreased productivity.
  • transgenics allow the incorporation of desirable traits in a targeted manner, regardless of barriers between species.
  • the current agronomic scenario has impacts promoted by climate change which cause serious imbalances in the environment and agriculture and population increase, which is a factor that causes environmental imbalance due to the demand for space to increase agricultural production. Mitigating these impacts requires sustainable management of natural resources such as water and space, as well as adversity such as drought, pests and pathogens. Thus, plants better suited to this scenario need to be developed and transgenics is a tool that accelerates the obtaining of these cultivars.
  • PI0209551-3 discloses an invention which relates to a coffee leaf derived nucleotide sequence that can be used as a promoter for inducible gene expression in plants.
  • said invention pertains to a nucleotide sequence encompassing the promoter and coding region of an rbcS gene.
  • the invention proposed herein is. a fruit-specific promoter and in addition to being the alternative to transgenic processes, particularly in plant organisms.
  • WO0151637 and WO0302939 refer to promoters, isolated from Fragaria vesca-strawberry, that selectively direct the expression of DNA sequences placed under its control in plant fruits.
  • the promoter sequences described in the above patents were isolated from Fragaria vesca - strawberry.
  • the proposal disclosed herein has the advantage of being used for the generation of cultivars and / or breeding programs in various plant organisms, including those belonging to the genus Coffea ssp, since the isolate was obtained from the same genus.
  • the proposed promoter presents an alternative for the creation of plant organisms expressing transgenes.
  • KR100797644 in turn refers to a fruit specific expression promoter derived from Citrus unshiu - citrus fruit of Japanese origin.
  • the promoter is provided to induce late maturation expression in fruits, to efficiently express an exogenous gene in fruits and to control its expression in order to so that transgenic plants are produced efficiently.
  • the advantage of using the invention proposed by our group is particularly in the cultivars of the genus Coffea ssp or even in such breeding programs because it is a regulatory region present in the genus itself. Also presenting an alternative for the creation of plant organisms expressing transgenes, as above.
  • WO2010093175 discloses a specific expression promoter of the HR7 gene
  • WO2010012848 refers to a promoter sequence called FSP1 located in the 5 'region of the Snl gene DNA, both derived from Solanum lycopersicum - tomato.
  • a gene introduced from a transformed plant may be specifically expressed in flower and fruit tissue as compared to conventionally used, such as, for example, the Cauliflower mosaic virus - CaMV 35S promoter.
  • it is a specific promoter that can be used for fruit expression, it has the disadvantage that the promoter claimed here is unable to be used as a native promoter of the genus Coffea ssp and / or breeding programs of the same kind.
  • the inventions depicted in CN1298021 and WO2005026366 refer to sequences for directing expression of a gene of interest in the endosperm. However, they are derived from the 5 ' control sequences of the waxy gene and the glutelin gene GluD-1 gene respectively from rice, thus presenting the same disadvantages cited in the previous paragraph concerning the genus Coffea ssp.
  • compositions comprise novel nucleotide sequences for a promoter that is known to control seed expression of the gene known as eepl and not specifically fruit. Besides the sequence is not specific to Coffea ssp.
  • WO2008040061 discloses an isolated nucleic acid sequence comprising a nucleotide sequence that corresponds to an active promoter region of a DNA sequence.
  • the isolated nucleic acid sequence is derived from a cereal grain and has the same disadvantages with respect to the use of the promoter in the Coffea ssp genus and breeding programs of said genus.
  • US2009089897 and US2010037347 provide compositions and methods for regulating expression of plant nucleotide sequences, with the novel compositions being nucleotide sequences for tissue promoters, however, isolated from sorghum.
  • WO2010118477 in turn provides compositions comprising plant operable promoter sequences isolated from Triticum aestivum-wheat, and variants thereof, which confer selective / specific expression of specific genes especially in the endosperm and is therefore different and not having the sequence advantages herein. proposal in relation to the genus Coffea ssp.
  • US7071378 and WO2005026366 disclose in their content promoter nucleotide sequences isolated, respectively from Zea mays - maize and Hordeum vulgare - barley, which allow the expression of coding sequences where they may be. igadas. which are region specific. endosperm.
  • the present invention relates to a novel endosperm-specific promoter sequence for gene expression of interest only in fruit.
  • the invention also provides a new alternative for plant expression systems.
  • the invention relates to a novel promoter for gene specific expression in fruit endosperm.
  • the expression of the transgene only in the part of interest allows the accumulation of the exogenous transcript only in the fruit, favoring the implementation of strategies aimed at increasing the added value, the generation of cultivars more adapted to environmental stress, pathogens and pests. pesticides as well as plant organisms with high nutritional value and high therapeutic value.
  • the present invention is a new alternative to expression systems in plant organisms that can be used for the generation of new cultivars and breeding programs.
  • the invention aims to increase the economic, social and environmental and biosafety benefits associated with genetic transformation.
  • the present invention provides a polynucleotide sequence that is substantially similar to SEQ ID NO1; reverse sequence of SEQ ID NO1; probes and primers corresponding to SEQ ID NO1.
  • the present invention provides chimeric genes comprising the polynucleotide of the present invention, either alone or in combination with one or more known polynucleotides, together with cells and organisms comprising these chimeric genes.
  • the present invention provides recombinant vectors comprising, in the 5 '-3' direction, a polynucleotide promoter sequence of the present invention, a polynucleotide to be transcribed, and a gene termination sequence.
  • the polynucleotide to be transcribed may comprise an open reading frame of a polynucleotide encoding a polypeptide of interest, or may be a non-coding, or untranslated region of a polynucleotide of interest.
  • the open reading array can be oriented in a "sense" or "antisense" direction.
  • the gene termination sequence is functional in a host plant.
  • the gene termination sequence is that of the gene of interest, but may be described in the prior art (see Benjamin Lewin, Genes VIII, chapter 9) as the A. tumefasciens nopaline synthase terminator.
  • Recombinant vectors may further include a marker for identifying transformed cells.
  • transgenic plant cells comprising the recombinant vector of the present invention are provided, together with organisms, as plants, comprising these transgenic cells, and fruits, seeds and other products, derivatives, or progeny of these plants.
  • the propagules of the inventive transgenic plants are included in the present invention.
  • a method for modifying gene expression in an organism, such as a plant including stable incorporation into the genome of the organism containing the recombinant vector of the present invention.
  • a method for producing a transformed organism such as a plant, having the expression of a modified polypeptide.
  • Such a method comprises transforming a plant cell with the recombinant vector of the present invention to provide a transgenic cell under conditions that lead to regeneration and growth of the mature plant.
  • a method for identifying a gene responsible for a desired function or phenotype comprises: 1) transforming a plant cell containing a recombinant vector comprising a polynucleotide promoter sequence of the present invention operably linked to a polynucleotide to be tested, 2) culturing the plant cell under conditions that lead to regeneration and growth of the mature plant to provide a transgenic plant, and 3) to compare the transgenic plant phenotype with the non-plant phenotype. processed or wild type.
  • Figure 1 Flowchart showing the steps involved for the development of the endosperm-specific promoter.
  • FIG. 1 Electrophoretic fractionation of specific fragments representing the CaLTP1 sequence. (+) positive control, (R) root cDNA, (Fr) fruit cDNA and (Fo) cDNA leaf.
  • Figure 3 Representative graph of LTP1 expression profile in root, leaf and fruit in relation to the ubiquitin gene.
  • Figure 4 Validation of LTP1 preferential expression in fruit by Northern blot. Denaturing gel 1.5% with samples of root, leaf and fruit of Coffea arabica 120 days after flowering. R: root; Fo: Leaf and Fr: Fruit. Figure 5. Electrophoretic fractionation of fragments obtained by the 5'race technique. M - 1Kb ladder marker, 1/1 M - Dral library, 2 / 2M - Eco RV library, 3 / 3M - PvuII library and 4 / 4M - Stul library.
  • FIG. 1 Scheme detailing the reconstruction of binary vector PBI121.
  • the vector PBI121 is 12800 bp in length and its Gen Bank access number is AF485783.
  • the construct of interest was obtained by replacing the CaMV 35S promoter (835 bp) with the 451 bp fragment related to the CaLTP1 promoter.
  • FIG. 7 Reconstruction of binary vector PBI121.
  • the vector PBI121 is 12800 bp in length and its Gen Bank access number is AF485783.
  • the construct of interest was obtained by replacing the CaMV 35S promoter (835 bp) with the 451 bp fragment related to the CaLTP1 promoter.
  • FIG. 8 Location of GUS activity in tobacco plants transformed with the PBI promoter.
  • a B C D; and I, J, K, L represent the negative and positive controls (PBI 121) of the experiment, respectively.
  • A, E and I represent leaf and root tissues; B, F and J fruit cross sections; C, G and K seeds; D, H and L stamen, petal and gynoecium.
  • E, F, G and H represent CaLTP1 promoter activity.
  • the present invention relates to an endosperm specific promoter for expression of gene of interest only in the fruit of the transgenic plant organism.
  • a "chimeric gene” is a gene comprising a promoter and a coding region of different origins.
  • the chimeric gene comprises the polynucleotide of the present invention linked to endogenous and / or exogenous gene coding regions.
  • a "consensus sequence” is an artificial sequence in which the base at each position represents the base most often found in the current sequence by comparing different alleles, genes, or organisms.
  • a “promoter” is that portion of DNA above the coding region that contains RNA polymerase II binding sites to initiate DNA transcription.
  • “Expression” is the transcription or translation of a structural, endogenous or heterologous gene.
  • GC box is a common promoter element that can increase promoter activity.
  • TATA box is an element in the promoter, located approximately 30 bases above the transcription start site. TATA box is associated with transcription factors in general, including RNA polymerase II.
  • the term "gene” means a physical and functional unit of inheritance, represented by a DNA segment that encodes a functional protein or RNA molecule.
  • An "endogenous gene” is a gene that is unique to the cell or organism.
  • a "gene ..heterólogo" ,, .. uru is ..gene. is jadp, of an organism.
  • the donor is recombined in the transformed recipient organism. It is a gene that is not proper to the cell or organism.
  • reporter gene is a coding unit whose product is easily tested, for example, CAT, GUS, GAL, LUC, and GFR genes. Expression of a reporter gene can be used to test the function of a promoter linked to that reporter gene.
  • the term "propagule” as used in the present invention means any part of a plant that may be used in sexual or asexual reproduction or propagation, including seedlings.
  • Sense means that the polynucleotide sequence is in the same 5 '-3' orientation with respect to the promoter.
  • Antisense means that the polynucleotide sequence is in the opposite orientation to the 5 '-3' orientation of the promoter.
  • x-mer refers to a sequence comprising at least one specific number ("x") of polynucleotide residues identified as SEQ ID NO1. According to preferred embodiments, the value of x is preferably at least 20, more preferably at least 40, more preferably at least 60 and more preferably at least 80.
  • polynucleotides of the present invention comprise a 20-mer polynucleotide, 40 Mere, 60 Mere, 80 Mere, 100 Mere, 120 Mere, 150 Mere, 180 Mere, 220 Mere, 250 Mere, 300 Mere, 400 Mere, 500 Mere or 500 Mere identified as SEQ ID NO1 and variants thereof.
  • polynucleotide (s) as used herein means a single or double stranded deoxyribonucleotide or ribonucleotide base polymer and includes corresponding RNA and DNA molecules, including HnRNA and mRNA molecules, from both "sense" and "strands".
  • antisense and comprises cDNA, genomic DNA, and recombinant DNA, as well as fully or partially synthesized polynucleotides.
  • An HnRNA molecule contains introns and corresponds to a DNA molecule in a generally one-to-one mode.
  • An mRNA molecule corresponds to a DNA and HnRNA molecule from which the introns have been excised.
  • a polynucleotide may consist of a complete gene, or any portion thereof.
  • Operable "antisense" polynucleotides may comprise a fragment of the corresponding polynucleotide, and the definition of "polynucleotide” thus includes all such operable antisense fragments.
  • Antisense polynucleotides and techniques involving antisense polynucleotides are well known in the art (Sambrook, J.; EFFritsh and T. Maniatis - Molecular cloning. A laboratory manual, 2 nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.)
  • the polynucleotides described in the present invention are preferably about 80% pure, more preferably at least about 90% pure, and most preferably at least about 99% pure.
  • oligonucleotide refers to a relatively short segment of a polynucleotide sequence, generally comprising from 6 to 60 nucleotides. Such oligonucleotides may be used as probes or primers, where probes can be used for use in hybridization assays and primers for use in DNA amplification by polymerase chain reaction.
  • probe used in the present invention refers to an oligonucleotide, polynucleotide or nucleic acid, being RNA or DNA, if occurring naturally as in a purified or synthetically produced restriction enzyme digestion, which is capable of annealing with or specifically hybridizing to a nucleic acid containing sequences complementary to the probe.
  • a probe may further be single stranded or double stranded.
  • the exact length of the probe will depend on many factors, including temperature, probe origin, and method use. For example, depending on the complexity of the target sequence, the oligonucleotide probe typically contains 15-25 or more nucleotides, although it may contain fewer nucleotides.
  • Probes herein are selected to be complementary to differentiate strands of a sequence from a particular nucleic acid. This means that the probe may be complementary enough to be able to "specifically hybridize” or ring to their respective target chains under a number of predetermined conditions. Consequently, the probe sequence need not accurately reflect the complementary sequence of the target. For example, a non-complementary nucleotide fragment may be ligated to the 5 'or 3' end of the probe, with the remainder of the probe sequence being complementary to the target chain. Alternatively, non-complementary bases or long sequences may be interspersed within the probe if it has sufficient complementarity with the target nucleic acid sequence to specifically ring with it.
  • primer refers to an oligonucleotide, whether RNA or DNA, single stranded or double stranded, derived from a biological system, generated by restriction enzyme digestion, or synthetically produced which, when placed in an environment itself, is capable of functionally acting as an initiator of a mold dependent nucleic acid synthesis.
  • the primer When presented with an appropriate nucleic acid template, suitable nucleoside triphosphates, nucleic acid precursors, a polymerase enzyme, suitable cofactors, and conditions such as appropriate temperature and pH, the primer may be extended at its 3 'terminus by the addition of nucleotides by the action of a polymerase or with activity similar to produce a first extension of the product.
  • the primer may vary in length depending on particular conditions and application requirements.
  • the oligonucleotide primer is typically 15-25 or more nucleotides in length.
  • the primer must have sufficient complementarity with the desired mold to begin synthesis of the desired product extent. This does not mean that the primer sequence must represent an exact complement of the desired template.
  • a non-complementary nucleotide sequence may be linked to the 5 'end of a complementary primer.
  • non-complementary bases may be interspersed within the primer oligonucleotide sequence, provided that the primer has sufficient complementarity with the desired template chain sequence to functionally provide a template-primer complex for synthesis of product extension.
  • the term refers to the hybridization of an oligonucleotide to a substantially complementary sequence containing a single stranded DNA or RNA molecule of the present invention.
