CN113025632B

CN113025632B - 黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE及其应用

Info

Publication number: CN113025632B
Application number: CN202110053364.6A
Authority: CN
Inventors: 孟祥南; 于永波; 于洋; 范海延; 崔娜; 陈秋敏; 马立锋; 于广超
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2021-01-15
Filing date: 2021-01-15
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2041-01-15
Also published as: CN113025632A

Abstract

本发明属于植物分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE及其应用，该基因全长编码区序列见SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。以高抗白粉病品系黄瓜B21‑a‑2‑1‑2为试材，克隆CsCSE基因全长编码序列并将其插入植物过表达载体pRI101；克隆CsCSE基因5’端特异性片段并将其插入病毒诱导基因沉默表达载体pTRV2，通过农杆菌介导瞬时转化黄瓜子叶。对转化株系进行白粉病菌接种鉴定，证明了CsCSE基因在黄瓜抗白粉病菌过程中的正调控作用，为实际生产中培育抗病、稳产黄瓜新品种提供理论依据，对我国蔬菜产业具有重要应用价值。

Description

黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE及其应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus)是我国设施园艺栽培的重要经济作物之一，在蔬菜产业中扮演着重要的角色。随着种植密度加大、连作种植等，黄瓜在栽培中常遭受各种病原菌的侵染，其中白粉病尤为严重。黄瓜白粉病是由葫芦科白粉病菌(Erysiphe ciehoracearum)以及单丝壳白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)引起的一种世界性气传真菌病害，其中S.fuliginea 更为常见。白粉病一旦发生，可使黄瓜减产高达50％，严重限制了我国黄瓜产业的发展。目前，选育和推广抗白粉病黄瓜新品种仍是防治和解决该病害最经济、有效的途径。因此，加强优质白粉病抗性相关基因的挖掘及抗病机理研究，对控制该病害发生和提高黄瓜产量具有重要意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE及其应用，为抗病品种的遗传改良提供一个新的基因资源。

本发明是这样实现的，提供一种黄瓜木质素生物合成关键酶基因 CsCSE，来自高抗白粉病品系黄瓜B21-a-2-1-2，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

提供一种用于扩增上述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的引物，为pRI101-CsCSE-F和pRI101-CsCSE-R，其核苷酸序列如下：

pRI101-CsCSE-F： 5’-CATATGCCCGTCGACATGGCTGCTCAACAACTAGATG-3’；

pRI101-CsCSE-R： 5’-GCTCACCATGGATCCTTTGATTTGGAGATCATCACATTCAGC-3’。

并且，引物5’端的前9个碱基为载体同源序列，紧接着的6个碱基为酶切位点序列，前15个碱基不属于CsCSE基因序列，但为构建重组植物过表达载体所必需。

提供一种上述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE编码的蛋白质，具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列。

提供一种含有上述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的重组植物过表达载体，所述载体为pRI101-CsCSE。

提供一种用于扩增上述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CSCSE特异性目的片段的引物，引物为pTRV2-CsCSE-F和pTRV2-CsCSE-R，其核苷酸序列如下：

pTRV2-CsCSE-F：5’-AAGGTTACCGAATTCATGGCTGCTCAACAACT AGATGG-3’

pTRV2-CsCSE-R：5’-GAGACGCGTGAGCTCCCTCATTTTGTTCCTGT TTTCTTTC-3’。

提供一种含有上述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的重组病毒诱导基因沉默表达载体，CsCSE特异性目的片段具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，载体为pTRV2-CsCSE。

提供了上述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE在调控植物抗病性中的应用。

提供了上述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的重组植物过表达载体在调控植物抗病性中的应用。

提供了上述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的重组病毒诱导基因沉默表达载体在调控植物抗病性中的应用。

进一步地，对于上述应用，转化植物为黄瓜，具体为利用农杆菌介导结合子叶注射，将基因转化至黄瓜。

即，本发明的技术方案如下：

1、提供了一种来自高抗白粉病品系黄瓜B21-a-2-1-2的木质素生物合成关键酶基因CsCSE，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2、提供了上述CsCSE基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3、提供了含有所述CsCSE基因的重组植物过表达载体以及含有所述 CsCSE特异性目的片段的重组病毒诱导基因沉默表达载体。

4、提供了含有上述3所述重组表达载体的宿主。

5、提供了上述CsCSE基因、重组表达载体以及宿主细胞在调控黄瓜抗病性中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明首次从黄瓜中克隆得到一个木质素生物合成关键酶基因CsCSE 及其所编码的蛋白质CsCSE。利用生物工程手段将CsCSE基因转入黄瓜中，获得CsCSE基因瞬时过表达和沉默株系。结合正、反两方面公开了黄瓜 CsCSE基因作为正调控因子参与黄瓜防卫反应过程。该基因的发现与克隆为黄瓜白粉病的抗性育种提供一个新的候选基因，也为CsCSE蛋白功能的相关研究提供一种研究方向；将该基因转入植物中，有助于获得新的抗病品种，为增强黄瓜白粉病抗性开辟新途径。

