KR20130015711A - 식물의 방어관련 식물특이 전사인자 유전자 ＣａＨＳＴＦ１ 및 이를 이용한 형질전환 식물체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물의 방어반응에 관련이 있으며 TMV-P0에 의해 유도되는 방어반응에서 포지티브 조절자 (positive regulator)로써 기능을 하는 식물의 방어관련 식물특이 전사인자 유전자 CaHSTF1 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 발명은 저항성 식물체의 육종을 위한 재료를 제공하여 고온에서 효과적인 저항성을 갖는 식물체 제작 및 식물체의 방어 반응 메커니즘 연구에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 식물의 방어관련 식물특이 전사인자 유전자 CaHSTF1 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 식물의 방어반응에 관련이 있으며 담배 모자이크 바이러스-P0(TMV-P0)에 의해 유도되는 방어반응에서 포지티브 조절자 (positive regulator)로써 기능을 하는 고추식물의 방어관련 식물특이 전사인자 유전자 CaHSTF1 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것이다.
온도는 식물의 성장과 발달의 영향을 주는 중요한 환경적 요소이다(Long and Woodward 1988). 하지만 식물의 어떤 식으로 온도 변화에 반응하는지는 정확히 알려져 있지 않다(Penfield 2008). 온도는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 벌레 등에 대한 저항성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Garrett et al. 2006). 특히 고온은 식물의 면역반응을 억제하는 것으로 알려져 있다(Dropkin 1969). 이렇게 온도가 식물에 영향을 주고, 전 세계적인 기온 상승으로 인해, 농업에 큰 영향을 줌에도 불구하고, 고온으로 인한 식물 면역 반응의 저하에 대한 분자적 기작은 거의 알려져 있지 않다.
열 충격 전사인자(heat shock transcription factor)는 곰팡이에서부터 동물까지 공통으로 다양한 스트레스로부터 세포를 보호하는 역할을 한다(Chen and Parker 2002). 그리고 이 전사인자의 기본적인 구조와 DNA 결합 부위 (예:heat shock element)는 효모에서부터 인간까지 공통적이다(Wu 1995). 효모와 인간은 각각 1개와 3개의 열 충격 전사인자를 가지고 있는 반면에(Nakai 1999), 식물은 많은 수의 전사인자를 가지고 있다. 애기장대는 21개, 벼는 23개의 열충격 전사인자를 가지고 있는 것으로 밝혀졌다(Nover et al. 2001; von Koskull-Doring et al. 2007).
최근 연구에 따르면 식물의 열 충격 전사인자는 다양한 환경적 요인에 반응한다고 알려졌다(Baniwal et al. 2004; Yokotani et al. 2008). 토마토의 HsfA1a의 발현이 억제되면 고온 스트레스에 매우 민감해지며(Mishra et al., 2002), 벼의 HsfA4d에 이상이 생기면 고온에 매우 민감해져서 괴사병반이 생긴다. 열 충격 전사 인자는 환경적 스트레스에 관여할 뿐만 아니라 생물학적 스트레스에도 관여한다는 사실이 밝혀져 있다. 애기장대의 HstfB1과 HstfB2b는 PDF 1.2의 발현과 병원체에 대한 저항성에 관여한다고 알려져 있다(Kumar et al. 2009). 고추는 열 충격 전사인자와 관련된 EST 클론을 가지고 있으나, 아직까지 기능과 개수에 대해서는 정확하게 알려진 바가 없다.
본 발명의 배경이 되는 기술로는 예를 들어 대한민국 등록특허 10-0921744(특허문헌 1)에 콩으로부터 분리한 고온저항성 유도 유전자가 기재되어 있으며, NCBI Accession No. AY284925에는 열충격 단백질 유전자 CaHSP18가 등록되어 있다(비특허문헌 1).
