CN116813736A - TaSPDT蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了TaSPDT蛋白及其编码基因与应用。本发明属于生物技术领域，具体涉及TaSPDT蛋白及其编码基因与应用。本发明的蛋白质是如下任一种的蛋白质：氨基酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的蛋白质；或将上述蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控小麦生长发育性能和种子磷积累量的蛋白质；或将上述蛋白质的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。通过调控目的植物中蛋白质TaSPDT的活性和/或含量，或/和蛋白质的编码基因的表达量，可以调控小麦生长发育性能和种子磷积累量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及TaSPDT蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
磷是植物生长发育必须的三大营养元素之一，但同时也是植物生长的主要限制因素，因为土壤内的磷易与铁、铝和钙等金属离子螯合成不溶物，难以被植物吸收。通常需要施用磷肥，来提高作物产量。然而由于Pi在土壤中的高固定率和低扩散率，需要过量施磷来满足作物生长需要，这与有限的磷矿存量产生了矛盾，也对环境造成了污染。
小麦是世界上三大粮食作物之一，需要施用大量的磷肥，其中用于小麦的磷肥达施磷总量的16.1％，然而磷肥的当季利用率很低，只能达到15-30％，过半被土壤固定为缓效态或无效态磷，这也导致了出现大量的耕地中总磷含量高，但有效磷含量较低的情况。大量的施用磷肥加速了磷矿石的消耗，引起水体富营养化，威胁着现代农业的可持续发展。
植株吸收的磷一部分积累在根、茎等器官中，一部分随着生殖生长的进行贮藏在种子中。小麦等作物中约30-60％的磷以植酸形式积累在种子的糊粉层和胚芽中。非反刍动物如人类、猪、家禽和鱼类不能合成植酸酶，植酸盐不能被消化吸收。大量未消化的植酸盐从畜禽粪便中排泄到环境中，会造成农业磷污染和水体富营养化。Akond等人发现大豆中植酸浓度与Fe、Mg、Ca等矿物质的生物利用度呈负相关。种子中过多的植酸积累导致谷物和豆类为主食的人群极易缺乏矿物质营养。同时植酸盐还能够与碱性氨基酸、种子中贮藏的蛋白和消化道中的酶形成复合物，降低氨基酸的可用性、蛋白质消化率和消化酶的活性。
因此，从优化植株中磷的分配角度出发，开展小麦等农作物地上部磷的转运和分配机制的研究，有望为提升磷的利用效率、减少资源投入、降低植酸等“抗营养物质”积累提供一定的理论指导。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控小麦生长发育性能和种子磷积累量。
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质可为如下任一种的蛋白质：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的蛋白质；
A2)氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的蛋白质；
A3)氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的蛋白质；
A4)将A1)、A2)或A3)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)、A2)或A3)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控小麦生长发育性能和种子磷积累的蛋白质；例如本领域技术人员可根据如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白突变体；
A5)在A1)、A2)、A3)或A4)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
上述A1)所述蛋白质的名称为TaSPDT。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质TaSPDT的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质TaSPDT的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质TaSPDT且具有蛋白质TaSPDT功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
上文中，所述蛋白质来源于小麦(Triticum aestivum L.)。
本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述中的任一种：
B1)编码前文所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
C1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；
C3)含有C2)所述编码基因的表达盒；
C4)含有C2)所述编码基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C2)所述编码基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；
C6)含有C2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C7)含有C2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；
C8)含有C2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下所示的基因：
E1)编码链的编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
E2)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
E3)编码链的编码序列是SEQ ID No.3的cDNA分子或DNA分子。
SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的DNA分子(调控小麦生长发育性能和种子磷积累量的基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的蛋白质TaSPDT。
SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为蛋白质TaSPDT编码基因(CDS)的核苷酸序列。
本发明所述的TaSPDT基因可以为任意能够编码蛋白质TaSPDT的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。
B1)所述核酸分子还可包括与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为载体pYPQ131D－TaU6和pYLCRISPR/Cas9。
