BRPI0612762A2 - genes e promotores de deidrina de café - Google Patents

Abstract

GENES E PROMOTORES DE DEIDRINA DE CAFE. A presente invenção refere-se a polinucleotídeos codificando deidrina e proteína abundante embriogênica tardia (LEA) de plantas de café. Também são descritas uma sequência promotora de um gene de deidrina de café e métodos para uso desses polinucleotídeos e sequências promotoras para regulagem de gene e manipulação de sabor, aroma, tolerância a estresse e outras características de grãos de café.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GENES EPROMOTORES DE DEIDRINA DE CAFÉ".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo de biotecnologia agri-cultural. Em particular, a invenção refere-se a polinucleotídeos codificandodeidrina de plantas de café, seqüências promotoras de genes de deidrina decafé e métodos para uso desses polinucleotídeos e promotores para regula-gem de gene e manipulação do sabor, aroma e outras características degrãos de café.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Várias publicações, incluindo patentes, pedidos de patente pu-blicados e artigos da literatura, são citados durante o relatório. Cada umadessas publicações é incorporada aqui a título de referência, em sua totali-dade. Citações não-reveladas integralmente dentro do relatório podem serencontradas no final do relatório.

Aroma e sabor de café são componentes-chave em preferênciado consumidor para variedades e marcas de café. Aroma e sabor caracterís-ticos do café derivam de uma série complexa de reações químicas envol-vendo precursores de sabor (reações Maillard) que acontecem durante atorrefação do grão. Precursores de sabor incluem compostos químicos ebiomoléculas presentes no grão de café verde. Até agora, mais de 800 agen-tes químicos e biomoléculas foram identificados como contribuindo para sa-bor e aroma de café. (Montavon e outros, J. Agric. Food Chem., 51:2328-34(2003)).

Devido ao fato dos consumidores de café estarem se tornandoprogressivamente sofisticados, é desejável produzir café com aroma e saboraperfeiçoados a fim de satisfazer as preferências do consumidor. Ambosaroma e sabor podem ser artificialmente dados a produtos de café atravésde meios químicos. Vide, por exemplo, Patente U.S. N0 4.072.761 (aroma) ePatente U.S. N0 3.962.321 (sabor). No entanto, até agora, há poucos dadoscom relação à influência de componentes de grão de café naturais tal comopolissacarídeos, proteínas e lipídeos sobre aroma e sabor do café.Uma abordagem é selecionar variedades do germoplasma que têm caracte-rísticas de sabor superiores. Uma desvantagem desta abordagem é que,freqüentemente, as variedades de qualidade mais alta também possuemcaracterísticas agronômicas negativas significantes, tal como rendimentopobre e baixa resistência a doenças e estresses ambientais. É também pos-sível selecionar novas variedades de testes de melhoramento genético ondevariedades com características industriais e agronômicas diferentes são cru-zadas e suas progênies são avaliadas quanto a ambos alta qualidade e per-formance agronômica boa. No entanto, esta última abordagem consomemuito tempo, com um experimento de geração e seleção durante três esta-ções de crescimento levando no mínimo 7-8 anos. Deste modo, uma abor-dagem alternativa para elevar a qualidade do café seria usar as técnicas debiologia molecular para realçar aqueles elementos responsáveis pelo sabore aroma que são naturalmente encontrados no grão de café ou adicionarelementos de realce de aroma e sabor que não acontecem naturalmente emgrãos de café. Engenharia genética é particularmente adequada para atingiressas finalidades. Por exemplo, proteínas do café de espécies de café dife-rentes podem ser trocadas. Na alternativa, a expressão de genes codifican-do proteínas do café de ocorrência natural que positivamente contribuempara sabor do café pode ser aumentada. Por outro lado, a expressão de ge-nes codificando proteínas do café de ocorrência natural que contribuem ne-gativamente para o sabor do café pode ser suprimida. Uma outra aplicaçãode técnicas modernas é usar informação molecular referente à associaçãode alta qualidade com alelos específicos para avaliar novas variedadesquanto à presença ou ausência de tais usando geração auxiliada por marcador.

Cafés de diferentes variedades e origens exibem variações dequalidade de sabor e aroma significantes quando as amostras de grão verdesão torradas e processadas da mesma maneira. As diferenças na qualidadesão uma manifestação de variações químicas e físicas dentro das amostrasde grão que resultam principalmente de diferenças em condições de cresci-mento e processamento, e também de diferenças na base genética de am-bos a planta maternal e o grão. No nível de composição química, pelo me-nos parte da qualidade do sabor pode estar associada com variações nosníveis de metabólitos pequenos, tal como açúcares, ácidos, fenólicos e cafe-ína encontrados associados com grão de diferentes variedades. É aceito quehaja outras moléculas de sabor e precursoras de sabor menos bem caracte-rizadas. Ainda, é provável que variações estruturais dentro do grão prova-velmente também contribuam para diferenças na qualidade do café. Umaabordagem para encontrar novos componentes no grão de café ligados àqualidade do café é estudar os genes e proteínas diferentemente expressosdurante a maturação de amostras de grão em variedades diferentes quepossuem características de qualidade diferentes.

Um grupo de proteínas chamadas as proteínas abundantes naembriogênese tardia (LEA) foi mostrado acumular de uma maneira coorde-nada durante os últimos estágios de desenvolvimento de semente de algo-dão (Dure, L. e outros, Biochemistry, 20:4162-4178 (1981)). Proteínas dei-drina (DHN) são um subgrupo de proteínas LEA que foram também chama-das a "família LEA D-11" ou proteínas LEA tipo 2 (Close, T., Physiol. Plant,97:795-803 (1996); Ingram, J. Annu. Rev. Plant Physiology Plant MoL Biol.,47:377-403 (1996)). Expressão das proteínas DHN foi associada com a pro-teção de vários tipos de células de planta de estresses osmóticos, tal comoaqueles causados por dissecação, sal e temperatura baixa. (Skriver, K. eoutros, Plant Cell, 2:503-512 (1990); Allagulova, C.R. e outros, Biochemistry-Moscow 68:945-951 (2003)).

Nos últimos anos, evidência experimental direta ligou expressãomaior de deidrinas com proteção de estresse osmótico. Por exemplo, plantasArabidopsis engenheiradas para superexpressar uma proteína de fusão dei-drina foram verificadas ter sobrevivência melhorada quando expostas à tem-peratura baixa (Puhakainem, T. e outros, Plant Molecular Biology, 54:743-753 (2004)). Similarmente, expressão de uma proteína deidrina cítrica emtabaco transgênico mostrou dar tolerância maior à baixa temperatura (Hara,M. e outros, Planta 217:290-298 (2003)). Outra evidência de apoio para liga-ção de deidrinas e tolerância a estresse induzido por baixa temperatura sãoas observações que locais QTL para tolerância a congelamento e capacida-de de sobreviver ao clima frio mapeiam muito próximos a deidrinas (Close,T., 1996; Zhu1 B. e outros, Molecular and General Genetics, 264:145-153(2000)). Genes de DHN são também expressos robustamente em sementesem torno do final da maturação, um período quando a semente sofre umaredução desenvolvimentalmente programada no teor de água (Nylander, M.e outros, Plant Molecular Biology, 45:263-279 (2001); Choi, D.W. e outros,Theoretical and Applied Genetics 100:1274-1278 (2000)). As proteínas LE-A/deidrina foram estimadas compreender até 4% da proteína da sementetotal, e são imaginadas estarem envolvidas na proteção do embrião e/ououtros tecidos de semente de estresses osmóticos associados com o teor deágua baixo da semente madura (Roberts, J. e outros, Plant Cell 5:769-780(1993)); Wise, M. e outros, Trends Plant Sci., 9:13-17 (2004)).

Deidrinas são amplamente percebidas participar, com outrasproteínas LEA, no processo de desidratação que acontece durante os últi-mos estágios de maturação de semente através do auxílio na aclimataçãodos tecidos de semente ao teor de água menor encontrado em sementesmaduras (Close, T., 1996); Nylander, M., 2001). Ainda, acredita-se que assementes sintetizadas por deidrina durante maturação também continuem aestabilizar as estruturas celulares associadas durante quiescência da se-mente. Neste último contexto, foi recentemente proposto que deidrinas po-dem também possuir uma capacidade de seqüestro de radical (Hara, M.,2003) e propriedades de ligação de metal (Alsheikh, M.K. e outros, J. Biol.Chem., 278:40882-40889 (2003)), ambas características que são prováveisserem úteis durante longos períodos de armazenamento de semente.

Um número considerável de proteínas deidrina foi isolado e es-tudado, e o(s) mecanismo(s) fisioquímico(s) e/ou estrutural(ais) precisos se-gundo o qual essas proteínas funcionam para proteger células de estresseosmótico in vivo está(ão) sob investigação. As deidrinas são proteínas muitohidrofílicas e exibem um nível excepcionalmente baixo de estrutura reconhe-cível (Close, T., 1996; Soulages, J.L. e outros, Plant Physiology, 131:963-975 (2003)). Um elemento-chave das deidrinas é acreditado ser a presençade um ou mais 15 alongamentos de aminoácidos, ricos em lisina, chamadosos "motivos k", que são previstos formar alfa-hélices anfifáticas de classe A(Close, T., 1996; Close, T. J., Physiol. Plant, 100:291-296 (1997)). Deidrinaspodem também conter dois outros motivos, um "segmento Y" N-terminal(consenso V/TDE/QYGNP) e um "segmento S" rico em serina, o último dosquais pode ser fosforilado e é imaginado participar em localização nuclear(Close, T.J., 1997; Godoy, J.A. e outros, Plant Mol. Biol., 1921-1934 (1994)).

Foi proposto que os segmentos K anfifáticos curtos de polipeptídeos de dei-drina interagem funcionalmente com os "patches" hidrofóbicos expostos asolvente de proteínas que estão sofrendo desnaturação parcial, e então blo-queiam a formação de agregado de proteína (Close, T., 1996). Hélices Kanfifáticas podem também estar envolvidas em ligação de lipídeo de mem-brana, e então poderiam desempenhar um papel mais específico em prote-ção de lipoproteínas, proteínas localizada em membranas e/ou a própria es-trutura da membrana (Close, T., 1996; Koag, M.C. e outros, Plant Physio-Iogy, 131:309-316 (2003)). Uma proposta alternativa para pelo menos partedo efeito protetor de deidrinas é a habilidade dessas proteínas muito está-veis, mas relativamente não-estruturadas, em se ligar fortemente e organizarmoléculas de água (Soulages, J.L., 2003). Este último efeito poderia levar àperda de água reduzida de células, e poderia também melhorar a estabilida-de de certas macromoléculas através do desenvolvimento de região basea-da em deidrina de água "ordenada" firmemente ligada em torno dessas mo-léculas.

Apesar do envolvimento de proteínas deidrina em resistência deplanta a estresses osmóticos tal como seca e estresse de sal e a provávelimportância de deidrinas durantes desenvolvimento de grão, pouca informa-ção está disponível sobre esses genes em café. No café, pouco é compre-endido sobre o número de deidrinas, sua estrutura de proteína, seus níveisde expressão e distribuição em tecidos diferentes da planta de café e dentreespécies de café, bem como durante maturação do grão de café e pericarpo,e a regulagem de sua expressão no nível molecular. Deste modo, há a ne-cessidade de identificar, isolar e caracterizar proteínas deidrina de café, ge-nes e elementos reguladores genéticos. Tal informação vai permitir que pro-teínas deidrina do café sejam geneticamente manipuladas, com o objetivo demelhorar o aroma e sabor do café, bem como melhorando outras vantagensfenotípicas associadas com resistência a estresse osmótico aperfeiçoada.

Deidrinas, que são expressas em níveis relativamente altos nofinal da maturação do grão, são de interesse por causa dos papéis potenci-almente importantes que elas têm na organização de moléculas de água nogrão de café e na estabilização de macromoléculas e organelas dentro dogrão de deidrina maduro. Pelo menos parte deste efeito protetor é acreditadoser devido à habilidade das deidrinas e outras proteínas LEA em estabilizardiferentes interfaces de água/proteína/lipídeo. Devido ao fato dos níveis deágua poderem influenciar o espectro de produtos formados na reação Mail-Iard (Turner, J. e outros, J. Agric. Food. Chem., 50:5400-5404 (2000)), a dis-ponibilidade e organização de moléculas de água no grão de café podeminfluenciar a reação Maillard de geração de sabor que acontece durante atorrefação do café.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção descrita aqui refere-se a polinucleotídeos codificandodeidrina de plantas de café, seus polipeptídeos codificados, seqüênciaspromotoras dos genes de deidrina de café e métodos para uso desses poli-nucleotídeos, polipeptídeos e promotores para regulagem e manipulação degene de sabor, aroma e outras características de grãos de café.

Um aspecto da invenção refere-se a uma molécula de ácido nu-cleico isolada de café (Coffea spp.) tendo uma seqüência de codificação quecodifica uma deidrina ou uma proteína abundante embriogênica tardia (LEA).

Em certas modalidades, a deidrina codificada tem um peso molecular entrecerca de 17 kDa e cerca de 26 kDa. Em certas modalidades, a proteína dei-drina ou LEA codificada tem uma seqüência de aminoácido que é 46% oumais idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOS: 7-12. Em algumas modali-dades, a seqüência de codificação é 45% ou mais idêntica a qualquer umadas seqüências de codificação mostradas nas SEQ ID NO: 1-6.

Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico é um genetendo uma estrutura de leitura aberta que compreende a seqüência de codi-ficação. Alternativamente, ela pode compreender uma molécula de mRNAproduzida através da transcrição deste gene ou uma molécula de cDNA pro-duzida através de transcrição reversa da molécula de mRNA. A invençãorefere-se também a um oligonucleotídeo entre 8 e 100 bases de comprimen-to, o qual é complementar a um segmento da molécula de ácido nucleicoacima mencionada.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um vetor compreen-dendo a molécula de ácido nucleico codificando deidrina ou LEA acima des-crita. Em certas modalidades, o vetor é um vetor de expressão selecionadodo grupo de vetores consistindo em vetores de plasmídeo, fagemídeo, cos-mídeo, baculovírus, bacmídeo, bacteriano, levedura e viral. Em certas moda-lidades, o vetor contém a seqüência de codificação da molécula de ácidonucleico operavelmente ligada a um promotor constitutivo. Em outras moda-lidades, a seqüência de codificação é operavelmente ligada a um promotorinduzível. Em outras modalidades, a seqüência de codificação da moléculade ácido nucleico é operavelmente ligada a um promotor específico de teci-do, tal como um promotor específico de semente, de preferência um promo-tor específico de semente de café. Em modalidades específicas, o promotorespecífico de semente é um promotor de gene de deidrina de café, tal comoo promotor contido na SEQ ID NO: 13.

De acordo com um outro aspecto da invenção, uma célula-hospedeira transformada com o vetor acima mencionado é provida. A célula-hospedeiro pode ser uma célula de planta, bacteriana, fúngica, de inseto oumamífera. Em certas modalidades, a célula-hospedeiro é uma célula deplanta selecionada de qualquer um de café, tabaco, Arabidopsis, milho, trigo,arroz, soja, cevada, centeio, aveias, sorgo, alfafa, trevo, canola, açafrão, gi-rassol, amendoim, cacau, tomate tomatillo, batata, pimenta, beringela, beter-raba açucareira, cenoura, pepino, alface, ervilha, áster, begônia, crisântemo,delfínio, zínia e gramado. A invenção refere-se também a uma planta trans-gênica fértil produzida através da regeneração da célula de planta transfor-mada. Em uma modalidade específica, a planta transgênica fértil é uma es-pécie Coffea.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um método para mo-dular sabor ou aroma de grãos de café. O método compreende modulaçãoda produção de uma ou mais deidrinas ou proteínas LEA dentro de semen-tes de café. Em algumas modalidades, o método compreende aumento daprodução das uma ou mais deidrina ou proteínas LEA, por exemplo, atravésdo aumento da expressão de um ou mais genes de codificação da deidrinaou proteína LEA endógenos dentro das sementes de café ou através da in-trodução de um transgene codificando deidrina ou proteína LEA na planta.

Em outras modalidades, o método compreende diminuição da produção deuma ou mais deidrina ou proteínas LEA1 por exemplo, através da introduçãode uma molécula de ácido nucleico no café que inibe a expressão de um oumais dos genes de codificação da deidrina ou proteína LEA.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um método para au-mento da resistência a estresse osmótico em uma planta. Este método com-preende aumento da produção de uma ou mais deidrina ou proteínas LEAdentro da planta, por exemplo, através da introdução de um transgene decodificação de deidrina ou proteína LEA na planta.

De acordo com um outro aspecto da invenção, um promotor iso-lado de um gene de planta de café codificando deidrina é provido. Em certasmodalidades, o gene de café codificando deidrina codifica uma proteína dei-drina tendo uma ou mais das características descritas acima. Em certas mo-dalidades, o promotor compreende uma ou mais seqüências reguladorasselecionadas do grupo consistindo em uma TATA box, um elemento respon-sivo a ácido abscísico, uma repetição RY (CATGCA(T/a)(A/g) de uma Iegu-minina box para regulagem da expressão de proteínas do tipo leguminina,pelo menos um motivo de seqüência de ação eis de elemento responsivo àdesidratação/repetição C (G/ACCGAC) e pelo menos um motivo E-box(CANNTG). Em uma modalidade específica, o promotor compreende SEQID NO: 13.

A invenção refere-se também a um gene quimérico compreen-dendo um promotor de um gene de codificação de deidrina de café, opera-velmente ligado a uma ou mais seqüências de codificação. Um vetor paratransformação de uma célula, compreendendo o gene quimérico, é tambémprovido, bem como células transformadas com o vetor e plantas transgêni-cas férteis produzidas através da regeneração de uma célula de plantatransformada com o vetor.

Outras características e vantagens da presente invenção serãocompreendidas a partir dos desenhos, descrição detalhada e exemplos queseguem.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

figura 1. Alinhamento ótimo de deidrinas do tipo Y3SK2 de Coffeacanephora com vários homólogos de planta próximos. O alinhamento foi ge-rado usando o programa Clustal W no software MegAIign (DNASTAR) e en-tão otimizado mais manualmente. Aminoácidos idênticos são postos em cai-xa. As barras sólidas demarcam os segmentos Y, os retângulos escurossimples demarcam os segmentos S e os retângulos com linhas interrompi-das demarcam os segmentos K. O círculo preto representa o aminoácidodiferente entre CcDH2a e CcDH2b. Números de acesso: deidrina de Lyco-persicon esculentun TAS14 (AAC49618)(SEQ ID NO: 14); deidrina de Sola-num commersonii Dhnl (CAA75798)(SEQ ID NO:15); deidrina de Arabidop-s/s thaliana RAB18 (NP_201441) (SEQ ID NO:16).

figura 2. Alinhamento opcional da deidrina do tipo SK3 de Coffeacanephora com vários homólogos de planta próximos. O alinhamento foi ge-rado conforme descrito para a figura 1. Aminoácidos idênticos são postos emcaixa. Os retângulos escuros simples demarcam os segmentos S e os re-tângulos com linhas interrompidas demarcam os segmentos K. Números deacesso: deidrina de Nlcotiana tabacum (BAD13499)(SEQ ID N0:17); homó-logo de deidrina de Solanum tuberosum CI7 (T07779) (SEQ ID NO: 18); dei-drina de Arabidopsis thaliana (CAA62449)(SEQ ID N0:19).

figura 3. Alinhamento ótimo da proteína abundante de embriogê-nese tardia de Coffea canephora CcLEAI com vários homólogos de plantapróximos. O alinhamento foi gerado conforme descrito na figura 1. Aminoá-cidos idênticos são postos em caixa. Cisteínas conservadas são marcadaspor um asterisco e a posição de duas cisteínas menos altamente conserva-das marcada por um círculo. Números de acesso: proteína relacionada a-bundante da embriogênese tardia de Arabidopsis thaliana(NP_200248)(SEQ ID N0:20), proteína abundante da embriogênese tardiaEMB7 (T09288)(SEQ ID NO: 21), proteína cap 2 da raiz de Zea mays (BA-A75477)(SEQ ID NO:22).

figura 4. Análise de expressão de RT-PCR de transcritos dasdeidrinas e CcLEAI de café em órgãos diferentes de Coffea arabica e Cof-fea canephora. 100 pb representa Iadder marcador de peso molecular de100 pb; SG1 LG1 YG1 RG representam verde pequeno, verde grande, amare-lo verde e vermelho para o grão e pericarpo respectivamente; R, S, L, F re-presentam raiz, caules, folhas e flores.

figura 5. Análise de expressão de RT-PCR quantitativa de Cc-DH2 em órgãos diferentes de Coffea canephora e Coffea arabica. GSG,GLG, GYG, GRG representam grão verde pequeno, verde grande, amareloe vermelho respectivamente; PSG, PLG, PYG, PRG representam pericarpoverde pequeno, verde grande, amarelo e vermelho respectivamente; R, S, L,F representam raiz, caule, folhas e flores. Os desvios padrão são informadosno gráfico para cada reação.

figura 6. Análise Southern blot de deidrina CcDH2. O autorradio-grama foi exposto por três dias.

figura 7. Seqüência de DNA do promotor de CcDH2a e seqüên-cia transcrita de Coffea canephora. A seqüência de ácido nucleico do insertopVC1 é apresentada, junto com a seqüência amino correspondente. A pri-meira base no cDNA (C) é marcada por um círculo. A TATA box putativaestá sublinhada. As seqüências de repetição RY são marcadas com um sub-linhado duplo, os elementos responsivos a ABA estão em caixa e a seqüên-cia DRE/CRT é posta em caixa com linhas grossas.

figura 8. Gráficos de hidrofilicidade Kyte-Doolittle de polipeptí-deos codificados. CcDHIa (173 aa,SEQ ID NO:17); CcDHIb (176 aa, SEQID NO: 8); CcDH2a (163 aa, SEQ ID NO:9); CcDH2b (163 aa, SEQ IDN0:10); CcDH3 (228 aa, SEQ ID NO:11); CcLEAI (358 aa, SEQ ID NO:12).figura 9. Análise de expressão de RT-PCR Quantitativa de Tem-po Real de expressão de CcDHI nas folhas de plantas de controle e estres-sadas pela seca. As plantas 1-3 eram plantas de controle regularmente re-gadas; as plantas 4-6 não receberam nenhuma água deste o início do expe-rimento ("0") até a semana 6.

figura 10. Análise de expressão de RT-PCR Quantitativa deTempo Real de expressão de CcDH2 nas folhas de plantas de controle eestressadas pela seca. As plantas 1-3 eram plantas de controle regularmen-te regadas; as plantas 4-6 não receberam nenhuma água desde o início doexperimento ("0") até a semana 6.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS

Definições:

Vários termos relacionando-se com as moléculas biológicas eoutros aspectos da presente invenção são usados em todo o relatório e rei-vindicações.

"Isolado" significa alterado "pela mão do homem" do estado na-tural. Se uma composição ou substância ocorre na natureza, ela foi "isolada"se ela tiver sido mudada ou removida de seu ambiente original, ou ambos.Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo naturalmente presente emuma planta ou animal vivo não é "isolado", mas o mesmo polinucleotídeo oupolipeptídeo separado de materiais coexistentes de seu estado natural é "i-solado", como o termo é empregado aqui.

"Polinucelotídeo", também referido como "molécula de ácido nu-cleico", geralmente refere-se a qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxir-ribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não-modificado ou RNA ou DNAmodificado. "Polinucleotídeos" incluem, sem limitação, DNA de filamentosimples e duplo, DNA que é uma mistura de regiões de filamento simples eduplo, RNA de filamento simples e duplo e RNA que é mistura de regiões defilamento simples e duplo, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNAque pode ser de filamento simples ou, mais tipicamente, filamento duplo ouuma mistura de regiões de filamentos simples e duplo. Ainda, "polinucleotí-deo" refere-se a regiões de filamento triplo compreendendo RNA ou DNA ouambos RNA e DNA. O termo polinucleotídeo também inclui DNAs ou RNAscontendo uma ou mais bases modificadas e DNAs ou RNAs com estruturasprincipais modificadas para estabilidade ou por outras razões. Bases "modi-ficadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns tal comoinosina. Uma variedade de modificações pode ser feita em DNA e RNA; en-tão, "polinucleotídeo" compreende formas químicamente, enzimáticamenteou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos conforme tipicamenteencontrado na natureza, bem como as formas químicas de DNA e RNA ca-racterísticas de vírus e células. "Polinucleotídeo" também compreende poli-nucleotídeos relativamente curtos, freqüentemente referidos como oligonu-cleotídeos.