附图说明

下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1为白粉病菌胁迫下，抗白粉病品系B21-a-2-1-2和感白粉病品系 B21-a-2-2-2黄瓜CsCSE基因表达情况；

图2(A)为pRI101-CsCSE载体构建示意图；

图2(B)为CsCSE基因全长编码序列扩增结果；

图2(C)为pRI101-CsCSE菌落PCR电泳检测；

图2(D)为pRI101-CsCSE测序结果；

图3(A)为pTRV2-CsCSE载体构建示意图；

图3(B)为CsCSE基因特异性片段扩增结果；

图3(C)为pTRV2-CsCSE菌落PCR电泳检测；

图3(D)为pTRV2-CsCSE测序结果；

图4(A)和图4(B)为CsCSE基因瞬时转化植株的鉴定，其中：

TRV:00为注射病毒诱导基因沉默表达空载体；TRV:CsCSE为注射 CsCSE的重组病毒诱导基因沉默表达载体；GFP:00为注射植物过表达空载体；GFP:CsCSE为CsCSE重组植物过表达载体，下同；

图5为CsCSE基因瞬时沉默(12d)和过表达(7d)转化黄瓜的白粉病抗性鉴定，其中DI为病情指数，下同；

图6为CsCSE基因瞬时沉默和过表达(20d)转化黄瓜的白粉病抗性鉴定。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

黄瓜品种B21-a-2-1-2和B21-a-2-2-2为抗、感白粉病姐妹系，由辽宁省农科院蔬菜所选育提供。该姐妹系在商品性、株型、抗其它病害等性状上基本一致，是开展黄瓜-白粉病互作机理研究以及白粉病抗性相关基因挖掘的重要材料。本发明前期通过高通量转录组测序手段筛选了一个在抗病品系中表达明显上调的基因CsCSE(Cucsa.134370)。CSE是一种新型的木质素生物合成关键酶基因，直接影响植物细胞壁中木质素及其单体含量的变化。然而，目前尚未有研究将CSE影响木质素生物合成与植物抗病性联系起来。因此，开展CSE在黄瓜抗白粉病方面的研究，不仅可以在遗传水平上揭示其参与黄瓜抵御白粉病菌胁迫的调控机理，也为开展黄瓜抗白粉病基因工程育种提供优良的基因资源。

本发明首次公开了CSE在植物抗病中的作用，利用PCR技术从抗白粉病品系B21-a-2-1-2黄瓜中获得CsCSE基因编码区全长。然后，利用农杆菌介导结合子叶注射，获得CsCSE基因瞬时过表达和沉默株系。通过对转化植株抗病性鉴定，证明了CsCSE基因在黄瓜-白粉病菌互作中的正调控作用，为提高黄瓜抗病性提供新思路。

实施例1、白粉病菌胁迫下，黄瓜CsCSE基因的表达模式分析

供试黄瓜品种为B21-a-2-1-2(抗)和B21-a-2-2-2(感)。采用喷雾法对黄瓜幼苗进行白粉病菌接种处理，分别于处理0、3、6、9、12、24h时剪取叶片并液氮研磨。使用RNApreppure plant kit(DP432，天根)提取叶片总RNA，电泳检测RNA提取效果后，使用QuantScript RT kit(KR103-04，天根)将RNA反转录为cDNA。实时定量PCR以所获cDNA为模板，q-F和q-R为引物，qActin-F和qActin-R为内参引物(见表1)，运用QuantScript RT kit(KR103-04，天根)和Roche荧光定量PCR仪进行。运用2^-△△Ct法进行数据分析，结果见图1。结果表明，白粉病菌胁迫下，CsCSE基因在抗白粉病品系黄瓜中的表达量始终高于其在感白粉病品系中的表达量。

表1 CsCSE基因表达量分析所需引物

实施例2、重组载体pRI101-CsCSE和pTRV2-CsCSE的构建

参考图2(A)、图2(B)、图2(C)和图2(D)，以抗白粉病品系B21-a-2-1-2 黄瓜cDNA为模板，pRI101-CsCSE-F和pRI101-CsCSE-R为引物扩增CsCSE 基因编码区全长，回收目的小片段。应用SalⅠ和Bam HⅠ对载体pRI101进行酶切，反应体系为：7μL pRI101质粒，1μL 10×Tbuffer，1μL SalⅠ，1μL Bam HⅠ，37℃反应3h，回收线性大片段。利用HDCloning Plus (TaRaKa，638910)将CsCSE目的小片段连接到pRI101线性大片段上，反应体系为：6μL线性大片段，2μL目的小片段，2μL 5×In-Fusion HD Enzyme Premix，50℃反应15min。利用热激法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，经菌落PCR、测序鉴定后，摇菌、提质粒获得重组质粒pRI101-CsCSE。