고추는 한국에서 가장 많이 재배되는 원예작물의 한가지로서 농업경제에 있어서 매우 중요한 작물이다. 이러한 고추식물에서 바이러스병, 세균병, 진균병 등이 다양하게 보고되어 있으며 실제로 병 발생에 의한 생산량 감소가 빈번히 일어난다. 그리고 전 지구적인 기온 상승으로 인한 병 발생이 더욱 증가하고 있으나, 현재까지 고온에서 효과적인 병 저항성 작물은 보고되어 있지 않으며 식물보호를 위해서 화학적 방제에 의존적이다. 그러므로 전통적인 육종을 이용한 새로운 저항성 작물 개발을 위한 노력의 단점을 보완할 수 있는 생명공학적 기법을 이용한 효과적인 방어관련 유전자의 분리 및 형질전환 식물의 제작은 생산비 절감을 통한 농가소득의 증대효과 및 친환경시대에 맞는 고품질 청정작물의 생산을 가능하게 하며 이와 연계된 다양한 산업의 활성화에 기여할 수 있다.
NCBI Accession No. AY284925(2009.11.04)
본 발명자들은 TMV-P0에 의해 유도되는 방어반응에서 포지티브 조절자 (positive regulator)로써 기능을 하는 고추식물의 방어관련 식물특이 전사인자 유전자 CaHSTF1을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 식물의 방어관련 식물특이 전사인자 유전자 CaHSTF1 및 이에 의해 코딩되는 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 상기 유전자의 발현을 억제하는 벡터를 제공하는 것이다.
더 나아가, 본 발명은 상기 CaHSTF1 유전자를 식물체에 도입하여 병 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제작하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 분리된 유전자 CaHSTF1를 제공한다.
상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 식물세포 및 식물체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는, 상기 유전자 CaHSTF1의 프로모터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는, 고추의 전사조절 유전자 CaHSTF1을 TRV 벡터에 재조합하여 구축된 VIGS (virus induced gene silencing)용 벡터 pTRV2- CaHSTF1을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는, 고추의 전사조절 유전자 CaHSTF1을 TRV 벡터에 재조합하여 구축된 VIGS (virus induced gene silencing)용 벡터 pTRV2- CaHSTF1 로 형질전환되어 CaHSTF1 유전자의 발현이 억제된 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체를 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명은 식물의 방어관련 식물특이 전사인자를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 CaHSTF1 유전자, 그 상동형 유전자(homologs) 및 그 변이형 유전자 (variants)를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CaHSTF1 단백질 또는 변이형 단백질 (variants)을 제공한다.
상기 CaHSTF1 유전자의 "상동형 유전자(homologs)"는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CaHSTF1 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 유전자를 뜻한다. 따라서 상동형 유전자의 범주에는 발현 시 서열번호 2로 표시되는 CaHSTF1 단백질을 생산할 수 있는 모든 종류의 유전자가 포함된다.
상기 CaHSTF1 단백질의 "변이형 단백질(variants)"은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CaHSTF1 단백질 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실, 부가, 삽입 또는 치환시킨 단백질을 의미하며, 상기 CaHSTF1 유전자의 "변이형 유전자 (variants)"는 CaHSTF1 단백질의 변이형 단백질을 코딩하는 모든 유전자를 의미한다. 상기 CaHSTF1 단백질의 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것이 바람직하며, 상기 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다(도 1).
도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 CaHSTF1은 하나의 HSTF 도메인과 1개의 nuclear localization signal을 가지는 것으로 나타났다. 또한, CaHSTF1 cDNA 핵산 서열은 1729bp (서열번호 1)이며, 242 개의 아미노산 (서열번호 2)을 인코딩 (encoding)하는 729개의 뉴클레오타이드 (neucleotide)로 이루어진 하나의 ORF를 가지고 있다. 도 2 및 도 3은 본 발명에 의한 CaHSTF1 단백질의 아미노산 서열을 다른 종의 HSTF와 비교하고, 아미노산 서열 유사성에 기초한 계통수를 나타낸 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는, 비생물적 또는 생물적 스트레스에 특이적으로 발현되는 상기 유전자 CaHSTF1의 프로모터를 제공한다. 상기 비생물적 스트레스는 저온, 고온, 가뭄, 염분, 화학물질 등을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니나 온도 스트레스 또는 살리실산, 에테폰일 수 있다. 상기 생물적 스트레스는 비병원균 또는 병원균을 포함하여, 이에 한정되는 것은 아니나 TMV-P0일 수 있다.