"Polipeptídeo" refere-se a qualquer peptídeo ou proteína com-preendendo dois ou mais aminoácidos unidos um ao outro por ligações pep-tídeo ou ligações peptídeo modificadas, isto é, isósteres de peptídeo. "Poli-peptídeo" refere-se a ambos cadeias curtas, geralmente referidas como pep-tídeos, oligopeptídeos ou oligômeros, e a cadeias mais longas, geralmentereferidas como proteínas. Polipeptídeos podem conter aminoácidos outrosque não os aminoácidos codificados por 20 genes. "Polipeptídeos" incluemseqüências de aminoácido modificadas ou por processos naturais, tal comoprocessamento pós-traducional, ou por técnicas de modificação química quesão bem conhecidas no campo. Tais modificações são bem descritas emtextos básicos e em monografias mais detalhadas, bem como em uma litera-tura de pesquisa extensa. Modificações podem acontecer em qualquer lugarem um polipeptídeo, incluindo a estrutura principal do peptídeo, as cadeiaslaterais do aminoácido e os terminais amino ou carboxila. Será compreendi-do que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo grau ouem graus variáveis em vários locais em um dado polipeptídeo. Também, umdado polipeptídeo pode conter muitos tipos de modificações. Polipeptídeospodem ser ramificados como um resultado de ubiquitinação, e eles podemser cíclicos, com ou sem ramificação. Polipeptídeos cíclicos, ramificados ecíclicos ramificados podem resultar de processos pós-traducionais naturaisou podem ser feitos através de métodos sintéticos. Modificações incluemacetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavi-na, ligação covalente de porção heme, ligação covalente de um nucleotídeoou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado delipídeo, ligação covalente de fosfotidilinositol, ligação com cruzamento, cicli-zação, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de ligaçõescom cruzamento covalentes, formação de cistina, formação de piroglutama-to, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI,hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, processamentoproteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfação,adição de aminoácidos a proteínas mediadas por RNA de transferência talcomo arginilação e ubiquitinação. Vide, por exemplo, Proteins - Structureand Molecular Properties, 2a Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Com-pany, Nova York, 1993 e Wold, F., Posttranslational Protein Modifications:Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 em Posttranslational Covalent Modifi-cation of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova York, 1983;Seifter e outros, "Analysis for Protein Modifications and Nonprotein Cofac-tors". Meth. EnzymoL (1990) 182:626-646 e Rattan e outros "Protein Synthe-sis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann. NY Acad. Sei. (1992)663:48-62.

"Variante" conforme o termo é usado aqui, é um polinucleotídeoou polipeptídeo que difere de um polinucleotídeo ou polipeptídeo de referên-cia respectivamente, mas retém propriedades essenciais. Uma variante típi-ca de um polinucleotídeo difere em seqüência de nucleotídeo de um outro,polinucleotídeo de referência. Mudanças na seqüência de nucleotídeo davariante podem ou não alterar a seqüência de aminoácido de um polipeptí-deo codificado pelo polinucleotídeo de referência. Mudanças em nucleotídeopodem resultar em substituições, adições, deleções, fusões e truncamentode aminoácido no polipeptídeo codificado pela seqüência de referência, con-forme discutido abaixo. Uma variante típica de um polipeptídeo difere emseqüência de aminoácido de um outro polipeptídeo de referência. Em geral,diferenças são limitadas de modo que as seqüências do polipeptídeo de re-ferência e a variante são intimamente similares no geral, em muitas regiões,idênticas. Um polipeptídeo variante e de referência pode diferir em seqüên-cia de aminoácido em uma ou mais substituições, adições ou deleções emqualquer combinação. Um resíduo de aminoácido substituído ou inseridopode ou não ser um codificado pelo código genético. Uma variante de umpolinucleotídeo ou polipeptídeo pode acontecer naturalmente, tal como umavariante alélica, ou ela pode ser uma variante que não é conhecida aconte-cer naturalmente. Variantes de ocorrência não-natural de polinucleotídeos epolipeptídeos podem ser feitas através de técnicas de mutagênese ou atra-vés de síntese direta.

Em referência a plantas mutantes, os termos "mutante nulo" ou"mutante de perda-de-função" são usados para designar um organismo ouseqüência de DNA genômico com uma mutação que faz com que um produ-to de gene seja não-funcional ou amplamente ausente. Tais mutações po-dem acontecer nas regiões de codificação e/ou reguladoras do gene, e po-dem ser mudanças de resíduos individuais, ou inserções ou deleções deregiões de ácidos nucleicos. Essas mutações podem também acontecer nasregiões de codificação e/ou reguladoras de outros genes que podem regularou controlar um gene e/ou proteína codificada, de modo a fazer com que aproteína seja não-funcional ou amplamente ausente.

O termo "substancialmente igual" refere-se a seqüências de áci-do nucleico ou aminoácido tendo variações de seqüência que não afetammaterialmente a natureza da proteína (isto é, a estrutura, características deestabilidade, especificidade de substrato e/ou atividade biológica da proteí-na). Com referência particular a seqüências de ácido nucleico, o termo"substancialmente igual" pretende se referir à região de codificação e a se-qüências conservadas governando expressão, e refere-se principalmente acódons degenerados codificando o mesmo aminoácido, ou códons substitu-tos codificando aminoácidos substitutos conservativos no polipeptídeo codifi-cado. Com referência a seqüências de aminoácido, o termo "substancial-mente igual" refere-se em geral a substituições e/ou variações conservativasem regiões do polipeptídeo não-envolvidas na determinação de estrutura oufunção.Os termos "porcentagem idêntica" e "porcentagem similar" sãotambém usados aqui em comparações entre seqüências de aminoácido eácido nucleico. Quando se referindo a seqüências de aminoácido, "identida-de" ou "porcentagem idêntica" refere-se à porcentagem de aminoácidos daseqüência de aminoácido objeto que foi correlacionada com os aminoácidosidênticos na seqüência de aminoácido comparada através de um programade análise de seqüência. "Porcentagem similar" refere-se à porcentagemdos aminoácidos da seqüência de aminoácido objeto que foi correlacionadacom aminoácidos idênticos ou conservados. Aminoácidos conservados sãoaqueles que diferem em estrutura, mas são similares em propriedades físi-cas de modo que a troca de um pelo outro não mudaria apreciavelmente aestrutura terciária da proteína resultante. Substituições conservativas sãodefinidas em Taylor (1986, J. Theor. Biol., 119:205). Quando se referindo amoléculas de ácido nucleico, "porcentagem idêntica" refere-se à porcenta-gem dos nucleotídeos da seqüência de ácido nucleico objeto que foi correla-cionada a nucleotídeos idênticos por um programa de análise de seqüência.

"Identidade" e "similaridade" podem ser prontamente calculadasatravés de métodos conhecidos. Seqüências de ácido nucleico e seqüênciasde aminoácido podem ser comparadas usando programas de computadorque alinham as seqüências similares dos ácidos nucleicos ou aminoácidos eentão definem as diferenças. Em metodologias preferidas, os programasBLAST (NCBI) e parâmetros usados nele são empregados, e o sistemaDNAstar (Madison, Wl) é usado para alinhar fragmentos de seqüência deseqüências de DNA genômico. No entanto, alinhamentos equivalentes eavaliações de similaridade/identidade podem ser obtidos através do uso dequalquer software de alinhamento padrão. Por exemplo, o GCG WisconsinPackage versão 9.1, disponível da Genetics Computer Group em Madison,Wisconsin, e os parâmetros de referência usados (lacuna na penalidade decriação=12, lacuna na penalidade de extensão=4) por este programa podemser também usados para comparar identidade e similaridade de seqüência.

"Anticorpos" conforme aqui usado inclui anticorpos policlonais emonoclonais, anticorpos quiméricos, de cadeia simples e humanizados, bemcomo fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2 e Fv), inclu-indo os produtos de um Fab ou outra biblioteca de expressão de imunoglo-bulina. Com relação a anticorpos, o termo "imunologicamente específico" ou"específico" refere-se a anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos deuma proteína de interesse, mas que não reconhecem substancialmente e seligam a outras moléculas em uma amostra contendo uma população mistade moléculas biológicas antigênicas. Ensaios de avaliação para determinar aespecificidade de ligação de um anticorpo são bem conhecidos e rotineira-mente praticados na técnica. Quanto a uma discussão compreensiva de taisensaios, vide Harlow e outros (Eds.), ANTIBODIES A LABORATORY MA-NUAL; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Capí-tulo 6.

O termo "substancialmente puro" refere-se a uma preparaçãocompreendendo pelo menos 50-60% em peso do composto de interesse(por exemplo, ácido nucleico, oligonucleotídeo, proteína, etc). Com mais pre-ferência, a preparação compreende pelo menos 75% em peso e com maispreferência 90-99% em peso do composto de interesse. Pureza é medidaatravés de métodos apropriados para o composto de interesse (por exemplo,métodos cromatográficos, eletroforese de gel de agarose ou poliacrilamida,análise de HPLC e similar).

Com relação às moléculas de ácido nucleico de filamento sim-ples, o termo "hibridizando especificamente" refere-se à associação entreduas moléculas de ácido nucleico de filamento simples de seqüência sufici-entemente complementar para permitir tal hibridização sob condições prede-terminadas geralmente usadas na técnica (algumas vezes chamada "subs-tancialmente complementar"). Em particular, o termo refere-se à hibridizaçãode um oligonucleotídeo com uma seqüência substancialmente complementarcontida dentro da molécula de DNA ou RNA de filamento simples, à exclu-são substancial de hibridização do oligonucleotídeo com ácidos nucleicos defilamento simples de seqüência não-complementar.

Uma "seqüência de codificação" ou "região de codificação" refe-re-se a uma molécula de ácido nucleico tendo informação de seqüência ne-cessária para produzir um produto de gene, tal como um aminoácido ou po-lipeptídeo, quando a seqüência é expressa. A seqüência de codificação po-de compreender seqüências não-traduzidas (por exemplo, íntrons ou regiõesnão-traduzidas 5' ou 3') dentro das regiões traduzidas ou pode não ter taisseqüências não-traduzidas intervenientes (por exemplo, como em cDNA).

"íntron" refere-se a seqüências de polinucleotídeo em um ácidonucleico que não codificam informação com relação à síntese de proteína.Tais seqüências são transcritas em mRNA, mas são removidas antes datradução do mRNA em uma proteína.

O termo "operavelmente ligado" ou "operavelmente inserido"significa que as seqüências reguladoras necessárias para expressão da se-qüência de codificação são postas em uma molécula de ácido nucleico nasposições apropriadas com relação à seqüência de codificação de modo apermitir expressão da seqüência de codificação. A título de exemplo, umpromotor é operavelmente ligado com uma seqüência de codificação quandoo promotor é capaz de controlar a transcrição ou expressão desta seqüênciade codificação. Seqüências de codificação podem ser operavelmente ligadasa promotores ou seqüências reguladoras em uma orientação em senso ouantissenso. O termo "operavelmente ligado" é algumas vezes aplicado aorearranjo de outros elementos de controle transcripcionais (por exemplo,aumentadores) em um vetor de expressão.

Seqüências de controle transcripcional e traducional são se-qüências reguladoras de DNA, tal como promotores, aumentadores, sinaisde poliadenilação, terminadores e similar, que provêem a expressão de umaseqüência de codificação em uma célula-hospedeiro.

O termo "promotor", "região de promotor" ou "seqüência promo-tora" refere-se geralmente a regiões reguladoras transcripcionais de um ge-ne que podem ser encontradas no lado 5' ou 3' da região de codificação oudentro da região de codificação ou dentro de íntrons. Tipicamente, um pro-motor é uma região de regulagem de DNA capaz de ligação de polimerasede RNA em uma célula e iniciar a transcrição de uma seqüência de codifica-ção a jusante (direção 3'). A seqüência de promotor 5' típica é ligada em seuterminal 3' pelo sítio de iniciação de transcrição e se estende a montante(direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessá-rios para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima da base. Dentroda seqüência do promotor está um sítio de iniciação de transcrição (conve-nientemente definido por mapeamento com nuclease S1), bem como domí-nios de ligação de proteína (seqüências de consenso) responsáveis pelaligação de polimerase de RNA.

Um "vetor" é um réplicon, tal como um plasmídeo, fago, cosmí-deo ou vírus no qual um outro segmento de ácido nucleico pode ser opera-velmente inserido de modo a causar a replicação ou expressão do segmento.

O termo "construto do ácido nucleico" ou "construto de DNA" éalgumas vezes usado para se referir a uma seqüência ou seqüências de co-dificação operavelmente ligadas a seqüências reguladoras apropriadas einseridas em um vetor para transformação de uma célula. Este termo podeser usado intercomutavelmente com o termo "DNA transformante" ou "trans-gene". Tal construto de ácido nucleico pode conter uma seqüência de codifi-cação para um produto de gene de interesse, junto com um gene marcadorselecionável e/ou um gene repórter.

Um "gene marcador" ou "gene marcador selecionável" é um ge-ne cujo produto de gene codificado confere uma característica que permiteque uma célula contendo o gene seja selecionada dentre células não con-tendo o gene. Vetores usados para engenharia genética tipicamente contêmum ou mais genes marcadores selecionáveis. Tipos de genes marcadoresselecionáveis incluem (1) genes de resistência a antibiótico, (2) genes detolerância ou resistência a herbicida e (3) genes marcadores metabólicos ouauxotrópicos que permitem que células transformadas sintetizem um com-ponente essencial, geralmente um aminoácido, que as células não podemde outro modo produzir.

Um "gene repórter" é também um tipo de gene marcador. Eletipicamente codifica um produto de gene que é ensaiável ou detectável atra-vés de meios de laboratório padrão (por exemplo, atividade enzimática, fluo-rescência).

O termo "expressar", "expresso" ou "expressão" de um gene re-fere-se à biossíntese de um produto de gene. O processo envolve transcri-ção do gene em mRNA e então tradução do mRNA em um ou mais polipep-tídeos, e compreende todas as modificações pós-traducionais de ocorrêncianatural.

"Endógeno" refere-se a qualquer constituinte, por exemplo, umgene ou ácido nucleico, ou polipeptídeo, que pode ser encontrado natural-mente dentro do organismo especificado.

Uma região "heteróloga" de um construto de ácido nucleico é umsegmento identificável (ou segmentos) da molécula de ácido nucleico dentrode uma molécula maior que não é encontrado em associação com a maiormolécula na natureza. Deste modo, quando a região heteróloga compreendeum gene, o gene será geralmente flanqueado por DNA que não flanqueia oDNA genômico no genoma do organismo fonte. Em um outro exemplo, umaregião heteróloga é um construto onde a própria seqüência de codificaçãonão é encontrada na natureza (por exemplo, um cDNA onde a seqüência decodificação genômica contém íntrons ou seqüências sintéticas tendo códonsdiferentes do gene-nativo). Variações alélicas ou eventos mutacionais deocorrência natural não dão origem a uma região heteróloga de DNA confor-me aqui definido. O termo "construto de DNA", conforme acima definido, étambém usado para se referir a uma região heteróloga, particularmente umaconstruída para uso em transformação de uma célula.

Uma célula foi "transformada" ou "transfectada" por DNA exóge-no ou heterólogo quando tal DNA foi introduzido na célula. O DNA transfor-mante pode ou não ser integrado (covalentemente ligado) ao genoma dacélula. Em células procariontes, de levedura e mamífero, por exemplo, oDNA transformante pode ser mantido em um elemento epissomal tal comoum plasmídeo. Com relação a células eucarióticas, uma célula estavelmentetransformada é uma onde o DNA transformante se tornou integrado a umcromossomo de modo que ele é herdado por células filhas através de repli-cação cromossômica. Esta estabilidade é demonstrada pela habilidade dacélula eucariótica em estabelecer linhagens de célula ou clones compreen-didos de uma população de células filhas contendo o DNA transformante.

Um "clone" é uma população de células derivada de uma única célula ouancestral comum através de mitose. Uma "linhagem de célula" é um clonede uma célula primária que é capaz de crescer estável in vitro por muitasgerações.

"Grão" ou "semente" refere-se à unidade de reprodução da plan-ta em amadurecimento, capaz de se desenvolver em uma outra tal planta.Conforme aqui usado, especialmente com relação a plantas de café, os ter-mos são usados sinônima e intercomutavelmente.

Conforme aqui usado, o termo "planta" inclui referência a plantasinteiras, órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, brotos, raízes), se-mentes, pólen, células de planta, organelas de célula de planta e sua progê-nie. Partes de plantas transgénicas devem ser compreendidas dentro do es-copo da invenção compreender, por exemplo, células de planta, protoplas-tos, tecidos, calos, embriões bem como flores, caules, sementes, pólen, fru-tas, folhas ou raízes originando-se em plantas transgénicas ou sua progênie.

O termo "estresse osmótico" refere-se a qualquer estresse naplanta que rompe a concentração de água, açúcar ou eletrólito normal emuma célula de planta ou planta no geral. Estresse osmótico pode ser ambi-entalmente relacionado, tal como condições de pouca água ou seca prolon-gada, temperaturas baixas, frio, temperaturas congelantes, teor de sal altono solo e similar. Estresse osmótico pode também acontecer naturalmente,como seria esperado para desenvolvimento e maturação de semente.

Descrição:

Em um de seus aspectos a presente invenção refere-se a molé-culas de ácido nucleico de café que codificam uma variedade de proteínasdeidrina, bem como uma outra proteína LEA (abundante embriogênica tardi-a). Exemplos representativos de moléculas de ácido nucleico de codificaçãode deidrina e LEA foram identificados a partir de bancos de dados de maisde 47.000 etiquetas de seqüência expressas (ESTs) de várias bibliotecas decDNA de Coffea canephora (robusta) feitas com RNA isolado de folhas jo-vens e de grão e tecidos de pericarpo de cerejas colhidas em estágios dife-rentes de desenvolvimento. ESTs de sobreposição foram identificadas e "a-grupadas" em unigenes (contíguos) compreendendo seqüências de codifica-ção completa. As seqüências de unigenes foram anotadas através da reali-zação de pesquisa BLAST de cada seqüência individual contra o banco dedados de proteína não-redundante NCBI (National Center for BiotechnologyInformation). Análise de seqüência de DNA revelou cinco seqüências únicasrepresentando três genes de deidrina diferentes e um gene de LEA. EssescDNAs são referidos aqui como CcDHIa (SEQ ID NO:1), cCDHIb (SEQ IDNO:2), CcDH2a (SEQ ID NO:3), CcDH2b (SEQ ID NO: 4) e CcDH3 (SEQ IDNO:5). CcDHIa e CcDHIb foram verificados ser variantes alélicas um dooutro, enquanto dois unigenes distintos foram verificados codificar a estrutu-ra de leitura aberta para CcDH2. Ainda, análise de uma biblioteca de cDNAconstruída a partir de RNA isolado de grãos de café em 30 semanas pós-fertilização revelou um clone de cDNA de comprimento completo codificandouma proteína LEA de café. Este cDNA é referido aqui como CcLEAI (SEQID NO:6).

As seqüências de aminoácido deduzidas de CcDHIa-CcDH3são mostradas aqui como SEQ ID NOS: 7-11. As proteínas têm massas mo-Ieculares de aproximadamente 17,8 kDa (CcDHIa, SEQ ID NO:7), 18,1 kDa(CcDHIb SEQ ID NO:8), 17,4 kDa (CcDH2 e CcDH2, SEQ ID NOS:9 e 10) e21,5 kDa (CcDH3, SEQ ID NO:11). Essas proteínas foram verificadas contermotivos de aminoácido de deidrina de assinatura, e foram classificadas deacordo com esses motivos. CcDHIa, CcDHIb e CcDH2 (a e b) têm a estru-tura Y3SK2 e CcDH3 tem a estrutura SK3. CcDHIa e CcDHIb mostram con-servação absoluta em cada um dos três motivos, e nas duas regiões conser-vadas que precedem cada um dos dois motivos K. Em contraste, CcDH2mostra diferenças pontuais em todos exceto um dos motivos Y, S e K, e dife-renças mais significantes fora desses motivos específicos de deidrina. Gráfi-co de hidrofilicidade revelou que todas as proteínas deidrina de café identifi-cadas aqui são muito hidrofílicas inteiramente (Vide figura 8).

A seqüência de aminoácido deduzida codificada por CcLEAI émostrada aqui como SEQ ID NO:12. Esta proteína tem uma massa molecu-lar de aproximadamente 39,5 kDa. Gráfico de hidrofilicidade desta proteínaindica que esta proteína é menos hidrofílica do que as moléculas de deidri-na, e que há duas regiões hidrofóbicas pequenas, uma das quais está Iocali-zada em seus primeiros 30 resíduos N-terminais. O N-terminal de CcLEAIfoi também verificado conter um segmento rico de prolina notável.

Um outro aspecto da invenção refere-se a seqüências promoto-ras e elementos relacionados que controlam a expressão de genes de dei-drina em café. Conforme descrito em mais detalhes nos exemplos, uma se-quência promotora (contida na SEQ ID NO:13) de CcDH2a foi identificadaatravés de "primer walking" auxiliado por PCR. O promotor de CcDH2 foimostrado conter vários elementos reguladores análogos àqueles previamen-te caracterizados em outras espécies estarem envolvidos na regulagem deexpressão de gene durante desenvolvimento de semente. Esses elementosreguladores de CcDH2 são mostrados na figura 7 e descritos nos exemplos.

Usando este promotor ligado ao gene repórter GUS, foi determinado que opromotor é específico para sementes, silíquas, cotilédons, hipocótilos e pri-meiras folhas verdadeiras de mudas em desenvolvimento. Além disso, con-forme descrito nos Exemplos, expressão dos genes CcDHI e CcDH2 tam-bém foi mostrada ser induzida por estresse de seca e outras condições deestresse.

Embora polinucleotídeos codificando deidrinas e proteínas LEAde Coffea canephora sejam descritos e exemplificados aqui, a presente in-venção pretende compreender ácidos nucleicos e proteínas codificadas deoutras espécies de Coffea que são suficientemente similares para seremusadas intercomutavelmente com os polinucleotídeos e proteínas de C. ca-nephora para os propósitos descritos abaixo. Deste modo, quando o termo"deidrina" ou "proteínas abundantes da embriogênese tardia (LEA)" é usadoaqui, ele pretende compreender todas as deidrinas e proteínas LEA de Cof-fea que têm as características físicas, bioquímicas e funcionais gerais descri-tas aqui, bem como os polinucleotídeos que as codificam.

Considerados em termos de suas seqüências, polinucleotídeoscodificando deidrina e proteína abundante da embriogênese tardia da inven-ção incluem variantes alélicas e mutantes naturais de SEQ ID NOS:1-6, quesão prováveis de ser encontrados em variedades diferentes de C. canepho-ra, e homólogos de SEQ ID NOS:1-6, prováveis de ser encontrados em es-pécies de café diferentes. Devido ao fato de tais variantes e homólogos se-rem esperados possuir certas diferenças em seqüência de nucleotídeo eaminoácido, a presente invenção provê moléculas de ácido nucleico codifi-cando deidrina e proteína LEA isoladas que codificam respectivos polipeptí-deos tendo pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, de preferência pelomenos 60, 65 ou 70%, com mais preferência pelo menos 71%, 72%, 73%,74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% ou 80%, com mais preferência ainda 81%,82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% e com mais preferência ainda90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% e ainda mais preferido 96%, 97%, 98% e99% ou mais de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 7-12, ecompreendendo uma seqüência de nucleotídeo tendo faixas equivalentes deidentidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-6. Devido ao fato da vari-ação de seqüência natural provavelmente existir entre deidrinas e proteínasLEA, e os genes codificando-as em variedades e espécies de café diferen-tes, um versado na técnica esperaria encontrar este nível de variação, en-quanto ainda mantendo as propriedades únicas dos polipeptídeos e polinu-cleotídeos da presente invenção. Tal expectativa é devido em partes à de-generação do código genético, bem como ao sucesso evolucionário conhe-cido de variações de seqüência de aminoácido conservativas, que não alte-ram apreciavelmente a natureza da proteína codificada. Deste modo, taisvariantes e homólogos são considerados substancialmente iguais uns aosoutros e são incluídos no escopo da presente invenção.

Conforme mencionado, os inventores demonstraram que a ex-pressão de certos dos genes de deidrina e proteína LEA é específica de se-mente, silíqua e mudas em café, bem como sendo induzíveis por seca e ou-tras formas de estresse. Deste modo, as seqüências reguladoras de geneassociadas com genes de codificação de deidrina e proteína LEA são deutilidade prática e são consideradas dentro do escopo da presente invenção.O promotor de DH2 de C. canephora é exemplificado aqui. A região a mon-tante da seqüência genômica de DH2 de C. canephora é mostrada aqui co-mo SEQ ID ΝΟ.Ί3 e contém parte ou todo o promotor exemplar da invenção,embora outras porções do promotor possam ser encontradas em outros Io-cais no gene, conforme explicado na definição de "promotor" mostrada aci-ma. No entanto, promotores e outras seqüências reguladoras de gene dosgenes de deidrina e proteína LEA de qualquer espécie de café podem serobtidos através dos métodos descritos abaixo e podem ser utilizados de a-cordo com a presente invenção. Os promotores e elementos reguladoresque governam especificidade de tecido e especificidade temporal de expres-são de gene de deidrina e proteína LEA podem ser usados para vantagempara alterar ou modificar a tolerância a estresse osmótico de várias espéciesde café, dentre outras utilidades.

As seções que seguem mostram os procedimentos gerais envol-vidos na prática da presente invenção. Até o ponto que materiais específicossão mencionados, é apenas para o propósito de ilustração, e não pretendelimitar a invenção. A menos que de outro modo especificado, procedimentosbioquímicos e biológicos moleculares gerais, tal como aqueles mostradosem Sambrook e outros, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1989) ou Ausubel e outros (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons (2005), são usados.

