CN110106174A - 一种大豆叶特异启动子GmGLP3（Glyma16g00980）及其分离方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大豆叶特异启动子GmGLP3(Glyma16g00980)，具有SEQ ID NO 1所示的多核苷酸序列，大豆基因GmGLP3能够在大豆叶中特异高表达，在别的组织部位几乎不表达，大豆叶特异启动子GmGLP3在预防病虫害侵染大豆叶部中的应用。本发明提供的大豆叶特异启动子GmGLP3可以在拟南芥叶中高效表达，在别的组织中几乎不表达；本发明提供的大豆叶特异启动子GmGLP3在大豆根中不表达；本发明提供的大豆叶特异启动子GmGLP3可以驱动抗病基因在模式植物拟南芥叶中高效表达，减少转基因对植株可食用部分的影响。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大豆叶特异启动子 GmGLP3及其分离方法和应用。
背景技术
大豆作为重要的粮食作物，已有五千年栽培历史，广泛栽培于世界各地。大豆种子含有丰富的植物蛋白质、脂肪和多种营养元素，常用来做各种豆制品，豆油，酿造酱油等。大豆的生长环境比较恶劣，常常会遭受严重的外界病原微生物，害虫，营养缺乏和其他非生物胁迫，使其正常生长发育严重受到影响，甚至死亡，导致产量下降，品质恶化。例如，大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus，SMV)病严重影响大豆的产量和种子的品质，在自然条件下每年可导致我国大豆 8-50％的产量损失。然而，目前尚没有开发出有效且经济的方法来应对这些疾病，并且不同的病虫害会侵害大豆的不同组织，组成型启动子会使毒性蛋白在可食用也有部分表达。
发明内容
为了更有针对性地应对病虫害，需要在侵入组织表达目的基因，本发明的目的是提供一种大豆叶特异启动子GmGLP3及其分离方法和应用。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种大豆叶特异启动子GmGLP3，具有SEQ ID NO 1所示的多核苷酸序列。
与所述的大豆叶特异启动子GmGLP3互补的多核苷酸序列SEQ ID NO 2。
上述大豆叶特异启动子GmGLP3能够在拟南芥叶中特异表达，在别的组织部位几乎不表达，并且不能在大豆根中表达。
本发明还提供一种大豆叶特异启动子GmGLP3的分离方法，包括以下操作步骤：
(1)根据已发表的大豆转录组数据，挑选出在叶表达量较高，而其他组织中表达量很低或根本没有表达的的基因；
(2)根据候选基因的基因号在植物全基因组信息数据库 Phytozome中查找到基因序列，并用Primer5软件设计RT-PCR引物，设计完成的引物在NCBI网站上进行比对，取只能比对到大豆mRNA数据库中一条模板的引物为最终采用的引物序列；
(3)根据基因的基因编号，在植物全基因组信息数据库 Phytozome中查找到候选基因上游2500bp的序列作为启动子的备选序列，对各序列进行酶切位点分析后，设计特异性引物扩增该启动子区，使最终克隆得到的启动子片段在2000bp，在正向引物和反向引物的5’端分别引入Pst I酶切位点和BamH I酶切位点以及保护碱基。
本发明提供了大豆叶特异启动子GmGLP3在预防病虫害侵染大豆根部中的应用。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
1.本发明提供的大豆叶特异启动子GmGLP3可以在大豆叶中高效表达，在别的组织中几乎不表达；
2.本发明提供的大豆叶特异启动子GmGLP3在大豆根中不表达；
3.本发明提供的大豆叶特异启动子GmGLP3可以驱动抗病基因在大豆叶中高效表达，减少转基因对植株可食用部分的影响；
4.本发明提供的大豆叶特异启动子GmGLP3还可以用来调整期望的大豆性状，并开发对各种胁迫具有耐受性，增强的营养价值和先进的生产力的大豆品种。
附图说明
图1RT-PCR验证候选基因的表达模式，ACT11作对照；
图2为大豆叶特异启动子GmGLP3转化载体结构图谱；
图3为转基因T1代拟南芥植株抗除草剂检测；
图4为拟南芥转基因植株GUS染色情况；
图5为大豆毛状根GUS染色情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据厂家的条件作进一步调整，未说明的实施条件通常为常规实验条件。
实施例
1、根据已发表的大豆转录组数据，挑选出在叶表达量较高，而其他组织中表达量很低或根本没有表达的的基因，如表1所示：
