CN111424043B - 正调控因子NbPRO19C55-1基因及其蛋白在抗植物疫霉菌中的应用 - Google Patents

正调控因子NbPRO19C55-1基因及其蛋白在抗植物疫霉菌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种正调控因子NbPRO19C55‑1基因及其蛋白在抗植物疫霉菌中的应用，属于生物技术领域，所述NbPRO19C55‑1基因通过正调控植物免疫信号，增强植物对寄生疫霉菌的抗性；所述NbPRO19C55‑1基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，该基因的核苷酸序列还包括SEQ ID No：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成突变体、等位基因或衍生物；该基因作为正调控因子在提高植物疫霉菌抗性上的用途，可用于抗疫霉菌品种的选育。

Description

正调控因子NbPRO19C55-1基因及其蛋白在抗植物疫霉菌中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种正调控因子NbPRO19C55-1基因及其蛋白在抗植物疫霉菌中的应用。
背景技术
植物分泌型小肽在植物生长发育及响应各种生物和非生物胁迫中都发挥着重要调控功能，在提高植物抗病性方面的研究倍受瞩目。它们多在受损伤部位或侵染部位上调表达，能够快速启动植物胼胝质累积、活性氧迸发及抗病蛋白累积等防卫反应。小肽能在极低浓度水平下激活植物抗病信号，并能协同其它免疫信号(如PAMPs)和植物激素一起调控植物抗病反应。如果通过CRISPR/Cas9定向编辑将NbPRO19C55改造成受病原菌侵染诱导表达，转化作物有望使植物获得有效的抗病性。
目前已经鉴定到多个参与植物抗病反应的分泌型小肽，但对烟草应对疫霉菌侵染中发挥免疫调节能的小肽研究较少。对植物免疫相关分泌型小肽的鉴定及其加工成熟、识别受体及作用机制方面的研究仍需探索。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种植物免疫正调控因子NbPRO19C55-1基因在抗植物疫霉菌中的应用，以为烟草黑胫病的防治提供一种新的生物防治途径。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供一种正调控因子NbPRO19C55-1基因在抗植物疫霉菌中的应用，所述NbPRO19C55-1基因通过正调控植物免疫信号，调控植物对疫霉菌的抗性；
所述NbPRO19C55-1基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
进一步地，所述NbPRO19C55-1基因的核苷酸序列还包括SEQ ID No：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成突变体、等位基因或衍生物。
本发明还提供一种正调控因子NbPRO19C55-1基因编码的蛋白在抗植物疫霉菌中的应用，通过基因工程，增加所述NbPRO19C55-1基因编码的蛋白的表达量，正调控植物免疫信号，调控植物对疫霉菌的抗性；
所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
进一步地，所述蛋白的氨基酸序列还包括SEQ ID No：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物质的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
更进一步地，所述氨基酸序列或衍生物为与SEQ ID No：2所示的氨基酸序列同源性在90％以上的同源序列。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开的植物免疫正向DAMPs分子NbPRO19C55基因，首次作为影响植物免疫正调控因子被克隆。通过基因工程构建NbPRO19C55-1基因的过表达烟草材料，离体叶片接菌实验证明NbPRO19C55-1过表达烟草更抗寄生疫霉菌侵染，通过病毒介导的基因沉默技术(VIGS)获得NbPRO19C55-1/-2共沉默的本氏烟草植物材料，通过离体叶片接菌证明此材料减弱对寄生疫霉菌的抗性。以上实验结果证明了NbPRO19C55基因作为正调控因子在提高植物疫霉菌抗性上的用途，可用于抗疫霉菌品种的选育。
另外，本发明还实时荧光定量PCR技术，分析发现NbPRO19C55-1基因可以受到植物内源水杨酸的诱导上调表达，诱导PTI信号通路Marker基因WRKY33、FRK的上调表达以及下游磷酸化反应。综上，NbPRO19C55-1作为一个新型的植物免疫正向调控因子，正向调控植物对疫霉菌的抗性。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为NbPRO19C55-1与NbPRO19C55和NbPRO19C55-2蛋白序列比对图；