Moléculas de Ácido Nucleico, Proteínas e Anticorpos:

As moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser prepara-das através de dois métodos gerais: (1) elas podem ser sintetizadas a partirde trifosfatos de nucleotídeo apropriados ou (2) elas podem ser isoladas defontes biológicas. Ambos métodos utilizam protocolos bem conhecidos natécnica.

A disponibilidade de informação de seqüência de nucleotídeo, talcomo cDNA tendo SEQ ID NOS:1-6, ou a seqüência reguladora de SEQ IDN0:13, permite a preparação de uma molécula de ácido nucleico isolada dainvenção através de síntese de oligonucleotídeo. Oligonucleotídeos sintéti-cos podem ser preparados através do método de fosforamidita empregadono Applied Biosystems 38A DNA Synthesizer ou dispositivos similares. Oconstruto resultante pode ser purificado de acordo com métodos conhecidosna técnica, tal como cromatografia líquida de alta performance (HPLC). Poli-nucleotídeos de filamento duplo, longos, tal como uma molécula de DNA dapresente invenção, devem ser sintetizados em estágios, devido a limitaçõesde tamanho inerentes em métodos sintéticos de oligonucleotídeo atuais.

Deste modo, por exemplo, uma molécula de filamento duplo longa pode sersintetizada como vários segmentos menores de complementaridade apropri-ada. Segmentos complementares então produzidos podem ser anelados demodo que cada segmento possui terminais coesos apropriados para ligaçãode um segmento adjacente. Segmentos adjacentes podem ser ligados porterminais coesos de anelamento na presença de DNA Iigase para construiruma molécula de filamento duplo longa inteira. Uma molécula de DNA sinté-tica então construída pode ser então clonada e amplificada em um vetor a-propriado.

De acordo com a presente invenção, ácidos nucleico tendo ahomologia de seqüência de nível apropriado com parte ou todas as regiõesde codificação e/ou reguladoras de polinucleotídeos de codificação de dei-drina ou LEA podem ser identificados usando condições de hibridização elavagem de estringência apropriada. Será compreendido por aqueles versa-dos na técnica que a estratégia acima mencionada, quando aplicada a se-qüências genômicas, vai, em adição a permitir isolamento de seqüências decodificação de deidrina ou proteína LEA, também permitir isolamento depromotores e outras seqüências reguladoras de gene associadas com genesde deidrina ou de proteína LEA, embora as próprias seqüências reguladoraspossam não compartilhar homologia suficiente para permitir hibridização a-dequada. Além disso, a anotação de pelo menos uma seqüência de codifi-cação parcial vai permitir que o versado na técnica determine a seqüênciade codificação restante, bem como o promotor ou outras seqüências regula-doras de gene associadas com a deidrina ou proteína LEA de interesse atra-vés da técnica de walking de genoma a montante ou a jusante. Tais técnicassão estabelecidas no campo. (Mishra, R.N. e outros, 2002; Rishi, A.S. e ou-tros, 2004).

Como uma ilustração típica, hibridizações podem ser realizadas,de acordo com o método de Sambrook e outros, usando uma solução dehibridização compreendendo: 5X SSC1 5X reagente de Denhardt1 SDS a1,0%, 100 pg/l de DNA de esperma de salmão fragmentado, desnaturado,0,05% de pirosofato de sódio e até 50% de formamida. Hibridização é reali-zada a 37-42°C por pelo menos seis horas. Seguindo a hibridização, filtrossão lavados como segue: (1) 5 minutos em temperatura ambiente em 2XSSC e 1% de SDS; (2) 15 minutos em temperatura ambiente em 2X SSC e0,1% de SDS; (3) 30 minutos-1 hora a 37°C em 2X SSC e 0,1% de SDS; (4)2 horas a 45-55°C em 2X SSC e 0,1% de SDS, mudando a solução a cada30 minutos.

Uma fórmula comum para calcular as condições de estringênciarequeridas para obter hibridização entre moléculas de ácido nucieico de umahomologia de seqüência especificada (Sambrook e outros, 1989):Tm = 81,5°C + 16,6Log[Na+] + 0,41 (%G+C) - 0,63 (% de formamida) -600/no. de pb em dúplex

Como uma ilustração da fórmula acima, usando [Na+] = [0,368]e 50% de formamida, com teor de GC de 42% e um tamanho de sonda mé-dio de 200 bases, a Tm é 57°C. A Tm de um dúplex de DNA diminui em 1 -1,5°C com cada 1% de diminuição na homologia. Deste modo, alvos commais de 75% de identidade de seqüência seriam observados usando umatemperatura de hibridização de 42°C. Em uma modalidade, a hibridização éa 37°C e a lavagem final é a 42°C; em uma outra modalidade a hibridizaçãoé a 42°C e a lavagem final é a 50°C; e em ainda uma outra modalidade, ahibridização é a 42°C e lavagem final é a 65°C, com as soluções de hibridi-zação e lavagem acima. Condições de alta estringência incluem hibridizaçãoa 42°C na solução de hibridização acima e uma lavagem final a 65°C em0,1 X SSC e 0,1% de SDS por 10 minutos.

Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser mantidoscomo DNA em qualquer vetor de clonagem conveniente. Em uma modalida-de preferida, clones são mantidos em vetor de clonagem/expressão deplasmídeo, tal como pGEM-T (Promega Biotech, Madison1 Wl), pBluescript(Stratagene, La Jolla, CA), pCR4-T0P0 (Invitrogen, Carlsbad, CA) oupET28a+ (Novagen, Madison, Wl), todos os quais podem ser propagadosem uma célula-hospedeiro E. coli adequada.

Moléculas de ácido nucleico da invenção incluem cDNA, DNAgenômico, RNA e seus fragmentos que podem ser de filamento simples, du-plo ou até mesmo triplo. Deste modo, a presente invenção provê oligonucle-otídeos (filamentos de DNA ou RNA de senso ou antissenso) tendo seqüên-cias capazes de hibridizar com pelo menos uma seqüência de uma moléculade ácido nucleico da presente invenção. Tais oligonucleotídeos são úteiscomo sondas para detecção de genes codificando deidrina ou proteína LEAou mRNA em amostras de teste de tecido de planta, por exemplo, através deamplificação por PCR, ou para a regulagem positiva ou negativa de expres-são de genes codificando deidrina ou proteína LEA na ou antes da traduçãodo mRNA em proteínas. Métodos onde oligonucleotídeos ou polinucleotí-deos codificando deidrina ou proteína LEA podem ser utilizados como son-das para tais ensaios incluem, mas não estão limitados a: (1) hibridização insitu-, (2) hibridização Southern·, (3) hibridização northerrr, e (4) reações deamplificação combinadas tal como reações de cadeia de polimerase (PCR,incluindo RT-PCR) e reação em cadeia da Iigase (LCR).

Polipeptídeos codificados por ácidos nucleicos da invenção po-dem ser preparados em uma variedade de modos, de acordo com métodosconhecidos. Se produzidos in situ os polipeptídeos podem ser purificados apartir de fontes apropriadas, por exemplo, sementes, pericarpos ou outraspartes de planta.

Alternativamente, a disponibilidade de moléculas de ácido nucle-ico codificando os polipeptídeos permite produção das proteínas usando mé-todos de expressão in vitro conhecidos na técnica. Por exemplo, um cDNAou gene pode ser clonado em um vetor de transcrição in vitro apropriado, talcomo pSP64 ou pSP65 para transcrição in vitro, seguido por tradução livrede célula em um sistema de tradução livre de célula adequado, tal comogerme de trigo ou reticulócitos do coelho. Sistemas de transcrição e traduçãoin vitro estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Promega Biotech,Madison, Wl1 BRL, Rockville, MD ou Invitrogen1 Carlsbad, CA.

De acordo com uma modalidade preferida, quantidades maioresde polipeptídeos de deidrina ou proteína LEA podem ser produzidas atravésda expressão em um sistema procariótico ou eucariótico adequado. Por e-xemplo, parte ou toda a molécula de DNA, tal como os cDNAs tendo SEQ IDNOS: 1-6, pode ser inserida em um vetor de plasmídeo adaptado para ex-pressão em uma célula bacteriana (tal como E. coli) ou uma célula de leve-dura (tal como Sacharomyces cerevisiae) ou em um vetor de baculovíruspara expressão em uma célula de inseto. Tais vetores compreendem os e-Iementos reguladores necessários para expressão do DNA na célula-hospedeiro, posicionados de tal maneira a permitir expressão do DNA nacélula-hospedeiro. Tais elementos reguladores requeridos para expressãoincluem seqüências promotoras, seqüências de iniciação de transcrição e,opcionalmente, seqüências reforçadoras.

As deidrinas ou proteínas LEA produzidas através da expressãode gene em um sistema procariótico ou eucariótico recombinante podem serpurificadas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em uma modali-dade preferida, um sistema de expressão/secreção comercialmente disponí-vel pode ser usado, com o que a proteína recombinante é expressa e emseguida secretada da célula-hospedeiro, para ser facilmente purificada domeio circundante. Se vetores de expressão/secreção não forem usados,uma abordagem alternativa envolve purificação da proteína recombinanteatravés de separação por afinidade, tal como através de interação imunoló-gica com anticorpos que se ligam especificamente à proteína recombinante.Tais métodos são geralmente usados por praticantes versados.

As deidrinas e proteínas LEA da invenção, preparadas atravésdos métodos acima mencionados, podem ser analisadas de acordo comprocedimentos padrão.

Deidrinas e proteínas LEA purificadas a partir de café ou recom-binantemente produzidas podem ser usadas para gerar anticorpos policlo-nais ou monoclonais, fragmentos de anticorpo ou derivados conforme aquidefinido, de acordo com métodos conhecidos. Anticorpos que reconhecem eligam fragmentos das deidrinas ou proteínas LEA da invenção são tambémcompreendidos, contanto que os anticorpos sejam específicos para deidrinasou proteínas LEA. Por exemplo, se análises das proteínas ou análises Sou-thern ou de clonagem (vide abaixo) indicarem que os genes clonados per-tencem a uma família multigene, então anticorpos específicos de membrofeitos para peptídeos sintéticos correspondendo a regiões não-conservadasda proteína podem ser gerados.

Kits compreendendo um anticorpo da invenção para qualquerum dos propósitos descritos aqui são também incluídos no escopo da inven-ção. Em geral, tal kit inclui um antígeno de controle para o qual o anticorpo éimunoespecífico.

As deidrinas, e provavelmente as proteínas LEA também, estãoenvolvidas em proteção de componentes celulares de estresses osmóticos(desidratação, temperaturas baixas/congelamento, sal). Deste modo, as dei-drinas e proteínas LEA de café descritas e exemplificadas aqui são espera-das encontrar utilidade em uma variedade de aplicações alimentícias e cos-méticas. Por exemplo, as deidrinas ou proteínas LEA podem ser utilizadaspara alterar nucleação de gelo em alimentos congelados ou para facilitar asecagem de proteínas de uma maneira que permite reidratação rápida emum estágio posterior. Como um outro exemplo, as deidrinas ou proteínasLEA podem ser utilizadas em produtos de creme para a pele hidratantes.

Ainda, as propriedades antioxidantes e de ligação de íons recentementeconstatadas de deidrinas podem provar ser vantajosas em ambos produtosalimentícios e cosméticos. Em conexão com aplicações de alimento, é dignode atenção que deidrinas são proteínas muito não-estruturadas, altamentesolúveis, e elas não são conhecidas terem ligação dissulfeto. Como resulta-do, essas proteínas são prováveis de exibir antigenicidade muito baixa e vãoprovavelmente ser facilmente digeridas pelas proteases no intestino.

Uma ou mais das aplicações acima mencionadas para as deidri-nas ou proteínas LEA podem ser continuadas através da exploração da dis-ponibilidade dos polinucleotídeos codificando deidrina e proteína LEA descri-tos aqui em gerar quantidades significantes de proteína pura usando orga-nismos recombinantes (por exemplo, na levedura Picia pastoris ou em ali-mento compatível com Lactobacilli, ou em células de planta) e então testedas proteínas em ensaios já estabelecidos para formação de gelo, efeitossobre secagem, reidratação e potencial antioxidante. Se proteínas purifica-das específicas forem verificadas ser particularmente úteis, versões naturaisdessas proteínas também podem ser isoladas de grãos de café determina-dos ser ricos nessas deidrinas ou proteínas LEA particulares.

Vetores, Células, Tecidos e Plantas:

Também apresentados de acordo com a presente invenção sãovetores e kits para produção de células-hospedeiro transgênicas que contêmum polinucleotídeo ou oligonucleotídeo codificando deidrina ou proteína LE-A, ou homólogo, ou análogo ou sua variante, em uma orientação de sensoou antissenso, ou um gene repórter e outros construtos sob controle de pro-motores de gene codificando deidrina e proteína LEA e outras seqüênciasreguladoras. Células-hospedeiro adequadas incluem, mas não estão limita-das a, células de planta, células bacterianas, células de levedura e outrasfúngicas, células de inseto e células de mamífero. Vetores para transforma-ção de uma ampla variedade dessas células-hospedeiro são bem conheci-dos daqueles de habilidade na técnica. Eles incluem, mas não estão limita-dos a, plasmídeos, fagemídeos, cosmídeos, baculovírus, bacmídeos, cro-mossomos artificiais (BACs), cromossomos artificiais de levedura (YACs),bem como outros vetores bacterianos, de levedura e virais. Tipicamente, kitspara produção de células-hospedeiro transgênicas vão conter um ou maisvetores apropriados e instruções para produção das células transgênicasusando o vetor. Os kits podem ainda incluir um ou mais componentes adi-cionais, tal como meio de cultura para cultura das células, reagentes pararealização de transformação das células e reagentes para teste de célulastransgênicas para expressão de gene, para mencionar alguns.

A presente invenção inclui plantas transgênicas compreendendouma ou mais cópias de um gene de codificação de deidrina ou proteína LEA,ou seqüências de ácido nucleico que inibem a produção ou funcionamentode deidrinas ou proteínas LEA endógenas de uma planta. Isto é realizadoatravés da transformação das células de planta com um transgene que com-preende parte de toda a seqüência de codificação de deidrina ou proteínaLEA, ou mutante, antissenso ou sua variante, incluindo RNA1 controlada porseqüências reguladoras ou nativas ou recombinantes, conforme descrito a-baixo. Espécies de café de plantas transgênicas são preferidas, incluindo,sem limitação, C. abeokutae, C. arabica, C. arnoldiana, C. aruwemiensis, C.bengalensis, C. canephora, C. congensis, C. dewevrei, C. excelsa, C. euge-noides e C. heterocalyx, C. kapakata, C. khasiana, C. liberica, C. moloundou,C. rasemosa, C. salvatrix, C. sessiflora, C. stenophylla, C. travencorensis, C.wightiana e C. zanguebariae. Plantas de qualquer espécie são também in-cluídas na invenção; essas incluem, mas não estão limitadas a, tabaco, Ara-bidopsis e outras espécies "amigáveis em laboratório", cereais tal como mi-lho, trigo, arroz, soja, cevada, centeio, aveias, sorgo, alfafa, trevo e similar,plantas produtoras de óleo tal como canola, açafrão, girassol, amendoim,cacau e similar, vegetais tal como tomate tomatillo, batata, pimenta, beringe-la, beterraba açucareira, cenoura, pepino, alface, ervilha e similar, plantashorticulturais tal como áster, begônia, crisântemo, delfínio, petúnua, zínia,grama e gramado "turfgrasses" e similar.

Plantas transgênicas podem ser geradas usando métodos detransformação de planta padrão conhecidos daqueles versados na técnica.Essas incluem, mas não estão limitadas a, vetores de Agrobacterium, trata-mento com polietileno glicol de protoplastos, aplicação de DNA biolística,microfeixe de laser UV, vetores de gemini vírus e outros vetores virais deplanta, tratamento com fosfato de cálcio de protoplastos, eletroforação deprotoplastos isolados, agitação de suspensões celulares em solução commicrocontas revestidas com o DNA transformante, agitação de suspensãocelular em solução com fibras de silício revestidas com DNA transformante,absorção de DNA direta, absorção de DNA mediada por Iipossoma e similar.Tais métodos foram publicados na técnica. Vide, por exemplo, Methods forPlant Molecular Biology (Weissbach & Weissbach, Eds., 1988); Methods inPlant Molecular Biology (Schuler & Zielinski, Eds., 1989); Plant MolecularBiology Manual (Gelvin, Schilperoort, Verma1 Eds., 1993); e Methods in PlantMolecular Biology - A Laboratory Manual (Maliga, Klessig, Cashmore, Gruis-sem & Varner, Eds., 1994).

O método de transformação depende da planta a ser transfor-mada. Vetores de Agrobacterium são freqüentemente usados para transfor-mar espécies dicot. Vetores binários de Agrobacterium incluem, mas nãoestão limitados a, BIN19 e seus derivados, a série de vetor pBI e vetoresbinários pGA482, pGA492, pLH7000 (Acesso no GenBank AY234330) equalquer um adequado dos vetores pCAMBIA (derivado dos vetores pPZPconstruídos por Hajdukiewicz1 Svab & Maliga, (1994), Plant Mol. Biol.,25:989-994, disponível da CAMBIA, GPO Box 3200, Canberra, ACT 2601,Austrália ou através da internet em CAMBIA.org). Para transformação deespécies monocot, bombardeamento biolístico com partículas revestidascom DNA transformante e fibras de silício revestidas com DNA transforman-te é freqüentemente útil para transformação nuclear. Alternativamente, veto-res "superbinários" de Agrobacterium têm sido usados com sucesso para atransformação de arroz, milho e várias outras espécies monocot.

Construtos de DNA para transformação de uma planta selecio-nada compreendem uma seqüência de codificação de interesse operavel-mente ligada a seqüências reguladoras 5' apropriadas (por exemplo, se-qüências promotoras e reguladoras traducionais) e seqüências reguladoras3' (por exemplo, terminadoras). Em uma modalidade preferida, uma seqüên-cia de codificação de deidrina ou proteína LEA sob controle de seus elemen-tos reguladores 5' e 3' é utilizada. Em outras modalidades, seqüências decodificação e reguladoras de deidrina ou proteína LEA são trocadas (por e-xemplo, seqüência de codificação de CcLEAI operavelmente ligada ao pro-motor de CcDH2) para alterar o teor de água ou proteína da semente daplanta transformada para um aperfeiçoamento fenotípico, por exemplo, sa-bor, aroma ou outra característica.

Em uma modalidade alternativa, a região de codificação do geneé posta sob um promotor constitutivo poderoso, tal como o promotor 35S doVírus Mosaico da Couve-Flor (CaMV) ou o promotor 35S do vírus do mosai-co da escrofulária. Outros promotores constitutivos compreendidos para usona presente invenção incluem, mas não estão limitados a: promotores demanopina sintetase, nopalina sintase e octopina sintase de T-DNA. Em ou-tras modalidades, um promotor de monocot forte é usado, por exemplo, opromotor de ubiquitina de milho, o promotor de actina do arroz ou o promotorde tubulina de arroz (Jeon e outros, Plant Physiology, 123:1005-14, 2000).

Plantas transgênicas expressando seqüências de codificação dedeidrina ou proteína LEA sob um promotor induzível são também compreen-didas estar dentro do escopo da presente invenção. Promotores de plantainduzíveis incluem o promotor controlado por repressor/operador de tetraci-clina, os promotores de gene de choque térmico, promotores induzidos porestresse (por exemplo, ferimento), promotores de gene responsivo à defesa(por exemplo, genes da fenilalanina amônia liase), promotores de gene indu-zidos por ferimento (por exemplo, genes de proteína de parede celular ricosem hidroxiprolina), promotores de gene quimicamente induzíveis (por exem-plo, genes de nitrato redutase, genes de glucanase, genes de quitinase, etc)e promotores de gene induzíveis pelo escuro (por exemplo, gene de aspara-gian sintetase) para mencionar alguns.

Promotores específicos de tecido e específicos de desenvolvi-mento são também compreendidos para uso na presente invenção, em adi-ção aos promotores de deidrina e proteína LEA Específicos de semente dainvenção. Exemplos não-limitantes de outros promotores específicos de se-mente incluem Ciml (mensagem induzida por citoquinina), cZ19B1 (zeína de19 kDa de milho), milps (mio-inositol-1 -fosfato sintase) e celA (celulose sin-tase) (Pedido de Patente U.S. N0 09/377.648), beta-faseolina de feijão, na-pin, beta-conglicinina, Iecitina de soja, cruciferina, zeína de milho de 15 kDa,zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, waxy, shrunken-1, shrunken-2 eglobulina 1, Iegumina de soja 11S (Bàumlein e outros, 1992) e proteína dearmazenamento de semente de C. Canephora 11S (Marraccini e outros,1999, Plant PhysioL Biochem., 37:273-282). Vide também WO 00/12733,onde promotores preferidos de semente de genes terminação 1 e termina-ção 2 são revelados. Outros promotores específicos de semente de Coffeapodem ser também utilizados, incluindo, mas não limitado a, o promotor dogene oleosina descrito no Pedido de Patente PCT copendente, de proprie-dade comum N0 [Não concedido ainda]. Exemplos de outros promotores es-pecíficos de tecido incluem, mas não estão limitados a: promotores do genede subunidade pequena de ribulose bifosfato carboxilase (RuBisCo) (porexemplo, o promotor de subunidade pequena de café conforme descrito porMarracini e outros, 2003) ou promotores do gene de proteína de ligação a/bde clorofila (CAB) para expressão em tecido fotossintético; e os promotoresdo gene glutamina sintetase específicos de raiz onde expressão em raízes édesejada.

A região de codificação é operavelmente ligada a uma seqüên-cia reguladora 3' apropriada. Em modalidades onde a seqüência reguladora3' nativa não é usada, a região de poliadenilação de nopalina sintetase podeser usada. Outras regiões reguladores 3' úteis incluem, mas não estão Iimi-tadas à, região de poliadenilação de octopina sintase.

A região de codificação selecionada, sob controle de elementosreguladores apropriados, é operavelmente ligada ao marcador de resistênciaao fármaco nuclear, tal como resistência à canamicina. Outros sistemas demarcador selecionável úteis incluem genes que conferem resistências a an-tibiótico ou herbicida (por exemplo, resistência à higromicina, sulfonilureia,fosfinotricina ou glifosato) ou genes conferindo crescimento seletivo (por e-xemplo, fosfomanose isomerase, permitindo crescimento de células de plan-ta em manose). Genes marcadores selecionáveis incluem, sem limitação,genes codificando resistência a antibiótico, tal como aqueles codificando ne-omicina fosfotransferase Il (ΝΕΟ), di-hidrofolato redutase (DHFR) e higromi-cina fosfotransferase (HPT), bem como genes que conferem resistência acompostos herbicidas, tal como EPSPS resistente a glifosato e/ou glifosatooxidorredutase (GOX)1 Bromoxynil nitralase (BXN) para resistência à bromo-xinila, genes AHAS para resistência à imidazolinonas, gentes de resistênciaà sulfonilureia e genes de resistência a 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D).

Em certas modalidades, promotores e outras seqüências regula-doras de expressão compreendidos pela presente invenção são operavel-mente ligados a genes repórter. Genes repórter compreendidos para uso nainvenção incluem, mas não estão limitados a, genes codificando proteínafluorescente verde (GFP)1 proteína fluorescente vermelha (DsRed)1 ProteínaFluorescente Ciano (CFP)1 Proteína Fluorescente Amarela (YFP)1 ProteínaFluorescente Laranja de Cerianto (cOFP), fosfatase alcalina (AP)1 β-Iactamase1 cloranfenicol acetiltransferase (CAT)1 adenosina desaminase (A-DA), aminoglicosídeo fosfotransferase (neor, G418r), di-hidrofolato redutase(DHFR)1 higromicina-B-fosfotransferase (HPH)1 timidina cinase (TK)1 IacZ(codificando α-galactosidase) e xantina guanina fosforribosiltransferase(XGPRT)1 Beta-Glucuronidase (gus), Fosfatase Alcalina Planeental (PLAP)1Fosfatase Alcalina Embriônica Secretada (SEAP) ou Luciferase de Vagalu-me ou Bacteriana (LUC). Como com muitos procedimentos padrão associa-dos com a prática da invenção, versados na técnica estarão conscientes deseqüências adicionais que podem servir a função de um marcador ou repórter.

Modificações de seqüência adicionais são conhecidas na técnicaaumentar a expressão do gene em um hospedeiro celular. Essas modifica-ções incluem eliminação de seqüências codificando sinais de poliadenilaçãosupérfluos, sinais de sítio de união de éxon-íntron, repetições do tipo trans-poson e outras tais seqüências bem caracterizadas que podem ser prejudi-ciais para expressão do gene. Alternativamente, se necessário, o teor deG/C da seqüência de codificação pode ser ajustado para níveis médios paraum dado hospedeiro de célula de planta de café, conforme calculado atravésde referência a genes conhecidos expressos em uma célula de planta decafé. Também, quando possível, a seqüência de codificação é modificadapara evitar estruturas de mRNA secundárias hairpin previstas. Uma outraalternativa para aumentar expressão de gene é usar seqüências líder 5'. Se-qüências líder de tradução são bem conhecidas na técnica e incluem o deri-vado de ação eis (ômega') da seqüência líder 5' (ômega) do vírus do mosai-co do tabaco, as seqüências líder 5' do vírus do mosaico do capim bromo,vírus do mosaico da alfafa e vírus do mosaico amarelo do nabo.