  • Appropriate conditions necessary for specific hybridization between single-stranded nucleic acid molecules of varying complementarity are well described in the art (Handout: Recombinant DNA Technology. University of Sao Paulo, Chapter 4, 2003).
  • a common formula for calculating stringency conditions required for hybridization between nucleic acid molecules follows below (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) :
  • Tm 81.5 ° C + 16.6 Log [Na +] + 0.41 (% G + C) - 0.63 (% formamide) -600 / bp in the duplex (probe)
  • [Na +] [0.368] and 50% formamide, with 42% GC content and an average probe size of 200 bases, Tm will be 57 ° C.
  • Probes or primers are described as corresponding to the polynucleotide of the present invention identified as SEQ ID NO1 or a variant thereof, if the oligonucleotide probe or primer, or complement thereof, is contained within the sequence specified as SEQ ID NO1, or a variant thereof. .
  • oligonucleotide is referred to herein as primers and probes of the present invention, and is defined as a nucleic acid molecule comprising of two or more ribo or deoxyribonucleotides, preferably more than three.
  • the exact size of oligonucleotides will depend on several factors and on the particular application and use of oligonucleotides.
  • Preferred oligonucleotides comprise 15-50 consecutive base pairs complementary to SEQ ID NO 1.
  • Probes can be easily selected using procedures well described in the art (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Cold Spring Harbor , NY, 1989), taking into consideration DNA-DNA hybridization stringencies, recombination and fusion temperatures, and potential for loop formation and other factors, which are known in the state of the art.
  • complement For the 5'AGTGAAGT3 'sequence, the complement is 3'TCACTTCA5', the reverse complement is 3'ACTTCACT5 'and the reverse sequence is 5'TGAAGTGA3'.
  • variants or substantially similar encompasses amino acid sequences or nucleotides other than specifically identified sequences, wherein one or more nucleotides or amino acid residues are deleted, substituted or added. Variants may be allelic, naturally occurring variants, or non-naturally occurring variants. Variant or substantially similar sequences refer to nucleic acid fragments which may be characterized by the percentage similarity of their nucleotide sequences to the nucleotide sequences described herein (SEQ ID NO 1), as determined by common algorithms employed in the state of the art.
  • Preferred nucleic acid fragments are those whose nucleotide sequences have at least about 40 or 45% sequence identity, preferably about 50% or 55% sequence identity, more preferably about 60% or 65% identity. more preferably about 70% or 75% sequence identity, more preferably about 80% or 85% sequence identity, more preferably about 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%) of sequence identity as compared to the reference sequence. Percentage identity is determined by aligning two sequences to be compared by determining the number of identical residues in the aligned portion, dividing this number by the total number of residues in the searched sequence, and multiplying the result by 100. This alignment can be done using software.
  • vector refers to a replicon, such as plasmid, cosmid, bacmid, phage or virus, to which other gene sequences or elements (whether DNA or RNA) may be linked to be replicated together with the vector.
  • virus derived vector is selected from bacteriophage, vaccinia, retrovirus or bovine papilloma virus.
  • the "recombinant vector” results from the combination of a commercial vector with chimeric genes, or the polynucleotide of the present invention operably linked to an endogenous and / or heterologous polynucleotide of interest which is in turn operably linked to a termination signal.
  • Such vectors may be obtained commercially, including Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif.), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) And Promega (Madison, Wis. ).
  • Some examples of vectors used in the present invention, but not limited to, are pGEM-T, pCAMBIA 1391, gateway vectors, and pMON vector.
  • enhancer sequences known as enhancers, which may be very far from the promoter (before or after, upstream or downstream) and which enhance the transcription rate. These amplifiers are non-specific and potentiate the transcription of any promoter that is in your neighborhood. The efficiency of expression of a gene in a specific tissue depends on the proper combination and integration of the amplifiers, promoters and adjacent sequences.
  • the first discovered enhancer that stimulated eukaryotic gene transcription was SV40 (present in the Simian Virus 40 genome). After the discovery of the SV40 enhancer hundreds of other enhancers such as HSV-1, AMV, HPV-16 were identified in other genomes. in the DNA of eukaryotic cells. (Lodish et al, Cell and Molecular Biology. 4th edition page 368)
  • operably linked means that regulatory sequences required for expression of the coding sequence are placed on the DNA molecule at appropriate positions relative to the coding sequence for the purpose of expressing the coding sequence. This same definition is sometimes applied for the arrangement of coding sequences and transcriptional controlling elements (for example, promoters, enhancers and terminating elements or sequences) in the expression vector.
  • An exogenous coding region is typically flanked by operably linked regulatory regions that regulate expression of the exogenous coding region in a transformed cell (can be microorganism, plant or animal).
  • a typical regulatory region operably linked to an exogenous coding region includes a promoter, that is, a nucleic acid fragment that can cause transcription of exogenous coding regions, positioned at the 5 'region of the exogenous coding region.
  • the regulatory region refers to regions substantially similar to SEQ ID NO 1.
  • the promoter sequence of the present invention may be linked to other regulatory sequences already described, such as: ATATT (strong root expression element), AACAAAC and GCCACCTCAT (seed specific expression elements), CACGTG and CCTACC (both sequences can be stimulated by a stress factor), among others.
  • a "termination sequence” is a DNA sequence that signals the end of transcription.
  • termination sequences are, but are not limited to, SV40 termination signal, HSV TK adenylation signal, Ag obacterium tumefasciens (NOS) nopaline synthase gene termination signal, octopin synthase gene termination signal, CaMV 19S and 35S gene terminating signal, corn alcohol dehydrogenase gene terminating signal, mannopine synthase gene terminating signal, beta-phaseolin gene terminating signal, ssRUBISCO gene terminating signal, signal sucrose synthase gene termination signal, Trifolium subterranean (SCSV) attacking virus termination signal, Aspergillus nidulans trpC gene termination signal and the like.
  • NOS Ag obacterium tumefasciens
  • the present invention provides a regulatory region of isolated polynucleotides which may be employed in manipulating plant phenotypes, together with isolated polynucleotides comprising these regulatory regions. More specifically the present invention relates to the promoter or regulatory sequence according to SEQ ID NO1, responsible for the expression of a representative of the LTP1 family ("Lipid Transfer Protein"), being referred to herein as CaLTP1. responsible for the expression in the endosperm of the fruit.
  • SEQ ID NO1 responsible for the expression of a representative of the LTP1 family (“Lipid Transfer Protein")
  • the amount of a polypeptide of specific interest may be increased or decreased by incorporating additional copies of genes, or coding sequences encoding the polypeptide operably linked to the promoter sequence of the present invention (SEQ ID NO 1), into the genome of a subject. organism, like a plant. Similarly, an increase or decrease in the amount of polypeptide can be obtained by transforming plants with antisense copies of these genes.
  • the polynucleotide of the present invention has been isolated from coffee plants, more specifically Coffea arabica, but it can alternatively be synthesized using conventional synthesis techniques.
  • the isolated polynucleotide of the present invention includes the sequence identified as SEQ ID NO 1; reverse complement of the sequence identified as SEQ ID NO1; reverse complement of the sequence identified as SEQ ID NO 1.
  • the polynucleotide of the present invention may be identified in plant genomic DNA sequences for which genome sequence information is publicly available, or isolated from various polynucleotide libraries, or may be synthesized using techniques that are well known in the art. technique (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • the polynucleotide may be synthesized, for example, using automated oligonucleotide synthesizers (e.g., Beckman OLIGO 1000M DNA synthesizer) to obtain polynucleotide segments of up to 50 or more nucleic acids. A plurality of these polynucleotide segments can then be ligated using standard DNA manipulation techniques that are well known in the art (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • automated oligonucleotide synthesizers e.g., Beckman OLIGO 1000M DNA synthesizer
  • a conventional and exemplary polynucleotide synthesis technique involves the synthesis of a single stranded polynucleotide segment, having, for example, 80 nucleic acids, and hybridizing this segment to a synthesized complementary nucleic acid segment to produce an Overhang '. of 5 nucleotides.
  • the next segment can then be similarly synthesized as one. '.overhang' of ⁇ 5 nucleotides ⁇ no, opposite filament.
  • "Sticky" or cohesive ends ensure proper bonding when the two portions are hybridized.
  • the polynucleotide of this invention may be synthesized completely in vitro.
  • the promoter sequence of the present invention may be employed in recombinant and / or expression vectors to trigger transcription and / or expression of a polynucleotide of interest.
  • the polynucleotide of interest may be endogenous or heterologous to an organism, for example a plant, to be transformed.
  • Recombinant and / or expression vectors of the present invention may thus be employed to modulate transcription and / or expression levels of a polynucleotide, for example, a gene that is present in the wild-type plant, or may be employed to provide transcription and expression.
  • a DNA sequence that is not found in the wild-type plant including, for example, a gene encoding a reporter gene, such as GUS.
  • the polynucleotide of interest comprises an open reading frame encoding a polypeptide of interest.
  • the open reading matrix is inserted into the vector in a sense orientation and transformation with this recombinant vector / genetic construct will generally result in overexpression of the selected polypeptide.
  • the polypeptide of interest which will be regulated by the promoter of the present invention, may be inserted into the vector in sense, antisense orientation or in both directions. Transformation with a recombinant and / or expression vector containing the promoter of the invention by regulating expression of the polynucleotide of interest in antisense orientation or both directions (sense and antisense) will generally result in reduced expression of the selected polypeptide.
  • the polynucleotide of interest is operatively linked to a polynucleotide promoter sequence of the present invention such that a host cell is capable of transcribing an RNA driven by the polynucleotide-linked promoter sequence of interest.
  • the polynucleotide promoter sequence is generally positioned at the 5 'end of the polynucleotide to be transcribed.
  • tissue-specific promoter such as the coffee promoter sequence (Coffea arabica), responsible for the expression of the lipid transfer protein (LTP1) gene identified as SEQ ID NO1, will affect the transcription of the polynucleotide of interest. only in the endosperm of the transformed plant.
  • the recombinant vector or expression vector of the present invention may also contain a selection marker that is effective on cells of the organism, such as a plant, to allow detection of transformed cells containing the inventive recombinant vector.
  • a selection marker typically confer resistance to one or more toxins.
  • An example of this marker is the ntile gene, the expression of which results in resistance to kanamycin or neomycin, antibiotics that are generally toxic to plant cells at a moderate concentration. Transformed cells can thus be identified by their ability to grow in medium containing the antibiotic in question.
  • markers that may be used to construct recombinant and / or expression vectors containing the polynucleotide of the The present invention may be, but is not limited to: hpt gene confers resistance to the hygromycin antibiotic, manA gene and the bar gene.
  • the system that uses the Escherichia coli manA gene (which encodes the PMI - phosphomannose isomerase enzyme) (Miles and Guest, 1984. Complete nucleotide sequence of the fumA gene, of E. coli. Nucleic Acids Res. 1984 April 25; 12 (8): 3631-3642), having mannose as a selective agent, is one of the new systems suggested as alternatives to the first two described above (Joersbo et al., 1998 Parameters interacting with the production of transgenic sugar beet, Physiology Plantarum Volume 105 Issue 1 doi: 10.1034 / j. 1399-3054.1999.105117.x).
  • Mannose-6-phosphate the product of mannose phosphorylation by a hexokinase.
  • PMI promotes the interconversion of mannose-6-phosphate and fructose-6-phosphate, thus allowing the former to be catabolized in the glycolytic pathway (Ferguson and Street, 1958. Analysis of alternative marker / selective agent systems for positive selection of somatic embryos).
  • papaya transgenic crops Rev. Bras Fisiol Veg., 2001, vol.13, no.3, p.365-372.
  • ammonium glufosinate PPT
  • PAT ammonium glufosinate
  • GMO glutamine synthetase
  • the presence of the chimeric gene in transformed cells may be determined by other techniques known in the art (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), such as Southern and PCR.
  • inventive recombinant or expression vector components include the use of synthetic linkers containing one or more restriction endonuclease sites, as described, for example, in Sambrook et al. ("Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Chimeric genes of the present invention may be linked to a vector having at least one replication system, e.g. E.coli, so after each manipulation, the resulting constructs may be cloned and sequenced.
  • Recombinant and / or expression vectors of the present invention may be used to transform a variety of organisms including but not limited to plants: Plants that can be transformed using recombinant and / or expression vectors of the present invention include monocotyledonous angiosperms (e.g., grasses, corn, grains, oats, wheat and barley ...), dicotyledonous angiosperms (eg Arabidopsis, tobacco, vegetables, alfalfa, oats, eucalyptus, maple ...), and gymnosperms (eg pine, spruce white , larch ). Plant transformation protocols are already well known in the art (Plant Genetic Transformation Manual.
  • the recombinant and / or expression vectors of the present invention are employed to transform dicotyledonous plants.
  • the plant is selected from the Rubiaceae family, more preferably from the Coffea arabic species.
  • plants may be usefully transformed with the recombinant and / or expression vector of the present invention include, but are not limited to: Anacardium, Anona, Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Carica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, coconuts, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majority, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Pannesetum, Passiflora, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Pyrus Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, S
  • the transcription termination signal and polyadenylation region of the present invention includes, but is not limited to, SV40 termination signal, HSV T adenylation signal, A. tumefasciens nopaline synthase gene termination signal (nos) , CaMV RNA 35S gene termination signal, Trifolium subterranean (SCSV) attacking virus termination signal, Aspergillus nidulans trpC gene termination signal, and the like.
  • the terminator used in the present invention is the LTP1 (Lipid Transfer Protein) gene terminator.
  • Recombinant and / or expression vectors of the invention may be introduced into the desired host plant genome by a variety of conventional techniques.
  • mediated introduction ..by. A- tumefasciens; electroporation; protoplast fusion; injection into reproductive organs; injection into immature embryos; microinjection of plant cell protoplasts; using ballistic methods such as bombardment of DNA-coated particles and others.
  • the choice of technique will depend on the plant to be transformed. For example, dicotyledonous plants and some monocotyledons and gymnosperms can be transformed by Agrobacterium Ti plasmid technology.
  • Recombinant and / or expression vectors may be combined with appropriate T-DNA flanking regions and introduced into the conventional A.
  • tumefasciens host vector.
  • the virulence function of host A. tumefasciens will direct the insertion of the gene constructs and adjacent marker into plant cell DNA when the cell is infected with the bacterium.
  • A. tumefasciens-mediated transformation techniques including disarmament and the use of binary vectors, are well described in the scientific literature (as mentioned in US patent application 20020152501, Horsch et al. Science 233: 496-498, 1984; and Fraley et (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803, 1983).
  • the binary vector preferably used in the invention is the pBI 121 binary vector. Microinjection techniques are known in the state of the art and well described in scientific and patent literature.
  • the present invention utilizes transformation via A. tumefasciens-mediated introduction using model plant A. thaliana (Clough at al, "Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of A.
  • transformation methods may be used to insert recombinant and / or expression vectors of the present invention, such as biobalistics.
  • biobalistics is a direct DNA transformation technique that utilizes high speed driven microprojectiles to carry DNA into cells [Rech, EL; Aragón, FJL
  • cells having the recombinant and / or expression vector of the present invention incorporated into their genome can be selected by means of a marker such as the resistance marker. hygromycin or kanamycin.