도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, CaHSTF1의 프로모터 부위에는 3개의 W-box와 여러 종류의 전사인자(CRT/DRE, MYB:전사조절인자)들이 결합할 수 있는 요소(element)를 가지고 있다. W-box는 여러 종류의 생물 혹은 비생물에 의한 식물 스트레스 반응에서 중요한 역할을 하고 있는 WRKY 전사 조절 인자가 결합하는 부위로 알려져 있다(Thomas Eulgem and Imre E Somssich, Current Opinion in Plant Biology 2007, 10:366-371). 바이러스에 의해 유도되는 저항성 반응에 중요한 역할을 하고 있는 WRKYd가 VIGS를 통해 발현이 제한될 경우, 본 발명에 의한 CaHSTF1의 발현 또한 줄어드는 것을 통해 WRKYd가 CaHSTF1의 프로모터에 있는 W-box에 결합하는 것을 알 수 있다(도 5a 및 도 5b 참조). DRE/CRT(dehydration-responsive element/C-repeat)은 저온, 가뭄, 염분 등의 비생물적 스트레스 유도 유전자 발현에서 주요한 cis-acting 요소로서 초기 스트레스 신호전달에 기능을 하는 것으로 알려져 있다(Kazuko Yamaguchi-Shinozaki and Kazuo Shinozakiet, TRENDS in Plant Science Vol.10 No.2 February 2005).
이처럼 CaHSTF1의 프로모터에 대한 연구를 통해, CaHSTF1의 조절을 담당하는 여러 전사조절 인자를 유추하고 스트레스에 반응하는 기작을 알아낼 수 있었다. 프로모터 부위를 살펴본 바로는 CaHSTF1은 프로모터에 열충격에 반응하는 인자가 결합할 요소를 가지고 있지 않으나 CaHSTF1의 단백질은 HSP(Heat Shock Protein)과 결합할 수 있는 구조를 가지고 있다. 이는 병원균에 의해 유도되는 병저항성 반응의 일환으로 온도조절인자가 유도될 수 있으며 이러한 중요한 기능을 하는 것이 CaHSTF1임을 높이 시사하고 있다.
본 발명은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 고추식물 유래의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 이에 한정되는 것은 아니나 상기 재조합 벡터는 pBI101::GUS 벡터일 수 있다. 상기 재조합 벡터에는 GUS 리포터 유전자 대신에 발현을 원하는 목표유전자를 삽입시킬 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 상기 프로모터가 바이너리(binary) 벡터의 외래 유전자 앞에 삽입될 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드와 함께 존재시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 BR과 BL을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으므로, 예컨대, pGA 계열, pCG 계열, pCIT 계열, pGPTV 계열, pBECK2000 계열, BiBAC 계열, 및 pGreen 계열 벡터 등을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 용이하게 입수가능한 pBI101 (Clontech, 미국)을 사용하는 것이 좋다.
본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 상기 재조합 벡터가 바이너리벡터인 경우에는 Floral dip 방법 (Clough 와 Bent, 1998, The Plant Journa)에 따라 식물체를 형질전환시키고, 트랜전트발현벡터인 경우에는 입자 충격(Particle bombardment) 방법(Lacorte et al., 1997, Plant Cell Reports)에 따라 식물체를 형질전환시킬 수 있다. 본 발명에서 식물체는 쌍자엽 혹은 단자엽 식물, 유성생식 혹은 무성생식 식물에 상관없이 어떤 식물체 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시킨 후, 형질전환된 식물체에 비병원균, 병원균, 고온 또는 식물 방어관련 신호물질 등을 처리하여 상기 식물체 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 것을 특징으로 하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 목적 단백질은, 모든 종류의 단백질일 수 있으며, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질 및 셀룰로즈를 분해할 수 있는 효소이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 목적 단백질의 일례로는, 인터루킨, 인터페론 등을 들 수 있다.