Plantas são transformadas e em seguida avaliadas quanto auma ou mais propriedades, incluindo a presença do produto de transgene, omRNA codificando o transgene ou um fenótipo alterado associado com ex-pressão do transgene. Deve ser reconhecido que a quantidade de expres-são, bem como o padrão específico de tecido e temporal de expressão dotransgene em plantas transformadas pode variar dependendo da posição desua inserção no genoma nuclear. Tais efeitos de posição são bem conheci-dos na técnica. Por esta razão, vários transformantes nucleares devem serregenerados e testados quanto à expressão do transgene.

Métodos:

Os ácidos nucleicos e polipeptídeos da presente invenção po-dem ser usados em qualquer um de vários métodos com o que os produtosde proteína podem ser expressos em plantas de café a fim de que as proteí-nas possam desempenhar um papel em tolerância a estresse na planta, e noaumento do sabor e/ou aroma da bebida de café ou produtos de café por fimproduzidos a partir do grão da planta de café expressando a proteína.

Com relação à tolerância a estresse, é agora bem estabelecidoque proteínas deidrina participam em proteção de plantas de estresses os-móticos ou ambientais tal como desidratação e congelamento (Allagulova eoutros, 2003). Por exemplo, deidrinas desempenham um papel em retençãode água e regulagem osmótica para proteger a planta contra a perda de á-gua, especialmente em condições de seca. Ainda, dado que as deidrinasexibem a capacidade em interagir com cátions, proteínas deidrina podemservir para ligar sais em excesso durante períodos de água limitada, e po-dem servir como uma função de quelação. Deidrinas também desempenhamum papel na integridade estrutural do material nuclear tal como cromatinadurante dissecação celular na semente em desenvolvimento, e foram verifi-cadas desempenhar um papel em proteção contra formação de cristal degelo e degradação de amido em temperatura congelante. A função de umadada proteína deidrina pode estar relacionada ao local da proteína dentro dacélula. Por exemplo, deidrinas localizadas no exterior da membrana celularpodem servir para estabilizar lipídeos e proteínas de membrana (Allagulovae outros, 2003). Deste modo, a habilidade em manipular produção de deidri-na ou proteína LEA em uma planta, ou até mesmo usar os polinucleotídeose proteínas da invenção para monitorar tal expressão de gene, vai permitir oestudo e manipulação de seca, frio ou sal, isto é, tolerância osmótica emcafé. Tal manipulação pode se estender da muda em germinação para aplanta em crescimento e fruta e sementes em desenvolvimento, para a esta-bilidade em armazenamento pós-colheita de grãos de café. Este conheci-mento permite a geração de plantas de café modificadas que são melhorequipadas para crescimento saudável e produção de plantação sob condi-ções de estresses osmóticos ou ambientais agudos ou prolongados tal comoaqueles encontrados sob períodos secos, condições de seca, frio ou conge-lamento prolongado. Deste modo, um aspecto da invenção refere-se a mé-todos para proteger plantas, de preferência plantas de café, através do au-mento da resistência a estresse osmótico através da modulação da expres-são de deidrinas ou proteínas LEA na planta.

Com relação ao sabor e aroma de grão de café torrado, é espe-rado que as deidrinas e proteínas LEA relacionadas exerçam alguma influ-ência sobre a geração de sabores de café via a reação Maillard que aconte-ce durante a torrefação. Proteínas, e particularmente produtos de degrada-ção de proteína (peptídeos e aminoácidos), representam um grupo importan-te de precursores de sabor (Spanier e outros, 2004). Deste modo, proteínasrelativamente abundantes tal como as deidrinas e proteínas LEA podem seresperadas fazer alguma contribuição para as reações de geração de saborque acontecem durante a torrefação do café. Neste contexto, é possível queessas proteínas relativamente não-estruturadas e muito hidrofílicas e alta-mente solúveis reajam diferentemente de outras proteínas celulares duranteuma reação Maillard, ou devido à sua estrutura incomum e/ou devido a su-ais) interação(ões) incomuns com moléculas de água. Sabe-se bem que osníveis de água presentes durante reações de cozimento, tal como a etapa detorrefação de café, podem também influenciar fortemente o(s) curso(s) dereações químicas induzidas por calor (Turner e outros, 2002). Devido ao fatodas deidrinas contribuírem para a organização de moléculas de água nogrão, uma variedade de diferenças específicas nos níveis e distribuição das* deidrinas poderia influenciar o desenvolvimento de um sabor durante o pro-cesso de torrefação. A habilidade em monitorar (por exemplo, através degeração auxiliada por marcador) ou manipular perfis de expressão de deidri-na e proteína LEA é provida pelos polinucleotídeos da presente invenção, deacordo com os métodos descritos aqui.

Deste modo, um aspecto da presente invenção refere-se a mé-todos para alterar o perfil da deidrina ou proteína LEA em uma planta, depreferência café, compreendendo aumento ou diminuição da uma quantida-de ou atividade de uma ou mais proteínas deidrina ou LEA na planta. Porexemplo, em uma modalidade da invenção, um gene codificando deidrinasob controle de suas próprias seqüências de controle de expressão é usadopara transformar uma planta para o propósito de produção grande desta dei-drina na planta. Alternativamente, uma região codificando deidrina ou proteí-na LEA é operavelmente ligada a regiões de controle de expressão heteró-logas, tal como promotores constitutivos ou induzíveis.

A organização de moléculas de água ou a estabilização de ma-cromoléculas ou organelas no grão de uma planta pode também ser alteradaatravés da diminuição da produção de uma ou mais deidrinas ou proteínasLEA na planta, ou através da avaliação de variantes de ocorrência naturalpara expressão de deidrina ou proteína LEA menor. Por exemplo, plantasmutantes de perda-de-função (nulas) podem ser criadas ou selecionadas depopulações de mutantes de planta atualmente disponíveis. Será tambémcompreendido por aqueles de habilidade na técnica que populações de plan-ta mutantes podem também ser avaliadas quanto a mutantes que superex-pressam uma deidrina particular, utilizando um ou mais dos métodos descri-tos aqui. Populações mutantes podem ser feitas através de mutagênesequímica, mutagênese por radiação e inserções de transposon ou T-DNA1 oudirecionando lesões locais induzidas em genomas (TILLING vide, por exem-plo, Henikoffe outros, 2004, Plant Physiol., 135(2):630-636; Gilchrist & Hau-ghn, 2005, Curr. Opin. Plant BioL1 8(2):211-215). Os métodos para fazer po-pulações mutantes são bem conhecidos na técnica.

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser usados para identi-ficar mutantes de deidrina ou proteínas LEA em várias espécies de planta.Em espécies tal como milho ou Arabidopsis, onde linhagens de inserção detransposon estão disponíveis, iniciadores de oligonucleotídeo podem serfeitos para avaliar linhagens quanto a inserções nos genes de deidrina ouproteína LEA. Através de geração, uma linhagem de planta pode ser entãodesenvolvida que é heterozigota ou homozigota para o gene interrompido.

Uma planta pode ser também engenheirada para mostrar umfenótipo similar àquele visto em mutantes nulos criados através de técnicasmutagênicas. Um mutante nulo transgênico pode ser criado através da ex-pressão de uma forma mutante de uma deidrina ou proteína LEA seleciona-da para criar um "efeito negativo dominante". Embora não limitando a inven-ção a nenhum outro mecanismo, a proteína mutante vai competir com prote-ína do tipo selvagem para interação de proteínas ou outros fatores celulares.Exemplos deste tipo de efeito "negativo dominante" são bem conhecidospara ambos sistemas de inseto e vertebrados (Radke e outros, 1997, Gene-tics 145:163-171; Kolch e outros, 1991, Nature 349:426-428).

Um outro tipo de mutante nulo transgênico pode ser criado atra-vés da inibição da tradução de mRNA codificando deidrina ou proteína LEAatravés de "silenciamento de gene pós-transcripcional". O gene codificandodeidrina ou proteína LEA da espécie direcionada para regulagem para baixo,ou um seu fragmento, pode ser utilizado para controlar a produção da prote-ína codificada. Moléculas de antissenso de comprimento completo podemser usadas para este propósito. Alternativamente, oligonucleotídeos de an-tissenso direcionados para regiões específicas do mRNA que são críticaspara tradução podem ser utilizados. O uso de moléculas de antissenso paradiminuir níveis de expressão de um gene predeterminado é bem conhecidona técnica. Moléculas de antissenso podem ser providas in situ através datransformação de células de planta com um construto de DNA que, quandoda transcrição, produz as seqüências de RNA de antissenso. Tais construtospodem ser feitos para produzir seqüências de antissenso de comprimentocompleto ou parciais. Este efeito de silenciamento de gene pode ser aumen-tado através de superprodução transgenicamente de ambos RNA de sensoe antissenso da seqüência de codificação de gene de modo que uma grandequantidade de dsRNA é produzida (por exemplo, vide Waterhouse e outros,1998, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 95:13959-13964). Com relação a isso,seqüências contendo dsRNA que correspondem a parte ou todo de pelomenos um íntron foram verificadas particularmente eficazes. Em uma moda-lidade, parte ou todo o filamento de antissenso da seqüência de codificaçãode deidrina ou proteína LEA é expresso por um transgene. Em uma outramodalidade, filamentos de senso e antissenso de hibridização de parte outoda a seqüência de codificação de deidrina ou proteína LEA são transgeni-camente expressos.

Em uma outra modalidade, genes de deidrina ou LEA podem sersilenciados através do uso de uma variedade de outras técnicas de silenci-amento de gene pós-transcripcionais (silenciamento de RNA) que estão atu-almente disponíveis para sistemas de planta. Silenciamento de RNA envolveo processamento de RNA de filamento duplo (dsRNA) em 21-28 fragmentosde nucleotídeo por uma enzima de base H RNase ("Dicer" ou "tipo Dicer").

Os produtos de clivagem, que são siRNA (RNA curto interferente) ou miRNA(micro-RNA), são incorporados aos complexos efetores de proteína que re-gulam expressão de gene de uma maneira específica de seqüência (pararevisões de silenciamento de RNA em plantas vide Horiguchi, 2004, Differen-tiation 72: 65-73: Baulcombe, 2004, Nature 431:356-363; Herr, 2004, Bio-chem. Soe. Trans. 32:946-951).

RNAs curtos interferentes podem ser quimicamente sintetizadosou transcritos e amplificados in vitro, e então aplicados às células. Aplicaçãopode ser através de microinjeção (Tuschl, T. e outros, 2002), transfecçãoquímica (Agrawal, N. e outros, 2003), eletroforação ou transfecção mediadapor Iipossoma catiônico (Brummelkamp, T.R. e outros, 2002; Elbashir, S.M. eoutros, 2002) ou qualquer outro meio disponível na técnica, que será com-preendido pelo versado na técnica. Alternativamente, o siRNA pode ser ex-presso intracelularmente através da inserção de moldes de DNA para siRNAnas células de interesse, por exemplo, por meio de um plasmídeo, (Tuschl,T. e outros, 2002), e pode ser especificamente direcionado para selecionarcélulas. RNAs curtos interferentes foram introduzidos com sucesso em plan-tas (Klahre, U. e outros, 2002).

Um método preferido de silenciamento de RNA na presente in-venção é o uso de RNAs hairpin curtos (shRNA). Um vetor contendo umaseqüência de DNA codificando uma seqüência de siRNA desejada particularé aplicado a uma célula alvo através de um meio comum. Uma vez na célu-la, a seqüência de DNA é continuamente transcrita em moléculas de RNAque dão a volta em si mesmas e formam estruturas hairpin através de for-mação de par de base intramolecular. Essas estruturas hairpin, uma vezprocessadas pela célula, são equivalentes a moléculas de siRNA e são usa-das pela célula para mediar silenciamento de RNA da proteína desejada.Vários construtos de utilidade particular para silenciamento de RNA em plan-tas são descritos por Horiguchi, 2004, supra. Tipicamente, tal construtocompreende um promotor, uma seqüência do gene-alvo a ser silenciado naorientação de "senso", um espaçador, o antissenso da seqüência de gene-alvo e um terminador.

Ainda um outro tipo de mutante nulo sintético pode ser tambémcriado através da técnica de "cossupressão" (Vaucheret e outros, 1998,Piant J., 16(6):651-659). Células de planta são transformadas com uma có-pia do gene endógeno direcionado para repressão. Em muitos casos, istoresulta na repressão completa do gene nativo bem como do transgene. Emuma modalidade, um gene de codificação de deidrina ou proteína LEA daespécie de planta de interesse é isolado e usado para transformar célulasdaquela mesma espécie.

Plantas mutantes ou transgênicas produzidas através de qual-quer um dos métodos acima são também caracterizadas de acordo com apresente invenção. De preferência, as plantas são férteis, deste modo sendoúteis para propósitos de geração. Deste modo, mutantes ou plantas que exi-bem um ou mais dos fenótipos acima mencionados podem ser usados parageração de planta, ou diretamente em aplicações agriculturais ou horticultu-rais. Eles também serão de utilidade como ferramentas de pesquisa para aelucidação adicional da participação de deidrinas e proteínas LEA em sabor,aroma e outras características de semente de café associadas com teor eorganização de água. Plantas contendo um transgene ou uma mutação es-pecificada podem ser também cruzadas com plantas contendo um transgeneou fenótipo complementar a fim de produzir plantas com fenótipos realçadosou combinados. A presente invenção refere-se também a composições emétodos para produção, de uma maneira preferida de semente ou específicade semente, de qualquer produto de gene heterólogo selecionado em umaplanta. Uma seqüência de codificação de interesse é posta sob controle deum promotor de deidrina ou proteína LEA de café específico de semente ououtro promotor específico de semente e outras seqüências reguladoras a-propriadas, para produzir um gene quimérico específico de semente. O genequimérico é introduzido em uma célula de planta através de qualquer um dosmétodos de transformação descritos aqui ou conhecidos na técnica. Essesgenes quiméricos e métodos podem ser usados para produzir uma varieda-de de produtos de gene de interesse na planta, incluindo, mas não limitadoa: (1) produtos de gene detectáveis tal como GFP ou GUS, conforme enu-merado acima; (2) produtos de gene conferindo um benefício agronômico ouhorticultural, tal como aqueles cujas atividades de enzima resultam em pro-dução de micronutrientes (por exemplo, pró-vitamina A, também conhecidacomo beta-caroteno) ou antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, ácidosgraxos ômega, licopeno, isopreno, terpenos); ou (3) produtos de gene paracontrole de patógenos ou pestes, tal como descrito por Mourgues e outros,(1998), TibTech 16:203-210 ou outros conhecidos ser protetores de semen-tes de planta ou prejudiciais para patógenos.

Além disso, certos promotores de gene de deidrina ou LEA po-dem ser usados para produzir proteínas recombinantes em ambos sementese silíquas. Ainda, dado que certos genes de deidrina são também ativadossob condições de seca e outros estresses, esses promotores devem provarser úteis para direcionar expressão de gene em outros tecidos, tal como fo-lhas maduras, quando eles são osmoticamente estressados. Esta última ca-racterística indica que é possível usar esses promotores para expressar pro-teínas recombinantes especificamente nas folhas de planta (por exemplo,tabaco) no final da maturação como elas sofrem senescência e começam asecar.

Acredita-se que as deidrinas sejam parte da defesa de umaplanta contra desidratação. Deste modo, a indução dos genes CcDHI e Cc-DH2 pode ser usada como uma medida de estresse de desidratação queexiste em uma planta; ambos no momento de indução do estresse de águabem como o nível de estresse de água. Deste modo, expressão de deidrinapode ser usada para avaliar populações de planta quanto a suas capacida-des de resposta a estresse osmótico.

Os exemplos que seguem são providos para descrever a inven-ção em mais detalhe. Os exemplos pretendem ilustrar, não limitar, a invenção.

Exemplo 1

Material de Planta para Extração de RNA

Raízes recém-colhidas, folhas jovens, caules, flores e frutos emdiferentes estágios de desenvolvimento foram colhidos de Coffea arabica L.cv. Caturra T-2308 e Coffea canephora var. PB409 cultivadas sob condiçõesde estufa (25° C, 70 RH) e também de Coffea canephora BP-409 cultivadano campo em East Java, Indonésia. Os estágios de desenvolvimento sãodefinidos como segue: fruto verde pequeno (SG)1 fruto verde grande (LG),fruto amarelo (Y) e fruto vermelho (R). Tecidos frescos foram congeladosimediatamente em nitrogênio líquido, então armazenados a -80° C até seremusados para extração de RNA.

Exemplo 2

Protocolos para Extração de RNA Total, Geração de cDNA e Condições deReação de PCR

As amostras de tecido armazenadas a -80° C foram moídas emum pó e RNA total foi extraído deste pó usando o método anteriormentedescrito (Rogers e outros, 1999). Amostras foram tratadas com DNase u-sando o kit "Qiagen RNase-Free DNase" de acordo com as instruções dofabricante para remover contaminação de DNA. Todas as amostras de RNAforam analisadas através de eletroforese em gel de formaldeído agarose einspeção visual das faixas de RNA ribossomal quando do tingimento combrometo de etídio. Usando oligo (dT20) como um iniciador, cDNA foi prepa-rado a partir de aproximadamente 4 pg de RNA total de acordo com o proto-colo no kit Superscript Il Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA).Para testar a presença de DNA genômico contaminante nas preparações decDNA, um par de iniciador foi feito abrangendo um íntron conhecido de umcDNA ubiquitariamente expresso específico, chalcona isomerase. A ausên-cia do fragmento genômico nas reações de PCR indicou a ausência de con-taminação por DNA genômico detectável. As reações de PCR foram realiza-das usando um cDNA de Cofrea arabica e Coffea canephora preparado con-forme acima descrito. Os iniciadores específicos de gene são mostrados naTabela 1.

Tabela 1. Lista de iniciadores usados para RT-PCR e RT-PCR quantitativo

<table>table see original document page 45</column></row><table>Reações de PCR (50 μL) foram estabelecidas contendo 10 μΐ_de uma diluição de cem vezes dos cDNAs, exceto por CcDH2 onde 10 ul deuma diluição de mil vezes do grupo de cDNA foram usados, cada iniciadora1 μΜ, 5 μΜ de 10X ThermoPoI Buffer (New England Biolabs Beverly1 MA), 1μL de DMSO1 dNTPs a 200 μΜ e 2 unidades de Taq polimerase (New En-gland Biolabs1 Beverly1 MA). As condições de ciclização foram 2 minutos a94°C, 35 ciclos (exceto para CcDHI onde 40 ciclos foram usados) de 94°Cpor 1 minuto, 60°C por 1 minuto e 72°C por 1,5 minuto. A etapa de extensãofinal era por 7 minutos e 72°C. Os produtos de RT-PCR foram dissolvidosem 2% (p/v) de géis de agarose e tingidos com brometo de etídio. O geneCcRL39, que codifica a proteína L39 de café constitutivamente expressa (u-ma proteína de subunidade grande ribossomal 60S), foi usado como umcontrole semiquantitativo para verificar que cada amostra de RNA foi trans-crita em cDNA em eficiências relativamente similares. Amplificação do geneRPL39 foi usada como um controle positivo para a transcrição reversa comos iniciadores mostrados na Tabela 1.

PCR-TaqMan quantitativa de CcDH2 e CcRPLI 39 foi realizadade acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems1 Perkin-Elmer)usando cDNA de Coffea arabica e Coffea canephora e as sondas TaqManmostradas na Tabela 1. Reações de 25 μΙ contendo 12,5 μΙ_ de TaqMan®Universal Master Mix 2X, sonda TaqMan®-MGB a 20 nM, iniciadores especí-ficos TaqMan® a 80 nM e 5 μΙ_ dos cDNAs diluídos 1000 vezes. As condi-ções de ciclização eram 50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos, então 40ciclos de 94°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto. Cada reação foi repe-tida 3 vezes. A expressão do gene DH2 em cada amostra de cDNA foi nor-malizada para a expressão do gene RPL39 na mesma amostra.

Exemplo 3

Protocolo para Isolamento de Região Promotora de DH2

A seqüência promotora de CcDH2 foi isolada usando o kit Ge-nome Walker de acordo com as especificações do fabricante (BD Sciences-Clontech). DNA genômico foi isolado de Coffea canephora var. BP409 con-forme descrito (Crouzillat e outros, 1996). O iniciador de Genome Wlakeradiantado específico de CcDH2 usado foi: iniciadorl de DH2a - 5'TGTGCTCCTGATGCTCTCTGTCCTTGTGC 3' (SEQ ID NO.:39). Um frag-mento de aproximadamente 2,1 kb foi isolado usando DNA genômico deCoffea canephora var. BP409 digerido com Hindlll ligado à seqüência adap-tadora de Genome Walker. Amplificação por PCR foi realizada em uma rea-ção de 50 ul usando o kit Clontech Advantage 2 PCR de acordo com o pro-tocolo do fabricante usando concentrações finais de 0,5 uM de iniciadorl deDH2a e o iniciador AP1 de Genome Walker. A reação de PCR foi realizadacom as condições que seguem: 94°C por 2 segundos e 72°C por 3 minutos(7 ciclos), 94°C por 2 segundos e 67°C por 3 minutos (32 ciclos), seguidopor 4 minutos a 67°C. O fragmento de PCR principal obtido foi então clonadono plasmídeo pCR4-TOPO (Invitrogen).

Um plasmídeo pJMcl contendo o inserto apropriado foi purifica-do e seu inserto foi completamente sequenciado. Para verificar que o insertoem pJMcl e (pcccs30w8a4) eram do mesmo gene, a seqüência de sobrepo-sição correspondente desses dois clones foi reamplificada a partir de DNAgenômico usando os iniciadores DH2a geneup 5' ATAGTGACCTTAA-TAGCGATCTTGTTGC 3' (SEQ ID N0.:40) e DH2a genelow 5' CCAAATCA-AATCAAACCAAGCAAATC 3' (SEQ ID NO.:41). A reação de PCR foi reali-zada com DNA genômico de Coffea canephora var. BP409 e usando Taq(New Englang Biolabs) e iniciadores específicos a 1 uM (DH2a geneup eDH2a genelow). A reação de PCR foi realizada com as condições que se-guem: 94°C 1 minuto, então 35 ciclos de 94°C 1 minuto, 58°C 1,5 minuto e72°C 3 minutos, seguido por 7 minutos a 72°C. O fragmento de PCR princi-pai produzido foi então clonado em pCR4-TOPO. Um plasmídeo pVC1 (figu-ra 7) contendo o inserto apropriado foi purificado e seu inserto foi completa-mente sequenciado. Havia 5 mudanças de base entre fragmentos genômi-cos de pJMcl e pVC1. Uma mudança estava na região promotora, duasmudanças estavam no íntron e duas mudanças estavam na seqüência decodificação de proteína. Dessas mudanças na seqüência de codificação deproteína, uma mudança era neutra, a outra resultou em um aminoácido diferente.Exemplo 4

Protocolo de Southern Blot

DNA genômico foi preparado conforme anteriormente descrito(Crouzillat e outros, 1996). Cinco microgramas de DNA genômico de DNA deC. canephora BP 409 foram digeridos da noite para o dia com enzimas a-propriadas (10 U^g) de acordo com as recomendações do fabricante e osprodutos foram separados em géis de agarose a 0,8%. Southern blot e hibri-dizações foram realizadas conforme anteriormente descrito (Crouzillat e ou-tros, 1996). A sonda foi gerada primeiro através de amplificação de PCR doinserto do clone de CcDH2 cccs30w8a4 com os iniciadores T3 + T7. Esteproduto de PCR foi então marcado com [32P]dCTP usando o kit "rediprime®Il random prime Iabeling system" (Amersham).

Exemplo 5

Identificação e Caracterização de cDNA de Deidrina de Café

Mais de 47.000 seqüências de EST foram geradas de várias bi-bliotecas de café feitas com RNA isolado de folhas jovens e do grão e teci-dos do pericarpo de cerejas colhidas em estágios diferentes de desenvolvi-mento. ESTs de sobreposição foram subseqüentemente "agrupadas" em"ünigenes" (isto é, contíguas) e as seqüências de unigene foram anotadasfazendo uma pesquisa BLAST de cada seqüência individual contra o bancode dados de proteína não-reduntante NCBI. Os ünigenes foram avaliadosquanto a seqüências de deidrina usando várias abordagens, incluindo umapesquisa das anotações de unigene com a palavra-chave "deidrina" e usan-do várias seqüências de proteína deidrina de Arabidopis e tomate em umapesquisa tBlastn de conjunto de unigene de café. Os vários protocolos depesquisa deram vários ünigenes de deidrina candidatos, e o clone de cDNApotencialmente mais longo para cada um desses ünigenes foi isolado dabiblioteca e completamente sequenciado (Tabela 2).

Tabela 2. cDNA de Coffea canephora de comprimento completo codificandodeidrina e proteínas LEA e o número de ESTs encontrado para cada se-qüência. Números de unigene e os pesos moleculares são dados em parên-teses para cada plasmídeo: cccl26i7 (Unigene 121870; 17,8 kDa);cccs30w27m8 (Unigene 121870; 18,1 kDa); cccs30w8a4 (Unigene 123406;cccs46w30p1 (Unigene 123405; 17,4 kDa); cccwc22w11a5 (Unigene

123385; 25,1 kDa); Dav1-59 (Unigene 119994; 39,5 kDa).