可用现有的植物表达载体构建含有TaSPDT基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用TaSPDT基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的TaSPDT基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得植物生长发育性能和种子磷积累量改变改变的转基因细胞系及转基因植株。携带TaSPDT基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
所述中间载体具体可为pYPQ131D-gR1。
所述中间载体pYPQ131D-gR1是将pYPQ131D－TaU6载体的BglII和BsmBⅠ识别位点间的片段替换为Target1保持载体的其他序列不变，得到的中间载体具体可为YPQ131D-gR1。
其中合成Target1的引物序列如下：5’-CTTGACTACAGCCTCCGCCTCCTC--3’，5’-AAACGAGGAGGCGGAGGCTGTAGT-3’。
所述中间载体pYPQ131D-gR2是将pYPQ131D－TaU6载体的BglII和BsmBⅠ识别位点间的片段替换为Target2，保持载体的其他序列不变，得到的中间载体具体可为pYPQ131D-gR2。
其中合成Target2的引物序列如下：5’-CTTGGCCAACCTGCCGCCCATCAT-3’，5’-AAACATGATGGGCGGCAGGTTGGC-3’。
所述重组载体具体可为CRISPR重组表达载体，所述重组载体是将pYLCRISPR/Cas9载体的BsaI识别位点插入pYPQ131D-gR1和pYPQ131D-gR2上的两个表达盒TaU6-gR1和TaU6-gR2片段，保持pYLCRISPR/Cas9载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。
所述TaU6-gR1片段为SEQ ID No.12所示核苷酸序列，所述TaU6-gR2片段同TaU6-gR1，仅将363至383位替换为5’-GGCCAACCTGCCGCCCATCAT-3’即可。
所述重组微生物具体可为重组农杆菌EHA105。
所述重组农杆菌EHA105是将所述CRISPR重组表达载体导入根癌农杆菌EHA105得到的重组菌。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为根癌农杆菌EHA105。
本发明还提供了前文所述蛋白质TaSPDT或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一中的应用：
U1)所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物生长发育性能和种子磷积累量中的应用；
U2)所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物生长发育性能和种子磷积累量的产品中的应用；
U3)所述的蛋白或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育生长发育性能和种子磷积累量改变的植物中的应用；
U4)所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育生长发育性能和种子磷积累量改变的植物的产品中的应用；
U5)所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用。
本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质TaSPDT。
上述应用中，所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述中的任一种：
B1)编码前文所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
C1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；
C3)含有C2)所述编码基因的表达盒；
C4)含有C2)所述编码基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C2)所述编码基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；
C6)含有C2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C7)含有C2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；
C8)含有C2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
本发明还提供了一种调控植物生长发育性能和种子磷积累量的方法，包括调控目的植物中前文所述蛋白质的活性和/或含量，或/和所述蛋白质的编码基因的表达量，来调控植物生长发育性能和种子磷积累量。
上述方法中，所述调控目的植物中所述蛋白质TaSPDT的活性和/或含量，或/和所述蛋白质的编码基因的表达量包括向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因TaSPDT，使植物生长发育性能和种子磷积累量改变；所述TaSPDT编码基因编码所述蛋白质TaSPDT。
上述方法中，所述调控目的植物中所述蛋白质TaSPDT的活性和/或含量，或/和所述蛋白质的编码基因的表达量包括抑制或降低或沉默目的植物中前文所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，使植物生长发育性能和种子磷积累量降低。
所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，等等导入。
上述应用及方法中，所述调控可为提高、增强或上调。
上述应用及方法中，所述调控可为抑制、降低或沉默。
为了便于对转基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色反应的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。上述方法得到的植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明还提供了一种培育生长发育性能和种子磷积累量改变的植物的方法，包括：1)提高、增强和/或上调增加目的植物中前文所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和提高、增强和/或上调前文所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到生长发育性能和种子磷积累量提高的植物；
2)抑制或降低或沉默目的植物中前文所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到生长发育性能和种子磷积累量降低的植物。