  • the cells of Transformed plants can then be grown to regenerate an entire plant that has the transformed genotype and ultimately the desired phenotype.
  • Such regeneration techniques rely on the manipulation of certain phytohormones in tissue culture growth media, typically containing a biocidal and / or herbicidal marker, which must be introduced together with the desired nucleotide sequence. Plant regeneration from protoplast culture is described in Evans et al. (Evans et al, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Celi Culture, pp.
  • Regeneration can also be achieved through plant calli, explants, organs, or part thereof.
  • Such regeneration techniques are well described in the prior art, such as in Leelavathi et al. [Leelavathi et al, A simple and rapid Agrobacterium-mediated transformation protocol for cotton (G hirsutum L.): Embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Celi Rep (2004) 22: 465-470].
  • This paper describes a protocol for cotton transformation and regeneration where the embryogenic callus with Agrobacterium is grown. under dehydration stress.- and antibiotic selection for 3. to .6 months.for the regeneration of several transgenic embryos, an average of 75 globular embryos. Being observed on the selection of plaques these embryos are cultured and multiplied in the medium, followed by the development of cotyledon embryos on the embryo maturation medium. To obtain an average of 12 plants per co-cultured callus petri dishes. Approximately 83% of these plants are transgenic.
  • the resulting transformed plants can be reproduced sexually or asexually using methods known in the art [Leelavathi et al, A simple and rapid Agrobacterium-transformation protocol for cotton (Gossipium hirsutum L.): Embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Celi Rep, 2004, 22: 465-470], to give successive generations of transgenic plants.
  • RNA production in cells can be controlled by choice of promoter sequence, functional copy number selection, or via the integration site of polynucleotides incorporated into the host genome.
  • An organism may be transformed using a recombinant and / or expression vector of the present invention. containing more than one open reading frame encoding a polypeptide of interest.
  • the isolated polynucleotide of the present invention also has utility in genome mapping, physical mapping and positional cloning of genes.
  • the sequence identified as SEQ ID NO1 and variants thereof may be used to design oligonucleotide probes and primers.
  • Oligonucleotide probes designed using the polynucleotide of the present invention can be used to detect the presence of the lipid transfer protein (LTP1) gene promoter in any organism having sufficiently similar DNA sequences in their cells using well known techniques. prior art, such as dot blot DNA hybridization techniques (Sambrook, J., Fritsch, EF, Maniatis, T. Molecular cloning a laboratory manual. 2 nd edition [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)
  • Oligonucleotide primers designed using the polynucleotide of the present invention may be used for PCR amplifications.
  • the present polynucleotide. invention can also. used to label or identify a reproductive organism or material. This tag may be obtained, for example, by stable introduction of a non-disruptive, non-functional heterologous polynucleotide identifier into an organism under the control of the polynucleotide of the present invention.
  • the proposed promoter for the present invention was obtained by preferably following the steps:
  • the obtained genetic material can be used in PCR reactions with specific primers of the selected gene, such as the LTP1 gene, to evaluate its specificity.
  • primers can be designed with the aid of the Primer program (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) (Rozen, S and Skaletsky HJ 2000 Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology, Human Press, Totowa, NJ, pp 365-386) or any other program and / or process that provides candidate specific primers.
  • 4 - PCR reactions may be conducted in a special apparatus for the procedure, such as MJ Research model PTC-100 thermocycler, or any other thermocycler capable of performing its function under ideal conditions for the reaction, in which the initial incubation of 94 ° C for 3 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds for denaturation, 50 ° C for 40 seconds for oligonucleotide hybridization and 72 ° C for 1 minute for extension.
  • a special apparatus for the procedure such as MJ Research model PTC-100 thermocycler, or any other thermocycler capable of performing its function under ideal conditions for the reaction, in which the initial incubation of 94 ° C for 3 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds for denaturation, 50 ° C for 40 seconds for oligonucleotide hybridization and 72 ° C for 1 minute for extension.
  • each reaction should be subjected to an additional period, in which 10 minutes at 72 ° C are recommended to complement the polymerization. It is recommended that each reaction contain ⁇ ⁇ . of 1: 10 diluted cDNA, 2.5 U Taq DNA polymerase and 30 pmoles of primer oligonucleotides in a final volume of 50 ⁇ l.
  • the identity of the amplified product can be confirmed, for example, by the electrophoretic migration of fragments, in which it is recommended to use as a comparison the positive control, consisting of a vector, such as a vector from the Genome Project database. Coffee (FV2-050) containing the sequence studied. 7 - After fractionation of the genetic material, the samples should be subjected to the Northen Blot process, which is recommended to transfer the genetic material to the proper membrane for the procedure, such as the nylon membrane, and hybridized in SSPE with probe corresponding to the partial sequence presumed LTP selected, such as labeling with isotope phosphorus 32 - 32 P.
  • the Northen Blot process which is recommended to transfer the genetic material to the proper membrane for the procedure, such as the nylon membrane, and hybridized in SSPE with probe corresponding to the partial sequence presumed LTP selected, such as labeling with isotope phosphorus 32 - 32 P.
  • the promoter should be isolated by any isolation technique, which is recommended to use the 5 ' race technique combined with the simplified nested PCR technique. Genome Walker Universal Kit (Clontech) as specified by the manufacturer.
  • the derived fragments may be cloned and sequenced by a process intended for this purpose. Recommends the use of the dideoxynucleotide method (Sanger,
  • Agrobacterium tumefaciens strains as a vector.
  • Agrobacterium tumefaciens CV3101 (C58PMP90) strains using any specific protocol for this purpose, such as that proposed by Horsch (Horsch RB, Fry JB, Hoffman NL, Eicholts D., Rogers SG and Fraley RT 1985.
  • Horsch Horsch RB, Fry JB, Hoffman NL, Eicholts D., Rogers SG and Fraley RT 1985.
  • Horsch Horsch RB, Fry JB, Hoffman NL, Eicholts D., Rogers SG and Fraley RT 1985.
  • the transformation efficiency of explants should be assessed by transient and stable expression in the tissues of regenerated propagules of a gene of interest, which is recommended to use the gus gene.
  • 12 - Analysis of gus gene expression should be performed by histochemical assay protocols, such as, for example, adaptation of the protocol described by Jefferson (Jefferson RA, Kavangh TA and Bevan MW 1987. GUS fusions: ⁇ -glucuronidase as a sensitive EMBO J. 6: 3901-3907) on leaves, roots, fruits, seeds and flowers (petal, gynoecium, stamen, pollen) of the transformed plants.
  • Jefferson Jefferson
  • GUS fusions ⁇ -glucuronidase as a sensitive EMBO J. 6: 3901-3907
  • a contig named fruit candidate gene 1 - CaLTPl was selected for experimental validation because it has a high degree of specificity and a high level of exclusive expression in fruit and is not protected by patent, neither the gene nor its promoter. After the characterization and validation assays it was clear that it was the LTP (Lipid Transfer Protein) gene.
  • Experimental validation of the CaLTP1 gene was performed as described by temporal and spatial expression assays using the following techniques: RT-PCR (Transcriptase Reverse-PCR); Northern Blot; RT-qPCR.
  • RNA samples from Coffea arabica cv IAPAR 59 were extracted from the experimental field of Embrapa Cerrados. RNA was extracted according to the methodology described by Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, and Bedbrook J. 1985. High expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4: 2411-2418). Then the RNAs were evaluated for integrity in denaturing gel 1.5%. Root, leaf and fruit RNA samples were used as a template in the formation of cDNA molecules by RT-PCR reactions using oligo dT primers. The cDNAs obtained were used in PCR reactions with specific LTP1 gene primers for tissue specificity evaluation.
  • Reactions were conducted in a MJ Research model PTC-100 thermocycler, with an initial incubation of 94 ° C for 3 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds for denaturation, 50 ° C for 40 seconds for oligonucleotide hybridization, and 72 cycles. ° C for 1 minute for extension. After the cycles, the reactions were subjected to an additional 10 minutes at 72 ° C to complement the polymerization. Each reaction contained ⁇ ⁇ of 1: 10 diluted cDNA, 2.5 U Taq DNA polymerase and 30 pmoles of primer oligonucleotides in a final volume of 50 ⁇ .
  • RNA, root, leaf and fruit samples of Coffea arabica cv IAPAR 59 were extracted and grown in the experimental field of Embrapa Cerrados, following the protocol described by Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, and Bedbrook J. 1985.). introduced chimeric genes in regenerated transformed plants (EMBO J 4: 2411-2418). Once extracted, the RNAs were fractionated in 1.5% denaturing gel for analysis of their integrity.
  • RNAs were subjected to DNAse enzyme treatment which consisted of a reaction containing 10 ⁇ g of one of the RNAs, 5 U of DNAse enzyme, 2 of the 10X reaction buffer (200mM Tris-HCl pH 8, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT) and DEPC water to complete the volume of 20 ⁇ .
  • the reaction was left at 37 ° C for 10 minutes and then transferred to ice. After the reaction the samples were treated in order to inactivate the DNAse, that is, 180 ⁇ DEPC water and 200 ⁇ ⁇ chlorophane (24:24: 1 phenol, chloroform and isoamyl alcohol, respectively) were added.
  • the samples were centrifuged at 12,000 g for 3 minutes.
  • the upper (aqueous) phase was transferred to a new tube and ethanol (2.5 times the sample volume) and 3M NaAc (1/10 of the sample volume) were added and left at -20 ° C for approximately 16 h.
  • the samples were centrifuged at 12,000 g for 40 minutes, the supernatant discarded and the pellet was washed with 70% ethanol before being resuspended in 20 ⁇ l DEPC water. After treatment, an aliquot of the RNAs were placed on 1.5% agarose gel for quality analysis.
  • the cDNA synthesis reaction was performed with 300 ng of RNA, root, leaf or fruit (DNAse treated), 2 ⁇ L oligo dT (50 ⁇ ), 1 ⁇ L dNTP Mix (15 mM) and DEPC water to complete 13 iL. The reaction was heated at 65 ° C for 5 minutes and then placed on ice for 3 minutes. Then 4 ⁇ L of First-Strand Buffer (5X), 1 ⁇ L of DDT (0, 1 M) and 1 ⁇ Super SuperScript III RT (200 ⁇ / ⁇ ) were added. The reaction was incubated at 50 ° C for 1 hour and then at 70 ° C for 15 minutes to inactivate the reaction. EXAMPLE 7 - RT-qPCR
  • RNA samples were treated with DNase and converted to cDNA.
  • PCR reactions were prepared using SYBR Green reagent and the following specific oligonucleotides:
  • RNA extraction method was as described by Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, and Bedbrook J. 1985. High level expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4: 2411-2418).
  • RNA was fractionated on 1.5% denaturing gel, transferred to a nylon membrane, and hybridized in SSPE with a probe corresponding to the partial sequence of the supposed 32 P-labeled LTP.
  • the result obtained by experimental validation by Northern blotting demonstrates the expression. fruit-specific gene (Fig. 4).
  • EXAMPLE 9 Promoter Isolation The promoter was isolated by the 5'race technique, coupled with the PCR technique.
  • EXAMPLE 10 Obtaining Binary Vectors
  • 4 binary vectors containing the full version of the CaLTP1 promoter which is a 1.2 Kb fragment and 3 truncated 451 bp versions, were made. , 785 bp and 1.0 Kb.
  • the fragments were cloned into pBI 121 binary vector at the Hind III and Bam H1 sites according to standard molecular biology techniques (SAMBROOK, J .; FRITSCH, E.E; MANIATIS, T. Molecular. Cloning: A Laboratory Manual 1. 2. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 608p).
  • the binary vectors made according to the previous item were used in the transformation of tobacco plants.
  • Agrobacterium tumefaciens CV3101 (C58PMP90) strains were transformed independently with the 4 constructs cited in the previous item, as well as with the original Horsch pBI 121 positive control (Horsch RB, Fry JB, Hoffman NL, Eicholts D., Rogers SG and Fraley).
  • RT 1985 A simple and general method for transferring genes into plants (Science 227: 1229-1231). After this stage, leaf sections (explants) of Nicotiana tabacum were immersed in a bacterial suspension containing the binary vector for 5 minutes.
  • the 451 base pair promoter fragment is capable of directing the expression of the gus reporter gene only in the seed of tobacco plants (Figure 7). Gus expression analysis was performed by histochemical assay according to the protocol described by Jefferson (Jefferson RA, Kavangh TA and Bevan MW 1987. GUS fusions: ⁇ -glucuronidase as a sensitive and versatile fusion marker gene in higher plants. EMBO J. 6: 3901-3907) on leaves, roots, fruits, seeds and flowers (petal, gynoecium, stamen, pollen) of plants transformed with the 451bp promoter and the positive and negative controls.
  • the cuts were made by hand using a scalpel and the samples were immersed in the reaction buffer consisting of: 1 mM X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-PD-glucuronide cyclohexylammonium salt), 10 mM EDTA, 0.5 mM potassium ferricyanide; 3 ⁇ 4 and 0,5 mM potassium ferrocyanide,

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Abstract

A presente invenção diz respeito a uma sequência promotora específica para a expressão de genes de interesse em endosperma de frutos. A invenção ainda descreve construções de DNA que contém o promotor bem como o método utilizando tais construções para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. A expressão do transgene somente no órgão de interesse permite o acúmulo do transcrito exógeno somente no fruto e constitui vantagem em relação à expressão constitutiva, pois favorece a implementação de estratégias que visam a obtenção de cultivares com maior valor agregado como: adaptação a estresse ambiental, tolerância a patógenos, pragas e defensivos agrícolas, aumento do valor nutricional e terapêutico e uma nova alternativa para sistemas de expressão em organismos vegetais gerando cultivares mais competitivas a custos mais baixos. Além disso, a presente invenção também apresenta uma sequência com expressão constitutiva, oferecendo uma alternativa para a implementação de sistemas de expressão onde a expressão constitutiva é requerida. A invenção tem como-objetivo o aumento-dos beneficios econômicos, sociais e ambientais e de biossegurança associados à transformação genética.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA MODIFICAR A EXPRESSÃO DE GENES
DE INTERESSE
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção está relacionada ao campo da biotecnologia. Mais especificamente a invenção diz respeito a um promotor específico para a expressão de genes de interesse em endosperma de frutos. A invenção descreve ainda construções de DNA que contêm o promotor da invenção operacionalmente ligado a um gene heterólogo e/ou endógeno. Além disso, a invenção diz respeito ao uso destas construções na forma de vetores de expressão, vetores recombinantes e em plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. A invenção ainda descreve um método utilizando tais construções contendo o promotor da invenção para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. Dessa forma, a expressão do transgene somente na parte de interesse permite o acúmulo do transcrito exógeno somente no fruto, favorecendo a implementação de estratégias que visam o aumento do valor agregado, a geração de cultivares mais adaptados ao estresse ambiental, a patógenos e pragas, defensivos agrícolas, além de plantas com alto valor nutricional e alto valor terapêutico. Além dessas vantagens, a presente invenção é uma nova alternativa para sistemas de expressão em organismos vegetais podendo ser utilizada para a geração de novas cultivares e programas de melhoramento. A invenção tem como objetivo o aumento dos benefícios económicos, sociais e ambientais e de biossegurança associados à transformação genética.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Nas ultimas três décadas a agricultura tem sido beneficiada pela biotecnologia a qual associa a tecnologia do DNA recombinante, a cultura de tecidos vegetais e os métodos de melhoramento clássico para gerar plantas resistentes a herbicidas (Aragão, F.J.L., Vianna, G. R., Albino, M.M.C. & Rech, E.L. 2002 Transgenic Dry Bean Tolerant to the Herbicide Glufosinate Ammonium. Crop Science, v. 42, n. 4, p. 1298-1302), a insetos-praga (Lilley C. J., Wang D., Atkinson H. J. & Urwin P. E. 2010 Effective delivery of a nematode-repellent peptide using.Plant Biotechnology Journal, pp. 1-11 doi: 10.1111 /j .1467-7652.2010.00542.x, a root-cap-specific promoter) e tolerantes a seca (Quan R, Hu S, Zhang Z, Zhang H, Zhang Z, Huang R. Overexpression of an ERF transcription factor- TSRFl improves rice drought tolerance. Plant Biotechnol J. 2010 May l ;8(4):476-88), além de plantas com alto valor nutricional (Aluru, M, Xu, Y., Guo, R., Wang, Z., Li, S., White, W, Wang, K. & Rodermel, S. 2008 Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content. J. Exp. Bot., v. 59, n. 3, p. 3551- 3562) e alto valor terapêutico (Marcondes, J. & Hansen, E. 2008 Transgenic lettuce seedlings carrying hepatitis B virus antigen HBsAg. Braz. J. Infect. Dis., v.12, n. 6, p. 469-471). Somadas, essas características resultam em aumento de produção, ganhos económicos, melhoria da qualidade de vida da população e preservação do meio ambiente. Por meio da técnica de transgenia é possível a introdução de genes de interesse independentemente de barreiras interespecíficas.