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Análise de seqüência de DNA dos clones de cDNA de compri-mento completo selecionados revelou quatro seqüências únicas represen-tando três genes de deidrina diferentes. Os genes correspondentes foramchamados CcDHI, CcDH2 e CcDH3. Duas seqüências aparentemente aléli-cas do gene CcDHI foram identificadas através de sequenciamento dos doiscDNA mais longos em unigene N0 121870. Os clones de cDNA CcDHIa eCcDHIb eram de 836 e 896 pb de comprimento respectivamente. As duasseqüências ORF exibiram 5 mudanças de base únicas e CcDHIb tinha umainserção de 9 bases. As diferenças traduziram em seis diferenças de amino-ácido. CcDHIa e CcDHIb codificam proteínas de 172 aminoácidos e 175aminoácidos que têm pesos moleculares previstos de aproximadamente17,8 kDa e 18,1 kDa, respectivamente. Dois unigenes distintos, N0 123406 eN0 123405, foram verificados codificar ORF e CcDH2. O unigene N0 123405(CcDH2b) é composto de 2 ESTs e difere da seqüência de unigene N0123406 (CcDH2a) pela presença de uma seqüência de íntron. Quando asbordas do íntron/éxon do cDNA para DH2b (cccs46w30p1) foram examina-das em mais detalhes, foi observado que a junção 3' tinha a seqüênciattatgg/TCG enquanto outras seqüências genômicas obtidas pelo genomewalking (vide abaixo) tinham a seqüência ttatag/T(A)CGG. No geral, as se-qüências de íntron do cDNA cccs46w30p1 e as seqüências de íntron noDNA genômico eram quase idênticas. Devido ao fato de nenhuma das mu-danças de base únicas terem aparecido em todas as três seqüências de ín-tron genômicas disponíveis, parece que uma alteração na seqüência de sítiode união 3' de CcDH2b pode ser a causa da união aberrante deste cDNA. OcDNA de 756 pb pcccs30w8a4 (CcDH2a) codifica uma proteína de 162 ami-noácidos de comprimento com o peso molecular previsto de 17,4 kDa. Umunigene foi encontrado para CcDH3 (N0 123385). A seqüência de proteínacodificada por CcDH2 demonstra que este cDNA de 833 pb codifica umaproteína de 227 aminoácidos com o peso molecular aproximado previsto de25,1 kDa.

As seqüências de proteína das deidrinas de café foram alinha-das com as seqüências de proteína mais homólogas encontradas no bancode dados de proteína não-redundante e também analisadas quanto à pre-sença dos motivos de aminoácido específicos de deidrina Y1 S e K. As figu-ras 1 e 2 mostram que as três deidrinas se encaixam em três classes, comCcDHIa, CcDHIb e CcDH2a tendo a estrutura Y3SK2 e CcDH3 tendo a es-trutura SK3. Dessas seqüências de proteína com a estrutura Y3SK2, CcDHIae CcDHIb mostram conservação absoluta em cada um dos três motivos,bem como nas duas regiões conservadas que precedem cada um dos doismotivos Κ. Esta observação, e o fato de que as diferenças de seqüência pe-quenas que existem acontecem nas regiões menos conservadas das se-qüências alinhadas, está de acordo com a idéia de que CcDHIa e CcDHIbsão alélicos. Em contraste, CcDH2a é claramente diferente de CcDHI. En-quanto CcDH2a tem a estrutura Y3SK2, ele também exibe diferenças pontu-ais em todos exceto um dos motivos Y1 S e K, bem como diferenças maissignificantes fora desses motivos específicos de deidrina. Os CcDHI e Cc-DH2 codificam proteínas com pl calculado que são quase neutras, e seusgráficos de hidrofilicidade indicam que essas proteínas são muito hidrofílicasinteiramente. O pl calculado da proteína codificada por CcDH3 é levementeácido (5,47) e esta proteína é também muito hidrofílica, conforme mostradopelo gráfico de hidrofilicidade Kyte-Doolittle na figura 8.

Exemplo 6

Caracterização de um cDNA Codificando uma Proteína LEA de Café

Uma biblioteca de cDNA foi construída a partir de RNA prepara-do de grão de café 30 semanas após fertilização. Desta biblioteca, um clonede cDNA de comprimento completo (Dav1-59) codificando uma proteína LEAfoi isolado e sequenciado. Este clone de cDNA foi renomeado CcLEAI. Ain-da, o banco de dados EST foi pesquisado quanto a "unigenes" anotadoscomo proteínas LEA. Esta pesquisa produziu 9 seqüências de unigene, umadas quais (unigene N0 119994) correspondia à seqüência anteriormente iso-lada de CcLEAI (Tabela 3). A análise de EST indicou que CcLEAI é forte-mente e exclusivamente expresso durante apenas um período de desenvol-vimento de grão (30 semanas após florescimento).

Tabela 3. Seqüências de unigene de Coffea canephora anotadas como pro-teínas LEA<table>table see original document page 52</column></row><table>

A proteína codificada por CcLEAI é de 358 aminoácidos e temum peso molecular previsto de 39,5 kDa. O pl calculado para CcLEAI é le-vemente básico (8,17) e um gráfico de hidrofilicidade mostra que emboraesta proteína não tenha regiões significantes de hidrofobicidade, ela é me-nos hidrofílica do que as três deidrinas de café. Os 30 primeiros resíduos N-terminais de CcLEAI formam uma de duas regiões hidrofóbicas pequenasnesta proteína. A figura 3 mostra o alinhamento de CcLEAI com as 3 se-qüências mais homólogas encontradas no Genbank não-reduntantes dobanco de dados de proteína. Os valores de identidade geral dessas seqüên-cias alinhadas apenas variaram de 34,7% para a seqüência de Arabidopsis a47,9% para a seqüência de Picea (abeto branco). No entanto, três são regi-ões altamente conservadas, curtas, nessas proteínas. Todas das seqüênciasde proteína relacionadas tinham perfis de hidrofilicidade relativamente simila-res a CcLEAI, e, geralmente, o patch hidrofóbico mais significante das pro-teínas poderia ser encontrado nos 1-25 aminoácidos N-terminais. CcLEAIfoi também verificado conter um segmento rico em prolina na região N-terminal, que está ausente das outras proteínas na figura 3.

Exemplo 7

Expressão de RT-PCR de Genes CcDHI, CcDH2, CcDH3 e CcLEA-Iem

Tecidos de Café Diferentes e Durante Desenvolvimento de Grão de Café

Devido ao fato das bibliotecas de EST não estarem normaliza-das, e terem sido muito amostradas, o número de ESTs encontrado em cadaunigene dá uma estimativa aproximada do nível de expressão daquele geneem cada tecido amostrado. A Tabela 2 (acima) mostra que CcDHI e CcHD2são fortemente expressos no grão em 30 e 46 semanas após fertilização,mas não foram detectados na biblioteca de pericarpo, nem foram detectadosem cerejas inteiras (grão em desenvolvimento + pericarpo) em 22 semanasapós fertilização. Ambos CcDHI e CcDH2 são expressos na folha, embora ocCDH1 possa ser expresso em folha jovem em um nível maior do que Cc-DH2. Expressão de CcDH3 foi detectada no grão em 46 semanas após ferti-lização e na folha jovem, embora 2 ESTs fossem também observadas nasamostras de cereja inteiras de 22 semanas.

Para ampliar os dados de expressão, análise de RT-PCR foi rea-lizada para cada um dos três genes de deidrina de café. Os resultados destaanálise são mostrados na figura 4. CcDHI foi expresso significantemente emgrão de arabica em todos os estágios examinados, e nos três últimos está-gios examinados para robusta. Expressão de CcDHI poderia ser tambémdetectada em outros tecidos testados, embora nenhum sinal tenha sido de-tectado para arabica nas amostras de pericarpo verde pequeno e pericarpoamarelo, ou para robusta nas amostras de raiz ou folha. Dentre os tecidostendo expressão de CcDHI, a amostra de flor de arabica parecia ter o nívelmais alto de transcritos.

Um nível relativamente alto de transcritos de CeDH2 foi detecta-do em todos os estágios de desenvolvimento de grão de arabica e nos últi-mos três estágios de grão de robusta (figura 4). Em contraste com CcDHI,quaisquer transcritos de CcDH2 foram detectados através de RT-PCR nosoutros tecidos estudados. A ausência de níveis significantes de transcritosde CcDH2 em tecidos outros que não o grão, bem como a última induçãodeste gene em robusta, foi confirmada através de RT-PCR quantitativaTaqMan (figura 5). A expressão de CcDH2 foi comparada com o transcritoconstitutivamente expresso do gene CcRPL39 (RPL39 codifica proteína desubunidade ribossômica grande N0 39). A comparação demonstrou que aexpressão de CcDH2 aumentou gradualmente em robusta, começando doestágio verde grande até o estágio vermelho maduro. Em contraste, os da-dos de RT-PCR quantitativos para arabica mostraram que o nível mais altode transcritos de CcDH2 foram detectados no estágio verde grande e que osníveis de transcrito caíram um pouco conforme a maturação progredia.

Análise de RT-PCR da expressão do gene CcDH3 demonstrouque níveis significantes desses transcritos foram também detectados emtodas as amostras de grão de arábica, bem como nos três últimos estágiosde desenvolvimento do grão de robusta (figura 4). Os níveis de transcritos deCcDH3 em alguns dos outros tecidos, tal como pericarpo vermelho, caule eflores, eram quase tão altos quanto no grão. Exame dos dados original mos-trou que transcritos de CcDH3 podiam ser detectados em todos os outrostecidos de arabica e robusta examinados. No entanto, uma diferença signifi-cante é notada entre os níveis de transcrito para os três primeiros estágiosde pericarpo de robusta e arabica.

A expressão de CcLEAI foi também avaliada através de RT-PCR. Os dados obtidos confirmam que este gene tem um padrão de expres-são muito único, com transcritos sendo detectados apenas no estágio verdepequeno de arabica e no estágio verde grande de grão de robusta (figura 4).Nenhuma expressão foi detectada em nenhum dos outros tecidos de arabicaou robusta examinados. Este dado está de acordo com o padrão de distribu-ição de ESTs para este gene visto na Tabela 3, que indica que este gene éexpresso em grão de robusta em 30 WAF mas não em nenhuma outra bi-blioteca de EST de grão, cereja, pericarpo ou folha.

Exemplo 8

Análise de Seqüência do Promotor de CcDH2CcDH2 é um gene específico de grão, moderadamente expres-so. Southern blotting foi realizado para determinar se o nível de expressãofoi obtido de um gene com um número cópia único/baixo ou um gene multi-cópia. Conforme mostrado na figura 6, cada digestão produziu apenas umafaixa, sugerindo que CcDH2 é provável de ser codificado por um gene únicono genoma de C. canophora.

A técnica de primer walking foi usada para isolar um fragmentogenômico incorporando o promotor de CcDH2. Amplificação de PCR do DNAfoi realizada usando um iniciador de Genome Walker específico de CcDH2feito do centro do cDNA cccs30w8a4 (iniciador 1 de DH2a) e o iniciador AP1do kit de Genome Walking. Um fragmento genômico de 2,1 kb que se esten-dia 1,43 kb a montante da seqüência de cDNA de cccs30w8a4 (C. canopho-ra) foi gerado e clonado. Análise de seqüência da seqüência compósita obti-da a partir dos plasmídeos de sobreposição contendo ambas seqüênciasgenômica e de DNA mostrou que o gene CcDH2 contém um íntron único(231 pb) localizado dentro da região ORF (figura 7). Análise adicional da re-gião promotora deste gene indica a presença de uma seqüência TATA puta-tiva de 30 pb a montante da extremidade 5' da seqüência de cDNA.

Vários elementos reguladores potenciais anteriormente mostra-dos estarem envolvidos na regulagem de expressão de gene durante desen-volvimento de semente foram também identificados na região a montante 5'do gene CcDH2. Por exemplo, três regiões com similaridade com o elementoresponsivo a ABA de Arabidopsis RYACGTGGYR (SEQ ID NO:42) foramencontradas. Dois elementos foram verificados que compartilhavam similari-dade significante com a repetição RY (CATGCA(T/a)(A/g) da região de nú-cleo na "leguminina" box que está envolvida na regulagem da expressão deproteínas de armazenamento do tipo leguminina. A presença de dois moti-vos de seqüência de ação eis (G/ACCGAC) de elemento responsivo à desi-dratação/Repetição C (DRE/CRT) foi também identificada. Os motivosDRE/CRT foram mostrados anteriormente interagir com fatores de transcri-ção DREBs/CBF para controlar a resposta de genes ligados à desidrataçãoe outros estresses em Arabidopsis e arroz. (Dubouzet, J.G., Plant J., 33:751-763 (2003)). Ainda, vários motivos E-box (CANNTG), que são componentesbem definidos nos promotores de proteína de armazenamento tal como pro-teína 2S (Chatthai, M., Plant Physiol Biochem., 42:417-423 (2004)), foramidentificados na região promotora de CcDH2.

Exemplo 9

Análise Funcional do promotor de CcDH2 de deidrina de café em Arabidop-sis thaliana

Expressão em Arabidopsis thaliana de um gene repórter codifi-cando beta-glucuronidase (GUS), sob controle do promotor de CcDH2, foiexaminada.

Materiais e Métodos:

A seqüência promotora de DH2 de deidrina de pVC1 foi amplifi-cada usando a polimerase Pful sob as condições descritas pelo fornecedor(Stratagene) e os iniciadores:

TG - TG698 ttgaagcttGTGGACATGACGGAAGAGGT (SEQ ID NO,:43) e

TG - TG743 gcagatctaccatggAGGACTCCTGTTATTAGAAAA (SEQ IDNO,:44).

O fragmento de PCR então obtido foi então cortado com Hindllle Bglll e clonado nos sítios HindlIl/Bglll do vetor de transformação de plantapCAMBIA1301. Isto põe o fragmento de aproximadamente 1,3 kb contendo aseqüência promotora de deidrina e a região não-traduzida completa 5' docDNA de deidrina (aproximadamente 80 pb) dentro de 2 pb do ATG paraGUS (primeiro éxon de GUS). O posicionamento correto do promotor foi veri-ficado através de sequenciamento. O novo vetor contendo promotor de Cc-DH2 de deidrina foi chamado pCAMBIA1301UCD2.4.

Transformação de planta. O vetor de transformação pCAMBI-A1301UCD2.4 foi então transformado na linhagem Agrobacterium tumefaci-ens EHA105 usando procedimentos padrão. O gene de resistência à higro-micina, dirigido pelo promotor 2 χ 35S, era o marcador selecionável de plan-ta em pCAMBIA1301. Transformação mediada por Agrobacterium tumefaci-ens de Arabidopsis (com o plasmídeo pCAMBIA1301UCD2.4) foi realizadaatravés do método floral-dip (Clough e Bent, 1998).Plantas transformadas foram identificadas pondo em placa se-mente em 0,8% de ágar contendo nitrato de sódio a 1 mM e 50 pg por ml dehigromicina. Mudas transformadas foram identificadas 7 dias após serempostas em placa como plantas com uma raiz primária estendida. As mudasforam transferidas para ágar a 0,8% contendo sais 0,5X M&S. As plantasforam em seguida transferidas para o solo quando o segundo par de folhasse desenvolveu, e deixadas amadurecer para agrupar semente (T1). Emalguns casos, as sementes T1 foram germinadas, e então deixadas crescere agrupadas sementes (T2).

Tingimento de GUS. As mudas e silíquias examinadas quanto aotingimento de GUS eram ou de sementes T1 ou T2, e estavam em estágiosdiferentes de desenvolvimento. A solução de tingimento de GUS foi prepara-da dissolvendo 5 mg de X-Gluc em 50 μΙ de dimetilformamida, e então adi-cionando isto a 10 ml de NaPO4 a 50 mM pH 7,0. Com um fórceps fino, asmudas foram transferidas das placas de germinação para um tubo de micro-fuge de 1,5 ml contendo 1,0 ml de corante GUS. Os tubos foram transferidospara um dissecador e postos sob vácuo por 10 minutos e incubados a 37°C(no escuro) por 24 a 48 horas. O tingimento foi removido e substituído com asolução de retirada de tingimento (EtOH a 70%). A limpeza foi aceleradapondo os tubos a 37°C. Dependendo da quantidade de pigmento no tecido,várias mudanças de EtOH a 70% foram requeridas. As mudas e outros teci-dos tingidos foram vistos sob um microscópio de dissecação e as imagensforam digitalmente registradas. No caso de silíquas, as silíquoas foram re-movidas de plantas e abertas com o escalpe para permitir penetração decorante. O corante GUS no procedimento foi modificado para incluir 0,5% deTriton X100. Seguindo o tingimento, as silíquas tiveram o corante retiradoatravés de incubação em EtOH:Acido Acético (2:1) e então incubação emmeio de Luz de Hoyer (100 g de hidrato Cloral em 60 ml de água). Silíquascom sementes mais jovens foram pré-incubadas na solução de Etanol:ÁcidoAcético por 4 horas, e com sementes mais velhas por 8 horas. Silíquas fo-ram limpas em meio de Luz de Hoyer por 24 horas a vários dias.

Resultados:Expressão de GUS em Arabidopsis thaliana transformada compCam1301UCD2-4 foi observada. Expressão de GUS foi verificada ser a-bundante em cotilédons e em hipocótilos de mudas de 1 semana de vida.Nas mudas de duas semanas de vida, tingimento com GUS era ainda abun-dante nos dois primeiros cotilédons, e em um nível menor nas duas primei-ras folhas verdadeiras. Atividade de GUS não foi significantemente detecta-da na raiz ou no segundo par de folhas em desenvolvimento. Nenhuma ex-pressão foi detectada em folhas maduras. Expressão de GUS foi tambémdetectada na parede da silíqua e em sementes em desenvolvimento. Umtingimento de GUS de 48 horas de sementes de uma linhagem T1 resultouem algumas sementes sendo positivas para atividade de GUS e outras sen-do negativas.

Em suma, os dados apresentados neste exemplo confirmam queo promotor de CcDH2 de deidrina de café dirige a expressão do gene ligado(neste caso GUS) fortemente em sementes, silíquas e nos primeiros cotilé-dons e hipocótilos das sementes em germinação. Este resultado demonstraque a seqüência promotora de CcDH2 descrita aqui contém todos os ele-mentos funcionais requeridos para dirigir expressão de gene específico emplantas. Os dados obtidos também indicam que o promotor de CcDH2 podeser usado para dirigir a expressão de genes em tecidos imaturos tal comoembrião derivado dos dois primeiros cotilédons de mudas. Ainda, os dadosindicam que o promotor de CcDH2 é ativado em outros tecidos destinados asofrer dissecação, tal como as silíquas. Finalmente, dada a distância evolu-cionária relativamente grande entre Arabidopsis e Coffe, os dados apresen-tados aqui mostrando que o promotor de CcDH2 de café funciona em Arabi-dopsis, implica que este promotor deve ser ativo em uma variedade relati-vamente ampla de plantas.

Exemplo 10

Expressão Induzida por Estresse Osmótico de Genes Codificando Deidrinasde Café CcDHI e CcDH2

Genes de deidrina são sabidos serem induzidos sob formas dife-rentes de estresse osmótico. Deste modo, uma avaliação foi realizada paradeterminar se os genes CcDHI e CcDH2 de café eram induzidos por estres-ses osmóticos diferentes.

Materiais e Métodos:

Experimentos de desidratação foram realizados usando árvoresde café catimor Coffea arabica, clonalmente propagadas pequenas, cultiva-das em uma estufa. As árvores eram de aproximadamente 3 anos de idadee foram cultivadas em solo. Várias semanas antes dos experimentos, as ár-vores foram cultivadas juntas na estufa com uma temperatura de aproxima-damente 25°C, com umidade relativa de aproximadamente 70%, e foramregadas diariamente usando irrigação automática. No início do experimento,três árvores agiram como controles e foram regadas diariamente. As outrastrês árvores não foram regadas e então sofreram uma desidratação progres-siva. Amostragem de duas folhas jovens (5-8 cm de tamanho e tomadas docrescimento emergente no alto da planta) foi realizada toda semana paracada árvore e as amostras foram congeladas diretamente em nitrogênio lí-quido.

Extração de RNA e síntese de cDNA. A extração de amostras detecido submetidas aos vários tratamentos de estresse e dos controles foifeita usando RNEASY® Plant mini kit da Qiagen GmbH (Hilden, Alemanha).As amostras de tecido congeladas foram inicialmente moídas em um pilãousando nitrogênio líquido a fim de se obter um pó. O RNA neste pó congela-do foi então extraído de acordo com o protocolo do RNEASY® Plant mini kit.Resumindo, um máximo de 100 mg de pó congelado foi misturado com otampão de Iise celular e beta-mercaptoetanol. Para tecidos que mostraramnecrose significante, PMSF a 2 μΜ foram também adicionados. A fim de eli-minar níveis baixos de DNA genômico contaminante, um tratamento usandoRNase livre de DNase contido no RNEASY® Plant mini kit foi usado (confor-me descrito pelo fornecedor), que é um tratamento de 15 minutos em tempe-ratura ambiente na coluna. No final, o RNA foi eluído da coluna em 50 μΙ_ deágua livre de RNase. A quantidade de RNA foi determinada através de me-dição espectrofotométrica a 260 nm e a qualidade do RNA foi estimada atra-vés de cálculo da razão de absorbância 260 nm/280 nm. A qualidade dosRNAs foi também verificada através de eletroforese em géis de agarose a1%. As reações de transcrição reversa para essas amostras de RNA foramrealizadas como segue; aproximadamente 1 pg de RNA total e 12,4 pg deoligo-dT [2,3 μΙ de oligo-dT a 70 μΜ (ProIigo)] com água livre de RNase paraum volume final de 13 μΙ_. Esta mistura foi incubada a 65°C por 5 minutos.Então 7 μΙ_ de uma mistura de tampão 5X (tampão de reação TRANSCRIP-TOR® RT), 20U de inibidor de RNase1 1 mM das quatro dNTPs (250 um ca-da) e 10U de transcriptase reversa TRANSCRIPTOR® (Roche, Nutley, NJ)foram adicionados. Esta mistura foi incubada a 55°C por 40 minutos. Porúltimo, 0,5 μΐ_ de RnaseH (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi então adicionadoaos 20 μΙ_ de mistura e a reação foi incubada mais por 30 minutos a 37°C.Os cDNAs gerados foram purificados usando o kit de purificação em gelSNAP® da Invitrogen (Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo provido pelofornecedor.

Criação de iniciadores e de sonda MGB. Os grupos de iniciado-res e sonda-MGB foram criados usando o software PRIMER EXPRESS®(Applied Biosystems, Foster City, CA). As temperaturas de hibridização dosiniciadores eram em torno de 60°C enquanto aquelas da sonda MGB erampróximas a 70°C. O tamanho dos amplicons era aproximadamente 80 pb. Osiniciadores foram sintetizados pela PROLIGO e as sondas MBG foram sinte-tizadas de acordo com as instruções do fornecedor (Applied Biosystems,Foster City, CA). As seqüências dos iniciadores e sondas para CcDH2 e C-crpl39 foram apresentadas acima na Tabela 1. Os iniciadores para CcDHIeram CACTGGCACTACTGGAGCCTATG 3' (SEQ ID NO,:45) e 5'GCTGGGTGGCGTATGCA 3'. A sonda MGB para CcDHI era 5' CTGGAG-CACATGGGA 3' (SEQ ID NO,:46).

RT-PCR Quantitativa de Tempo Real. O cDNA usado para essesexperimentos foi preparado conforme acima descrito. TaqMan-PCR foi reali-zada conforme recomendado pelo fabricante (Applied Biosystems, Perkin-Elmer) e conforme descrito acima. Resumidamente, todas as reações eram25 μL em volume e continham 5 μΙ de cDNA, 1x tampão TaqMan (AppliedBiosystems), MgCI2 a 5 mM, 200 μΜ de cada uma de dATP, dCTP, dGTP edUTP e 0,625 unidade de AmpIiTaq Gold DNA polimerase. O tampão de re-ação da Applied Biosystems contém AmpErase® UNG (Uracil-N-glicosilase)e corante de referência Passivo (ROX TM) e componentes de tampão otimi-zados. As reações de PCR foram realizadas usando 800 nM dos iniciadoresespecíficos de gene, adiantado e reverso, e com 200 nM da sonda TaqMane 5 pL de cDNA de diluição de 100 vezes, que corresponde a aproximada-mente 0,01 pg de RNA total. As reações foram incubadas por 2 minutos a50°C, então 10 minutos a 95°C, seguido por 40 ciclos de amplificação de 15segundos a 95°C/1 minuto a 60°C. As reações foram realizadas e analisa-das usando um GeneAmp 7500 Sequence Detection System (Applied Bi-osystems). Cada amostra foi executada 3 vezes e o valor médio calculado.Quantificação foi realizada usando o método de quantificação relativa, com omRNA constitutivamente expresso para a proteína ribossomal rpl39 agindocomo a referência interna para cada amostra. A fim de usar o método dequantificação relativa, foi necessário mostrar que a eficiência de amplificaçãopara as seqüências de gene de teste diferentes era mais ou menos equiva-lente à eficiência de amplificação da seqüência de referência (seqüência decDNA rp139) usando os conjuntos de iniciador e sonda especificamente de-finidos. Para determinar esta equivalência relativa, DNA de plasmídeo con-tendo as seqüências de cDNA apropriadas foi diluído 1/1000, 1/10.000,1/100.000 e 1/1.000.000 vezes, e usando as condições de Q-PCR descritasacima, a inclinação da curva Ct = f(quantidade Log de DNA) foi calculadapara cada conjunto de plasmídeo/iniciador/sonda TaqMan. Conjuntos deplasmídeo/iniciador/TaqMan dando curvas com inclinações próximas a 3,32,que representa uma eficiência de 100%, foram consideradas aceitáveis. Osconjuntos de plasmídeo/iniciador/sonda TaqMan usados deram todos valores aceitáveis para Ct = f(quantidade Log de DNA).