表1 各基因在不同组织的表达量
表2 启动子序列的长度
| 启动子编号 | 序列长度(bp) |
| GmGLP3(Glymal6g00980) | 2290 |
2.RT-PCR验证大豆组织特异表达基因的表达模式
根据候选基因的基因号在植物全基因组信息数据库Phytozome中查找到基因序列(https：//www.phytozome.net/)，并用Primer5软件设计RT-PCR引物，设计完成的引物在NCBI网站 (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)上进行比对，取只能比对到大豆mRNA数据库中一条模板的引物为最终采用的引物序列，如图2所示；
3.根据基因的基因编号，在植物全基因组信息数据库Phytozome 中查找到候选基因上游2500bp的序列作为启动子的备选序列，对各序列进行酶切位点分析后，设计特异性引物扩增该启动子区，使最终克隆得到的启动子片段在2000bp左右，在正向引物和反向引物的5’端分别引入Pst I酶切位点和BamH I酶切位点以及保护碱基，得到的大豆叶特异启动子GmGLP3转化载体结构图谱如图3所示；
4.将根癌农杆菌感受态细胞从-80℃的冰箱中取出，置于冰上融化；取1μg质粒加入100uL农杆菌感受态细胞，在冰上放置30min；立即放入液氮中2min，37℃水浴5min；再放于冰上2min；在超净工作台中准备好无菌的2mL离心管，加入700μL未添加抗生素的LB液体培养基和农杆菌感受态；于28℃，200rpm的摇床中振荡培养4h；将菌液涂布于添加卡那霉素、壮观霉素和利福平的LB平板中，菌液晾干后，封盖倒置于28℃的培养箱中培养2天，直至长出单菌落。
每种质粒挑取10个单菌落并用启动子特异性引物检测，检测正确的阳性克隆进行繁殖扩增，先放入20mL液体LB培养基中小摇，而后放在200mL液体培养基中大量繁殖(培养基中均已加入Kan，Rif， Spect抗性)；当菌液浓度达到OD600为1.5-3.0(菌液呈橙黄色)时，可将200mL菌液分装到4个无菌的50mL离心管中，室温下5000rpm 离心10min，倒掉上清，保留菌体沉淀，用拟南芥侵染液(含 0.02％silwet)吹打稀释菌液，至OD600为0.8-1.0左右，即可用于侵染，侵染前一天将待用的野生型拟南芥苗浇足量的水；每种质粒转化10株左右的野生型拟南芥，选取足量的花序形成至初花期的野生型拟南芥，将待侵染的植物剪去已长出的果荚和开放的花；将带有菌体的侵染液倒入小烧杯中，把拟南芥的地上部分浸入侵染液，侵染 3min，取出后立即用保鲜膜包裹住植株，并平放遮光，待18h后即可将保鲜膜揭开(最好不要超过20h，以防植株萎蔫)，正常条件下继续培养即可。
5.采用北京酷来博科技有限公司的GUS染色试剂盒对植物进行 GUS组织化学染色，将1mLGUS染色浓缩液(50×)加入50mL的GUS 染色缓冲液中(即稀释50倍)，混合均匀即配成GUS染液；将植物组织材料取出，并清洗干净，尤其注意植物根系的清洗，需用水缓慢将泥土冲洗干净，注意轻柔操作，以免伤及植物根系，将清洗好的植株放入平皿中；将90％丙酮加入平皿中，液面覆盖植物即可，在4℃中放置20min，固定材料，防止GUS信号扩散；倒掉丙酮，用GUS清洗液洗掉丙酮，重复清洗两次；将培养皿中的清洗液倒掉，加入GUS 染色液，使染色液没过植物材料，用锡纸将培养皿包好，放入37℃培养箱中，经常观察植物染色情况，如果染上色了即可以进行脱色，也可以染色过夜；将染色液倒出，用移液枪吸净残留的染色液，加入 70％乙醇，进行脱色，刚开始脱色要勤于更换乙醇，至少更换3-5次直至脱色完全(阴性对照材料呈白色)；脱色完成后，用镊子将植物材料取出，放在玻璃片上，滴加少量水分，将植株铺平在一个平面上，用肉眼或显微镜观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点，拍照并用Photoshop软件修图，拟南芥转基因植株GUS染色情况如图4 所示；
6.(1)挑选适量没有斑点及破裂，饱满且颜色黄润的大豆WS82 种子；
(2)把挑选好的种子放入培养皿中，大豆种子不宜过多，平铺一层即可，否则豆子堆叠在一起会使豆子灭菌不彻底)，将培养皿盖打开，置于密封罐中；用50mL离心管装40mL次氯酸钠溶液(NaClO)，也放置于密封罐中，向次氯酸钠溶液中滴入1.6mL浓盐酸，产氯气用来灭菌(2HCl+NaClO＝Cl2+NaCl+H2O)，盖好密封罐，用保鲜膜封住罐子口，密闭18-20h，注意在通风橱中操作。当天配制GM培养基，倒平板过夜，并将镊子灭菌，备用；