作为本发明的一种实施方案，所述培育生长发育性能和种子磷积累量改变的植物的方法包括如下步骤：
(1)构建含有如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的sgRNA1和sgRNA2编码序列的表达载体；
(2)将步骤(1)构建的表达载体导入植物中；
(3)经筛选和鉴定获得生长发育性能和种子磷积累量降低的植物。
在一个具体的实施例中，培育调控生长发育性能和种子磷积累量降低的植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中的编码TaSPDT蛋白的核酸分子表达，得到生长发育性能和种子磷积累量降低的转基因植物。
所述抑制目的植物中的编码TaSPDT蛋白的核酸分子表达具体可通过向目的植物中导入以编码TaSPDT蛋白的核酸分子为靶标的敲除载体实现。所述抑制目的植物中的编码TaSPDT蛋白的核酸分子表达具体可通过向目的植物中导入以编码TaSPDT蛋白的核酸分子为靶标的基因编辑载体实现。具体的，所述基因编辑载体为基于Cas9基因编辑技术的载体。具体的，所述基因编辑载体表达sgRNA和Cas9蛋白。所述sgRNA以编码TaSPDT蛋白的核酸分子为靶标。具体的，所述sgRNA的靶标为：
Target1:5’-ACTACAGCCTCCGCCTCCTC-3’
Target2:5’-GCCAACCTGCCGCCCATCAT-3’
本发明还提供了一种培育生长发育性能和种子磷积累量提高的植物的方法，包括如下步骤：增加植物中TaSPDT蛋白的含量，得到生长发育性能和种子磷积累量提高的植物。
本发明中，所述植物育种的目的包括培育生长发育性能和种子磷积累量提高的植物。
本发明中，所述生长发育性能可为如下任一种：
M1)苗期小麦根长；
M2)苗期小麦根的直径；
M3)成熟期小麦秸秆干重；
M4)成熟期小麦种子干重；
M5)成熟期小麦穗数。
上述应用或方法中，所述植物是如下中的任一种：
C1)单子叶植物；
C2)禾本目植物；
C3)禾本科植物；
C4)小麦属植物；
C5)小麦。
本发明的TaSPDT蛋白可介导磷向种子中的分配，通过提供了一种调控小麦种子中磷积累量的方法，有望为提升磷的利用效率、减少资源投入、降低植酸等“抗营养物质”积累提供一定的理论指导。
附图说明
图1为TaSPDT在不同pH值下对Pi转运活性。数值为生物学重复平均值±标准差(n＝4)。
图2为TaSPDT的时空表达模式。苗期、扬花期和灌浆期小麦分别在0.2mM和0.02mMPi浓度培养时，各器官的TaSPDT基因相对表达量。
图3为TaSPDT在节点中定位的组织特异性。对小麦节点I(A-E)和基部节点(F-H)进行TaSPDT抗体(红色)和DAPI(蓝色)的免疫共染色。A为节点I横切免疫染色结果图；B为图A中虚线框放大图；C、D为图B中虚线框放大图；E为节点I不加一抗的阴性对照局部图；F为基部节点横切面；G为图F中虚线框放大图；H为基部节点不加一抗的阴性对照局部图。DVB：分散维管束、PDV：分散维管束韧皮部、XDV：分散维管束木质部；EVB：膨大维管束、PEV：膨大维管束韧皮部、XEV：膨大维管束木质部；RVB：常规维管束、PCB：薄壁细胞桥、BS：维管束鞘细胞、XPC：木质部实质细胞、XTC：木质部转移细胞。比例尺＝100m。
图4为TaSPDT:GFP载体构建示意图以及TaSPDT亚细胞定位结果。A为TaSPDT:GFP载体构建示意图；B为节点I横切免疫染色结果图局部图；C为TaSPDT在小麦原生质体中的定位。GFP发射绿色荧光；Auto-fluorescence叶绿体自发荧光，用紫红色标示。比例尺＝5μm。
图5为TaSPDT基因结构及靶点位置图。
图6为转基因小麦Bar试纸条检测。
图7为TaSPDT基因编辑小麦萌发和苗期根形态。A中比例尺＝1cm；B为第5d时小麦发芽率，数值为生物学重复平均值±标准差(n＝10)；C-F为10d龄小麦幼苗根系表型数据，数值为生物学重复平均值±标准差(n＝4)。
图8为TaSPDT基因编辑小麦成熟期表型。A为成熟期小麦穗和地上部照片，比例尺＝2cm；B-F分别为成熟期小麦株高、秸秆干重、种子干重、单株穗数和单株平均穗粒数，数值为生物学重复平均值±标准差(n＝4)。
图9为TaSPDT基因编辑小麦中磷浓度与分布。A为小麦地上部不同器官的总磷浓度；B为小麦地上部不同器官的干重；C为小麦地上部不同器官的磷分布比例；D为种子中植酸浓度。图中数值为生物学重复平均值±标准差(n＝4)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例中的pxβg-ev1质粒由日本冈山大学Maki Katsuhara教授提供，已记载于：Ma JF,Tamai K,Yamaji N,et al.A silicon transporter in rice.Nature.2006；440(7084):688-691.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pYPQ131D－TaU6已记载于：Zhang S,Zhang R,Song G,etal.Targeted mutagenesis using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas9 system in common wheat.BMC Plant Biol.2018；18(1):302.Published 2018 Nov26.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pTF486载体由西北农林科技大学宫海军教授提供，记载于Sun H,Duan Y,Mitani-Ueno N,et al.Tomato roots have a functional silicon influxtransporter but not a functional silicon efflux transporter.Plant CellEnviron.2020；43(3):732-744.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的野生型小麦品种Fielder已记载于：Sato K,Abe F,Mascher M,etal.Chromosome-scale genome assembly of the transformation-amenable commonwheat cultivar'Fielder'.DNA Res.2021；28(3):dsab008.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例采用IBM SPSS Statistics 26统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用LSD法(α＝0.05)进行显著性差异分析，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
实施例1、TaSPDT蛋白及其编码基因的获得