A ausência de qualquer nível significante de DNA genômico re-sidual nas preparações de cDNA foi verificada através da medição do nívelde sinal de amplificação de PCR quantitativa para um conjunto de inicia-dor/sonda específico genômico para gene GOS versus o sinal para umasonda de cDNA de gene GOS.Resultados:

A figura 9 mostra a indução de expressão de gene CcDHI nasfolhas de árvores cultivadas em estufa pequenas quando o fornecimento deágua é parado (condições de seca). Após duas semanas, expressão de DH1é significantemente induzida em uma das plantas estressadas com água(planta N0. 4). Após três semanas, expressão de CcDHI foi induzida em to-das as três das plantas estressadas com água (plantas N0. 4-6). A indução émuito significante, atingindo um RQ de mais de 50 para planta N0. 4. Consi-derando que o gene de controle rp139 é relativamente altamente expresso,um RQ de 50 representa um nível muito alto de indução de expressão degene, e sugere fortemente que CcDHI desempenha um papel importante naresposta à seca de folhas de café. A figura 10 mostra a indução de expres-são de gene CcDH2 no mesmo conjunto de amostras. A indução de CcDH2mostra várias diferenças para a resposta de CcDHI. A primeira diferença éque CcDH2 é claramente induzido mais tarde do que CcDHI, com a plantaaparentemente mais estressada (planta N0. 4) mostrando indução na sema-na 3, uma semana mais tarde do que para CcDHI. Por volta da semana 4,CcDH2 foi induzido em todas as três plantas estressadas com água. A se-gunda diferença entre indução de CcDH2 versus CcDHI é que o nível deindução de CcDH2 é significantemente menor do que aquele observado paraCcDHI. No geral, esses resultados indicam que CcDHI e CcDH2 não sãoinduzidos precisamente da mesma maneira, embora os sinais estejam pro-vavelmente se sobrepondo, isto é, o(s) sinal(ais) necessário(s) para induçãode CcDHI são necessários para CcDH2, mas CcDH2 pode precisar de si-nal(ais) adicional(ais) que aparecem apenas conforme o estresse de águaaumenta. Apoiando o argumento de que CcDH2 é induzido por condiçõesque se aproximam de perda de água extrema, a expressão em plantas N0 5e N0 6 continua a aumentar conforme o estresse de água piora com o temposem água. Alternativamente, pode ser que CcDH2 seja expresso mais signi-ficantemente do que indicado na figura 10, mas esta indução está localizadapara tecidos específicos. É importante notar que as três plantas de controleque foram regularmente regadas não mostraram nenhuma indução de Cc-DH1 ou CcDH2 (figuras 9, 10; plantas N0S 1-3).

Os resultados apresentados acima indicam que os promotoresassociados com CcDHI e CcDH2 podem ser úteis para indução e direcio-namento de expressão de gene em tecidos osmoticamente estressados. Porexemplo, esses promotores podem ser usados para direcionar a expressãode genes que são capazes de dar alguma proteção de estresse osmótico noperíodo preciso quando este estresse acontece, mas não na maioria dostecidos sob condições normais. É também aparente a partir do trabalho aci-ma que, se o objetivo for induzir um gene em estresse de água baixo, opromotor para CcDHI seria otimamente usado, enquanto que para induçãode gene em estresse de água maior, o uso do CcDH2 seria mais ideal quan-do o objetivo é induzir um gene recombinante apenas sob condições de es-tresse de água relativamente alto.

Para examinar mais o efeito de condições de estresse osmóticodiferentes foi examinado o efeito de temperatura fria e níveis elevados deNaCI sobre expressão de CcDHI e CcDH2. Foi também testado o efeito deum hormônio associado com sinalização de estresse osmótico (ácido abscí-sico - ABA). Para esses experimentos, foram usados microcortes de cafécrescendo em meios sólidos in vitro (meios sólidos £30,3 em placas de Petri).Para o experimento com frio e ABA foram gerados microcortes para varieda-de robusta ThB4 em placas BO,3 (fotoperíodo de 16 horas). Quando essesmicrocortes eram suficientemente grandes, eles foram transferidos para no-vos meios/placas e incubados por mais 7 dias a 24°C (fotoperíodo de 16 ho-ras). Em T=0, um conjunto de placas foi transferido para 5°C por 7 dias (fo-toperíodo de 16 horas). Um outro conjunto de microcortes foi posto em meiocom ABA (meio B0,3+ ABA a 100 uM) por 7 dias a 24°C (fotoperíodo de 16horas). As amostras tomadas em T=O e T=7 dias (5°C e ABA) foram conge-ladas a -80°C e então RNA foi extraído para análise de QRT-PCR conformeacima descrito. Os resultados de expressão obtidos para a amostra T=O domaterial de partida indicam que CcDHI tinha um RQ = 1,17. Outros experi-mentos mostraram que os níveis basais de CcDHI podem variar de RQ 0,05a aproximadamente RQ 1 em microcortes. Tal espalhamento relativamenteamplo sugere que o nível maior representa a detecção de um estresse os-mótico leve no material de partida para esses experimentos (possivelmenterelacionado com quão bem o material fixou o meio sólido e/ou como quãobem as placas são vedadas que afeta a umidade relativa e a idade precisado material de partida). Não obstante, as amostras mantidas a 5°C por 7 di-as não mostraram nenhuma indução de CcDHI, e, de fato, os níveis de Cc-DH1 realmente caíram para um RQ = 0,16, um nível mais próximo para nívelde expressão mais freqüentemente visto em microcortes não-estressados).

Em contraste com os dados apresentados acima para CcDHI,nenhuma expressão de CcDH2 foi detectada em T=O. No entanto, após 7dias a 5°C, RQ=O,022 foi detectado para CcDH2. Esta última observaçãosugere que CcDH2 é induzido muito levemente pelas condições de frio. Énotado que 5°C é uma temperatura muito baixa para café, e então é possívelque se a temperatura do estresse de frio fosse ligeiramente maior (8-15°C),a indução de CcDH2 poderia ser mais significante. Finalmente, os microcor-tes tratados com 100 um de ABA por 7 dias mostraram um aumento signifi-cante em expressão de CcDHI (RQ, 6,99). Este último resultado demonstraque ABA está envolvido na sinalização para indução de CcDHI. Em contras-te, ABA não produziu nenhuma expressão detectável de CcDH2 indicandoque este hormônio sozinho não é suficiente para induzir CcDH2 a nenhumgrau detectável.

Para testar o efeito de sal, foram adicionados 250 ml de NaCI aum meio sólido B0,3. Em T=0, um conjunto de microcortes de RobustaFRT35 foi posto em meio B0,3 ou meio B0,3 com 250 ml de NaCI e posto a24°C (fotoperíodo de 16 horas). Em T = Oe nos dias 4 e 7 amostras foramtomadas e congeladas a -80°C para análise QRT-PCR posterior conformedescrito acima. Os resultados obtidos mostram que, nos controles, os níveisde CcDHI foram bastante baixos no início e permaneceram baixos durantetodo o experimento (Controle -- T=0, RW=0,2; T=4 dias, RQ=O,07; T=7 dias,RQ=0,38). No tratamento de teste, o nível de CcDHI aumentou significan-temente nos dias 4 e 7 do tratamento (NaCI a 250 mM - T=4 dias, RQ =3,31; T=7 dias, RQ=4,46). Este experimento mostra que aumento da con-centração de sal pode induzir expressão de DH1 para níveis significantes,embora não tão alto quanto visto nas folhas de plantas sob estresse de á-gua. Nenhuma indução significante foi vista para expressão de CcDH2 napresença de NaCI a 250 mM em nenhuma das amostras do dia T=4 ou T=7.

Referências:

Agrawal N, Dasaradhi PVN1 Mohmmed A1 Malhotra P, BhatnagarRK1 Mukherjee SK: RNA interference: Biology, mechanism, and applications.Microbiol. Mol Biol. Rev. 67:657-685 (2003).

AIIaguiova1CR1 GimaIov1FR, Shakirova1FM1 Vakhitov1VA: Theplant dehydrins: Structure and putative functions. Biochemistry-Moscow 68:945-951 (2003).

AIsheikh1MK1 Heyen1BJ1 RandaIIjSK: Ion binding properties ofthe dehydrin ERD14 are dependent upon phosphorylation. J.Biol.Chem. 278:40882-40889 (2003).

Baumlein H.NIVRIDWU: Cis-analysis of a seed protein genepromoter: the conservative RY repeat CATGCATG within the Iegumin box isessential for tissue-specific expression of a Iegumin gene. Plant J. 2: 233-239(1992).

Brummelkamp TR1 Bernards R, Agami R: A system for stableexpression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296:550-553 (2002).

Chatthai M,FBYDSIOLOMMS: 2S storage protein gene of Dou-glas-fir: characterization and activity of promoter in transgenic tobacco seeds.Plant Physiol Biochem 42: 417-423 (2004).

Choi1DW1 CIose1TJ: A newly identified barley gene, Dhn12 enco-ding a YSK2 DHN, is Iocated on chromosome 6H and has embryo-specificexpression. Theoretical and Applied Genetics 100: 1274-1278 (2000).

Close1T: Dehydrins: emergence of a biochemical role of a familyof plant dehydration proteins. Physiol.Plant 97: 795-803 (1996).

Close1TJ: Dehydrins: a commonality in the response of plants todehydration and Iow temperature. Physiol.Plant 100: 291-296 (1997).

Clough1 SJ and Bent AF: Floral dip: a simplified method for A-grobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal16; 735-743(1998).

CrouziIIat1D, Lerceteau1E, Petiard1V, Morera1J1 Rodriguez1H1WaIker1D1 PhiIips1WRR1 SchneII1J1 Osei1J1 Fritz1P: Theobroma cacao L.: agenetic Iinkage map and quantitative trait Ioci analysis. Theor.AppI.Genet. 93:205-214(1996).

Dubouzet JG.SYIYKMDEMSSMSKY-SK: OsDREB genes in rice,Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought-, hi-gh-salt- and cold-responsive gene expression. Plant J. 33: 751-763 (2003).

Dure1L1 Greenway1S1 GaIau1G: Biochemistry 20: 4162-4178(1981).

Dure1L: Structural motifs in LEA proteinsof higher plants. In: Clo-se, T. J., Bray1 E1 and A. (eds), Response of Plants to Cellular DehydrationDuring Environmental Stress1 pp. 91-103. American Soeiety of Plant Physio-Iogists1 Rockville1 MD. (1993).

Elbashir SM1 Harborth J1 Weber K1 Tusehl T: Analysis of genefunction in somatic mammalian cells using small interfering RNAs. Methods26:199-213(2002).

Godoy1JA1 Lunar1R1 Torres-Schumann1S1 Moreno1J1 Rodrigo1M1Pintor-Toro1JA: Expression, tissue distribution and subcellular Iocalization ofdehydrin TAS14 in salt-stressed tomato plants. Plant Mol.Biol. 1921-1934(1994).

Hara1M1 Terashima1S1 Fukaya1T1 Kuboi1T: Enhancement of coldtolerance and inhibition of Iipid peroxidation by citrus dehydrin in transgenictobacco. Planta 217: 290-298 (2003).

Hara1M1 Fujinaga1M1 Kuboi1T: Radical scavenging activity andoxidative modification of citrus dehydrin. Plant Physiology and Biochemistry42: 657-662 (2004).

lida1K1 Seki1M1 Sakurai1T1 Satou1M1 Akiyama1K1 Toyoda1T1 Kona-gaya,A, Sinozaki1K: Genome-wide analysis of alternative pre-mRNA splicingin Arabidopsis thaliana based on full-length cDNA sequences. Nucleic AeidsResearch 32: 5096-5103 (2004).Ingram,J, Bartels,D: The molecular basis of dehydration toleran-ce in plants. Annu.Rev.Plant Physiology Plant Mol Biol 47: 377-403 (1996).

Iwasaki1T1 Yamaguchi-Shinozaki1K1 Shinozaki1K: Identification ofa cis-regulatory region of a gene in Arabidopsis thaliana whose introductionby dehydration is mediated by abscisic acid and requires protein synthesis.Molecular and General Genetics 247: 391-398 (1995).

Klahre U1 Crete P1 Leuenberger AS1 Iglesias VA1 Meins F: Highmolecular weight RNAs and small interfering RNAs induce systemic post-transcriptional gene silencing in plants. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99:11981-11986(2002).

Koag1MC1 Fenton1RD1 WiIkens1S1 CIose1TJ: The binding of maizeDHN1 to Iipid vesicles. Gain of structure and Iipid specificity. Plant Physiology131: 309-316(2003).

Marraccini P., Deshayes A., Pétiard V. and Rogers W.J. 1999.Molecular cloning of the complete 11S seed storage protein gene of Coffeaarabica and promoter analysis in the transgenic tobacco plants. Plant Physi-ol. Biochem. 37:273-282.

Marraccini P1 Courjault C1 Caillet V1 Lausanne F1 LePage B1 Ro-gers W1 Tessereau S1 and Deshayes A. 2003. Rubisco small subunit of Cof-fea arabica: cDNA sequence, gene cloning and promoter analysis in trans-genic tobacco plants. Piant Physiol. Biochem. 41:17-25.

Matsuyama1T1 Yasumura1N1 Funakoshi1M1 Yamada1Y1 Hashimo-to,T: Maize genes specifically expressed in the outermost cells of the rootcap. Plant Cell Physiol. 40: 469-476 (1999).

Mishra RN1 Singla-Pareek SL1 Nair S1 Sopory SK1 Reddy MK:Directional genome walking using PCR. Biotechniques. 33:830-834 (2002).

Moore1R1 McCIeIen1C: Ultrastructural aspects of cellular differen-tiation in the root cap of Zea mays. Can.J.Bot. 61: 1566-1572 (1983).

NyIander1M1 Svensson1J1 PaIva1ET1 WeIin1BV: Stress-inducedaccumulation and tissue-specific Iocalization of dehydrins in Arabidopsis tha-liana. Plant Molecular Biology 45: 263-279 (2001).

Puhakainen1T1 Hess1MW1 MakeIa1P1 Svensson1J1 Heino1P1 Pal-va,ET: Overexpression of multiple dehydrin genes enhances tolerance tofreezing stress in Arabidopsis. Plant Molecular Biology 54: 743-753 (2004).

Rishi AS1 Nelson ND1 Goyal A: Genome walking of Iarge frag-mente: an improved method. J. Biotechnol. 111:9-15 (2004).

Roberts1J1 DeSimone1N1 LingIe1W1 Dure1L: Cellular concentrati-ons and unifomity of cell-type accumulation of two LEA proteins in cottonembryos. Plant Cell 5: 769-780 (1993).

Rogers1 WJ., Bézard, G., Deshayes, A., Meyer, I., Pétiard, V.,Marraccini, P. (1999). Biochemical and molecular characterisation and ex-pression of the 11S-type storage protein from Coffea arabica endosperm.Plant Physiol. Biochem. 37(4): 261-272.

Shirsat A1WNCRBD: Sequences responsible for the tissue speci-fic promoter activity of a pea Iegumin gene in tobacco. Molecular and Gene-ral Genetics 215: 326-331 (1989).

Skriver1K1 Mundy1J: Gene expression in response to abscisic a-cid and osmotic stress. Plant Cell 2: 503-512 (1990).

SouIages1JL1 Kim1K1 Arrese1EL1 WaIters1C1 Cushman1JC: Con-formation of a group 2 late embryogenesis abundant protein from soybean.Evidence of poly (L-proline)-type Il structure. Plant Physiology 131: 963-975(2003).

Spanier1AM1 FIores1M1 ToIdra1F1 Aristoy1MC1 Bett1KL1 Bys-tricky.P, BIand1J: Meat flavor: contribution of proteins and peptides to the fla-vor of beef. Adv.Exp.Med.Biol. 542: 33-49 (2004).

Turner1J1 Linforth1R1 TayIor1A: Real-time monitoring of thermalflavor generation in skim milk powder using atmospheric pressure chemicalionization mass spectrometry. J.Agric.Food Chem 50: 5400-5404 (2002).

Tuschl T1 Borkhardt A: Small interfering RNAs: A revolutionarytool for the analysis of gene function and gene therapy. Mol. Interventions.2:158-167 (2002).

Wise1M1 TunnaeIiffe1A: POPP the question: what do LEA proeinsdo? Trends Plant Sei. 9: 13-17 (2004).

Zhu1B1 Choi1DW1 Fenton1R1 CIose1TJ: Expression of the barleydehydrin multigene family and the development of freezing tolerance. Mole-cular and General Genetics 264: 145-153 (2000).

SEQÜÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS E POLIPEPTÍDEOS REIVINDICADOS

CcDHIa cDNA (vide SEQ ID NO:1) e proteína codificada (vide SEQ IDNO:7)

gtgggaagaa gtcctatcgg tctctgatct ttcacctttc gttaatttgt gttcgatatt 60

ctactcccgc tagtagttga aatttggcaa ttaag atg gcg caa tac ggg gct 113

Met Ala Gln Tyr Gly Ala1 5

gaa tat ggc aac caa aag age cag tac gat gag tac gga aac cca gtt 161

Glu Tyr Gly Asn Gln Lys Ser Gln Tyr Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Val

10 15 20

cgt cag aca gac gaa tat ggt aac cct gcc cgc cat gga ggt acc atg 209

Arg Gln Thr Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Ala Arg His Gly Gly Thr Met

25 30 35

ggt gat tat gga acc act ggc act act gga gcc tat ggt ggc aca act 257

Gly Asp Tyr Gly Thr Thr Gly Thr Thr Gly Ala Tyr Gly Gly Thr Thr

40 45 50

gga gea cat ggg act tat gea act gga acc acc ggc act acc ggt acc 305

Gly Ala His Gly Thr Tyr Ala Thr Gly Thr Thr Gly Thr Thr Gly Thr55 60 65 70

ggt gea tac gcc acc cag cct ggc act gat gtg ggg aag gag cac cat 353

Gly Ala Tyr Ala Thr Gln Pro Gly Thr Asp Val Gly Lys Glu His His

75 80 85

ggc ctt ggt ggc atg ctt cat cgc tet ggc age ggt age tet age tcg 401

Gly Leu Gly Gly Met Leu His Arg Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser

90 95 100

tcc gag gat gat ggg caa ggc ggg agg agg aag aag ggg atg aag gag 449

Ser Glu Asp Asp Gly Gln Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Met Lys Glu

105 110 115

aag ata aag gag aaa ctg cct ggc ggt cac aag gag gct caa cct gga 497Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly His Lys Glu Ala Gln Pro Gly

120 125 130

caa gaa tat tcg agt gct act gca gct cct gga tac ggc ggg gaa gga 545

Gln Glu Tyr Ser Ser Ala Thr Ala Ala Pro Gly Tyr Gly Gly Glu Gly135 140 145 150

gtg cag cac gag aag aaa gga att atg gat aaa ate aag gag aaa tta 593

Val Gln His Glu Lys Lys Gly Ile Met Asp Lys Ile Lys Glu Lys Leu

155 160 165

cca ggg ggt cac cac aac tga agatetaatt ctaataaata ttggtccgat 644

Pro Gly Gly His His Asn170

tatgatattg tgtacccctg ttttcaatct caatctcgtt cgtgtcgcgt ttgtgttttc 704tgagatttga gtgtgtggac gtcttgagtt tctgtaattg gaataaaaga tgattcgtct 764tcgtcttcgt ggactctgta gtgtgtttgt ccgtatattc ggcgtcttgt actcgggtca 824tctggtcatg ta 836

CcDHIb cDNA (vide SEQ ID NO:2) e proteína codificada (vide SEQ IDNO:8)

gtgggaagaa gtcttatcgg tctctgatcc ttcacctttc gttaatctgt gttetatatt 60

ctacttccgc tagtagttga aatttggcaa ttaag atg gcg caa tac ggg gct 113

Met Ala Gln Tyr Gly Ala

1 5

gaa tat ggc aac caa aag age cag tac gat gag tac gga aac cca gtt 161

Glu Tyr Gly Asn Gln Lys Ser Gln Tyr Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Val10 15 20

cgt cag aca gac gaa tat ggt aac cct gcc cgc cat gga ggt acc atg 209

Arg Gln Thr Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Ala Arg His Gly Gly Thr Met

25 30 35

ggt gat tat gga acc act ggc act act gga gcc tat ggt ggc aca act 257

Gly Asp Tyr Gly Thr Thr Gly Thr Thr Gly Ala Tyr Gly Gly Thr Thr40 45 50

ggg aca gct gga gca cat ggg act tat gca act gga acc acc ggc act 305

Gly Thr Ala Gly Ala His Gly Thr Tyr Ala Thr Gly Thr Thr Gly Thr55 60 65 70

acc ggt acc ggt gca tat gcc acc cag cct ggc act gat gtg ggg aag 353

Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Ala Thr Gln Pro Gly Thr Asp Val Gly Lys75 80 85

gag cgc cat ggc ctt ggt ggc atg ctt cat cgc tct ggt age ggt age 401

Glu Arg His Gly Leu Gly Gly Met Leu His Arg Ser Gly Ser Gly Ser

90 95 100

tct age tcg tcc gag gat gat ggg caa ggc ggg agg agg aag aag ggg 449

Ser Ser Ser Ser Glu Asp Asp Gly Gln Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly105 110 115

atg aag gag aag ata aag gag aaa ctg cct ggc ggt cac aag gag gct 4 97

Met Lys Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly His Lys Glu Ala

120 125 130

caa cct gga caa gaa tat tcg agt gct act gca gct cct gga tac ggc 545

Gln Pro Gly Gln Glu Tyr Ser Ser Ala Thr Ala Ala Pro Gly Tyr Gly135 140 145 150

ggg gaa gga gag cag cac gag aag aaa gga att atg gat aaa ate aag 593

Gly Glu Gly Glu Gln His Glu Lys Lys Gly Ile Met Asp Lys Ile Lys155 160 165

gag aaa tta cca ggg ggt cac cgc aac tga agatetaatt ctaataaata 643

Glu Lys Leu Pro Gly Gly His Arg Asn170 175

ttggatccaa ttatgatatc gtgtacccct gttttcaatc tcaatctcgt tcgtgtcgcg 703tttgtgtctt ctgagatttg agtgtgtggg cgtcttgagt ttctgtaatc ggaataaaga 763tgattcgtct tcgtcttcgt cttcgtcttc gtggactctg tagtgtgttt gtccgtatat 823tcggcgtctt gtactcgggt catctggtca tgtatgtaac atgttatata tcaaatacgt 883gaagttttgc gttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 943aaaaaaaaaa aaa 956

CcDH2a (vide SEQ ID NO:3) e proteína codificada (vide SEQ ID NO:9)

ctaaaattcg tcaaccccaa gtctcaggct accttaattt cagtgccctt tttctttatt 60

tttttctaat aacaggagtc ctggaaa atg gct gac ttg cgt gat gaa tat gga 114

Met Ala Asp Leu Arg Asp Glu Tyr Gly1 5

aat cct atg cag ttg acc gac cag tat ggc aac ccg gtt cag ctc aag 162

Asn Pro Met Gln Leu Thr Asp Gln Tyr Gly Asn Pro Val Gln Leu Lys10 15 20 25

gac gag tat ggc aac cca atg cag ctt age ggt gta gct ate acc gcc 210

Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Met Gln Leu Ser Gly Val Ala Ile Thr Ala

30 35 40

ggg acg gct agt gct gtc cat tet act gga acc gga cca act gct gcc 258

Gly Thr Ala Ser Ala Val His Ser Thr Gly Thr Gly Pro Thr Ala Ala45 50 55

act gga acc cag caa cat cag gag cag ctt cat cgg tet age age tca 306

Thr Gly Thr Gln Gln His Gln Glu Gln Leu His Arg Ser Ser Ser Ser

60 65 70

age tet ggc tcg tcg gag gat gat gga caa gga gga aga aga aag aaa 354

Ser Ser Gly Ser Ser Glu Asp Asp Gly Gln Gly Gly Arg Arg Lys Lys75 80 85

aaa ggg ttg aaa gaa aag ata aag gag aaa cta acg ggc ggg agg cac 402

Lys Gly Leu Lys Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Thr Gly Gly Arg His90 95 100 105

aag gac aga gac gat cag gag cac ate gat gat cag cac gcg cac age 450

Lys Asp Arg Asp Asp Gln Glu His Ile Asp Asp Gln His Ala His Ser

110 115 120

gcc tet cct cca aca acc acc act ggc age ggg acg tet act aca gtc 498

Ala Ser Pro Pro Thr Thr Thr Thr Gly Ser Gly Thr Ser Thr Thr Val125 130 135

ggg ggt cag cag cat gaa aag aag age atg gtg gag aag att atg gaa 54 6

Gly Gly Gln Gln His Glu Lys Lys Ser Met Val Glu Lys Ile Met Glu

140 145 150

aag ctc cct ggc cat cac gac acc cgc tag ttacctacca caacatactg 596

Lys Leu Pro Gly His His Asp Thr Arg155 160

tgatcatcgt gtaaaatctc tcctgatgcc taggaaatct agattatgtt aggcattttg 656tttggtatgt atgtgtgatt aagaccttgt tgtgcgcttg aatcttgaac gtgcatggga 716

tttgcttggt ttgatttgat ttggtgaaat aagttgtact aaaaaaaaaa aaaaaaaa 774

CcDH2b cDNA (vide SEQ ID N0:4) e proteína codificada (vide SEQ IDN0:10)

ctaaaattcg tcaaccccaa gtctcaggct accttaattt cagtgccctt tttctttatt 60tttttctaat aacaggagtc ctggaaa atg gct gac ttg cgt gat gaa tat gga 114