参考图3(A)、图3(B)、图3(C)和图3(D)，以pTRV2-CsCSE-F和 pTRV2-CsCSE-R为引物扩增CsCSE基因5’端特异性片段，回收目的小片段。应用EcoRⅠ和SacⅠ对载体pTRV2进行酶切，回收线性大片段。将目的小片段连接至线性大片段上，转至大肠杆菌DH5α中，获得重组质粒pTRV2-CsCSE。

实施例3、CsCSE在黄瓜-白粉病互作中的功能鉴定

供试黄瓜品种为新泰密刺。利用冻融法将质粒pRI101、pRI101-CsCSE、 pTRV1、pTRV2和pTRV2-CsCSE分别转入农杆菌EHA105中。应用YEP液体培养基(含50μg mL^-1Kan和50μg mL^-1Rif)分别培养上述农杆菌，至菌液 OD₆₀₀为0.6-1.0，收集沉淀菌体；应用缓冲液(含10mM MES和10mM MgCl₂的水溶液)洗涤菌体1次；应用注射液(含10mM MES、10mM MgCl₂和的200μM AS的水溶液)悬浮菌体，至菌液OD₆₀₀为0.4，黑暗放置3h；应用无针头注射器将pRI101菌体悬浮液(GFP：00)、pRI101-CsCSE菌体悬浮液 (GFP：CsCSE)、pTRV1菌体悬浮液和pTRV2菌体悬浮液(1:1混合，TRV： 00)以及pTRV1菌体悬浮液和pTRV2-CsCSE菌体悬浮液(1:1混合，TRV： CsCSE)分别注入黄瓜子叶。

提取所有瞬时转化黄瓜株系叶片总RNA，检测CsCSE基因的表达量来筛选并鉴定阳性株系，部分鉴定结果见图4(A)和图4(B)。对瞬时转化株系进行白粉病菌接种处理，通过黄瓜叶片表型观察、白粉病菌菌丝染色以及病情指数调查明确CsCSE基因在黄瓜-白粉病互作中的具体功能。结果表明：过表达CsCSE基因显著提高了黄瓜的白粉病菌抗性，而沉默CsCSE基因显著降低了黄瓜的白粉病菌抗性(图5和6)。

上面结合附图对本发明的实施方式做了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

<110> 沈阳农业大学

<120> 黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE及其应用

<130> 2021

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 954

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggctgctc aacaactaga tggcatcacc tatgaagagg attttctatt taactcacgt 60

gggatgaatc ttttcacgtg caaatggctt ccaaaggata aggaaccaaa ggctttgatc 120

ttcatctgcc atggctatgc aatggaatgc agcatcacca tgaatagcac agcaattcgg 180

cttgcaaagg caggttttgc tgtttatggt attgattacg aaggccatgg aaaatcagat 240

ggcttgcaag gctatattac aagctttgat tttgtagtgg atgattgctc caatttcttc 300

acagacattt ctgaaaggaa agaaaacagg aacaaaatga ggtatctgtt aggagagtcg 360

atgggaggag cactggcttt gttattgcat agaaaaaaac cagattattg ggatggtgct 420

gtcttggttg cacctatgtg taagcttgca gatgatgtta aaccaagtcc actagttata 480

aacatactga caaagctttg caattttata cccacatgga aaattgttcc aacccaagat 540

atcattgatg tagctttcaa agttcctgag attagaaatc agatcagaac taatccttac 600

tgttacaaag ggaaacctcg tttgaacact gggcatgaac tcctgaggat cagcttagat 660

ctcgagcaaa gactggatga ggtttcgtta ccgtttataa tcctccatgg agaggaagat 720

cgagtgaccg aaatgtcggc gagtgagcaa ctttatggga aggcgtcgag ctgggataag 780

agcttgaaga gatatccaga gatgtggcat ggattgttgt atggagagac agatgagaac 840

attgatgttg tgtttggaga cataattggt tggttggatg aaagatgtgc tttgggaaat 900

tcaaggatag aaaagcagct caaggctgaa tgtgatgatc tccaaatcaa atga 954

<210> 2

<211> 317

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Ala Gln Gln Leu Asp Gly Ile Thr Tyr Glu Glu Asp Phe Leu