从小麦中分离克隆出一个编码TaSPDT蛋白(小麦类硫转运体负责磷酸盐转运的蛋白)的基因，具体步骤如下：以小麦品种郑麦7698(Triticum aestivum L.cv.Zhengmai7698)cDNA为模板，利用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara，日本)扩增TaSPDT编码区，引物为TaSPDT-F：5’-ACTCTCTGCTTTAGCCGTCG-3’；TaSPDT-R：5’-AGATCAGCACCGCCGTTATT-3’，PCR扩增程序如下：预变性过程温度设置为95℃，时间为3min；变性过程温度设置为95℃，时间为15sec；退火温度设置为60℃，时间为15sec；延伸温度设置为72℃，时间为30sec，共30个循环，最后72℃延伸5min。电泳分离PCR产物，对目的条带进行切胶回收，切胶回收PCR产物，利用2×Rapid Taq Master Mix(vazyme，中国)对PCR产物3’末端进行加A，回收TaSPDT片段。
小麦的基因组DNA中的TaSPDT-4A基因如序列表的SEQ ID No.7所示，TaSPDT-4A基因的编码序列如序列表的SEQ ID No.1所示，编码氨基酸序列如序列表的SEQ ID No.4所示的蛋白质TaSPDT-4A。基因组DNA中的TaSPDT-7A基因如序列表的SEQ ID No.8所示，TaSPDT-7A基因的编码序列如序列表的SEQ ID No.2所示，编码氨基酸序列如序列表的SEQ ID No.5所示的蛋白质TaSPDT-7A。基因组DNA中的TaSPDT-7D基因如序列表的SEQ ID No.9所示，TaSPDT-7D基因的编码序列如序列表的SEQ ID No.3所示，编码氨基酸序列如序列表的SEQID No.6所示的蛋白质TaSPDT-7D。
2、TaSPDT蛋白功能验证
1)TaSPDT蛋白转运活性分析
为了探究小麦中SPDT蛋白对磷的转运活性和转运特点，本研究利用爪蟾卵母细胞(购自爪蟾资源中心(杭州))作为异源表达系统，向卵母细胞中注射TaSPDT的cRNA，检测了不同pH值环境下该蛋白对磷的转运活性。具体实验步骤如下：
将步骤1中获得的TaSPDT-7A片段用T4连接酶连接到线性化的pGEM-T Easy载体系统(Promega，美国)，连接产物经冻融法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。对过夜培养后出现的菌落进行PCR验证，选取扩增出正确目的条带的单克隆过夜摇菌，提取质粒，利用内切酶BamH I(New England Biolab，美国)进行酶切验证，将酶切结果正确后的质粒进行测序。用限制性内切酶酶切正确连接的质粒，将酶切产物跑胶分离，切胶回收目的片段TaSPDT。
将载体pxβg-ev1用限制性内切酶Bgl II(New England Biolab，美国)线性化，用酒精沉淀的方法进行回收。
将回收得到的TaSPDT片段与线性化的pxβg-ev1载体检测浓度后，利用T4连接酶(NEB，美国)进行连接转化，提取质粒酶切验证，得到含有正确的重组质粒pxβg-ev1-TaSPDT单克隆，摇菌提取质粒备用。
重组质粒pxβg-ev1-TaSPDT的结构描述如下：将pxβg-ev1载体的Bgl II酶切识别位点之间的小片段替换成核苷酸序列包含TaSPDT的编码序列，且保持pxβg-ev1载体的其他序列不变得到的重组表达载体。
重组质粒用限制性内切酶Xba I(New England Biolab，美国)进行线性化，利用试剂盒 System—T3和Ribo m7G Cap Analog(Promega，美国)进行TaSPDT的cRNA的制备与纯化回收。利用显微操作系统(Eppendorf，德国)向卵母细胞注射TaSPDT的cRNA，将注射TaSPDT的cRNA或RNase-free ddH2O的蛙卵18℃孵育24h后，置于pH为7.5或5.5的含32P的MBS溶液中30min。通过32P同位素吸收试验测定在蛙卵中表达的TaSPDT基因的磷转运活性。
结果发现，在外部溶液pH值为5.5，即卵母细胞内外存在质子梯度时，TaSPDT蛋白显示出了对磷的转运活性，而在pH 7.5时，转运活性消失(图1)。这些结果表明小麦中TaSPDT是一个H+/Pi同向转运体。
2)TaSPDT基因表达模式分析
为了研究TaSPDT的表达模式，本研究利用qPCR检测了小麦在不同生长阶段各组织器官TaSPDT的表达水平。
将12天龄的小麦幼苗分别转入含有200μM P(CT)和20μM P(LP)的小麦水培营养液中，培养7d后分别对叶片、茎基部和根进行取样。挑选生长状况良好、生长状态一致的抽穗期盆栽小麦，冲洗干净根系，转入200μM P营养液中培养3d，然后分别用200μM P营养液和20μM P营养液培养，至扬花期和灌浆期对不同器官分别进行取样。
利用Plant RNA Kit R6827(Omega Biotek，美国)提取植物样品RNA，并利用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(Vazyme，中国)完成cDNA的制备，产物保存于-80℃冰箱。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，中国)进行qRT-PCR。小麦TEF-1和cyclin-T1-3用作内参基因。利用2-ΔΔCt计算TaSPDT的相对表达量。
所用引物如下：
SPDT-q-F：5’-GGGCATCTCGCTGTTCAAGA-3’；SPDT-q-R：5’-TCCACCAGGTAGGTGGAGTT-3’。
TEF-q-F：5’-CAGATTGGCAACGGCTACG-3’；TEF-q-R：5’-CGGACAGCAAAACGACCAAG-3’。
cyclin-q-F：5’-CGGACAGCAAAACGACCAAG-3’；cyclin-q-R：5’-CGGACAGCAAAACGACCAAG-3’。
结果显示，在营养生长时期，TaSPDT基因相对表达量整体较低，其中茎基部表达量最高，是地下部和地上部的6倍以上；在生殖生长时期，TaSPDT基因节点处表达量较高，且在低磷诱导下表达量显著上调。其中，在低磷条件下，扬花期小麦TaSPDT基因在基部节点表达量最高，花轴和小穗处表达量其次；灌浆期小麦TaSPDT基因在基部节点表达量下降，节点I处表达量显著提高，达到整个生育期的最高值，低磷环境下相较对照表达量提高63.6％(图2)。
由步骤2)中TaSPDT在小麦不同生育期的组织表达分析可知该基因在节点处表达量最高，本研究取基部节点和节点I，利用TaSPDT抗体进行免疫荧光染色，探究了TaSPDT的组织定位。
免疫荧光染色具体步骤如下：抗原多肽的制备和兔源抗体的制备由金斯瑞生物科技股份有限公司完成。用锋利刀片切取灌浆期小麦节点Ⅰ，浸泡于固定液[4％(W/V)的多聚甲醛、60mM蔗糖和50mM二甲胂酸(pH 7.4)]中，室温固定2h。用含有60mM蔗糖和50mM二甲胂酸的溶液(pH 7.4)洗涤三次后，用石蜡进行包埋，然后用切片机进行切片。
将切片放入二甲苯浸泡15min，更换二甲苯，然后依次在100％、100％、85％、75％乙醇中浸泡5min，最后用ddH2O冲洗。用免疫组化笔圈出组织所在位置，滴加入胃蛋白酶抗原修复液，将玻片放入湿盒中置于37℃保温箱中孵育30min。将玻片放入PBS(pH 7.4)中，在脱色摇床上晃动洗涤5分钟，重复3次。