Met Ala Asp Leu Arg Asp Glu Tyr Gly1 5

aat cct atg cag ttg acc gac cag tat ggc aac ccg gtt cag ctc aag 162

Asn Pro Met Gln Leu Thr Asp Gln Tyr Gly Asn Pro Val Gln Leu Lys10 15 20 25

gac gag tat ggc aac cca atg cag ctt age ggt gta gct ate acc gcc 210

Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Met Gln Leu Ser Gly Val Ala Ile Thr Ala30 35 40

ggg acg gct agt gct gtc cat tet act gga acc gga cca act gct gcc 258

Gly Thr Ala Ser Ala Val His Ser Thr Gly Thr Gly Pro Thr Ala Ala

45 50 55

act gga acc cag caa ctt cag gag cag ctt cat cgg tet age age tca 306

Thr Gly Thr Gln Gln Leu Gln Glu Gln Leu His Arg Ser Ser Ser Ser60 65 70

age tet ggc tcg gtgagatact tgccaagtta caatgtgtgt gtctgtgtgt 358

Ser Ser Gly Ser75

gtataatgcg ccatcataat tgtttgcttg acagatcctg ttaataatga accgtaattt 418gacgtaaagt gtacacgttt tgtttttctg ggacttacat aatatcgaat caggctcctg 478ttgaatttga atgttgttag ctaaaagaaa attttggtgg ctgagttgtt gaatttggtt 538tatgg tcg gag gat gat gga caa gga gga aga aga aag aaa aaa ggg ttg 588Ser Glu Asp Asp Gly Gln Gly Gly Arg Arg Lys Lys Lys Gly Leu80 85 90

aaa gaa aag ata aag gag aaa cta acg ggc ggg agg cac aag gac aga 636

Lys Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Thr Gly Gly Arg His Lys Asp Arg95 100 105gac gat cag gag cac ate gat gat cag cac gcg cac age gcc tet cct 684

Asp Asp Gln Glu His Ile Asp Asp Gln His Ala His Ser Ala Ser Pro

110 115 120

cca aca acc acc act ggc age ggg acg tet act aca gtc ggg ggt cag 732

Pro Thr Thr Thr Thr Gly Ser Gly Thr Ser Thr Thr Val Gly Gly Gln125 130 135 140

cag cat gaa aag aag age atg gtg gag aag att atg gaa aag ctc cct 780

Gln His Glu Lys Lys Ser Met Val Glu Lys Ile Met Glu Lys Leu Pro145 150 155

ggc cat cac gac acc cgc tagttaccta ccacaacata ctgtgatcat 828

Gly His His Asp Thr Arg160

cgtgtaaaat ctctcctgat gcctaggaaa tctagattat gttaggcatt ttgtttggta 888tgtatgtgtg attaagacct tgttgtgcgc ttgaatcttg aacgtgcatg ggatttgctt 948ggtttgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1008aaaaaaaaaa aa

1020

CcDH3 cDNA (vide SEQ ID NO:5) e proteína codificada (vide SEQ IDNO:11)

attttttgct gtttcctgtt acattctgct ttacgtacat ccatcagcaa a atg gcc 57

Met Ala1

gag tat gat cag agt aac ate aag gtt gag gag gga tca gct gtc gag 105

Glu Tyr Asp Gln Ser Asn Ile Lys Val Glu Glu Gly Ser Ala Val Glu

5 10 15

gcc acg gat cgc gga ctc ttc aac ttg ggc aag aaa gag gaa gtg aag 153

Ala Thr Asp Arg Gly Leu Phe Asn Leu Gly Lys Lys Glu Glu Val Lys

20 25 30

aag tgt gat caa ggc cag gcc ate tet gcg gag ttt gat gag aaa gtg 201

Lys Cys Asp Gln Gly Gln Ala Ile Ser Ala Glu Phe Asp Glu Lys Val35 40 45 50

cgt gtt tet gaa cca gac aag gag gag gga aag aag cat ggt ggt ctt 24 9Arg Val Ser Glu Pro Asp Lys Glu Glu Gly Lys Lys His Gly Gly Leu

55 60 65

ctc gag aag ctc cac cga tct ggt age age tcc age age tca agt gag 297

Leu Glu Lys Leu His Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Glu70 75 80

gaa gaa gta gaa gag ggt ggt gag aag aag aag aaa aag aag gaa aag 345

Glu Glu Val Glu Glu Gly Gly Glu Lys Lys Lys Lys Lys Lys Glu Lys

85 90 95

aag ggt ttg aag gac aag ate aag gag aag ata tcg ggt gat aag aag 393

Lys Gly Leu Lys Asp Lys Ile Lys Glu Lys Ile Ser Gly Asp Lys Lys100 105 110

gac gaa gaa aag gtt gaa aaa tgt gag gaa gac acg tct ate cca gtt 441

Asp Glu Glu Lys Val Glu Lys Cys Glu Glu Asp Thr Ser Ile Pro Val115 120 125 130

gag aaa tat gcc gaa ccg gcc cat gea gat gct gct cat gaa cca gag 489

Glu Lys Tyr Ala Glu Pro Ala His Ala Asp Ala Ala His Glu Pro Glu

135 140 145

gag aaa aag ggc ttc tta gat aag ate aag gag aaa cta cca ggt ggt 537

Glu Lys Lys Gly Phe Leu Asp Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly150 155 160

ggt cag aag aag act gag gaa gtc gea gea gea gea ccg cct cct cct 585

Gly Gln Lys Lys Thr Glu Glu Val Ala Ala Ala Ala Pro Pro Pro Pro

165 170 175

ccg gea gag tgc acc gcc act gaa ggt gag gcc aag gat aag aag gga 633

Pro Ala Glu Cys Thr Ala Thr Glu Gly Glu Ala Lys Asp Lys Lys Gly180 185 190

ttc ttg gac aag ate aag gag aag ctc cct ggc tac cat ccc aag act 681

Phe Leu Asp Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Tyr His Pro Lys Thr195 200 205 210

gaa gaa gag aag gaa aag gag aag gaa aaa gaa aag gag gct gga tgc 729

Glu Glu Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Ala Gly Cys215 220 225cat taa taaaagagca aagcaaatta atagcagctt tccagtgtgt cataattttg 785

His

catttggatt aatacatttt ggagtggcaa tgatcttttt attttaaa 833

CcLEAI cDNA (vide SEQ ID N0:6) e proteína codificada (vide SEQ IDNO:12)

aagcagtggt aacaacgcag agtacgcggg acgaacatca tcggtaccag tttcctattc 60

atacatcatc ttactagcac tg atg caa aaa atg act cct ctg aga tgc ate 112

Met Gln Lys Met Thr Pro Leu Arg Cys Ile1 5 10

aat ttc att ttt ctg gcc ttt tgg gtt cct gct gtc ctc gcg gtg atg 160

Asn Phe Ile Phe Leu Ala Phe Trp Val Pro Ala Val Leu Ala Val Met

15 20 25

gcc gaa aaa ccc cta gtt cct aca tac cta ate ccc aaa ccc cct cca 208

Ala Glu Lys Pro Leu Val Pro Thr Tyr Leu Ile Pro Lys Pro Pro Pro

30 35 40

ccg cca tcg cca gtg aaa cca tca gta ccc gtg ata cct gtc aaa ccc 256

Pro Pro Ser Pro Val Lys Pro Ser Val Pro Val Ile Pro Val Lys Pro

45 50 55

cga ate gtg aga tgc cgc tcc aca ttg ttt cct ctc tgc ttc aat ate 304

Arg Ile Val Arg Cys Arg Ser Thr Leu Phe Pro Leu Cys Phe Asn Ile

60 65 70

ccc ttc gtt tgc ccc tta gac tgt ctt acc aac tgt tta gtg gac tgt 352

Pro Phe Val Cys Pro Leu Asp Cys Leu Thr Asn Cys Leu Val Asp Cys75 80 85 90

gtc acc tgc aag gct tac tgc agt tgc aac ttt ccc ggc gct gtt tgt 400

Val Thr Cys Lys Ala Tyr Cys Ser Cys Asn Phe Pro Gly Ala Val Cys

95 100 105

cag gat cca cga ttc gtt ggg ggc gat ggc aac aca ttt tac ttc cat 448

Gln Asp Pro Arg Phe Val Gly Gly Asp Gly Asn Thr Phe Tyr Phe His

110 115 120

ggc cgc aag gat cag gac ttc tgc ctg gtt tcg gat acc aat ctt cat 4 96

Gly Arg Lys Asp Gln Asp Phe Cys Leu Val Ser Asp Thr Asn Leu His125

gta aat ggtVal Asn Gly140

ttc act tgg

Phe Thr Trp155

ctc gtg gccLeu Val Ala

ctc gct ataLeu Ala Ile

gga tcc aaaGly Ser Lys205

aca age aacThr Ser Asn220

ate acc gccIle Thr Ala235

ggt tat gacGly Tyr Asp

ttc aaa ttcPhe Lys Phe

acc tat agg30 Thr Tyr Arg285

cca gtc atg

130

cat ttc att ggc aaaHis Phe Ile Gly Lys145

gtg cag gcc att ggaVal Gln Ala Ile Gly160

gea aaa agg act tcaAla Lys Arg Thr Ser175

tcc att gat gga aatSer Ile Asp Gly Asn190

tgg caa ctt ccg gccTrp Gln Leu Pro Ala210

aat aac gga ctt gtgAsn Asn Gly Leu Val225

aat gtg gtt cca ataAsn Val Val Pro Ile240

att act gat gag gatIle Thr Asp Glu Asp255

ttc aac ate acc gatPhe Asn Ile Thr Asp270

age gat tac gtg aacSer Asp Tyr Val Asn290

ggc ggt gac cgt aag

135

aga aaa cct aat ttgArg Lys Pro Asn Leu150

ata atg ttc gac gacIle Met Phe Asp Asp165

acg tgg gac gac aatThr Trp Asp Asp Asn180

ccg att tcc ctc cccPro Ile Ser Leu Pro195

ccg tcc aat gtc agtPro Ser Asn Val Ser215

gtt gaa gcc gtg aacVal Glu Ala Val Asn230

aca gct caa gaa tcaThr Ala Gln Glu Ser245

tgc ttt acc cat ttgCys Phe Thr His Leu260

tca act gat gga gttSer Thr Asp Gly Val275

aaa atg aag gtg aatLys Met Lys Val Asn295

tac ttg act tcg gga

cgc aga gac 544

Arg Arg Asp

cac aga ate 592

His Arg Ile170

gtg gat cga 640

Val Asp Arg185

act gaa gaa 688

Thr Glu Glu200

ate atg aga 736

Ile Met Arg

aat ttc agg 784

Asn Phe Arg

aaa gtt cat 832

Lys Val His250

gag ctt ggg 880

Glu Leu Gly265

ttg gga caa 928

Leu Gly Gln280

gcg gta atg 976

Ala Val Met

ctt ttt agt 1024Pro Val Met Gly Gly Asp Arg Lys Tyr Leu Thr Ser Gly Leu Phe Ser

300 305 310

gcc gat tgt gct gtt tct cgc ttt ggt ggg aag gtt ctt gag aaa gcc 1072Ala Asp Cys Ala Val Ser Arg Phe Gly Gly Lys Val Leu Glu Lys Ala315 320 325 330

aat tct gct tct cct gtg cat gag tat cca gcc ttg aac tgc aag agt 1120Asn Ser Ala Ser Pro Val His Glu Tyr Pro Ala Leu Asn Cys Lys Ser

335 340 345

ggg atg gaa ggg aat ggc ttg gtt tgc aaa aaa taa ttaagttgct 1166Gly Met Glu Gly Asn Gly Leu Val Cys Lys Lys

350 355

acagagcatg ttgtatgctg aatgatgagc tataaataat tgagtttcag aaaagtctta 1226

ttagaaatga agtgatcata gctttacatg caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1286

a 1287

Seqüência completa de CcDH2, incluindo promotor (bases 1-1324; vide SEQID NO: 13), seqüência de codificação (vide SEQ ID NO:3) e proteína codifi-cada (vide SEQ ID NO:9) íntron I (1642)..(1866)

atagtgacct taatagcgat cttgttgctt ttgatcgtca gaaaagtagt ggacatgacg 60

gaagaggtcc taagatgagt tccagttcca gcatgaaggg ctctttggcg aagcctttct 120

tgaggcgtca cttttctttt ggatctaaag gcagtagatc aatgtcagag aatcattctt 180

cctggaagag gggattcttc tgggcaaaat cgagaaagga ttaagttctg tctagagtta 240

caaaggtgag caacagtcac ggttttttat tagggaatgg aaggattgga tcccttttca 300

cgtagtgaac aacatatatt ttgcatggtt ggtcttagta cctataacac gaaaatgttc 360

ttcatccgtt ctattaatca ttaggcttta gtcatttaaa ttttttacat cccgcatttc 420

tcctcttgat tcttgttgat ttctgcagat tccacagttg ttcttcagat gggctacgaa 480

atgcatgcag ggagcaggca atcagccata aattcaaccc tgtcaaggaa gctggcattg 540

tctcgtgcaa atgtaggtta gcttttgaag atacactgca aagggaagac catacagatg 600

gggaaatgaa ttcattataa tataggaaaa aggaaagatg ataggggtca gggcgtccgt 660

gcatcatgaa actagttctc tttcattttg tacgatggct gtttactgtt taatttcatg 720

aaattagttt ggatatatgc gtagcgtttt accatcgcat ttctaaatcg atattctatg 780

ggccgaatta cgcgttggag acatcattgg gttgctcctc tcaatcccat ctctatctat 840

tgacggatcc ggatcatgat gttgaacctt tcaacttttg acttagatgg gatttgtgtt 900cgcgtgttgt taacttgtta ctgaccgact cagaagacag cggattctga cttcaccacg 960tgtctcttta gtgaaaattt aaaaggcatt tttcttctgt tcatagttta aaatgtaatg 1020tgattattaa aagatcgttt ggtattattt caaggatgga tggattggat ggaagggata 1080tctgatatat atcataccct tccaaaattc aggaccatga cgtatttaat atcccccagc 1140ggaagacacg tgccttgatg tcttataggt ggcaatacac ttcagcttcc tctgctaata 1200cgtgtgagga tcttcggtac catgcagaaa agaccgcggt gctccttcca ccgtcctcat 1260ccctctcttg gcttttttaa gtctcctgcg atatccaaaa tccaaacaaa gccgttatcg 1320cagctaaaat tcgtcaaccc caagtctcag gctaccttaa tttcagtgcc ctttttcttt 1380atttttttct aataacagga gtcctggaaa atg gct gac ttg cgt gat gaa tat 1434Ala Asp Leu Arg Asp Glu Tyr

1 5

gga aat cct atg cag ttg acc gac cag tat ggc aac ccg gtt cag ctc 1482

Gly Asn Pro Met Gln Leu Thr Asp Gln Tyr Gly Asn Pro Val Gln Leu10 15 20

aag gac gag tat ggc aac cca atg cag ctt age ggt gta gct ate acc 1530Lys Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Met Gln Leu Ser Gly Val Ala Ile Thr

25 30 35

gcc ggg acg gct agt act gtc cat tet act gga acc gga cca act gct 1578

Ala Gly Thr Ala Ser Thr Val His Ser Thr Gly Thr Gly Pro Thr Ala40 45 50 55

gcc act gga acc cag caa cat cag gag cag ctt cat cgg tet age age 1626

Ala Thr Gly Thr Gln Gln His Gln Glu Gln Leu His Arg Ser Ser Ser

60 65 70

tca age tet ggc tcg gtgagatact tgccaagtta caatgtgtgt gtctgtgtgt 1681

Ser Ser Ser Gly Ser75

gtataatgcg ccatcataat tgtttgcttg acagatcctg ttaataatga accgtaattt 1741gacgtaaagt gtacacgttt tgtttttctg ggactaacat aatatcgaat caggctcctg 1801ttgaatttga atgttgttag ctaaaagaaa attttggtgg ctgagttgtt gaatttggtt 1861tatag acg gag gat gat gga caa gga gga aga aga aag aaa aaa ggg ttg 1911Thr Glu Asp Asp Gly Gln Gly Gly Arg Arg Lys Lys Lys Gly Leu80 85 90aaa gaa aag ata aag gag aaa cta acg ggc ggt agg cac aag gac aga 1959

Lys Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Thr Gly Gly Arg His Lys Asp Arg

95 100 105

gac gat cag gag cac ate gat gat cag cac gcg cac age gcc tet cct 2007

Asp Asp Gln Glu His Ile Asp Asp Gln His Ala His Ser Ala Ser Pro

110 115 120

cca aca acc acc act ggc age ggg acg tet act aca gtc ggg ggt cag 2055

Pro Thr Thr Thr Thr Gly Ser Gly Thr Ser Thr Thr Val Gly Gly Gln

125 130 135

cag cat gaa aag aag age atg gtg gag aag att atg gaa aag ctc cct 2103

Gln His Glu Lys Lys Ser Met Val Glu Lys Ile Met Glu Lys Leu Pro140 145 150 155

ggc cat cac gac acc cgc tagttaccta ccacaacata ctgtgatcat 2151

Gly His His Asp Thr Arg160

cgtgtaaaat ctctcctgat gcctaggaaa tctagattat gttaggcatt ttgtttggta 2211tgtatgtgtg attaagacct tgttgtgcgc ttgaatcttg aacgtgcatg ggatttgctt 2271ggtttgattt gatttgg 2288

A invenção não é limitada às modalidades descritas e exemplifi-cadas acima, mas é capaz de variação e modificação dentro do escopo dasreivindicações apensas.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<13®> «estec S.A.

CorneH Research PoundationBEN AMOR, ItuohaieedMCCARTHY, James GerardPETXARDt VíncentTANKSLÊV, Steven D.LiN, Chewel

<12Q> GENES E PROMOTORES DE DEIDRINA DE CAFÉ

<130> NO 7972/vfÒ

<150> y.s, 60/696890<151> 2005-07-06

<160> 46

<170» Patentln versão 3.3

<2X0> 1<211> SBO<212> DNA

<213> Ooffea çánepliiOra<4O0> I

gtggoaagaa gtcctatcgg tctctgatct ttcacctttc gttaatttgt gttcgatatt 60

ctactcccgc tagtagttga aatttggcaa ttaagatggc gcaatacggg gctgaatatg 120

gcaaccaaaa gagccagtac gatgagtacg gaaacccagt tcgtcagaca gacgaatatg 180

gtaaccctgc ccgccatgga ggtaccatgg gtgattatgg aaccactggt actactggag 240

cctatggtgg cacaactgga gcacatggga cttatgcaac tggaaccact ggcactaccg 300

gtaccggtgc atacgccacc cagcctggca ctgatgtggg gaaggagcac catggccttg 360

gtggcatgct tcatcgctct gqcagcggta gctctagctc gtccgaggat gatgggcaag 420

gcgggaggag gaagaagggg atgaaggaga agataaagga gaaactgcct ggcggtcaca 480

aggaggctca acctggacaã gaatattcgã gtgctaetgc ágctcctgga tâcggegggg 540

aaggagtgca gcacgagaag aaaggaatta tggataaaat caaggagaaa ttaccagggg 600

gteactacaa ctgaaçatct âattetaatá aatattggtc cgattatgát attgtgtacc 660

cetgttttca atctcaatct cgttcgtgtc gtgtttgtgt tttctgagat ttgagtgtgt 720

ggacgtcttg agtttctgta Bttggaataa aagatgat.tc gtcttcgtct togtggactc 780

tgtagtgtgt ttgtccgtat attc§i'cffc ttfftactcgg gtcátctggt eatgtatgta 840

acatgttata tatcaaatac gltfâaptttt gcfttãaaaa 880

«210> 2<213> 901«212> DNA

<2i3> coffea canephorâ<400> 2

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<210> 3

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<213> Coffea canephora

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<210> 4

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<212> DNA

<213> Coffea canephora

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<210> 5<211> 835<212> DNA

<213> Coffea canephora<:400> 5

attttttgct gtttcctgtt acattctgcttatgatcaga gtaacatcaa ggttgaggagctcttcaact tgggcaagaa agaggaagtggcggagtttg atgagaaagt gcgtgtttctggtggtcttc tcgagaagct ccaccgatctgaagtagaag agggtggtga gaagaagaagaagatcaagg agaagatatc gggtgataaggaagacacgt ctatcccagt tgagaaatatgaaccagagg agaaaaaggg cttcttagatcagaagaaga ctgaggaagt cgcagcagcagccactgaag gtgaggccaa ggataagaagcctggctacc atcccaagac tgaagaagaggctggatgcc attaataaaa gagcaaagcattttgcattt ggattaatac attttggagt

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tgtgaatcga etcgetatat ccattgatgg aaatccgatt tcccteccca ctgaagaagg 660

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cggacttgtg gttgaagccg tgaacaattt çaggatracc grcaatgtgg ttecaatàac 780

agctcaagaa tcaaaagttc atggttatga catrtartgat gaggattgct ttacccattt 840

ggagcttggg ttcaaattet tcaacaicac coattcaact gatgçagttc tgggacaaac 900

ctataggagc gattacgtga acaaaatgaa ggtçaatgcg gtaatgccag tcatgggcgg füê

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<210> 7

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<213> Cpffea cânlfAlitra

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<2Z3> Pormotori de CtíOMtl<22θ>

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<222> C1B67)..(2121)

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<4QQ> 7

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ttcatccgtt ctattaatca ttaggcttta gtcntttaaa ttttttacat cccgcatttc 420

tcctcttçat tcttfttgat ttctgtagat toracagttg ttcttcagat gggctacgaa 410

atgcatgcag ggagcag-gca atcagccata aattcaaccc tgtcaaggaa gctggcattg 540

tctcgtgçaa atgtaggtta gettTtgaag atacactgca mg&gaagac catacagatg 600

^ggaaatgaa ttcattataa tataggaaaa aggaaàgatg ataggggtcá gggtgtccgt GGD

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ggccgaatta cgcgttggag acatcattpg gttgctcctc tcaatcccat ctctatctat 840

tgacggatcc ggatcatgat gttgaaçcrtt tcaacttrttg açttagatfg gatttgtgtt §§§

cgcgigttgt taacttgtta etgacogaet cagaagacag cggattct-ga ctteaceaeg Sift

tgtctcttta gtpaaaattt aaaaggeatt ttccttctgt teatagttta aaatgtaotg WM

tgâttatrtaa aagatcgttt ggtattattt caaggatgga tggattggat ggaagggata :Μ31§

tc,tgacatai aicataccct tceaaaattc aggaccatga cgtatttaat atcccccagc 1140

ggaagacacg tgccttgatg tcttataggt ggeaatacac ttcagcttcc tctgctaata Ui&f

cgtgtgagga tetteggtac catgcagaaa agaccgcggt gctccttcca ccgtcctcat UM

ccctctcttg gcttttttaa gtctcctgeç atatccaaaa tccaaac&aa gccgttatcç1 1320

tagCtaaaat tcgtcaaccç çaagtctcag gctaccttaa trttcagtgçç ctttttettt IISD

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1 5

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' IS 30 .11'

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« 41 50 ' 5 5gcc act gaa acc cag caa cat cag gag cag ctt cat cgg tct age age 1626Ala Thr Gly Thr Gln Gln His Gln Glu Gln Leu His Arg ser ser Ser60 65 70

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gacgtaaagt gtacacgttt tgtttttctg ggactaacat aatatcgaat caggctcctg 1801

ttgaatttga atgttgttag ctaaaagaaa attttggtgg ctgagttgtt gaatttggtt 1861

tatag acg gag gat gat gga caa gga gga aga aga aag aaa aaa gag ttg 1911Thr Glu Asp Asp Gly Gln Gly Gly Arg Arg Lys Lys Lys Gly

Leu

80 " 85 ' 90'

aaa gaa aag ata aag gag aaa cta acg ggc gqt agg cac aag gac agaLys Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Thr Gly Gly Arg His Lys Asp Arg95 100 105