(3)打开密封罐，迅速盖上培养皿盖，取出培养皿并放入无菌操作台中吹30min，去掉氯气的味道，将灭过菌的镊子在酒精灯外焰上再次灼烧灭菌，待镊子降温后，夹起种子，种脐朝下，种在GM培养基中，注意种子要稍微插进培养基中，每个培养皿种10粒种子；
(4)将种好种子的培养皿放在纸箱子内，25℃，暗培养五天，期间每天检查一次种子的状态，及时将污染的种子取出；
(5)期间将目的质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞，具体转化步骤同上述2.2.6，涂Kan抗性平板，并且挑取单克隆，小摇获取菌液，PCR验证，取验证正确的菌液100uL涂布于Kan抗性平板上， 28℃倒置培养1天；
(6)准备几把镊子，刀，蓝枪头，剪好的滤纸(放在培养皿中)，适量培养皿和50mL离心管，121℃，20min灭菌备用；
(7)将LCCM(HYQ-CCM1，500ML)倒入无菌的50mL离心管中(每种质粒转化的农杆菌需要一个离心管)，用枪头将2-4mL LCCM吸到涂有菌液的平板上，将菌吹打均匀，放入50mL离心管中，做好标记；
(8)取萌发5-6d的大豆种子，自下胚轴0.3-0.5cm处切下(放在灭过菌的平皿的盖子上切，可以垫一张灭菌滤纸)，将子叶一分为二切开(一粒分成两瓣)，去除顶芽，用刀片在子叶节处轻轻划5-7 处伤口，在子叶表面也划几处伤口，即为外植体；
(9)把50mL带菌的侵染液LCCM倒在灭好的培养皿中，把切好的外植体放里面泡20-30min，期间注意要经常晃动平皿，防止菌液沉淀到底部，把SCCM培养基的盖子打开，在盖子上和培养基上分别铺一张滤纸，将转染后的子叶节先放在盖子的滤纸上阴干水分，然后接种到附加一层无菌滤纸的SCCM上(每个平皿放10瓣种子)，培养皿用封口膜封口，放在纸箱子内，25℃，暗培养5天；
(10)期间配制好足量的液体和固体发根培养基，并将镊子，刀，蓝枪头，剪好的滤纸(放在培养皿中)，适量的锥形瓶，灭菌待用；
(11)将豆子用灭菌后的镊子夹出，放在锥形瓶或敞口瓶内，用发根培养基(液体，加入Cef和Carben抗性)洗掉种子上的菌，共洗三次，前两遍摇晃涮净即可，第三遍泡半小时，期间经常摇晃锥形瓶，洗净后将豆子夹出，放在灭菌的滤纸上晾干，并切掉新长出的下胚轴(只保留大约0.5cm即可)，将晾干切好的豆子下胚轴朝下，倾斜着插入固体发根培养基，每个发根培养基中插入5瓣种子；
(12)将发根培养基封口，放入25℃培养箱中，16h/d光照，8h/d 黑暗条件下培养，15-20天长出毛状根，最后对大豆毛状根进行GUS 染色，染色结果如图5所示。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改变、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种大豆叶特异启动子GmGLP3，其特征在于，具有SEQ ID NO 1所示的多核苷酸序列。
2.与权利要求1所述的大豆叶特异启动子GmGLP3互补的多核苷酸序列SEQ ID NO 2。
3.根据权利要求1所述的一种大豆叶特异启动子GmGLP3，其特征在于，所述大豆叶特异启动子GmGLP3能够在拟南芥叶中特异表达，在别的组织部位几乎不表达，并且不能在大豆根中表达。
4.一种如权利要求1所述的大豆叶特异启动子GmGLP3的分离方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)根据已发表的大豆转录组数据，挑选出在叶表达量较高，而其他组织中表达量很低或根本没有表达的的基因；
(2)根据候选基因的基因号在植物全基因组信息数据库Phytozome中查找到基因序列，并用Primer5软件设计RT-PCR引物，设计完成的引物在NCBI网站上进行比对，取只能比对到大豆mRNA数据库中一条模板的引物为最终采用的引物序列；
(3)根据基因的基因编号，在植物全基因组信息数据库Phytozome中查找到候选基因上游2500bp的序列作为启动子的备选序列，对各序列进行酶切位点分析后，设计特异性引物扩增该启动子区，使最终克隆得到的启动子片段在2000bp，在正向引物和反向引物的5’端分别引入Pst I酶切位点和BamH I酶切位点以及保护碱基。
5.权利要求1所述的一种大豆叶特异启动子GmGLP3在预防病虫害侵染大豆叶部中的应用。
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