Apesar dos benefícios económicos, sociais e ambientais associados à transformação genética, essa tecnologia se tornou alvo de preocupação por parte de consumidores e ambientalistas devido a questões de biossegurança.
Dados da literatura apontam uma evolução na aplicação da transformação genética de acordo com o surgimento de várias gerações de transgênicos. A primeira e segunda geração de plantas, transgênicas utilizaram promotores constitutivos como . o promotor do vírus do mosaico da couve flor (CaMV 35S) (Odell, J.T., Nagy, F. & Chua, N-H. 1985 Identification of DNA sequences required for the activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature, v. 313, p. 810-812), promotores de genes encontrados no T-DNA de Agrobacterium tumefaciens como por exemplo, o promotor do gene da enzima nopalina sintetase (Bevan, M. W., Barnes, W. M. & Chilton, M. D. 1983 Structure and transcription of the nopaline syntase gene region of T-DNA. Nucleic Acids Research, v. l l, n. 2, p. 369-385) e promotores de genes que codificam proteínas altamente conservadas e envolvidas em processos vitais de praticamente todos os organismos como a ubiquitina (Toki S., Takamatsu S., Nojiri C, Ooba S., Anzai H., Iwata M., Christensen A.H., Quail P.H. & Uchimiya H. 1992 Expression of a Maize Ubiquitin Gene Promoter-bar Chimeric Gene in Transgenic Rice Plants. Plant Physiol. Nov;100(3): 1503-7) e a actina (An Y.Q., McDowell J.M., Huang S., McKinney E.C., Chambliss S. & Meagher R.B. 1996 Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. Plant J. Jul; 10(1): 107-21). Entretanto, a terceira geração de plantas transgênicas caracteriza-se, entre outros aspectos, pela utilização de promotores tecido-específicos, tais como: promotores específicos de células epidérmicas (Hooker T.S., Millar A.A. & Kunst L. 2002. Significance of the expression of the CER6 condensing enzyme for cuticular wax production in Arabidopsis. Plant Physiol. Aug; 129(4): 1568-80), de floema (Okumoto S., Koch W., Tegeder M., Fischer W.N., Biehl A., Leister D., Stierhof Y.D. & Frommer W.B. 2004. Root phloem-specific expression of the plasma membrane amino acid proton co- transporter AAP3. J Exp Bot. Oct;55(406):2155-68), de pólen (Wakeley PR, Rogers HJ, Rozycka M, Greenland AJ, Hussey PJ. A maize pectin methylesterase-like gene, ZmC5, specifically expressed in pollen. Plant Mol Biol. 1998 May;37(l): 187-92) ou induzidos por estresses bióticos (Himmelbach A., Liu L., Zierold U., Altschmied L., Maucher H., Beier F., Muller D., Hensel G, Heise A., Schutzendixbel A., Kumlehn J. & Schweizer P. 2010. Promoters of the barley germin-like GER4 gene cluster enable strong transgene expression in response to pathogen attack. Plant Celi. 2010. Mar; 22(3):937-52. Epub Mar 19), abióticos (Rai M., He C. & Wu R. 2009. Comparative functional analysis of three abiotic stress-inducible promoters in transgenic rice. Transgenic Res. Oct;18(5):787-99) e químicos (Tomsett, A. Tregova, A. Garoosi and M. Caddick, Ethanol-inducibic gene expression: first ste to vards a new green revolution?,; Trends, Plant Sei. 9 (2004), pp. 159-161) para promover uma expressão do transgene pontual e apenas quando necessário.
A obtenção e disponibilização de promotores capazes de limitar a expressão gênica temporal e/ou espacialmente pode ser uma das maneiras de equilibrar os benefícios da transgenia e suas restrições.
Promotor é um conjunto de módulos de controle de transcrição, organizados em volta do sítio de iniciação da enzima RNA polimerase II (Potenza, C; Aleman, L. & Sengupta-Gopalan, C. 2004. Targeting transgene expression in research, agricultural, and environmental applications: Promoters used in plant transformation. In Vitro Cellular Development Biological-Plant v. 40, p.1-22) os quais contém sequências específicas reconhecidas por proteínas envolvidas na transcrição. Diferentes classes de promotores vêm sendo descritas na literatura, baseadas em seu perfil de expressão. Entre elas está a dos promotores constitutivos, os quais são ativos em todos os tecidos e em todas as fases do desenvolvimento do organismo, como, por exemplo, o CaMV35S (Odell, J.T., Nagy, F. & Chua, N-H. 1985. Identification of DNA sequences required for the activity of the cauliflower mosaic vírus 35S promoter. Nature, v. 313, p. 810-812). Já os promotores tecido/órgão-específicos promovem a expressão de seu gene correlato somente em seu tecido/órgão-alvo como fruto (Atkinson R.G, Bolitho K.M., Wright M.A., Iturriagagoitia-Bueno T., Reid S.J. & Ross G.S. 1998 Apple ACC-oxidase and polygalacturonase: ripening-specific gene expression and promoter analysis in transgenic tomato. Plant Mol Biol. Oct; 38(3):449-60), semente-grão (Paine J.A., Shipton C.A., Chaggar S., Howells R.M., Kennedy .J., Vernon G, Wright S.Y., Hinchliffe E., Adams J.L., Silverstone A.L. & Drake R. 2005. Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content. Nat Biotechnol. Apr;23(4):482-7), raiz/tubérculos (Visser R.G, Stolte A. & Jacobsen E. 1991. Expression of a chimaeric granule-bound starch synthase-GUS gene in transgenic potato plants. Plant Mol Biol. Oct; 17(4): 691-9), flores (Annadana S., Beekwilder M.J., Kuipers G, Visser P.B., Outchkourov N., Pereira A., Udayakumar M., De Jong J. & Jongsma M.A. 2002. Cloning of the chrysanthemum UEP1 promoter and comparative expression in florets and leaves of Dendranthema grandiflora. Transgenic Res. Aug;l l(4):437-45) e folhas (Nomura M., Katayama K., Nishimura A., Ishida Y., Ohta S., KQmaii., ,..Miyao-Iokuto Matsuoka M. 2000, The promoter o-f-rbcS in a C3 plant (rice) direets organ-specific, light-dependent expression in a C4 plant (maize), but does not confer bundle sheath cell-specific expression. Plant Mol Biol. Sep;44(l):99-106). Existem ainda os promotores responsivos ou induzíveis os quais são ativados mediante uma determinada situação, em resposta a estresses bióticos, abióticos ou químicos. Promotores isolados a partir de um dado organismo podem ser utilizados para regular um gene de outro organismo por meio de construções gênicas quiméricas.
Existem inúmeros promotores tecido-específicos descritos para plantas, como é o caso da expressão específica em semente (WO8903887), tubérculo (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323: 1330), folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12:579-589), caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633), tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman et al., 1989 Gene 84: 359- 369 e Schmulling et al. (1989) Plant Celi 1 , 665-670), raiz (US20060143735 e como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1989 Genes Devei. 3: 1639-1646), estames (WO8910396, W09213956), promotores específicos da zona de deiscência (W09713865), meristema (Ito et al. (1994) Plant Molecular Biology, 24, 863 a 878) e fruto (Edwards and Coruzzi (1990) Annu.Rev.Genet. 24, 275 a 303 e US5753475, sendo que nesse último documento, a sequência apresentada tem ação específica no pericarpo do fruto.
Na presente invenção, apresentamos um promotor isolado a partir de cafeeiro (Coffea ssp), específico do endosperma do fruto. O endosperma é a parte consumida do grão, de grande interesse económico, e a possibilidade de expressar uma proteína de interesse especificamente no endosperma é útil na introdução de características relacionadas à qualidade nutricional, características organolépticas, vantagens na fase pós-colheita. Atualmente, os promotores utilizados na obtenção dos transgênicos comerciais são frequentemente constitutivos e promovem a expressão do transgene em todos os tecidos da planta e em todas as fases do desenvolvimento. Essa característica acarreta desgaste energético na planta, pois ocorre desperdício metabólico na produção de uma proteína em quantidades e locais em que ela é desnecessária e pode levar a diminuição da produtividade. Além disso, é desejável do ponto de vista comercial a agregação de. valor a culturas importantes ..economicamente como é o casa- do .arroz dourado, rico em β-caroteno (Beyer P. Golden Rice and 'Golden' crops for human nutrition. 2010. May 15. N Biotechnol. [Epub ahead of prinf]. http://vvw.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B8JG4-5033Y3B-
2&_user=7430124&_coverDate=05%2F 15%2F2010&_rdoc=l &_fmt=high&_orig=sear ch&_sort=d&_docanchor=&view=c&_acct=C000012878&_version= 1 &_urlVersion=0 &_userid=7430124&md5=a9c6d210db86be4e6946f0fl f69766c0). Outro aspecto importante é a facilitação de testes de biossegurança, uma vez que a expressão do gene fica restrita a um só órgão.
O uso cada vez mais frequente da transgenia como recurso na resolução de problemas de culturas economicamente importantes ocorre porque a transgenia permite a incorporação de características desejáveis de forma direcionada, independentemente de barreiras entre espécies.
A maioria das plantas transgênicas lançadas no mercado até o presente utiliza-se de promotores constitutivos, cujo produto é expresso em todos os tecidos do organismo. Outro fator limitante é a dependência tecnológica uma vez que os usos dos promotores disponíveis atualmente estão protegidos por patentes. A invenção aqui proposta pode ainda ser vista como uma alternativa a regiões promotoras já existentes, principalmente em cultivares e programas de melhoramento.
O cenário agronómico atual conta com impactos promovidos pelas mudanças climáticas os quais causam sérios desequilíbrios no meio ambiente e na agricultura e com o aumento populacional, que é um fator gerador de desequilíbrio ambiental pela demanda de espaço para aumento da produção agrícola. Para mitigar esses impactos é necessário o manejo sustentável dos recursos naturais como água e espaço e também das adversidades como seca, pragas e patógenos. Desta forma, plantas mais adequadas a esse cenário precisam ser desenvolvidas e a transgenia é uma ferramenta que acelera a obtenção desses cultivares.
O documento PI0209551-3 apresenta uma invenção que se refere a uma sequência de nucleotídeos derivada de folhas de café que pode ser usada como um promotor para uma expressão induzível de genes em plantas. Particularmente, a referida invenção pertence a uma sequência de nucleotídeos englobando o promotor e a região de codificação de um gene rbcS. De forma diferente, a invenção proposta no presente documento trata-se de. unu promotor específico para frutos e além .de ..con.sistir.-um a alternativa a processos de transgenia, particularmente em organismos vegetais.
Os documentos WO0151637 e WO0302939 se referem a promotores, isolados de Fragaria vesca ~ morango, que dirigem seletivamente a expressão de sequências de DNA colocados sob o controle do mesmo nos frutos de plantas. Quando comparadas ao presente invento, nota-se que as sequências dos promotores descritos nas patentes supracitadas foram isoladas de Fragaria vesca - morango. A proposta revelada no presente documento possui como vantagem a sua utilização para a geração de cultivares e/ou programas de melhoramento em diversos organismos vegetais, inclusive aos pertencentes ao género Coffea ssp, uma vez que o isolado foi obtido desse mesmo género. Além disso, o promotor proposto apresenta alternativa para a criação de organismos vegetais expressando transgenes.
A patente KR100797644 por sua vez, se refere a um promotor de expressão específico em frutos, derivado do Citrus unshiu - fruto cítrico de origem japonesa. O promotor é fornecido para induzir a expressão de período de maturação tardio em frutos, expressar eficientemente um gene exógeno em frutos e controlar sua expressão, de modo que plantas transgênicas sejam produzidas eficientemente. A vantagem ao se utilizar a invenção proposta pelo nosso grupo se faz particularmente nas cultivares do género Coffea ssp ou mesmo em programas de melhoramento desse género por se tratar de uma região regulatória presente no próprio género. Apresentando também uma alternativa para a criação de organismos vegetais expressando transgenes, como supracitado.
O documento WO2010093175 apresenta um promotor de expressão específico, do gene HR7, enquanto o documento WO2010012848 refere-se a uma sequência promotora denominada FSP1 situada na região 5 'do DNA do gene Snl, ambas derivadas do Solanum lycopersicum - tomate. De acordo com o documento, um gene introduzido a partir de uma planta transformada pode ser especificamente expresso em tecido de flores e frutos, quando comparado ao utilizado convencionalmente, como, por exemplo, o promotor do Cauliflower mosaic virus - CaMV 35S. Apesar de ser um promotor específico podendo ser utilizado para a expressão em frutos, apresenta como desvantagem ao promotor aqui pleiteado a impossibilidade de ser utilizado como um promotor nativo do género Coffea ssp e/ou programas de melhoramento desse mesmo género.