轻轻甩干PBS溶液，滴加3％ BSA，封闭30min。小心甩掉封闭液，在切片上滴加一抗，然后将切片平放在湿盒里，置于4℃冰箱过夜孵育。然后将玻片放入PBS(pH 7.4)中，在脱色摇床上摇动5min，重复3次。轻轻甩干后滴加二抗，室温避光孵育50min。同上用PBS洗涤3次，轻轻甩干切片滴加DAPI染液，室温避光孵育10min。同上用PBS洗涤3次，轻轻甩干后滴加自发荧光淬灭剂，反应5min，流水冲洗10min。轻轻甩干切片，用抗荧光淬灭封片剂封片。
将切片放于荧光显微镜(NIKON，日本)下观察并采集图像。DAPI激发/发射波长330-380/420nm，发蓝光；CY3激发/发射波长510-560/590nm，发红光。
结果发现TaSPDT定位在节点I的膨大维管束和分散维管束以及它们之间的薄壁细胞桥上(图3中A-D)。TaSPDT在基部节点的分布与在节点I上相似，定位于膨大维管束和常规维管束及其之间的薄壁细胞桥上(图3中E、F和G)。
4)TaSPDT蛋白亚细胞定位
TaSPDT蛋白具有典型的跨膜蛋白特征，可能定位于细胞质膜上。本研究构建了TaSPDT蛋白C端融合绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的重组载体(图4中A)，利用PEG介导法导入小麦原生质体，通过对原生质体中绿色荧光信号的观察，研究了TaSPDT的亚细胞定位分布。
具体实验步骤如下：
根据得到的TaSPDT-7A序列和pTF486载体设计引物，引入Sal I和BamH I酶切位点。以小麦cDNA为模板，利用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara，日本)扩增TaSPDT-7A编码区，对扩增产物进行切胶回收。将pTF486同时用限制性内切酶Sal I和BamH I(New EnglandBiolab，美国)酶切。用酒精沉淀回收线性化的pTF486载体。将回收的TaSPDT-7A片段和线性化的载体pTF486用 Snap Assembly Master Mix(Takara，日本)进行连接。通过冻融法将连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化后的单克隆利用PCR、酶切和测序进行检测，成功获得重组载体pTF486-TaSPDT-7A，将检测正确的单克隆提取质粒备用。
重组载体pTF486-TaSPDT-7A是将pTF486载体的Sal I和BamH I酶切识别位点之间的小片段替换成TaSPDT-7A的编码序列SEQ ID No.2，且保持pTF486载体的其他序列不变得到的重组表达载体。
使用小麦原生质体的制备与转化试剂盒(Coolaber，中国)提取小麦叶片原生质体，并利用PEG介导法将重组载体转入小麦原生质体中进行蛋白表达。28℃孵育16h后。用共聚焦显微镜(Zeiss，德国)观察并拍照，使用的GFP荧光信号激发光/发射光波长分别为488nm/495-556nm，叶绿体自发荧光激发光/发射光波长分别为488nm/637-758nm，通过荧光定位确定蛋白的亚细胞定位。
结果在转入TaSPDT:GFP重组载体的原生质体细胞质膜上观察到明显的绿色荧光，而转入空载体的原生质体荧光满布整个胞质(图4中C)。同时，免疫荧光结果同样可以发现，红色荧光分布于细胞壁内侧一圈(图4中B)，这些结果共同表明小麦中TaSPDT定位于小麦细胞质膜上。
实施例2、基因编辑小麦的创制与鉴定
利用Crisper-cas9系统创制TaSPDT基因编辑的小麦，所用小麦品种为Fileder，基因编辑载体构建和遗传转化具体实验步骤如下：
根据TaSPDT基因在4A、7A、7D染色体上的保守序列，共设计了两个靶点Target 1、Target2，分别位于第一和第二个外显子(图5)。靶点序列为：
Target1:5’-ACTACAGCCTCCGCCTCCTC-3’
Target2:5’-GCCAACCTGCCGCCCATCAT-3’
合成Target1和Target2，其中Target1的引物序列如下：5’-CTTGACTACAGCCTCCGCCTCCTC-3’，5’-AAACGAGGAGGCGGAGGCTGTAGT-3’；Target2的引物序列如下5’-CTTGGCCAACCTGCCGCCCATCAT-3’，5’-AAACATGATGGGCGGCAGGTTGGC-3’，引物磷酸化退火形成双链sgRNA1和sgRNA2。
首先将pYPQ131D－TaU6载体的BglII和BsmBⅠ识别位点间的片段替换为sgRNA1和sgRNA2。然后扩增pYQ131D-gR1和pYPQ131D-gR2上的两个表达盒TaU6-gR1和TaU6-gR2片段。表达盒TaU6-gR1片段的核苷酸序列为序列表中序列12，TaU6-gR2片段同TaU6-gR1，仅将序列表中序列12的第363至383位替换为5’-GGCCAACCTGCCGCCCATCAT-3’即可。
最后将pYLCRISPR/Cas9载体的BsaI识别位点插入两个表达盒TaU6-gR1和TaU6-gR2片段，保持pYLCRISPR/Cas9载体的其他序列不变，得到CRISPR/Cas9基因编辑载体。
转基因阳性植株的鉴定利用Gene TrueTM BAR Test Kit(Artron，加拿大)完成。转化的幼胚经过抗性筛选，诱导培育，共获得24株T0代转基因植株。将这24株小麦用Bar试纸检测(Artron，加拿大)，发现除10和13外的22株小麦全部显示阳性(图6)。
利用CTAB法分别提取T0代22棵阳性植株基因组DNA。取0.2g两叶一心期的新鲜小麦叶片于2mL灭菌离心管中，快速加入液氮充分研磨为粉末状。加入700μL提前预热好的CTAB溶液，上下颠倒混匀后于65℃水浴锅水浴1h，期间每10-14min颠倒混匀一次。每个离心管加700μL氯仿-异戊醇(24:1)，室温下于摇床上摇20min，转速50转/min。12000rpm，室温离心8min，移液枪吸取500μL上清液于1.5mL离心管中。上述离心管内加入1000μL冰无水乙醇，-20℃放置30min。8000rpm，室温离心10min，弃掉上清液。离心管内加入200μL 75％乙醇，冲洗两次，吹风吹干。最后加入50μL含RNase的TE Buffer，4℃放置24h,之后于-20℃保存。
以提取的DNA为模板，用高保真酶PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara，日本)，利用如下引物：Hi-Tom-F：5’-GGAGTGAGTACGGTGTGCGCTGCAGTACTTCTTCCCCA-3’；Hi-Tom-R：5’-GAGTTGGATGCTGGATGGTTATGGAGCAGAGGCGTG-3’，扩增靶点位置序列。取4μL PCR产物跑胶验证扩增结果，剩余反应液送至Hi-Tom平台进行测序。
结果表明，Target 2处未发生编辑，而在Target 1处有15株发生了编辑，突变类型共15种，包括单碱基插入和不同数目的碱基删除。其中7株在4A、7A和7D上的同源基因上同时发生了双等位突变(表1)。