图2为本氏烟叶片过表达NbPRO19C55-1表现出对寄生疫霉菌的抗性，A图为接种寄生疫霉菌菌丝块2天后病斑观察结果以及台盼蓝染色结果；B图为病斑直径统计结果；
图3为在本氏烟叶片中沉默NbPRO19C55-1表现出对寄生疫霉菌的感病，A图为接种寄生疫霉菌菌丝块48h后病斑观察结果以及台盼蓝染色结果；B图为病斑直径统计结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
NbPRO19C55-1基因的克隆
1、植物材料：本氏烟草(可以通过公开渠道获得)，从其叶片中抽提RNA。
用RNA提取试剂盒(OMGA，Lot#:R6827-01)抽提RNA，用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计上测定RNA的纯度和浓度。
2、基因克隆
用反转录试剂盒(TaKaRa，Lot#:AHE3187A)获得本氏烟的cDNA，根据茄科网站中提供的NbPRO19C55的全长编码序列设计上下游引物NbPRO19C55-F/R，
NbPRO19C55-F：5’-CGGGGTACCATGGCAAGATTTGTGGACTTT-3’，
NbPRO19C55-R：5’-CTAGACTAGTCTACTTATCATCATCATCCTTATAATCTTGATGATTGCCAGTGACAAC-3’，
以cDNA为模板进行扩增。PCR产物经酶切、连接、菌液PCR验证后构建成载体pKannibal-AtPPR1，然后送去测序。将测序结果与已公布序列进行比对，正确的质粒用于后续实验。
实施例2
NbPRO19C55-1基因的序列信息与同源性分析
本发明本氏烟NbPRO19C55-1基因全长CDS序列为270bp，详细序列见Sol GenomicsNetwork：Niben101Scf00803g01016.1，如本发明SEQ ID No：1，氨基酸序列共89个氨基酸，详细序列见Sol Genomics Network：Niben101Scf00803g01016.1，如本发明SEQ ID No：2。
将本氏烟NbPRO19C55-1基因编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序进行同源性检索，结果发现它与本氏烟草中的1个基因NbPRO19C55-2的氨基酸序列的相似度都在90％以上，其氨基酸序列见Sol Genomics Network：Niben101Scf03747g00005.1，如本发明SEQ IDNo：3。由上述内容可推断1个同源基因具有和NbPRO19C55相同或相似的功能。
NbPRO19C55-1基因在普通烟草中的1个同源基因NbPRO19C55，详细序列如本发明SEQ ID No：4所示，其与NbPRO19C55-1的氨基酸序列相似度在90％以上，推测其与NbPRO19C55-1具有相同或相似的功能。
本发明的NbPRO19C55基因与2个同源基因的氨基酸序列的比对结果见图1。
实施例3NbPRO19C55-1过表达植物表现出对寄生疫霉菌的抗性
设计特异引物，检测过表达植物中NbPRO19C55-1的表达情况。收取约0.2g烟草叶片样品提取RNA、反转录为cDNA后，设计特异性引物利用实时荧光定量PCR技术检测NbPRO19C55-1的表达情况。采集苗龄为6-7周的普通烟红花大金元为对照，划伤叶片后接种GFP标记的寄生疫霉菌菌丝块，于23℃培养箱黑暗培养约48个小时后观察并测量病斑直径。结果如图2所示。
实施例4在本氏烟中沉默NbPRO19C55-1可以降低对寄生疫霉的抗性
选取NbPRO19C55-1和NbPRO19C55-2特异的区段约120bp，构建pTRV2-NbPRO19C55沉默载体。将pTVR1、pTRV2-GFP和已连入目的片段的pTRV2载体，电转入农杆菌。利用农杆菌渗透法将pTRV1与pTRV-NbPRO19C55两种转化的农杆菌在本氏烟上共同瞬时表达，一般注射时终浓度为OD600＝0.25。利用一起沉默的PDS基因作为阳性对照，GFP为阴性对照，待阳性对照出现较明显的沉默效果时(2-3周后)选取实验组的叶片接菌分析。同时设计特异引物，检测沉默植株中PPR1的表达情况。收取约0.2g本氏烟叶片样品提取RNA、反转录为cDNA后，设计特异性引物利用实时荧光定量PCR技术检测NbPRO19C55的表达情况。
寄生疫霉菌接菌方法与上述类似。新鲜培养的寄生疫霉菌于培养后4天左右待用。用5mm左右的菌丝块进行离体叶片接菌实验。结果如图3所示。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 正调控因子NbPRO19C55-1基因及其蛋白在抗植物疫霉菌中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcaagat ttgtggactt tattttgctt attcttttgg ttacttcaat taacattttg 60