Por sua vez, as invenções retratadas nos documentos CN1298021 e WO2005026366 se referem a sequências para direcionar a expressão de um gene de interesse no endosperma. Entretanto, essas mesmas são derivadas das sequências controladoras 5 ' do gene waxy e do gene glutelin gene GluD-1 respectivamente, do arroz apresentando assim, as mesmas desvantagens citadas no parágrafo anterior referentes ao género Coffea ssp.
A invenção retratada no documento US2007169226 refere se a métodos e reagentes para a expressão de genes regulada temporalmente e/ou espacialmente, especialmente em sementes de plantas e tecidos reprodutivos femininos relacionados. Entretanto, as composições compreendem novas sequências de nucleotídeos para um promotor que sabidamente controla a expressão em sementes, do gene conhecido como eepl e não de frutos especificamente. Além da sequência não ser específica para Coffea ssp.
De forma bastante similar ao documento do item anterior, o documento WO2008040061 revela uma sequência de ácidos nucléicos isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos que corresponde a uma região promotora ativa de uma sequência de DNA. Contudo, a sequência de ácido nucléico isolada é derivada de um grão de cereal e trás as mesmas desvantagens referentes à utilização do promotor no género Coffea ssp e nos programas de melhoramento do referido género.
Ainda de forma semelhante, os documentos US2009089897 e US2010037347 fornecem composições e métodos para a regulação da expressão de sequências de nucleotídeos em planta, sendo que as novas composições são sequências de nucleotídeos para promotores de tecido, entretanto, isolado a partir de sorgo.
O documento WO2010118477 por sua vez proporciona composições compreendendo sequências promotoras operáveis em plantas, isoladas de Triticum aestivum - trigo, e suas variantes, que conferem expressão seletiva/específica de genes específicos especialmente no endosperma sendo, portanto diferente e não apresentando as vantagens da sequência aqui proposta em relação ao género Coffea ssp.
A patente US7071378 e o pedido de patente WO2005026366 revelam em seu conteúdo sequências de nucleotídeos promotoras isoladas, respectivamente de Zea mays - milho e Hordeum vulgare - cevada, que permitam a expressão de sequências codificadoras onde podem .estar .! igadas. que são específicas„para região do. endosperma.
Diante do explicitado, a presente patente refere-se a uma nova sequência promotora específica de endosperma para a expressão de gene de interesse somente no fruto. Além de apresentar vantagens como a expressão direcionada apenas no endosperma em frutos e ao ser utilizadas em cultivares de Coffea ssp e programas de melhoramento desse mesmo género, a invenção traz ainda uma nova alternativa para sistemas de expressão em vegetais.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção se refere a um novo promotor para expressão específica de gene em endosperma de frutos. Dessa forma, a expressão do transgene somente na parte de interesse permite o acúmulo do transcrito exógeno somente no fruto, favorecendo a implementação de estratégias que visam o aumento do valor agregado, a geração de cultivares mais adaptados ao estresse ambiental, a patógenos e pragas, defensivos agrícolas, além de organismos vegetais com alto valor nutricional e alto valor terapêutico. Além dessas vantagens, a presente invenção é uma nova alternativa para sistemas de expressão em organismos vegetais podendo ser utilizadas para a geração de novas cultivares e programas de melhoramento.. A invenção tem como objetivo o aumento dos benefícios económicos, sociais e ambientais e de biossegurança associados à transformação genética. Em uma primeira concretização, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo que seja substancialmente similar à SEQ ID NOl ; sequência reversa de SEQ ID NOl ; sondas e iniciadores correspondendo à SEQ ID NOl .
Em outro aspecto, a presente invenção provê genes quiméricos compreendendo o polinucleotídeo da presente invenção, ou sozinho, ou em combinação com um ou mais polinucleotídeos conhecidos, junto com células e organismos compreendendo estes genes quiméricos.
Em um aspecto relacionado, a presente invenção provê vetores recombinantes compreendendo, na direção 5 '-3', uma sequência de promotor de polinucleotídeo da presente invenção, um polinucleotídeo a ser transcrito, e uma sequência de terminação de genes. O polinucleotídeo a ser transcrito pode compreender uma armação de leitura aberta de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, ou pode ser uma região de não codificação, ou não traduzida, de um polinucleotídeo de interesse. A matriz de leitura aberta pode ser orientada em uma direção "sense" ou "antisense". Preferivelmente, a sequência de terminação de genes é funcional em uma planta hospedeira. Mais preferivelmente, a sequência de terminação de genes é a do gene de interesse, mas podendo ser outras descritas no estado da técnica (vide Benjamin Lewin, Genes VIII , capítulo 9) como o terminador da nopalina sintase de A. tumefasciens. Os vetores recombinantes podem ainda incluir um marcador para a identificação de células transformadas. Em outro aspecto, as células de plantas transgênicas compreendendo o vetor recombinante da presente invenção são providas, junto com organismos, como plantas, compreendendo estas células transgênicas, e frutos, sementes e outros produtos, derivados, ou progénie destas plantas. Os propágulos das plantas transgênicas inventivas são incluídos na presente invenção. Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para modificar a expressão de genes em um organismo, como uma planta, incluindo a incorporação estável no genoma do organismo contendo o vetor recombinante da presente invenção.
Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para produzir um organismo transformado, como uma planta, tendo a expressão de um polipeptídeo modificada. Esse método compreende transformar uma célula de planta com o vetor recombinante da presente invenção para prover uma célula transgênica sob condições que conduzem à regeneração e crescimento da planta madura.
Ainda em outro aspecto da presente invenção é provido um método para identificação de um gene responsável por uma função ou fenótipo desejado. O método compreende: 1) a transformação de uma célula de planta contendo um vetor recombinante compreendendo uma sequência de promotor de polinucleotídeos da presente invenção ligada operacionalmente a um polinucleotídeo a ser testado, 2) cultivar a célula de planta sob condições que conduzem a regeneração e crescimento da planta madura de modo a prover uma planta transgênica, e 3) comparar o fenótipo da planta transgênica com o fenótipo de plantas não. transformadas, ou de tipo selvagem,.
Os aspectos acima mencionados e adicionais da presente invenção e o modo de obter os mesmos se tornarão evidentes, e a invenção será melhor compreendida por referência na "Descrição Detalhada da Invenção". BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Fluxograma apresentando as etapas envolvidas para o desenvolvimento do promotor endosperma-específico.
Figura 2. Fracionamento eletroforético de fragmentos específicos representantes da sequência de CaLTPl . (+) controle positivo, (R) cDNA de raiz, (Fr) cDNA de fruto e (Fo) cDNA de folha.
Figura 3. Gráfico representativo do perfil de expressão da LTP1 em raiz, folha e fruto em relação ao gene da ubiquitina.
Figura 4. Validação da expressão preferencial de LTP1 em fruto por Northern blot. Gel desnaturante 1,5% com amostras de raiz, folha e fruto de Coffea arábica 120 dias após o florescimento. R: raiz; Fo: Folha e Fr: Fruto. Figura 5. Fracionamento eletroforético dos fragmentos obtidos por meio da técnica de 5'race. M - marcador 1Kb ladder, 1/1 M - biblioteca Dral, 2/2M - biblioteca Eco RV, 3/3M - biblioteca PvuII e 4/4M - biblioteca Stul.
Figura 6. Esquema que detalha a reconstrução do vetor binário PBI121. O vetor PBI121 possui 12800 pb de comprimento e seu número de acesso no Gen Bank é AF485783. A construção de interesse foi obtida por meio da substituição do promotor CaMV 35S (835 pb) pelo fragmento de 451 pb referente ao promotor CaLTPl .
Figura 7. Reconstrução do vetor binário PBI121. O vetor PBI121 possui 12800 pb de comprimento e seu número de acesso no Gen Bank é AF485783. A construção de interesse foi obtida por meio da substituição do promotor CaMV 35S (835 pb) pelo fragmento de 451 pb referente ao promotor CaLTPl .
Figura 8. Localização da atividade de GUS em plantas de tabaco transformadas com o promotor PBI. A, B, C, D; e I, J, K, L representam os controles negativo e positivo (PBI 121) do experimento, respectivamente. A, E e I representam tecidos foliares e radiculares; B, F e J secções transversais de frutos; C, G e K sementes; D, H e L estame, pétala e gineceu. E, F, G e H representam a atividade do promotor CaLTPl. -Pode-se^observar, o diagnóstico de , reação_apenas„nas . sementes (G) de plantas que contêm o promotor endosperma-específico.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um promotor específico de endosperma para a expressão de gene de interesse apenas no fruto do organismo vegetal transgênico.
Na descrição que segue, um número de termos é utilizado extensivamente. As seguintes definições são providas para facilitar o entendimento da invenção.
Um "gene quimérico" é um gene compreendendo um promotor e uma região codificadora de diferentes origens. No caso da presente invenção, o gene quimérico compreende o polinucleotídeo da presente invenção ligado a regiões codificadoras de genes endógenos e/ou exógenos.
Uma "sequência consenso" é uma sequência artificial na qual a base em cada posição representa a base frequentemente mais encontrada na sequência atual comparando-se diferentes alelos, genes ou organismos. Um "promotor" é aquela porção do DNA acima da região codificadora que contém sítios de ligação para RNA polimerase II para iniciar a transcrição do DNA.
"Expressão" é a transcrição ou tradução de um gene estrutural, endógeno ou heterólogo. "GC box" é um elemento comum no promotor que pode aumentar a atividade do promotor.
"TATA box" é um elemento no promotor, localizado aproximadamente 30 bases acima do sítio de início da transcrição. O TATA box está associado com fatores de transcrição em geral, incluindo a RNA polimerase II. O termo "gene" significa uma unidade física e funcional da hereditariedade, representada por um segmento de DNA que codifica uma proteína funcional ou molécula de RNA.
Um "gene endógeno" é um gene próprio da célula ou do organismo.
Um,, "gene ..heterólogo",, é .. uru ..gene . is jadp , de um organismo. _ doador, ,e recombinado no organismo receptor transformado. E um gene que não é próprio da célula ou do organismo.
Um "gene repórter" é uma unidade codificadora cujo produto é facilmente testado, por exemplo, genes CAT, GUS, GAL, LUC e GFR A expressão de um gene repórter pode ser usada para testar a função de um promotor ligado a esse gene repórter. O termo "propágulo" como usado na presente invenção significa qualquer parte de uma planta que pode ser usada na reprodução ou propagação, sexual ou assexuai, incluindo as mudas.
"Sense" significa que a sequência de polinucleotídeo está na mesma orientação 5 '-3' com relação ao promotor. "Antisense" significa que a sequência de polinucleotídeo está na orientação contrária com relação a orientação 5' -3' do promotor. Como usado aqui, o termo "x-mero", como referência a um valor específico de "x", refere-se a uma sequência compreendendo pelo menos um número específico ("x") de resíduos do polinucleotídeo identificado como SEQ ID NOl. De acordo com formas de realização preferidas, o valor de x é preferivelmente pelo menos 20, mais preferivelmente pelo menos 40, mais preferivelmente ainda pelo menos 60 e mais preferivelmente pelo menos 80. Assim, polinucleotídeos da presente invenção compreendem um polinucleotídeo de 20 meros, 40 meros, 60 meros, 80 meros, 100 meros, 120 meros, 150 meros, 180 meros, 220 meros, 250 meros, 300 meros, 400 meros, 500 meros ou 600 meros identificado como SEQ ID NOl e variantes dos mesmos. O termo "polinucleotídeo (s)" como usado aqui, significa um polímero de filamento único ou duplo de bases de deoxiribonucleotídeo ou ribonucleotídeo e inclui moléculas correspondentes de RNA e DNA, incluindo moléculas de HnRNA e mRNA, de filamentos tanto "sense" como "antisense", e compreende cDNA, DNA genômico, e DNA recombinante, assim como polinucleotídeos completamente ou parcialmente sintetizados. Uma molécula de HnRNA contém íntrons e corresponde a uma molécula de DNA em um modo geralmente um a um. Uma molécula de RNAm corresponde a uma molécula de DNA e HnRNA da qual os íntrons foram excisados. Um polinucleotídeo pode consistir de um gene completo, ou qualquer porção do mesmo. Os polinucleotídeos "antisenso" operáveis podem compreender um fragmento do polinucleotídeo correspondente, e a definição de "polinucleotídeo" inclui assim todos esses fragmentos antisense operáveis. Os polinucleotídeos antisense e técnicas envolvendo polinucleotídeos antisense são bem conhecidos no estado da técnica (Sambrook, J.; E.F.Fritsh and T. Maniatis - Molecular cloning. A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.)
Os polinucleotídeos descritos na presente invenção são preferencialmente cerca de 80% puros, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% puros, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% puro.
O termo "oligonucleotídeo" refere-se a um segmento relativamente curto de uma sequência de polinucleotídeo, geralmente compreendendo entre 6 a 60 nucleotídeos. Esses oligonucleotídeos podem ser usados como sondas ou iniciadores ("primers"), onde as sondas podem ser usadas para uso em testes de hibridização e iniciadores para uso na amplificação de DNA por reação de cadeia polimerase.
O termo "sonda" utilizado na presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucléico, sendo RNA ou DNA, se ocorrendo naturalmente como em uma digestão de enzima de restrição purificada ou produzida sinteticamente, que seja capaz de se anelar com ou especificamente hibridizando com um ácido nucléico contendo sequências complementares à sonda. Uma sonda pode ser ainda de cadeia simples ou cadeia dupla. O comprimento exato da sonda dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, origem da sonda e uso do método. Por exemplo, dependendo da complexidade da sequência alvo, a sonda de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-25 ou mais nucleotídeos, embora ela possa conter menos nucleotídeos. As sondas aqui são selecionadas para serem complementares para diferenciar cadeias de uma sequência de um ácido nucléico particular. Isto significa que a sonda pode ser suficientemente complementar para ser capaz de "hibridizar especificamente" ou anelar com suas respectivas cadeias-alvo sob uma série de condições pré-determinadas. Consequentemente, a sequência da sonda não necessita refletir exatamente a sequência complementar do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser ligado ao final 5 ' ou 3' da sonda, com o restante da sequência da sonda sendo complementar à cadeia alvo. Alternativamente, bases não complementares ou sequências longas podem estar intercaladas dentro da sonda se esta tiver complementaridade suficiente com a sequência do ácido nucléico alvo para anelar especificamente com ele.
O termo "primer" como utilizado aqui se refere a um oligonucleotídeo, sendo RNA ou DNA, cadeia simples ou cadeia dupla, derivado de um sistema biológico, gerado através de digestão com enzimas de restrição, ou produzido sinteticamente que, quando colocado em um ambiente próprio, é capaz de agir funcionalmente como um iniciador de uma síntese de ácido nucléico dependente de molde. Quando apresentado com um molde de ácido nucléico apropriado, trifosfatos nucleosídeos adequados precursores de ácidos nucléicos, uma enzima polimerase, cofatores adequados e condições tais como temperatura e pH adequados, o primer pode ser extendido em seu terminal 3' pela adição de nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou com atividade similar para produzir uma primeira extensão do produto. O 'primer' pode variar em comprimento dependendo de condições particulares e requerimentos para aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnósticos, o 'primer' oligonucleotídeo possui tipicamente de 15-25 ou mais nucleotídeos em comprimento. O 'primer' deve ter complementaridade suficiente com o molde desejado para iniciar a síntese da extensão do produto desejado. Isso não significa que a sequência do 'primer' deva representar um complemento exato do molde desejado. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeo não complementar pode ser ligada ao final 5' de um 'primer' complementar. Alternativamente, bases não complementares podem estar intercaladas dentro da sequência de oligonucleotídeo do 'primer', desde que o 'primer' tenha complementaridade suficiente com a sequência da cadeia molde desejada para prover funcionalmente um complexo molde-primer para a síntese da extensão do produto.