taspdt-6与野生型WT相比，对于4A染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生一个碱基“A”(对应于SEQ ID No.1的第319-320位之间，SEQ IDNo.7的第433-434位之间)的插入，另一条染色体中的TaSPDT基因发生2个碱基“5’-CA-3’”(对应于SEQ ID No.1的第321-322位，SEQ ID No.7的第435-436位)的缺失；对于7A染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生2个碱基“5’-CA-3’”(对应于SEQ ID No.2的第318-319位，SEQ ID No.8的第445-446位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生3个碱基“5’-AGC-3’”(对应于SEQ ID No.2的第319-321位，SEQ IDNo.8的第446-448位)的缺失；对于7D染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生5个碱基“5’-ACAGC-3’”(对应于SEQ ID No.3的第320-324位，SEQ IDNo.9的第528-532位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生2个碱基“5’-CA-3’”(对应于SEQ ID No.3的第321-322位，SEQ ID No.9的第529-530位)的缺失。
taspdt-7与野生型WT相比，对于4A染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生4个碱基“5’-ACAG-3’”(对应于SEQ ID No.1的第320-323位，SEQ ID No.7的第434-437位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生3个碱基“5’-ACA-3’”(对应于SEQ ID No.1的第320-322位，SEQ ID No.7的第434-436位)的缺失；对于7A染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生2个碱基“5’-CA-3’”(对应于SEQ ID No.2的第318-319位，SEQ ID No.8的第445-446位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生3个碱基“5’-TAC-3’”(对应于SEQ ID No.2的第316-318位，SEQ IDNo.8的第443-445位)的缺失；对于7D染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生一个碱基“A”(对应于SEQ ID No.3的第319-320位之间，SEQ ID No.9的第527-528位之间)的插入，另一条染色体中的TaSPDT基因发生3个碱基“5’-ACA-3’”(对应于SEQ ID No.3的第320-322位，SEQ ID No.9的第528-530位)的缺失。
taspdt-11与野生型WT相比，对于4A染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生4个碱基“5’-ACAG-3’”(对应于SEQ ID No.1的第320-323位，SEQ ID No.7的第434-437位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生1个碱基“T”(对应于SEQ ID No.1的第319-320位之间，SEQ ID No.7的第433-434位之间)的插入；对于7A染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生3个碱基“5’-ACA-3’”(对应于SEQ ID No.2的第317-319位，SEQ ID No.8的第444-446位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生1个碱基“A”(对应于SEQ ID No.2的第316-317位之间，SEQ ID No.8的第443-444位之间)的插入；对于7D染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生3个碱基“5’-ACA-3’”(对应于SEQ ID No.3的第320-322位，SEQ IDNo.9的第528-530位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生2个碱基“5’-CA-3’”(对应于SEQ ID No.3的第321-322位，SEQ ID No.9的第529-530位)的缺失。
taspdt-14与野生型WT相比，对于4A染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生1个碱基“A”(对应于SEQ ID No.1的第319-320位之间，SEQID No.7的第433-434位之间)的插入，另一条染色体中的TaSPDT基因发生1个碱基“T”(对应于SEQ ID No.1的第319-320位之间，SEQ ID No.7的第433-434位之间)的插入；对于7A染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生3个碱基“5’-ACA-3’”(对应于SEQ ID No.2的第317-319位，SEQ ID No.8的第444-446位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生2个碱基“5’-CA-3’”(对应于SEQ ID No.2的第318-319位，SEQ IDNo.8的第445-446位)的删除；对于7D染色体上的TaSPDT基因都发生1个碱基“A”(对应于SEQID No.3的第319-320位之间，SEQ ID No.9的第527-528位之间)的插入。
taspdt-16与野生型WT相比，对于4A染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生1个碱基“A”(对应于SEQ ID No.1的第320位，SEQ ID No.7的第434位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生1个碱基“C”(对应于SEQ ID No.1的第321位，SEQ ID No.7的第435位)的缺失；对于7A染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生3个碱基“5’-ACA-3’”(对应于SEQ ID No.2的第317-319位，SEQ ID No.8的第444-446位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生4个碱基“5’-ACAG-3’”(对应于SEQ ID No.2的第317-320位，SEQ ID No.8的第444-447位)的缺失；对于7D染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生4个碱基“5’-ACAG-3’”(对应于SEQ ID No.3的第320-323位，SEQ ID No.9的第528-531位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生3个碱基“5’-ACA-3’”(对应于SEQ ID No.3的第320-322位，SEQ ID No.9的第528-530位)的缺失。