1959

gac gat cag gag cac ate gat gat cag cac gcg cac age gcc tct cct 2007Asp Asp Gln Glu His Ile Asp Asp Gln His Ala His ser Ala ser Pro110 115 120

cca aca acc acc act ggc age gqg acg tct act aca gtc ggg gat cag 2055Pro Thr Tbr Thr Thr Gly Ser Gly Thr ser Thr Thr vai Gly Gly Gln125 130 135

cag cat gaa aag aag age atg gtq gag aag att atg gaa aag ctc cct 2103Gln His Glu Lys Lys ser Met VaT Glu Lys Ile Met Glu Lys Leu Pro140 145 150 155

ggc cat cac gac acc cgc tagttaccta ccacaacata ctgtgatcat 2151Gly His His Asp Thr Arg160

cgtgtaaaat ctctcctgat gcctaggaaa tctagattat gttaggcatt ttgtttggta 2211

tgtatgtgtg attaagacct tgttgtgcgc ttgaatcttg aacgtgcatg ggatttgctt 2271

ggtttgattt gatttgg 2288

<210> 8<211> 172<212> PRT

<213> coffea canephora<400> 8

Met Ala Gln Tyr Gly Ala Glu Tyr Gly Asn Gln Lys ser Gln Tyr Asp15 10 15

Glu Tyr Gly Asn Pro Val Arg Gln Thr Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Ala20 25 30

Arg His Gly Gly Thr Met Gly Asp Tyr Gly Thr Thr Gly Thr Thr Gly35 40 45

Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Gly Ala His Gly Thr Tyr Ala Thr Gly Thr50 55 60Thr Gly Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Ala Thr Gln Pro Gly Thr Asp65 70 75 80

Val Gly Lys Glu His His Gly Leu Gly Gly Met Leu His Arg Ser Gly85 90 95

Ser Gly ser ser ser Ser Ser Glu Asp Asp Gly Gln Gly Gly Arg Arg100 105 110

Lys Lys Gly Met Lys Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly His115 120 125

Lys Glu Ala Gln Pro Gly Gln Glu Tyr ser Ser Ala Thr Ala Ala Pro130 135 140

Gly Tyr Gly Gly Glu Gly vai Gln His Glu Lys Lys Gly Ile Met Asp145 150 155 160

Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly His His Asn165 170

<210> 9<2Í1> 175<212> PRT

<213> Coffea canephora<400> 9

Met Ala Gln Tyr Gly Ala Glu Tyr Gly Asn Gln Lys Ser Gln Tyr Asp15 10 15

Glu Tyr Gly Asn Pro vai Arg Gln Thr Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Ala20 25 30

Arg His Gly Gly Thr Met Gly Asp Tyr Gly Thr Thr Gly Thr Thr Gly35 40 45

Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Gly Thr Ala Gly Ala His Gly Thr Tyr Ala50 55 60

Thr Gly Thr Thr Gly Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Ala Thr Gln Pro65 70 75 80

Gly Thr Asp vai Gly Lys Glu Arg His Gly Leu Gly Gly Met Leu His85 90 95

Arg ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Asp Gly Gln Gly100 105 110

Gly Arg Arg Lys Lys Gly Met Lys Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro115 120 125Gly Gly His Lys Glu Ala Gln Pro Gly Gln Glu Tyr ser Ser Ala Thr130 135 140

Ala Ala Pro Gly Tyr Gly Gly Glu Gly Glu Gln His Glu Lys Lys Gly145 150 155 160

Ile Met Asp Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly His Arg Asn165 170 175

<210> 10<211> 162<212> PRT

<213> coffea canephora<400> 10

Met Ala Asp Leu Arg Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Met Gln Leu Thr Asp1 5 10 15

Gln Tyr Gly Asn pro Val Gln Leu Lys Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Met20 25 30

Gln Leu ser Gly vai Ala lie Thr Ala Gly Thr Ala ser Ala vai His35 40 45

Ser Thr Gly Thr Gly Pro Thr Ala Ala Thr Gly Thr Gln Gln His Gln50 55 60

Glu Gln Leu His Arg ser Ser Ser Ser Ser ser Gly Ser Ser Glu Asp65 70 75 80

Asp Gly Gln Gly Gly Arg Arg Lys Lys Lys Gly Leu Lys Glu Lys Ile85 90 95

Lys Glu Lys Leu Thr Gly Gly Arg His Lys Asp Arg Asp Asp Gln Glu100 105 110

His Ile Asp Asp Gln His Ala His Ser Ala ser Pro Pro Thr Thr Thr115 120 125

Thr Gly ser Gly Thr ser Thr Thr Val Gly Gly Gln Gln His Glu Lys130 135 140

Lys ser Met Val Glu Lys Ile Met Glu Lys Leu Pro Gly His His Asp145 150 155 160

Thr Arg

<210> 11

<211> 162

<212> PRT

<213> Coffea canephora<400> 11

Met Ala Asp Leu Arg Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Met Gln Leu Thr Asp1 5 10 15

Gln Tyr Gly Asn Pro vai Gln Leu Lys Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Met20 25 30

Gln Leu Ser Gly Val Ala Ile Thr Ala Gly Thr Ala ser Ala Val His35 40 45

Ser Tlir Gly Thr Gly Pro Thr Ala Ala Thr Gly Thr Gln Gln Leu Gln50 55 60

Glu Gln Leu His Arg Ser Ser Ser ser ser Ser Gly Ser Ser Glu Asp65 70 75 80

Asp Gly Gln Gly Gly Arg Arg Lys Lys Lys Gly Leu Lys Glu Lys Ile85 90 95

Lys Glu Lys Leu Thr Gly Gly Arg His Lys Asp Arg Asp Asp Gln Glu100 105 110

His Ile Asp Asp Gln His Ala His Ser Ala Ser Pro Pro Thr Thr Thr115 120 125

Thr Gly Ser Gly Thr ser Thr Thr Val Gly Gly Gln Gln His Glu Lys130 135 140

Lys ser Met Val Glu Lys Ile Met Glu Lys Leu Pro Gly His His Asp145 150 155 160

Thr Arg

<21Q> 12<211> 227<212> PRT

<213> Coffea canephora<400> 12

Met Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Asn Ile Lys Val Glu Glu Gly Ser Ala15 10 15

vai Glu Ala Thr Asp Arg Gly Leu Phe Asn Leu Gly Lys Lys Glu Glu20 25 30

Val Lys Lys cys Asp Gln Gly Gln Ala lie Ser Ala Glu Phe Asp Glu35 40 45

Lys Val Arg Val Ser Glu Pro Asp Lys Glu Glu Gly Lys Lys His Gly50 55 60GTy Leu Leu Glu Lys Leu His Arg ser Gly ser ser ser ser ser ser65 70 75 80

ser Glu Glu Glu vai Glu Glu Gly Gly Glu Lys Lys Lys Lys Lys Lys85 90 95

Glu Lys Lys Gly Leu Lys Asp Lys Ile Lys Glu Lys lie Ser Gly Asp100 105 110

Lys Lys Asp Glu Glu Lys Val Glu Lys cys Glu Glu Asp Thr ser Ile115 120 125

Pro vai Glu Lys Tyr Ala Glu Pro Ala His Ala Asp Ala Ala His Glu130 135 140

Pro Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Asp Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro145 150 155 160

Gly Gly Gly Gln Lys Lys Thr Glu Glu Val Ala Ala Ala Ala Pro Pro165 170 175

Pro Pro Pro Ala Glu cys Thr Ala Thr Glu Gly Glu Ala Lys Asp Lys180 185 190

Lys Gly Phe Leu Asp Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Tyr His Pro195 200 205

Lys Thr Glu Glu Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Ala210 215 220

Gly Cys His225

<210> 13<211> 357<212> PRT

<213> Coffea canephora<400> 13

Met Gln Lys Net Thr Pro Leu Arg Cys lie Asri Phe lie Phe Leu Ala1 5 10 15

Phe Trp vai Pro Ala vai Leu Ala Val Met Ala Glu Lys Pro Leu Val20 25 30

Pro Thr Tyr Leu Ile Pro Lys Pro Pro Pro Pro Pro ser Pro Val Lys35 40 45

Pro Ser Val Pro vai Ile Pro Val Lys Pro Ara Ile Val Arq cys Ara50 55 60ser Thr Leu Phe Pro Leu Cys Phe Asn lie" Pro Phe vai Cys Pro Leu65 70 75 80

Asp cys Leu Thr Asn cys Leu Val Asp Cys Val Thr Cys Lys Ala Tyr85 90 95

cys Ser Cys Asn Phe Pro Gly Ala Val Cys Gln Asp Pro Arg Phe Val100 105 110

Gly Gly Asp Gly Asn Thr Phe Tyr Phe His Gly Arg Lys Asp Gln Asp115 120 125

Phe Cys Leu Val Ser Asp Thr Asn Leu His Val Asn Gly His Phe lie130 135 140

Gly Lys Arg Lys Pro Asn Leu Arg Arg Asp Phe Thr Trp Val Gln Ala145 150 155 160

Ile Gly Ile Met Phe Asp Asp His Arg Ile Leu Val Ala Ala Lys Arg165 170 175

Thr ser Thr Trp Asp Asp Asn vai Asp Arg Leu Ala Ile ser ile Asp180 185 190

Gly Asn Pro ile Ser Leu Pro Thr Glu Glu Gly Ser Lys Trp Gln Leu195 200 205

Pro Ala Pro Ser Asn Val Ser Ile Met Arg Thr ser Asn Asn Asn Gly210 215 220

Leu Val Val Glu Ala Val Asn Asn Phe Arg lie Thr Ala Asn Val Val225 230 235 240

Pro Ile Thr Ala Gln Glu Ser Lys Val His Gly Tyr Asp Ile Thr Asp245 250 255

Glu Asp cys Phe Thr His Leu Glu Leu Gly Phe Lys Phe Phe Asn Ile260 265 270

Thr Asp Ser Thr Asp Gly Val Leu Gly Gln Thr Tyr Arg Ser Asp Tyr275 280 285

vai Asn Lys Met Lys Val Asn Ala Val Met Pro Val Met Gly Gly Asp290 295 300

Arg Lys Tyr Leu Thr Ser Gly Leu Phe Ser Ala Asp cys Ala Val ser305 310 315 320

Arg Phe Gly Gly Lys Val Leu Glu Lys Ala Asn ser Ala Ser Pro Val325 330 335His Glu Tyr Pro Ala Leu Asn Cys Lys ser Gly Met Glu Gly Asn Gly340 345 350

Leu vai cys Lys Lys355

<210> 14<211> 130<212> PRT

<213> Lycopersicon esculentum<400> 14

Met Ala Gln Tyr Gly Asn Gln Asp Gln Met Arg Lys Thr Asp Glu Tyr1 5 10 15

Gly Asn His vai Gln Glu Thr Gly Val Tyr Gln Gly Thr Gly Thr Gly20 25 30

Gly Met Met Gly Gly Thr Gly Thr Gly Gly Met Met Gly Gly Thr Gly35 40 45

Gly Glu Tyr Gly Thr Gln Gly Met Gly Thr Gly Thr His His His Glu50 55 60

Gly Gln Gln Gln Leu Arg Arg ser Asp ser ser ser Ser ser Glu Asp65 70 75 80

Asp Gly Glu Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Leu Lys Glu Lys Ile Met85 90 95

Glu Lys Met Pro Gly Gln His Glu Gly Glu Tyr Gly Gln Thr Thr Gly100 105 110

Glu Glu Lys Lys Gly Met Met Asg Lys Ile Lys Asp L^s Il e Pro Gly

Met His130

<210> 15

<211> 157

<212> PRT

<213> Solanum commersonii

<400> 15

Met Ala His Tyr Glu Asn Gln Tyr ser Ala Gly Gln Ala Leu Gln Lys1 5 10 15

Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Val Arg Gln Thr Asp Glu Tyr Gly Asn Pro20 25 30

lie Gln Gln Thr Gly Gly Thr Met Gly Glu Tyr Gly Thr Thr Gly Thr35 40 45Gly Tyr Gly Thr GTn Ala Gly His Thr Thr Gly vai Leu Gly Gly Asp50 55 60

Gln Arg Gln His Gly Thr Leu Gly Gly Met Leu His Arg Ser Gly Ser65 70 75 80

ser ser Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Asp Gly His Gly Gly Arg Arg85 90 95

Lys Lys Lys Gly Ile Lys Asp Lys vai Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly100 105 110

His Arg Asp Asp Leu Ala His ser Thr Ala Ttir Thr Thr Thr Thr Gly115 120 125

Tyr Gly Met Asp Gly Thr His Glu Lys Lys Gly Ile Met Glu Lys Ile130 135 140

Lys Glu Lys Leu Pro Gly His His Gly Pro Gly His His145 150 155

<210> 16<211> 186<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 16

Met Ala Ser Tyr Gln Asn Arg Pro Gly Gly Gln Ala Thr Asp Glu Tyr1 5 10 15

Gly Asn Pro Ile Gln Gln Gln Tyr Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Met Gly20 25 30

Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Thr Gly Gly Gln35 40 45

Gly Tyr Gly Thr Gly Gly Gln Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gln Gly Tyr50 55 60

Gly Thr Gly Gly Gln Gly Tyr Gly Thr Gly Thr Gly Thr Glu Gly Phe65 70 75 80

Gly Thr Gly Gly Gly Ala Arg His His Gly Gln Glu Gln Leu His Lys85 90 95

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Met Leu His Arg ser Gly Ser Gly100 105 110

Ser Ser ser Ser ser Glu asd Asp Gly Gln Glv Gly Arg Arg Lvs Lvs115 120 125Gly Ile Thr Gln Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly His His Asp Gln130 135 140

ser Gly Gln Ala Gln Ala Met Gly Gly Met Gly ser Gly Tyr Asp Ala145 150 155 160

Gly Gly Tyr Gly Gly Glu His His Glu Lys Lys Gly Met Met Asp Lys165 170 175

Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly Gly Arg180 185

<210> 17<211> 208<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum<400> 17

Met Ala Asp Gln Tyr Glu Lys Lys vai Glu Glu Gly Ser Ala Asn Val1 5 10 15

Glu Ala Thr Asp Arg Gly Leu Phe Asp Phe Leu Gly Lys Lys Glu Glu20 25 30

Glu Lys Pro Thr His Ala Gln Glu Glu His Ala lie ser ser Glu Phe35 40 45

Val Glu Lys Val Lys vai Ser Glu Glu vai Ala Glu Tyr Lys Glu Glu50 55 60

Glu Lys Lys Glu Glu His Asn Lys Glu Glu Lys Lys Leu His Arg Ser65 70 75 80

Ser ser ser ser ser ser ser ser Asp Glu Glu Glu Glu Xle Gly Glu85 90 95

Asp Gly Gln Lys Ile Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Leu Lys Asp Lys100 105 110

lie Lys Asp Lys Ile Ser Gly Glu His Lys Glu Glu Glu Lys Ala Gly115 120 125

Glu Asp Thr Ala vai Pro vai Glu Lys Tyr Glu Glu Thr Glu Glu Lys130 135 140

Lys Gly Phe Leu Asp Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly Gly Gln145 150 155 160

Lys Lys Thr Glu Glu Val Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ala Glu His165 170 175Glu Ala Glu Gly Lys Glu Lys Lys Gly Phe Leu Asp Lys Ile Lys Glu180 185 190

Lys Leu Pro Gly Tyr His Ser Lys Thr Glu Glu Lys Lys Lys Lys Lys195 200 205

<210> 18

<211> 209

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400> 18

Met Ala Asp Gln Tyr Glu Gln Asn Lys Pro ser Val Glu Glu Thr Val1 5 10 15

Gly Ala Asn Val Glu Ala Thr Asp Arg Gly Leu Phe Asp Phe Ile Gly20 25 30

Lys Lys Lys Glu Glu Lys Pro Ser His Ala His Glu Glu Glu Ala lie35 40 45

Ser Ser Glu Phe Cys Glu Lys Val Lys Val Ser Glu Glu Glu His Lys50 55 60

Glu Glu Glu Lys Lys Glu Glu Lys Lys Leu His Arg ser ser Ser ser65 70 75 80

ser Ser Ser Ser Ser Asp Glu Glu Glu Glu Ile Gly Glu Asp Gly Gln85 90 95

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Asn<210> 19<211> 265<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 19

Met Ala Glu Glu Tyr Lys Asn Asn Val Lys Glu His Glu Thr Pro Thr1 5 10 15

Val Ala Thr Glu Glu Ser pro Ala Thr Thr Thr Glu Val Thr Asp Arg20 25 30

Gly Leu Phe Asp Phe Leu Gly Lys Lys Glu Glu Glu Val Lys Pro Gln35 40 45

Glu Thr Thr Thr Leu Glu Ser Glu Phe Asp His Lys Ala Gln Ile Ser50 55 60

Glu Pro Glu Leu Ala Ala Glu His Glu Glu Val Lys Glu Asn Lys Ile65 70 75 80

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Lys Pro Ser Val Ile Glu Lys Leu His Arg ser Asn ser Ser Ser Ser100 105 110

Ser Ser ser Asp Glu Glu Gly Glu Glu Lys Lys Glu Lys Lys Lys Lys115 120 125

Ile vai Glu Gly Glu Glu Asp Lys Lys Gly Leu Val Glu Lys Ile Lys130 135 140

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<210> 20<211> 337<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 20

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Gly Ile vai Phe Tyr Phe His Gly Lys ser Asn Glu Glu Phe ser Leu100 105 110

Val Ser Asp Ser Asp Leu Gln Ile Asn Gly Arg Phe Ile Gly His Arg115 120 125

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<21Q> 21

<211> 320

<212> PRT

<213> Picea glauca

<400> 21

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Gly Gly Asp Gly Ile Met Phe Tyr Phe His Gly Lys Arq Asp Gln Asp85 90 95Phe Cys Leu lie Ser Asp Ser Asn Leu His' ile Asn Ala His Phe Ile100 105 UO

Gly Lys Arg Gly Gln Gly Met Gly Arg Asp Phe Thr Trp vai Gln Ser115 120 125

Ile Gly Val Leu Leu Glu Asp Gly Arg Gln Phe Tyr Leu Gly Ala Lys130 135 140

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Asn Gly Gln Thr Leu Thr Leu Pro Pro Gly Glu Gly Ala Thr Trp Ala165 170 175

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Arg Phe Ala Ser Ser Ser Asp Asp Glu Tyr Ala Ile Thr Ser Ala Leu290 295 300

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<210> 22

<211> 349

<212> PRT

<213> zea mays

<400> 22

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<211> 21

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<400> 36

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<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DH2a-Rl

<400> 37

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<210> 38

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<210> 39

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<400> 39

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<210> 40

<210> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<400> 40

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<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<400> 41

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<210> 42

<211> 10

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 42ryacgtggyr

<210> 43

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<400> 43

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<211> 23

<212> ONA

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<220>

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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Claims (47)

1. Molécula de ácido nucleico isolada de café (Coffea spp.), ca-racterizada pelo fato de que apresenta uma seqüência de codificação quecodifica uma deidrina ou uma proteína abundante embriogênica tardia (LEA).

2. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a seqüência de codificação codifica uma dei-drina tendo um peso molecular entre cerca de 17 kDa e cerca de 26 kDa.

3. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que a deidrina ou proteína LEA tem uma seqüên-cia de aminoácido que é 46% ou mais idêntica a qualquer uma das SEQ IDNOS: 7 a 12.

4. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que a deidrina ou proteína LEA tem uma seqüên-cia de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOS: 7 a 12.

5. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a seqüência de codificação é 50% ou maisidêntica a qualquer uma das seqüências de codificação mostradas nas SEQID NOS: 1 a 6.

6. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que a seqüência de codificação compreendequalquer uma das SEQ ID NOS: 1-6.

7. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a referida molécula é um gene tendo umaestrutura de leitura aberta que compreende a seqüência de codificação.

8. Molécula de mRNA, caracterizada pelo fato de que é produzi-da através de transcrição do gene como definido na reivindicação 7.

9. Molécula de cDNA, caracterizada pelo fato de que é produzidaatravés de transcrição reversa da molécula de mRNA como definida na rei-vindicação 8.

10. Oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de que apresentaentre 8 e 100 bases de comprimento, o qual é complementar a um segmentoda molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1.

11. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécu-la de ácido nucleico como definido na reivindicação 1.

12. Vetor de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelofato de que é um vetor de expressão selecionado do grupo de vetores con-sistindo em vetores de plasmídeo, fagemídeo, cosmídeo, baculovírus, bac-mídeo, bacteriano, levedura e viral.

13. Vetor de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelofato de que a seqüência de codificação da molécula de ácido nucleico é ope-ravelmente ligada a um promotor constitutivo.

14. Vetor de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelofato de que a seqüência de codificação da molécula de ácido nucleico é ope-ravelmente ligada a um promotor induzível.

15. Vetor de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelofato de que a seqüência de codificação da molécula de ácido nucleico é ope-ravelmente ligada a um promotor específico de tecido.

16. Vetor de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelofato de que o promotor específico de tecido é um promotor específico desemente.

17. Vetor de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelofato de que o promotor específico de semente é um promotor específico desemente de café.

18. Vetor de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelofato de que o promotor específico de semente de café é um promotor de ge-ne de deidrina.

19. Vetor de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelofato de que o promotor de gene de deidrina compreende SEQ ID NO: 13.

20. Célula-hospedeira caracterizada pelo fato de que é transfor-mada com o vetor como definido na reivindicação 11.

21. Célula-hospedeira de acordo com a reivindicação 20, carac-terizada pelo fato de que é selecionada do grupo consistindo em células deplanta, células bacterianas, células fúngicas, células de inseto e células demamífero.

22. Célula-hospedeira de acordo com a reivindicação 21, carac-terizada pelo fato de que é uma célula de planta selecionada do grupo deplantas consistindo em café, tabaco, Arabidopsis, milho, trigo, arroz, soja,cevada, centeio, aveias, sorgo, alfafa, trevo, canola, açafrão, girassol, a -mendoim, cacau, tomate tomatillo, batata, pimenta, beringela, beterraba a-çucareira, cenoura, pepino, alface, ervilha, áster, begônia, crisântemo, delfí-nio, zínia e gramado (turfgrass).

23. Planta transgênica fértil, caracterizada pelo fato de que éproduzida através de regeneração da célula-hospedeira como definida nareivindicação 22.

24. Planta transgênica fértil de acordo com a reivindicação 23,caracterizada pelo fato de que é Coffea spp.

25. Método para modular o sabor ou aroma de grãos de café,caracterizado pelo fato de que compreende a modulação da produção deuma ou mais deidrinas ou proteínas LEA dentro das sementes de café.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pe-lo fato de que compreende o aumento da produção de uma ou mais deidri-nas ou proteínas LEA.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pe-Io fato de que compreende o aumento da expressão de um ou mais genesde codificação de deidrina ou proteína LEA endógenos dentro das sementesde café.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pe-lo fato de que compreende a introdução de um transgene codificando deidri-na ou proteína LEA na planta.

29. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pe-lo fato de que compreende a diminuição da produção de uma ou mais dei-drinas ou proteínas LEA.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pe-Io fato de que compreende a introdução de uma molécula de ácido nucleicono café que inibe a expressão de um ou mais genes de codificação de dei-drina ou proteína LEA.

31. Método para aumentar a resistência a estresse osmótico emuma planta, caracterizado pelo fato de que compreende aumento da produ-ção de uma ou mais deidrinas ou proteínas LEA dentro da planta.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pe-lo fato de que compreende a introdução de um transgene codificando deidri-na ou proteína LEA na planta.

33. Promotor isolado, caracterizado pelo fato de que é um genede planta de café que codifica uma deidrina.

34. Promotor de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o gene codifica uma deidrina tendo um peso molecular en-tre cerca de 17 kDa e cerca de 26 kDa.

35. Promotor de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que o gene codifica uma deidrina tendo uma seqüência de ami-noácido que é 50% ou mais idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOS: 7 a 11.

36. Promotor de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que o gene codifica uma deidrina tendo qualquer seqüência deamino ácido de qualquer uma das SEQ ID NOS: 7-11.

37. Promotor de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o gene compreende uma estrutura de leitura aberta que é 50% ou mais idêntica a qualquer uma das seqüências mostradas nas SEQID NOS: 1 a 5.

38. Promotor de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato de que o gene compreende uma estrutura de leitura aberta tendoqualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 5.

39. Promotor de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que compreende uma ou mais seqüências reguladoras selecio-nadas do grupo consistindo em uma TATA box, um elemento responsivo aácido abscísico, uma repetição RY (CATGCA(T/a)(A/g) de uma legumininabox para regulagem da expressão de proteínas tipo leguminina, pelo menosum motivo de seqüência de ação eis de elemento responsivo à desidrata-ção/repetição C (G/ACCGAC) e pelo menos um motivo E box (CANNTG).

40. Promotor de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que compreende a SEQ ID NO:13.

41. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreendeo promotor como definido na reivindicação 33 operavelmente ligado a umaou mais seqüências de codificação.

42. Vetor para transformação de uma célula, caracterizado pelofato de que compreende o gene quimérico como definido na reivindicação 41.

43. Célula transformada, caracterizada pelo fato de que é com ovetor como definido na reivindicação 42.

44. Célula transformada de acordo com a reivindicação 43, ca-racterizada pelo fato de que é uma célula de planta.

45. Célula de planta transformada de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que é uma célula de Coffea spp.

46. Planta transgênica fértil, caracterizada pelo fato de que éproduzida através de regeneração da célula de planta transformada comodefinida na reivindicação 44.

47. Planta transgênica fértil de acordo com a reivindicação 46,caracterizada pelo fato de que é Coffea spp.