O termo "hibridizando especificamente" diz respeito à associação entre duas moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples que possuam sequências suficientemente complementares para permitir tal hibridização sob condições predeterminadas geralmente descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 1 , 2003)
Em particular, o termo se refere à hibridização de um oligonucleotídeo com uma sequência substancialmente complementar contendo uma molécula de DNA ou RNA de cadeia simples da presente invenção. Condições apropriadas necessárias para realização da hibridização específica entre moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples de complementaridade variada estão bem descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 4, 2003). Uma fórmula comum para se calcular as condições de estringência requeridas para se ter uma hibridização entre moléculas de ácido nucléico segue abaixo (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press):
Tm = 81 ,5°C + 16,6 Log [Na+] + 0,41 (%G+C) - 0,63 (% formamida)-600/pb no duplex (sonda) Como ilustração da fórmula acima, usando [Na+] = [0,368] e 50% de formamida, com conteúdo de GC de 42% e um tamanho de sonda médio de 200 bases, a Tm será de 57°C.
Sondas ou primers são descritos como correspondendo ao polinucleotídeo da presente invenção identificado como SEQ ID NOl ou uma variante do mesmo, se a sonda de oligonucleotídeo ou primer, ou seu complemento, estiver contido dentro da sequência especificada como SEQ ID NOl, ou uma variante desta.
O termo "oligonucleotídeo" é referido aqui como 'primers' e 'sondas' da presente invenção, e é definido como uma molécula de ácido nucléico compreendendo de dois ou mais ribo ou deoxiribonucleotídeos, preferencialmente mais do que três. O tamanho exato dos oligonucleotídeos dependerá de vários fatores e na aplicação particular e uso dos oligonucleotídeos. Oligonucleotídeos preferidos compreendem 15- 50 pares de base consecutivas complementares à SEQ ID NO 1. As sondas podem ser facilmente selecionadas usando procedimentos bem descritos no estado da técnica (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 1 89), levando em consideração estringências de hibridização DNA-DNA, recombinação e temperaturas de fusão, e potencial para formação de laços e outros fatores, que são conhecidos no estado da técnica.
A definição dos termos "complemento", "complemento reverso" e "sequência reversa", como usados aqui, é ilustrada pelo seguinte exemplo. Para a sequência 5'AGTGAAGT3', o complemento é 3'TCACTTCA5', o complemento reverso é 3'ACTTCACT5' e a sequência reversa é 5'TGAAGTGA3'.
Como usado aqui, o termo "variante" ou "substancialmente similar" compreende sequências de aminoácidos ou nucleotídeos diferentes de sequências especificamente identificadas, em que um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos é deletado, substituído ou adicionado. As variantes podem ser variantes alélicas, de ocorrência natural, ou variantes de ocorrência não natural. As sequências variantes ou substancialmente similares dizem respeito a fragmentos de ácidos nucléicos que podem ser caracterizados pela porcentagem de similaridade de suas sequências de nucleotídeos com a sequências de nucleotídeo descrita aqui (SEQ ID NO 1), como determinada por algoritmos comuns empregados no estado da técnica. Os fragmentos de ácidos nucléicos preferidos são aqueles cujas sequências de nucleotídeos têm pelo menos cerca de 40 ou 45% de identidade de sequência, preferencialmente cerca de 50% ou 55% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente ainda com cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência quando comparada com a sequência de referência. A identidade percentual é determinada por alinhamento de duas sequências a serem comparadas, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividindo este número pelo número total de resíduos na sequência pesquisada e multiplicando o resultado por 100. Esse alinhamento pode ser feito através de softwares existentes na internet, um deles é o BLASTN, que está disponível na página do National Center for Biotechnology Information/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). O termo "vetor" diz respeito a um replicon, tal como plasmídeo, cosmídeo, bacmídeo, fago ou vírus, no qual outras sequências genéticas ou elementos (seja DNA ou RNA) possam ser ligadas para serem replicadas juntas com o vetor. Preferencialmente o vetor derivado de vírus é selecionado entre os bacteriófagos, vaccinias, retrovírus ou vírus do papiloma bovino. O "vetor recombinante" é resultante da combinação de um vetor comercial com genes quiméricos, ou o polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a um polinucleotídeo endógeno e/ou heterólogo de interesse que por sua vez está operacionalmente ligado a um sinal de terminação. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo Clontech Laboratories, Inc (Palo Alto, Calif), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores utilizados na presente invenção, mas não limitados a, são os vetores pGEM-T, pCAMBIA 1391, vetores gateway e o vetor pMON.
O termo "sequências acentuadoras de expressão" conhecidas como amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou depois, "upstream" ou "downstream") e que potenciam a taxa de transcrição. Estes amplificadores não são específicos e potenciam a transcrição de qualquer promotor que estiver na sua vizinhança. A eficiência da expressão de um gene em um tecido específico depende da adequada combinação e integração dos amplificadores, dos promotores e das sequências adjacentes.
O primeiro intensificador descoberto que estimulava a transcrição de genes eucariotos foi o SV40 (Presente no genoma do Vírus 40 de Símio) Após a descoberta do intensificador SV40 foram identificados centenas de outros enhancer como HSV-1 , AMV, HPV-16 , em outros genomas virais no DNA de células eucarióticas. ( Lodish et al, Biologia celular e molecular. 4a edição pág 368)
O termo "operacionalmente ligado" significa que as sequências regulatórias necessárias para expressão da sequência codificadora são colocadas na molécula de DNA em posições apropriadas relativa à sequência codificadora para efeito de expressão da sequência codificadora . Essa mesma definição é às vezes aplicada para o arranjo de sequências codificadoras e elementos controladores da transcrição (por exemplo, promotores, auxiliadores ou "enhancers" e elementos ou sequências de terminação) no vetor de expressão. Uma região codificadora exógena é tipicamente flanqueada,por regiões regulatórias operacionalmente ligadas que regulam a expressão, da região codificadora exógena em uma célula transformada (podendo ser microorganismo, vegetal ou animal). Uma região regulatória típica operacionalmente ligada a uma região codificadora exógena inclui um promotor, isto é, um fragmento de ácido nucléico que pode causar transcrição de regiões codificadores exógenas, posicionado na região 5' da região codificadora exógena. No caso da presente invenção a região regulatória diz respeito às regiões substancialmente similares à SEQ ID NO 1. Para auxiliar no aumento da transcrição de um determinado polinucleotídeo, a sequência promotora da presente invenção poderá estar ligada a outras sequências regulatórias já descritas, tais como: ATATT (elemento de forte expressão na raiz), AACAAAC e GCCACCTCAT (elementos relativos a expressão específica em sementes), CACGTG e CCTACC (ambas sequências podem ser estimuladas ao um fator de estresse), entre outros. (Ai-Min Wu et al, Isolation of a cotton reversibly glycosylated polypeptide (GhRGPl) promoter and its expression activity in transgenic tobacco, Journal of Plant Physiology 163 (2006) 426— 435) Uma "sequência de terminação" é uma sequência de DNA que sinaliza o final da transcrição. São exemplos de sequências de terminação, mas não estão limitados a sinal de terminação de SV40, sinal de adenilaçâo de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Ag obacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans e outros semelhantes. A presente invenção provê uma região regulatória de polinucleotídeos isolados que podem ser empregadas na manipulação de fenótipos de plantas, junto com polinucleotídeos isolados compreendendo estas regiões regulatórias. Mais especificamente a presente invenção está relacionada ao promotor ou sequência regulatória de acordo com a SEQ ID NOl, responsável pela expressão de um representante da família LTP1 ("Lipid Transfer Protein"-Proteína transferidora de lipídio), sendo denominado na presente invenção de CaLTPl . responsável pela expressão no endosperma do fruto.
A quantidade de um polipeptídeo de interesse específico pode ser aumentada ou reduzida através da incorporação de cópias adicionais de genes, ou sequências de codificação, codificando o polipeptídeo, ligado operacionalmente a sequência de promotor da presente invenção (SEQ ID NOl), no genoma de um organismo, como uma planta. Similarmente, um aumento ou uma diminuição na quantidade do polipeptídeo pode ser obtido por transformação de planta com cópias antisense destes genes. O polinucleotídeo da presente invenção foi isolado de plantas de café, mais especificamente de Coffea arábica, mas ele pode ser alternativamente sintetizado usando técnicas de síntese convencionais. Especificamente o polinucleotídeo isolado da presente invenção inclui a sequência identificada como SEQ ID NO 1 ; o complemento reverso da sequência identificada como SEQ ID NOl ; complemento reverso da sequência identificada como SEQ ID NO 1. O polinucleotídeo da presente invenção pode ser identificado em sequências de DNA genômico de plantas para as quais a informação da sequência de genoma é disponível ao público, ou isolado de várias bibliotecas de polinucleotídeos, ou pode ser sintetizado usando técnicas que são bem conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). O polinucleotídeo pode ser sintetizado, por exemplo, usando sintetizadores automatizados de oligonucleotídeos (por exemplo, sintetizador de DNA OLIGO 1000M Beckman) para obter segmentos de polinucleotídeos de até 50 ou mais ácidos nucléicos. Uma pluralidade destes segmentos de polinucleotídeos podem ser então ligados usando técnicas de manipulação de DNA padrões que são bem conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Uma técnica de síntese de polinucleotídeo convencional e exemplar envolve a síntese de um segmento de polinucleotídeo de filamento único, tendo, por exemplo, 80 ácidos nucléicos, e hibridizando este segmento a um segmento de 85 ácidos nucléicos complementar, sintetizados, para produzir um Overhang' de 5 nucleotídeos. O próximo segmento pode ser então sintetizado de modo similar, como um. '.overhang', de^5- nucleotídeos~no, filamento oposto. As extremidades "pegajosas" ou coesivas asseguram uma ligação apropriada quando as duas porções são hibridizadas. Deste modo, o polinucleotídeo desta invenção pode ser sintetizado completamente in vitro.
Como observado acima, a sequência de promotor da presente invenção pode ser empregada em vetores recombinantes e/ou de expressão para acionar a transcrição e/ou expressão de um polinucleotídeo de interesse. O polinucleotídeo de interesse pode ser endógeno ou heterólogo para um organismo, por exemplo, uma planta, a ser transformada. Os vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção podem ser assim empregados para modular níveis de transcrição e/ou expressão de um polinucleotídeo, por exemplo, um gene que está presente na planta de tipo selvagem, ou pode ser empregado para prover transcrição e/ou expressão de uma sequência de DNA que não é encontrada na planta de tipo selvagem, incluindo, por exemplo, um gene que codifica um gene repórter, como GUS. Em algumas formas de realização da presente invenção, o polinucleotídeo de interesse compreende uma matriz de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de interesse. A matriz de leitura aberta é inserida no vetor em uma orientação sense e a transformação com essa construção genética/vetor recombinante irá geralmente resultar em super-expressão do polipeptídeo selecionado. O polipeptídeo de interesse, que será regulado pelo promotor da presente invenção, poderá ser inserido no vetor na orientação sense, antisense ou em ambas as direções. A transformação com um vetor recombinante e/ou de expressão contendo o promotor da invenção regulando a expressão do polinucleotídeo de interesse na orientação antisense ou em ambas as orientações (sense e antisense) irá geralmente resultar na expressão reduzida do polipeptídeo selecionado.
O polinucleotídeo de interesse, como uma sequência de codificação, é ligado de modo operativo em uma sequência do promotor de polinucleotídeo da presente invenção de modo que uma célula hospedeira é capaz de transcrever um RNA acionado pela sequência do promotor ligada ao polinucleotídeo de interesse. A sequência do promotor de polinucleotídeo está geralmente posicionada na extremidade 5' do polinucleotídeo a ser transcrito. O uso de promotor tecido-específico, como a sequência do promotor de café (Coffea arábica), responsável pela expressão do gene LTP1 (Lipid Transfer Protein- Proteína transferidora de lipídio) identificada como SEQ ID NOl, irá afetar a transcrição do polinucleotídeo de interesse apenas no endosperma da planta transformada.
O vetor recombinante ou vetor de expressão da presente invenção também pode conter um marcador de seleção que é eficaz em células do organismo, como uma planta, para permitir a detecção de células transformadas contendo o vetor recombinante inventivo. Estes marcadores, que são bem conhecidos, tipicamente conferem resistência a uma ou mais toxinas Um exemplo deste marcador é o gene nptil, cuja expressão resulta em resistência a canamicina ou neomicina, antibióticos que são geralmente tóxicos para células de plantas em uma concentração moderada. As células transformadas podem ser assim identificadas por sua capacidade de crescer em meio contendo o antibiótico em questão. Outros marcadores que podem ser utilizados para construir vetores recombinantes e/ou de expressão contendo o polinucleotídeo da presente invenção podem ser, mas não estão limitados a: gene hpt confere resistência ao antibiótico higromicina, gene manA e o gene bar.
O sistema que usa o gene manA (que codifica a enzima PMI - phosphomannose isomerase) de Escherichia coli (Miles e Guest, 1984. Complete nucleotide sequence of the fumarase gene fumA, of E. coli. Nucleic Acids Res. 1984 April 25; 12(8): 3631- 3642), tendo a manose como agente seletivo, é um dos novos sistemas sugeridos como alternativos aos dois primeiros descritos acima (Joersbo et al., 1998 Parameters interacting with mannose selection employed for the production of transgenic sugar beet, Physiologia Plantarum Volume 105 Issue 1 Page 109 - January 1999 doi: 10.1034/j .1399-3054.1999.105117.x). As espécies vegetais que não metabolizam manose sofrem severa inibição de crescimento quando esta é oferecida como única fonte de carbono em meio de cultura. Os efeitos adversos e inibitórios do uso da manose são consequências do acúmulo de manose-6-fosfato, produto da fosforilação da manose por uma hexoquinase. PMI promove a interconversão de manose-6-fosfato e frutose-6-fosfato, permitindo assim que a primeira possa ser catabolizada na via glicolítica (Ferguson e Street, 1958. Análise de sistemas gene marcador/ agente seletivo alternativos para seleção positiva de embriões somáticos transgênicos de mamoeiro, Rev. Bras. Fisiol. Veg., 2001, vol.13, no.3, p.365-372. ISSN 0103-3131. : Malca et al., 1967 Advances in the selection of transgenic plants using non-antibiotic marker genes, Physiologia Plantarum Volume 111 Issue 3 Page 269 - March 2001 doi:10.1034/j. l399- 3054.2001.1110301.x). O gene bar (que codifica a enzima PAT - phosphinothricin-N- acetyltransferase) de Streptomyces hygroscopicus (Murakani et al., 1986 The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus: molecular cloning and characterization of the gene cluster. Molecular and General Genetics., 205: 42-50, 1986.), tendo o glufosinato de amónio (PPT) como agente seletivo, é, dentre os sistemas tipo gene de tolerância a herbicida, um dos mais amplamente empregados pela engenharia genética no desenvolvimento de OGMs vegetais. PAT inativa herbicidas que apresentam o PPT como composto ativo mediante detoxificação deste. A detoxificação, que é resultante da acetilação do grupamento amino livre presente no PPT, torna este incapaz de competir de forma inibitória com a glutamina sintetase (GS), possibilitando assim a remoção da amónia tóxica da célula vegetal pela conversão de glutamato em glutamina, reação esta catalizada pela GS (Lindsey, 1992 Molecular cloning of ICAM-3, a third ligand for LFA-1, constitutively expressed on resting leukocytes, Nature 360, 481 - 484 (03 December 1992); doi: 10.1038/36048 laO).