1 5 10 15

Phe Asn Ser Arg Gly Met Asn Leu Phe Thr Cys Lys Trp Leu Pro Lys

20 25 30

Asp Lys Glu Pro Lys Ala Leu Ile Phe Ile Cys His Gly Tyr Ala Met

35 40 45

Glu Cys Ser Ile Thr Met Asn Ser Thr Ala Ile Arg Leu Ala Lys Ala

50 55 60

Gly Phe Ala Val Tyr Gly Ile Asp Tyr Glu Gly His Gly Lys Ser Asp

65 70 75 80

Gly Leu Gln Gly Tyr Ile Thr Ser Phe Asp Phe Val Val Asp Asp Cys

85 90 95

Ser Asn Phe Phe Thr Asp Ile Ser Glu Arg Lys Glu Asn Arg Asn Lys

100 105 110

Met Arg Tyr Leu Leu Gly Glu Ser Met Gly Gly Ala Leu Ala Leu Leu

115 120 125

Leu His Arg Lys Lys Pro Asp Tyr Trp Asp Gly Ala Val Leu Val Ala

130 135 140

Pro Met Cys Lys Leu Ala Asp Asp Val Lys Pro Ser Pro Leu Val Ile

145 150 155 160

Asn Ile Leu Thr Lys Leu Cys Asn Phe Ile Pro Thr Trp Lys Ile Val

165 170 175

Pro Thr Gln Asp Ile Ile Asp Val Ala Phe Lys Val Pro Glu Ile Arg

180 185 190

Asn Gln Ile Arg Thr Asn Pro Tyr Cys Tyr Lys Gly Lys Pro Arg Leu

195 200 205

Asn Thr Gly His Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Asp Leu Glu Gln Arg

210 215 220

Leu Asp Glu Val Ser Leu Pro Phe Ile Ile Leu His Gly Glu Glu Asp

225 230 235 240

Arg Val Thr Glu Met Ser Ala Ser Glu Gln Leu Tyr Gly Lys Ala Ser

245 250 255

Ser Trp Asp Lys Ser Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Met Trp His Gly Leu

260 265 270

Leu Tyr Gly Glu Thr Asp Glu Asn Ile Asp Val Val Phe Gly Asp Ile

275 280 285

Ile Gly Trp Leu Asp Glu Arg Cys Ala Leu Gly Asn Ser Arg Ile Glu

290 295 300

Lys Gln Leu Lys Ala Glu Cys Asp Asp Leu Gln Ile Lys

305 310 315

<210> 3

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggctgctc aacaactaga tggcatcacc tatgaagagg attttctatt taactcacgt 60

gggatgaatc ttttcacgtg caaatggctt ccaaaggata aggaaccaaa ggctttgatc 120

ttcatctgcc atggctatgc aatggaatgc agcatcacca tgaatagcac agcaattcgg 180

cttgcaaagg caggttttgc tgtttatggt attgattacg aaggccatgg aaaatcagat 240

ggcttgcaag gctatattac aagctttgat tttgtagtgg atgattgctc caatttcttc 300

acagacattt ctgaaaggaa agaaaacagg aacaaaatga gg 342

Claims

1.黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的应用，其特征在于，所述基因CsCSE来自高抗白粉病品系黄瓜B21-a-2-1-2，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；基因CsCSE用于调控黄瓜抗白粉病。

2.根据权利要求1所述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的应用，其特征在于，用于扩增所述黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的引物为pRI101-CsCSE-F和pRI101-CsCSE-R，其核苷酸序列如下：

pRI101-CsCSE-F：

5’-CATATGCCCGTCGACATGGCTGCTCAACAACTAGATG-3’；

pRI101-CsCSE-R：

5’-GCTCACCATGGATCCTTTGATTTGGAGATCATCACATTCAGC-3’；

3.根据权利要求1所述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的应用，其特征在于，所述基因CsCSE编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的应用，其特征在于，含有所述黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的重组植物过表达载体中，载体为pRI101-CsCSE。

5.根据权利要求1所述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的应用，其特征在于，用于扩增所述基因CSCSE特异性目的片段的引物为pTRV2-CsCSE-F和pTRV2-CsCSE-R，其核苷酸序列如下：

pTRV2-CsCSE-F：5’-AAGGTTACCGAATTCATGGCTGCTCAACAACTAGA TGG-3’

pTRV2-CsCSE-R：5’-GAGACGCGTGAGCTCCCTCATTTTGTTCCTGTTTT CTTTC-3’；

6.根据权利要求1所述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的应用，其特征在于，含有所述黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的重组病毒诱导基因沉默表达载体中，CsCSE特异性目的片段具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，载体为pTRV2-CsCSE。

7.根据权利要求4所述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的应用，其特征在于，所述重组植物过表达载体用于调控植物抗病性，转化植物为黄瓜，具体为利用农杆菌介导结合子叶注射，将基因转化至黄瓜。

8.根据权利要求6所述的黄瓜木质素生物合成关键酶基因CsCSE的应用，其特征在于，重组病毒诱导基因沉默表达载体用于调控植物抗病性，转化植物为黄瓜，具体为利用农杆菌介导结合子叶注射，将基因转化至黄瓜。