taspdt-21与野生型WT相比，对于4A染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生1个碱基“A”(对应于SEQ ID No.1的第319-320位之间，SEQID No.7的第433-434位之间)的插入，另一条染色体中的TaSPDT基因发生1个碱基“T”(对应于SEQ ID No.1的第319-320位之间，SEQ ID No.7的第433-434位之间)的插入；对于7A染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生24个碱基“5’-CTTCCAGTGGGGCTCCAACTACAG-3’”(对应于SEQ ID No.2的第296-320位，SEQ ID No.8的第423-447位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生2个碱基“5’-CA-3’”(对应于SEQ IDNo.2的第318-319位，SEQ ID No.8的第445-446位)的缺失；对于7D染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生3个碱基“5’-AGC-3’”(对应于SEQ IDNo.3的第322-324位，SEQ ID No.9的第530-522位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生3个碱基“5’-ACA-3’”(对应于SEQ ID No.3的第320-322位，SEQ ID No.9的第528-530位)的缺失。
taspdt-24与野生型WT相比，对于4A染色体上的TaSPDT基因都发生了2个碱基“5’-CA-3’”(对应于SEQ ID No.1的第321-322位，SEQ ID No.7的第435-436位)的删除；对于7A染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生4个碱基“5’-ACAG-3’”(对应于SEQ ID No.2的第317-320位，SEQ ID No.8的第444-447位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生1个碱基“A”(对应于SEQ ID No.2的第316-317位之间，SEQID No.8的第443-444位之间)的插入；对于7D染色体上的TaSPDT基因，发生了如下突变：一条染色体中的TaSPDT基因发生3个碱基“5’-ACA-3’”(对应于SEQ ID No.3的第320-322位，SEQ ID No.9的第528-530位)的缺失，另一条染色体中的TaSPDT基因发生1个碱基“T”(对应于SEQ ID No.3的第319-320位之间，SEQ ID No.9的第527-528位之间)的插入。
表1纯合突变株系基因编辑情况
PAM识别位点用虚线下划线标示，靶点位置用实线下划线标示，碱基插入用小写字母标示，碱基删除用红色“·”代替。
实施例3、TaSPDT基因编辑对小麦发芽率和苗期根系发育的影响
以实施例2中获得的突变体小麦taspdt-16与taspdt-21的T1代植株为研究对象，taspdt-16突变体小麦与野生型WT相比，4A两条染色体上的TaSPDT基因均发生碱基C(对应于SEQ ID No.1的第321位，SEQ ID No.7的第435位)的缺失，7A和7D染色体上TaSPDT基因碱基ACA(对应于SEQ ID No.2的第317-319位，SEQ ID No.8的第444-446位)缺失；taspdt-21突变体小麦与野生型WT相比，4A两条染色体上的TaSPDT基因均插入了碱基A(对应于SEQ IDNo.1的第319-320位之间，SEQ ID No.7的第433-434位之间)，7AD染色体上TaSPDT基因发生碱基CA(对应于SEQ ID No.2的第318-319位，SEQ ID No.8的第445-446位)的缺失，7DD染色体上TaSPDT基因发生碱基ACA(对应于SEQ ID No.3的第320-322位，SEQ ID No.9的第528-530位)的缺失；野生型小麦品种Fielder作为对照(简称WT)，探究TaSPDT基因编辑对小麦生长发育和种子中磷积累的影响。
1、种子发芽率测定及苗期生长监测
将小麦植株taspdt-16、taspdt-21和野生型小麦品种Fielder的种子用去离子水冲洗3遍，55℃水浴15min消毒后，置于用水润湿的纱布上于28℃黑暗条件下进行萌发。在第5d，测定发芽率。将发芽的种子放于漂浮在0.5mM CaCl2(pH 5.6)的网上继续培养，在第10d利用根系扫描仪RHIZO 2020a Operator根系分析系统统计根系表型。
本研究记录了TaSPDT基因编辑植株第5d时小麦发芽率，并用根系扫描仪观测了10天龄小麦幼苗根系形态(图7中A-F)。研究发现：TaSPDT敲除对小麦发芽率没有影响，但影响了苗期根系的发育。与野生型相比，TaSPDT敲除导致小麦根长降低了14-31％，侧根数目也有所下降，但差异不显著，同时根的直径显著加粗了16到25％，TaSPDT基因编辑小麦与野生型相比，表面积和根系体积没有显著差异。
2、TaSPDT基因编辑对小麦成熟期表型的影响
通过盆栽实验探究TaSPDT基因编辑小麦成熟期生物量等表型指标。将萌发的小麦植株taspdt-16、taspdt-21和野生型小麦品种Fielder种子转移至22.5cm*18.5cm*20.5cm的花盆中，每盆5株，栽培基质为品氏基质(Pindstrup，丹麦)和蛭石1∶1(v/v)混合物。培养至成熟期后，收取地上部，拍照记录形态特征，利用ImagJ 1.53t软件测量株高。对穗数和穗粒数进行统计后，将种子和秸秆分开。秸秆置于烘箱调至105℃杀青30min后，80℃烘至恒质量，种子在40℃烘干3d，称量并记录单株秸秆和种子干重。
通过对TaSPDT基因编辑对成熟期小麦表型的影响研究发现：TaSPDT基因编辑对小麦株高(图8中A和B)和穗粒数没有显著影响，但与野生型相比，秸秆干重降低了约30％，种子干重降低了33-50％，穗数也降低了35％左右(图8中C-F)。
3、各部分总磷含量的测定
总磷利用钼锑抗比色法测定。将小麦植株taspdt-16、taspdt-21和野生型小麦品种Fielder地上部分为种子、颖壳、穗轴和花梗、旗叶、节点I、其他部分等六部分，磨成粉末，取约0.05g，置于消煮管中。然后加入1mL H2O，再加入5mL浓H2SO4轻轻摇匀，静置8h以上。在消煮管的瓶口放一个小漏斗，在电炉上消煮，280℃，30min。当加热至消煮管内有大量白烟冒出时取下，加入约10滴H2O2，摇匀。加热至微沸，5-10min，取下。稍冷后重复加H2O2 5-10滴，继续消煮。如此重复2-3次，每次添加的H2O2应逐次减少。消煮到溶液呈无色或清亮后，再加热约5-10min，以除尽剩余的H2O2，关闭电炉，让其自然冷却30min后，取下，继续冷却。用少量水冲洗漏斗，洗液流入消煮管，继续加水定容至100mL，摇匀，冷却至室温，供磷的测定。吸取消煮液4mL注入50mL容量瓶中(根据样品浓度调整反应液数量)，加水至约30mL。加二硝基酚指示剂2滴，滴加4N NaOH溶液直至溶液变为黄色。再加2N H2SO4数滴，使溶液的黄色刚好褪去。然后加入钼锑抗试剂5mL，加水定容至50mL。摇匀，30min后，用酶标仪用820nm波长进行比色测定。