Alternativamente, a presença do gene quimérico em células transformadas pode ser determinada por meio de outras técnicas conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), como Southern e PCR.
As técnicas para ligar de modo operativo os componentes dos vetores recombinantes ou de expressão inventivos são bem conhecidas no estado da técnica e incluem o uso de ligadores sintéticos contendo um ou mais sítios de endonuclease de restrição, como descrito, por exemplo, em Sambrook et al ("Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Genes quiméricos da presente invenção podem ser ligados a um vetor tendo, pelo menos um sistema de replicação, por exemplo, E.coli, assim após cada manipulação, as construções resultantes podem ser clonadas e sequenciadas. Vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção podem ser usados para transformar uma variedade de organismos incluindo mas não limitando a plantas: As plantas que podem ser transformadas usando vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção incluem angiospermas monocotiledôneas (por exemplo, gramíneas, milho, grãos, aveia, trigo e cevada...), angiospermas dicotiledôneas (por exemplo, Arabidopsis, tabaco, legumes, alfafa, aveia, eucalipto, bordo...), e gimnospermas (por exemplo, pinheiro, espruce branco, lariço...). Os protocolos de transformação de plantas já são bem conhecidos no estado da técnica (Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CENARGEM, Capitulo 3 e 7, 1998). Em uma forma de realização preferida, os vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção são empregados para transformar plantas dicotiledôneas. Preferivelmente, a planta é selecionada da família das Rubiaceae, mais preferivelmente da espécie Coffea arábica. Outras plantas podem ser transformadas de modo útil com o vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção incluem, mas não são limitadas a: Anacardium, Anona, Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Carica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majoraria, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Passiflora, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Psidium, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, e Zea.
O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invenção inclui, mas não está limitado a, sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV T , sinal de terminação da gene da nopalina sintetase de A. tumefasciens (nos), sinal de terminação do gene RNA 35S do CaMV, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans, e outros semelhantes. Preferivelmente o terminador utilizado na presente invenção é o terminador do gene LTP1 (Lipid Transfer Protein-Proteína transferidora de lipídio).
Os vetores recombinantes e/ou de expressão da invenção podem ser introduzidos dentro do genoma da planta hospedeira desejada através de uma variedade de técnicas convencionais. Por, .exemplo, introdução mediada ..por. :A- tumefasciens; eletroporação; fusão de protoplasto; injeção em órgãos reprodutivos; injeção em embriões imaturos; microinjeção de protoplastos de células de plantas; utilizando-se métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com DNA e outros. A escolha da técnica irá depender da planta a ser transformada. Por exemplo, plantas dicotiledôneas e algumas monocotiledôneas e gimnospermas podem ser transformadas por tecnologia de plasmídeo Ti de Agrobacterium. Os vetores recombinantes e/ou de expressão podem ser combinados com regiões flanqueadoras de T-DNA apropriadas e introduzidas dentro de vetor convencional hospedeiro A. tumefasciens. A função de virulência do hospedeiro A. tumefasciens direcionará a inserção das construções gênicas e marcador adjacente dentro do DNA da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas por A. tumefasciens, incluindo desarmamento e o uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica (como mencionado no pedido de patente US 20020152501, Horsch et al. Science 233:496-498, 1984; e Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803, 1983). O vetor binário utilizado preferencialmente na invenção é o vetor binário do tipo pBI 121. Técnicas de microinjeção são conhecidas no estado da técnica e bem descritas em literatura científica e patentária. A introdução de vetores recombinantes e/ou de expressão utilizando-se precipitações de polietileno glicol é descrita em Paszkowski et al. Embo J. 3:2717-2722, 1984 (como mencionado no pedido de patente 5 US20020152501). Técnicas de eletroporação são descritas em From et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824, 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de transformações balísticas são descritas em Klein et al. Nature 327:70-73, 1987 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). A introdução dos vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção pode ser
10 feita em tecidos, como tecido de folha, células dissociadas, protoplastos, sementes, embriões, regiões meristemáticas, cotilédones, hipocotilédones, e outros. Preferencialmente a presente invenção utiliza a transformação através da introdução mediada por A. tumefasciens utilizando a A. thaliana com planta modelo (Clough at al, "Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of A.
15 thaliana", Plant J. 1998 Dec;16(6):735-43.). No entanto outros métodos de transformação podem ser utilizados para inserir vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção., tais como a biobalística. que consiste .em uma-técnic de transformação direta do DNA que utiliza microprojéteis impulsionados em alta velocidade para carrear o DNA para dentro das células [Rech, E.L; Aragão, F.J.L.
20 Biobalística. In: Manual de Transformação Genética de Plantas (Brasileiro, A.C.M. & Carneiro, V.T.C, eds.), EMBRAPA Serviço de Produção de Informações -SPI. 1998, 106pp], e via tubo polínico. O método de transformação via tubo polínico foi divulgado pela primeira vez por Zhou et al (Zhou, G., Wang, J., Zeng, Y., Huang, J., Qian, S., and Liu, G. Introduction of exogenous DNA into cotton embryos. Meth. in Enzymol.
25 101 :433-448, 1983) e consiste na aplicação de uma solução de DNA na parte superior da maçã jovem após a polinização. Utilizando esta técnica, o DNA exógeno pode alcançar o ovário através da passagem deixada pelo tubo polínico e integrar as células zigóticas já fertilizadas, porém não divididas.
Uma vez que as células foram transformadas, por qualquer uma das técnicas 30 mencionadas acima, as células tendo o vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção incorporado em seu genoma podem ser selecionadas por meio de um marcador, como o marcador de resistência a higromicina ou a canamicina. As células de plantas transformadas podem então ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e, finalmente, o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fitohormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida, que deve ser introduzido junto com a sequência de nucleotídeos desejada. Regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos é descrita em Evans et al. (Evans et al, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Celi Culture, pp. 124- 176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985, como mencionado no pedido de patente US20020152501). A regeneração pode ser também obtida através de calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são bem descritas no estado da técnica, tais como em Leelavathi et al. [Leelavathi et al, A simple and rapid Agrobacterium-mediated transformation protocol for cotton (G hirsutum L.): Embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Celi Rep (2004) 22:465-470]. Esse trabalho descreve um protocolo para transformação e regeneração do algodão onde o calo embriogênico com Agrobacterium, é,„cultivado. sob estresse de desidratação.- e, seleção ,de antibiótico por, 3. a .6 meses.para a regeneração de diversos embriões transgênicos, uma média de 75 embriões globular. Sendo observado sobre a seleção de placas esses embriões são cultivados e multiplicados no meio, seguido pelo desenvolvimento de embriões cotiledonares sobre o meio de maturação do embrião. Para se obter uma media de 12 plantas por placas de petri de calos co-cultivados. Aproximadamente 83% dessas plantas são transgênicas. As plantas transformadas resultantes podem ser reproduzidas de modo sexual ou assexuai, usando métodos conhecidos no estado da técnica [Leelavathi et al, A simple and rapid Agrobacterium- ediated transformation protocol for cotton (Gossipium hirsutum L.): Embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Celi Rep, 2004, 22: 465-470 ], para dar gerações sucessivas de plantas transgênicas.
A produção de RNA em células pode ser controlada por escolha da sequência do promotor, por seleção do número de cópias funcionais ou através do sítio de integração de polinucleotídeos incorporados no genoma hospedeiro. Um organismo pode ser transformado utilizando um vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção contendo mais de uma matriz de leitura aberta de codificação para um polipeptídeo de interesse.
O polinucleotídeo isolado da presente invenção também tem utilidade no mapeamento do genoma, em mapeamento físico e em clonagem posicionai de genes. A 5 sequência identificada como SEQ ID NOl e suas variantes podem ser usadas para projetar sondas e iniciadores de oligonucleotídeos. As sondas de oligonucleotídeos projetadas usando o polinucleotídeo da presente invenção podem ser usadas para detectar a presença do promotor do gene LTP1 (Lipid Transfer Protein-Proteína transferidora de lipídio) em qualquer organismo tendo sequências de DNA 10 suficientemente similares em suas células usando técnicas bem conhecidas no estado da técnica, como as técnicas de hibridização de DNA dot blot (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning a laboratory manual. 2nd edition [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)
Os iniciadores de oligonucleotídeos projetados usando o polinucleotídeo da 15 presente invenção podem ser usados para amplificações de PCR. O polinucleotídeo da pjresente. invenção também pode. usado para etiquetar ou identifica um organismo ou material reprodutivo do mesmo. Esta etiqueta pode ser obtida, por exemplo, por introdução estável de um identificador de polinucleotídeo heterólogo, não funcional, não disruptivo, em um organismo, sob o controle do polinucleotídeo da presente 20 invenção.
O promotor proposto para a presente invenção foi obtido seguindo preferencialmente as etapas:
1 - O material genético das amostras dos possíveis candidatos pode ser realizado segundo os procedimentos descritos por Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, e Bedbrook J. 25 1985. High levei expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4: 2411-2418.), ou qualquer procedimento que permita ter acesso ao material genético integro, como por exemplo, os métodos de extração que utilizam solventes orgânicos.
2 - 0 material isolado dos possíveis candidatos deve ter sua integridade confirmada, 30 como por exemplo, através de técnicas de gel desnaturante, para então servir de molde na formação das novas moléculas de DNA por meio de reações de PCR, ou mesmo RT- PCR caso o molde seja RNA. Recomenda-se o tratamento das amostras com DNAse, como por exemplo, via procedimento descrito nesse documento.
3 - 0 material genético obtido pode ser utilizado em reações de PCR com primers específicos do gene selecionado, como por exemplo, o gene LTP1 , para avaliação da tecido especificidade do mesmo. Os referidos primers podem ser desenhados com auxílio do programa Primer (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) (Rozen, S e Skaletsky H. J. 2000 Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386) ou qualquer outro programa e/ processo que forneça primers específicos para os candidatos.
4 - As reações de PCR podem ser conduzidas em aparato especial para o procedimento, como termociclador MJ Research modelo PTC- 100, ou qualquer outro termociclador capaz de desenvolver sua função, em condições idéias para a reação, na qual é sugerida a incubação inicial de 94°C por 3 minutos, seguida de 35 ciclos de 94°C por 30 segundos para desnaturação, 50°C por 40 segundos para hibridização dos oligonucleotídeos e 72°C por 1 minuto para extensão.
5 - Após o procedimento, as reações devem ser submetidas a um período adicional, na qual se recomenda 10 minutos a 72°C, para complemento da polimerização. E recomendável que cada reação continha Ι μΙ. de cDNA diluído 1 : 10, 2,5 U de Taq DNA polimerase e 30 pmoles de oligonucleotídeos iniciadores em um volume final de 50 \xL.
6 - A identidade do produto amplificado pode ser confirmada, como por exemplo, pela migração eletroforética dos fragmentos, na qual se recomenda utilizar como comparação o controle positivo, constituído por um vetor, como por exemplo, um vetor do banco de dados do Projeto Genoma Café (FV2-050) contendo a sequência estudada. 7 - Após o fracionamento do material genético, as amostras devem ser submetidas ao processo de Northen Blot, o qual se recomenda a transferência do material genético para membrana própria para o procedimento, como por exemplo, a membrana de nylon, e hibridizado em SSPE com sonda correspondente a sequência parcial da suposta LTP marcada, como por exemplo, a marcação com o isótopo 32 do fósforo - 32P.
8 - 0 promotor deve ser isolado por qualquer técnica de isolamento, a qual se recomenda utilizar a técnica de 5 'race, aliada à técnica de PCR "nested" simplificada pela utilização do Genome Walker Universal Kit (Clontech) segundo especificações do fabricante.
9 - Os fragmentos provenientes podem ser clonados e sequenciados por processo destinado a esse fim. Recomenda a utilização do método de dideoxinucleotídeo (Sanger,
5 R, Nicklen,S. e Coulson,A.R. 1979. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5463-5468.).
10 - A caracterização do perfil de expressão do promotor putativo isolado pode ser realizado através da expressão dessa sequência, e variações truncadas provenientes dessa, mas que conservem a função proposta de promotor, em vetores binários, o qual se sugere a utilização do vetor binário do tipo pBI 121 e clonagem nos sítios Hind III e
10 Bam Hl de acordo com técnicas padrão de biologia molecular, como por exemplo, a técnica proposta por Sambrook (SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular. Cloning: A Laboratory Manual 1. 2. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 608p). Recomenda-se a utilização de controles positivos e negativos para a realização de tais processos.
15 11 - 0 processo de transformação deve ser realizado no organismo de interesse, na qual se sugere a planta de fumo - Nicotiana tabacum, utilizando-se como vetor cepas de Agrobacterium tumefaciens. como por exemplo, a. cepas de Agrobacterium tumefaciens CV3101 (C58PMP90), utilizando-se qualquer protocolo específico para esse fim, como por exemplo, o proposto por Horsch (Horsch R.B., Fry J.B., Hoffman N.L., Eicholts D., 0 Rogers S.G. and Fraley R.T. 1985. A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: 1229-1231). A eficiência de transformação dos explantes deve ser avaliada através da expressão transiente e estável nos tecidos dos propágulos regenerados de um gene de interesse, o qual se recomenda a utilização do gene gus. 12 - A análise de expressão do gene gus deve ser realizada por protocolos de ensaio 5 histoquímico, como por exemplo, conforme adaptação do protocolo descrito por Jefferson (Jefferson R.A., Kavangh T.A. and Bevan M.W. 1987. GUS fusions: β- glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6: 3901-3907) em folhas, raízes, frutos, sementes e flores (pétala, gineceu, estame, pólen) das plantas transformadas. EXEMPLO
A presente invenção é ainda definida nos seguintes exemplos. Deve ser entendido que esses Exemplos, enquanto indicam parte da invenção, são colocados como forma de ilustração somente, não tendo, portanto, qualquer cunho limitante do escopo das presentes invenções.