ggatgtgaag cacggcctct caatatattg aagattgatg gctatggcta tggcaatggt 120
gtgggtttta attggttaac tttaggttct attaaagatg gtcctagtcc tggagttggc 180
cataaattta ccaacagcca aacacttgga ggaattaagg attcaggtcc aagtcctgga 240
gaaggacaca aggttgtcac tggcaatcat caatag 276
<210> 2
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Arg Phe Val Asp Phe Ile Leu Leu Ile Leu Leu Val Thr Ser
1 5 10 15
Ile Asn Ile Leu Gly Cys Glu Ala Arg Pro Leu Asn Ile Leu Lys Ile
20 25 30
Asp Gly Tyr Gly Tyr Gly Asn Gly Val Gly Phe Asn Trp Leu Thr Leu
35 40 45
Gly Ser Ile Lys Asp Gly Pro Ser Pro Gly Val Gly His Lys Phe Thr
50 55 60
Asn Ser Gln Thr Leu Gly Gly Ile Lys Asp Ser Gly Pro Ser Pro Gly
65 70 75 80
Glu Gly His Lys Val Val Thr Gly Asn His Gln
85 90
<210> 3
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Arg Phe Val Asp Phe Ile Leu Leu Ile Leu Leu Val Thr Ser
1 5 10 15
Ile Asn Asn Leu Gly Cys Glu Ala Arg Pro Leu Asn Ile Leu Lys Ile
20 25 30
Asp Gly Tyr Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Phe Asn Trp Leu Thr Leu
35 40 45
Gly Ser Ile Lys Asp Gly Pro Ser Pro Gly Val Gly His Glu Phe Thr
50 55 60
Asn Ser Gln Thr Leu Gly Gly Ile Lys Asp Ser Gly Pro Ser Pro Gly
65 70 75 80
Val Gly His Lys Val Ile Thr Gly Asn His Gln
85 90
<210> 4
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Arg Phe Val Asp Phe Ile Leu Leu Ile Leu Leu Val Asn Ser
1 5 10 15
Ile Asn Ile Leu Gly Cys Glu Ala Arg Pro Leu Asn Ile Leu Lys Ile
20 25 30
Asp Gly Tyr Gly Asn Gly Val Gly Phe Asn Trp Leu Thr Leu Gly Ser
35 40 45
Ile Lys Asp Gly Pro Ser Pro Gly Val Gly His Lys Phe Thr Asn Ser
50 55 60
Gln Thr Leu Gly Gly Ile Lys Asp Ser Gly Pro Ser Pro Gly Glu Gly
65 70 75 80
His Lys Val Val Ala Gly Asn His Gln
85

Claims (2)

1.一种正调控因子NbPRO19C55-1基因在抗烟草疫霉菌中的应用，其特征在于，所述NbPRO19C55-1基因通过正调控植物免疫信号，调控植物对疫霉菌的抗性；
所述NbPRO19C55-1基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.一种正调控因子NbPRO19C55-1基因编码的蛋白在抗烟草疫霉菌中的应用，其特征在于，通过基因工程，增加所述NbPRO19C55-1基因编码的蛋白的表达量，正调控植物免疫信号，调控植物对疫霉菌的抗性；
所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
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