4、种子中植酸含量的测定
种子中植酸含量利用分光光度法测定，将30mg小麦taspdt-16、taspdt-21和野生型小麦Fielder种子全粉置于1.5mL离心管中，加入0.4mol/L HCl 1mL和15％的TCA提取液，室温下振荡3h，再以2 000×g离心10min，然后取50μL上清液，置于1.5mL离心管中(内装36.3mmol/L NaOH 550μL)，加入200μL显色液(含0.03％氯化铁，0.3％磺基水杨酸)，反应后取200μL溶液，用酶标仪在500nm下读数，测定植酸含量。
通过检测转基因植株各部分总磷和种子中植酸的水平发现(图9中A-C)：TaSPDT基因编辑小麦节点I以下部分干重没有显著变化，与野生型植株相比，磷浓度升高了约30％，磷分布占比约达到整株小麦磷含量的40％，比野生型相同部位高了60％。与野生型相比，TaSPDT基因编辑小麦节点I、穗轴和花梗、颖壳等虽干重整体下降，但总磷浓度和分布占比没有显著变化。与野生型相比，TaSPDT基因编辑小麦种子中总磷浓度下降超过12％，占比下降了22-36％，植酸浓度同样显著下降(图9中D)。说明TaSPDT基因编辑后，植株通过节点I向种子中转运磷的水平有所减少，TaSPDT可能参与了磷向种子的分配。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.蛋白质，所述蛋白质是如下任一种的蛋白质：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的蛋白质；
A2)氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的蛋白质；
A3)氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的蛋白质；
A4)将A1)、A2)或A3)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)、A2)或A3)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控小麦生长发育性能和种子磷积累量的蛋白质；
A5)在A1)、A2)、A3)或A4)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质来源于小麦。
3.与权利要求1或2所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
C1)抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；
C3)含有C2)所述编码基因的表达盒；
C4)含有C2)所述编码基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C2)所述编码基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；
C6)含有C2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C7)含有C2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；
C8)含有C2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下E1)、E2)或E2)所示的基因：
E1)编码链的编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
E2)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
E3)编码链的编码序列是SEQ ID No.3的cDNA分子或DNA分子。
5.应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：
U1)权利要求1或2所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控小麦生长发育性能和种子磷积累量中的应用；
U2)权利要求1或2所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控小麦生长发育性能和种子磷积累量的产品中的应用；
U3)权利要求1或2所述的蛋白或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育生长发育性能和种子磷积累量改变的植物中的应用；
U4)权利要求1或2所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育生长发育性能和种子磷积累量改变的植物的产品中的应用；
U5)权利要求1或2所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
7.一种调控小麦生长发育和种子磷积累量的方法，其特征在于：包括调控目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量，或/和，权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，来调控小麦生长发育性能和种子磷积累量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述调控目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量，或/和，权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量包括向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到小麦生长发育性能和种子磷积累量高于所述受体植物的目的植物；所述编码基因编码权利要求1或2中所述蛋白质。
9.培育生长发育和种子磷积累量改变的植物的方法，包括：1)提高、增强和/或上调增加目的植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和提高、增强和/或上调权利要求1中所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到生长发育性能提高和种子磷积累量提高的植物；
2)抑制或降低或沉默目的植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和抑制或降低或沉默权利要求1中所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到生长发育性能降低和种子磷积累量降低的植物。
10.根据权利要求5或6所述的应用、权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物是如下中的任一种：C1)单子叶植物；
C2)禾本目植物；
C3)禾本科植物；
C4)小麦属植物；
C5)小麦。
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