Técnicas usuais de biologia molecular tais como transformação de bactérias e eletroforese em gel de agarose de ácidos nucleicos são referidos através de termos comuns para descrevê-los. Detalhes da prática dessas técnicas, bem conhecidos no estado da técnica, são descritos em Sambrook, et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Várias soluções utilizadas nas manipulações experimentais são referidas por seus nomes comuns tais como "agarose", "TBE", "miniprep", etc. As composições dessas soluções podem ser encontradas na referência Sambrook, et al. (supracitada).
EXEMPLO 1 - Análise in silico Os J''C'ontigsJ' -"'dO banco de dados do genoma café' (VIEIRA, L. G. E. ;
ANDRADE, A. C. ; COLOMBO, C. A. ; MORAES, A. H. A. ; MEHTA, A. ;
OLIVEIRA, A. C. ; LABATE, C. A. ; MARINO, C. L. ; MONTEIRO-VITORELLO, C.
B. . Brazilian coffee genome project: an EST-based genomic resource. Brazilian Journal of Plant Physiology, v. 18, p. 95-108, 2006) foram organizados em 2 grupos contrastantes: fruto e não fruto. Esses dois grupos foram comparados por meio de teste exato de Fisher e o resultado indicou 18 "contigs" preferencialmente expressos em fruto.
Em seguida os "contigs" foram analisados quanto à existência ou não de patentes.
EXEMPLO 2 - Validação Experimental
Foi selecionado para validação experimental um "contig" nomeado gene candidato de fruto 1 - CaLTPl por apresentar alto grau de especificidade e alto nível de expressão exclusiva em fruto e por não estar protegido por patente, nem o gene nem seu promotor. Após os ensaios de caracterização e validação ficou claro que se tratava do gene da LTP (Lipid Transfer Protein-Proteína transferidora de lipídio). A validação experimental do gene CaLTPl (gene candidato de fruto 1) foi realizada como descrito por meio de ensaios de expressão temporal e espacial utilizando-se as técnicas de: RT- PCR (Transcriptase Reverse-PCR); Northern Blot; RT-qPCR.
EXEMPLO 3 - RT-PCR
Para realização dos ensaios de RT-PCR foram extraídas amostras de RNA de raiz, folha e fruto de Coffea arábica cv IAPAR 59, cultivadas no campo experimental da Embrapa Cerrados. O RNA foi extraído segundo a metodologia descrita por Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, e Bedbrook J. 1985. High levei expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4: 2411-2418). Em seguida os RNAs foram avaliados, quanto sua integridade, em gel desnaturante 1,5 %. As amostras de RNA de raiz, folha e fruto foram usadas como molde na formação de moléculas de cDNA por meio de reações de RT-PCR utilizando-se primers oligo dT. Os cDNAs obtidos foram usados em reações de PCR com primers específicos do gene LTP1 para avaliação da tecido especificidade do mesmo. Para tal, foram desenhados os seguintes oligonucleotídeos específicos com ajuda do programa Primer (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) (Rozen, S e Skaletsky H. J. 2000 Primer3 on the WWW -for general- users and for biologist programmers In: Krawetz S, Miscner-S" (cds ) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386):
Primer para fruto n°l : SEQ ID NO 2;
Primer para fruto n°2: SEQ ID NO 3.
As reações foram conduzidas em termociclador MJ Research modelo PTC- 100, com incubação inicial de 94°C por 3 minutos, seguida de 35 ciclos de 94°C por 30 segundos para desnaturação, 50°C por 40 segundos para hibridização dos oligonucleotídeos e 72°C por 1 minuto para extensão. Após os ciclos, as reações foram submetidas a um período adicional de 10 minutos a 72°C para complemento da polimerização. Cada reação continha Ι μΕ de cDNA diluído 1 : 10, 2,5 U de Taq DNA polimerase e 30 pmoles de oligonucleotídeos iniciadores em um volume final de 50 μί. A identidade do produto amplificado foi confirmada pela migração eletroforética dos fragmentos em comparação ao controle positivo, constituído por um vetor do banco de dados do Projeto Genoma Café (FV2-050) contendo a sequência estudada) (Figura 2). EXEMPLO 4 - Extração de RNA
Foram extraídas amostras de RNA total de raiz, folha e fruto de Coffea arábica cv IAPAR 59, cultivadas no campo experimental da Embrapa Cerrados, seguindo o protocolo descrito por Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, and Bedbrook J. 1985. High levei expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4: 2411-2418). Depois de extraídos, os RNAs foram fracionados em gel desnaturante 1 ,5% para análise de sua integridade.
EXEMPLO 5 - Tratamento com DNAse
Os RNAs foram submetidos ao tratamento com a enzima DNAse o qual consistiu em uma reação contendo 10 μg de um dos RNAs, 5 U da enzima DNAse, 2 do tampão de reação 10X (200mM Tris-HCl pH 8, 0,1 mM EDTA, 1 raM DTT) e água DEPC para completar o volume de 20 μΐ,. A reação foi deixada a 37°C por 10 minutos e depois transferida para o gelo. Após a reação as amostras foram tratadas com o objetivo de inativar a DNAse, ou seja, foi adicionado 180 μΐ de água DEPC e 200 μΐ^ de clorofane (24:24: 1 de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico, respectivamente). Após misturar algumas vezes, as amostras foram centrifugadas a 12.000 g por 3 minutos. A fase superior (aquosa) foi transferida para novo tubo e adicionado etanol (2,5 vezes o volume da amostra) e NaAc 3M (1/10 do volume da amostra) e deixado a -20°C durante aproximadamente 16 h. Em seguida as amostras foram centrifugadas a 12.000 g por 40 minutos, descartou-se o sobrenadante e o pellet foi lavado com etanol 70% antes de ser ressuspendido em 20 \ih de água DEPC. Após tratados, uma alíquota dos RNAs foi colocada em gel de agarose 1 ,5% para análise de sua qualidade.
EXEMPLO 6 - Síntese de cDNA
A reação de síntese de cDNA foi realizada com 300 ng de RNA, de raiz, folha ou fruto (tratados com DNAse), 2 yL de oligo dT (50 μΜ), 1 \xL de dNTP Mix (15 mM) e água DEPC até completar 13 iL. A reação foi aquecida à 65°C por 5 minutos e depois colocada no gelo por 3 minutos. Em seguida foi adicionado 4 \xL de First-Strand Buffer (5X), 1 \xL de DDT (0, 1 M) e 1 μΐ de SuperScript III RT (200 υ/μΐ). A reação foi incubada à 50°C por 1 hora e depois a 70°C por 15 minutos para inativar a reação. EXEMPLO 7 - RT-qPCR
Amostras de RNA total de raiz, folha e fruto foram tratadas com DNase e convertidas em cDNA. As reações de PCR foram preparadas utilizando-se o reagente SYBR Green e os seguintes oligonucleotídeos específicos:
Primer para fruto n°3 : SEQ ID NO 4;
Primer para fruto n°4: SEQ ID NO 5.
As reações foram conduzidas em aparelho do tipo 7500 PCR Systems (Applied Biosystems) de acordo com Bustin, (Bustin SA em Quantification of mRNA using real- time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems; J Mol Endocri- nol (2002) v.29 - p23-39). As análises comparativas foram feitas usando-se o gene da ubiquitina como padrão constitutivo (figura 3).
EXEMPLO 8 - Northern blot
Amostras de RNA total de folha e fruto (estágio verde) foram extraídas de cafeeiro adulto da espécie Coffea arábica variedade Catuaí Amarelo. No caso de raiz, foram utilizadas raízes de plantas com 190 dias que foram germinadas em papel germiteste, transferidas para substrato vegetal (vermiculita - Terral) e cumvauas em casa de vegetação. O método de extração de RNA foi como descrito por Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, e Bedbrook J. 1985. High levei expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4: 2411-2418). O RNA foi fracionado em gel desnaturante 1,5%, transferido a vácuo para membrana de nylon, e hibridizado em SSPE com sonda correspondente a sequência parcial da suposta LTP marcada com 32P. O resultado obtido na validação experimental por Northern blotting demonstra a expressão fruto-específica do gene (Fig. 4).
EXEMPLO 9 - Isolamento do promotor O promotor foi isolado por meio da técnica de 5'race, aliada à técnica de PCR
"nested" simplificada pela utilização do Genome Walker Universal Kit (Clontech) segundo especificações do fabricante. Para amplificação foram utilizados os seguintes primers:
la reação: Primer para la reação forward: SEQ ID NO 6;
Primer para lareação re verse: SEQ ID NO 7.
2a reação:
Primer para 2a reação forward: SEQ ID NO 8;
Primer para 2a reação reverse: SEQ ID NO 9.
Os fragmentos obtidos (figura 5) foram clonados e sequenciados pelo método de dideoxinucleotídeo (Sanger,R, Nicklen,S. and Coulson,A.R. 1979. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5463-5468).
EXEMPLO 10 - Obtenção de vetores binários A fim de caracterizar o perfil de expressão do promotor putativo isolado, foram confeccionados 4 vetores binários contendo a versão completa do promotor de CaLTPl , que é um fragmento de 1 ,2 Kb e 3 versões truncadas de 451 pb, 785 pb e 1,0 Kb. Para tal, os fragmentos foram clonados em vetor binário do tipo pBI 121 nos sítios Hind III e Bam Hl de acordo com técnicas padrão de biologia molecular (SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. E; MANIATIS, T. Molecular. Cloning: A Laboratory Manual 1. 2. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 608p).
EXEMPLO 11 - Transformação de fumo com vetores binários
Os vetores binários confeccionados conforme o item anterior foram utilizados na transformação de plantas de fumo. Cepas de Agrobacterium tumefaciens CV3101 (C58PMP90), foram transformadas independentemente com as 4 construções citadas no item anterior, assim como com o controle positivo pBI 121 original segundo Horsch (Horsch R.B., Fry J.B., Hoffman N.L., Eicholts D., Rogers S.G. and Fraley R.T. 1985. A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: 1229— 1231). Após essa etapa, secções foliares (explantes) de Nicotiana tabacum foram imer- sas em suspensão bacteriana contendo o vetor binário por 5 minutos. Em seguida, os discos foram colocados em papel de filtro para eliminar o excesso de bactérias e incubados em meio para co-cultivo durante 48 horas (Trinca, S.; De Pace C; Caccia, R.; Mugnozza, G.S.; Dodds, J.H. Jaynes, J. Transformation of potato (Solanum tuberosum L.) leaf disc using A. tumefaciens transfer DNA sequences coding for lytic peptides. Molecular methods for potato improvement. Lima: CIP, 1991. 85p). Após o co-cultivo, os explantes foram colocados em meio de seleção (meio de co-cultivo suplementado com 50 mg.L-1 de canamicina e 50 mg. L-l de cefotaxima). A eficiência de transformação dos explantes foi avaliada pela expressão transiente e estável do gene gus nos tecidos dos propágulos regenerados. EXEMPLO 12 - Análise da expressão de gus
O fragmento promotor de 451 pares de base é capaz de comandar a expressão do gene repórter gus somente na semente das plantas de fumo (figura 7). A análise da expressão de gus foi feita por ensaio histoquímico conforme adaptação do protocolo descrito por Jefferson (Jefferson R.A., Kavangh T.A. and Bevan M.W. 1987. GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6: 3901-3907) em folhas, raízes, frutos, sementes e flores (pétala, gineceu, estame, pólen) de plantas transformadas com o promotor de 451pb e os controles positivos e negativos. Os cortes foram feitos a mão com o auxílio de bisturi e as amostras foram imersas no tampão de reação que consiste em: 1 mM X-gluc (5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-P-D-glucuronide cyclohexylammonium salt), 10 mM de EDTA, 0.5 mM de ferricianeto~de -potássio;¾e 0.5 mM de ferrocianeto- de potássio,
Figure imgf000037_0001
0,1%, em 100 mM de NaH2P04 . H20. Ajustou-se o pH da solução para 7,0 com NaOH e filtrou-se em capela. Depois do passo de 15 minutos de infiltração à vácuo (5 mmHg) as amostras foram incubadas a 37°C overnight.

Claims

REIVINDICAÇÕES
Um polinucleotídeo com atividade tecido-específica caracterizado por compreender uma sequência selecionada dentre o grupo consistindo de:
a) sequências que sejam substancialmente similares a SEQ ID NOl ;
b) complementos da sequência descrita em SEQ ID NOl ;
c) complementos reversos da sequência descrita em SEQ ID NOl ;
d) sequências reversas da sequência descrita em SEQ ID NOl ;
Um gene quimérico caracterizado por compreender:
a) um polinucleotídeo cuja sequência seja substancialmente similar a SEQ ID NOl, opcionalmente ligado a sequências acentuadoras de expressão ou promotores de interesse; operacionalmente ligados a
b) uma sequência de polinucleotídeo de interesse.
Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo fato da sequência de polinucleotídeo de interesse poder ser uma região de codificação ou uma região de não codificação.
Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelo fato da região de codificação ser isolada de um gene endógeno ou heterólogo.
Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo fato da sequência de polinucleotídeo de interesse poder estar na orientação sense ou antisense.
Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo fato das sequências acentuadoras de expressão serem selecionadas do grupo consistindo de SV40, HSV-1, AMV, HPV-16 , entre outros.
Um vetor recombinante caracterizado por conter um gene quimérico de acordo com a reivindicação 2.
Um vetor recombinante caracterizado por compreender:
a) um polinucleotídeo cuja sequência seja substancialmente similar a SEQ ID NOl, opcionalmente ligado a sequências acentuadoras de expressão ou promotores de interesse; operacionalmente ligados a
b) uma sequência de polinucleotídeo de interesse; e
c) uma sequência de terminação.
Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 8 caracterizado pelo fato da sequência de polinucleotídeo de interesse poder ser uma região de codificação ou uma região de não codificação.
10. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 8 caracterizado pelo fato da sequência de polinucleotídeo de interesse ser isolada de um gene endógeno ou heterólogo.
1 1. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 8 caracterizado pelo fato da sequência de terminação ser selecionada do grupo consistindo de sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans e outros semelhantes.
12. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 8 caracterizado pelo fato das sequências acentuadoras de expressão serem selecionadas do grupo consistindo de SV40, HSV-1, AMV, HPV-16 , entre outros.
13. Uma célula transformada caracterizada pelo fato de conter um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12.
14. Uma planta, ou uma parte, ou um propágulo ou progénie da mesma caracterizada por compreender um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12<
15. Método para modificar a expressão de genes em um organismo caracterizado por incorporar estavelmente no genoma do organismo um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12 ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6.
16. Método de acordo com reivindicação 15 caracterizado pelo fato do organismo ser uma planta.
17. Método para produzir uma planta tendo a expressão de um gene modificada caracterizada pelo fato de compreender as seguintes etapas:
a) transformar uma célula de planta, tecido, órgão ou embrião um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12 ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a b) selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes; c) regenerar plantas maduras de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b);
d) selecionar plantas maduras da etapa (c) tendo a expressão do gene modificada quando comparada com uma planta não transformada.
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