본 발명에 의한 CaHSTF1의 병저항성 관련 여부를 조사하기 위해 다양한 종류의 생물 또는 비생물 스트레스에 대한 상기 유전자의 발현 양상을 측정하였다.
우선 CaHSTF1은 고추에 저항성을 가지고 있는 TMV-P0를 처리했을 때 24℃ 및 34℃에서 발현이 증가하는 것으로 나타났다 (도 6a, 도 6b 및 도 10a 참조). 그리고 고온에 노출되었을 시에도 발현이 증가하는 것으로 나타났다(도 9a 참조). CaHSTF1이 다른 자극물질을 처리할 경우에도 발현이 증가하는지 알아보기 위해 식물의 방어반응에 관련된 신호전달 경로 (signaling pathway)의 신호 (signal) 분자로 알려진 살리실산 (salicylic acid, SA) 및 에테폰 (ethephon)을 처리하였다. 그 결과 CaHSTF1의 전사 (transcripts)는 살리실산(SA)과 에테폰(ethephon) 처리에 의해 매우 늦은 시간 내에 발현이 증가하였다 (도 13a 및 도 13b 참조).
바이러스-유도 유전자 침묵 (Virus-inducing gene silencing, VIGS) 방법 (Chung, E., Seong, E., Kim, Y.-C., Eun Joo Chung, E. J., Oh, S.-K., Lee, S., Park, J. M., Joung, Y. H., and Choi, D.(2004) A method of high frequency virus-induced gene silencing in chili pepper (Capsicum annuum L. cv. Bukang).Mol. Cells 17: 377-380.; Ratcliff, F., Martin-Hernandez, A.M. and Baulcombe, D.C. (2001) Tobacco rattle virus as a vector analysis of gene function by silencing. Plant J. 25, 237-245)을 이용하여 고추에서 CaHSTF1 유전자의 발현을 감소시킨 녹다운 (knockdown) 식물을 만들고 여기에 TMV-P0를 처리하였을 때 식물이 어떤 표현형을 보이는지 관찰한 결과, 24℃에서는 TMV-P0에 의해 유도되는 과민성 세포 사멸 (hypersensitive cell death)이 감소하는 표현형을 관찰하였다(도 7a 및 7b 참조). 또한 병 반응 동안 관련된 유전자인 PR 유전자들이 24℃에서는 발현이 감소하는 것으로 확인되었다 (도 8a ~ 8e 참조). 그리고 34℃에서는 TMV-P0 감염시 세포 사멸(cell death)의 표현형이 24℃에서의 과민성 세포 사멸 (hypersensitive cell death)과 유사하게 나타나는 것을 관찰하였다 (도 11 참조). 또한 병 반응 동안 관련된 PR 유전자들의 발현이 증가하고, HSP18의 발현이 감소하는 것을 확인하였다 (도 12a ~ 도 12d 참조).
이상에서 본 발명에 의한 CaHSTF1은 식물 방어 반응에 중요 요소로 기능을 한다 할 것이다.
세포 내 위치를 확인하기 위한 GFP-융합 단백질 타겟팅 (GFP-fused protein targeting) 실험을 통하여 핵 안에 위치하고 있다는 것으로 확인되었다 (도 14a 및 14b 참조).
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 이를 포함하는 형질전환 식물 세포 및 식물체를 제공한다.
본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 본 발명의 발현 벡터에 포함되는 유전자는 CaHSTF1을 코딩하는 염기서열을 포함하며, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 것이다.
상기 유전자를 삽입하기 위하여 사용되는 벡터로는 일반적인 식물 형질전환용 발현 벡터이면 어느 것이든 무방하나, 본 발명에서는 CaHSTF1 유전자를 삽입하기 위한 벡터로 식물 형질전환용 pCAMBIA2300 벡터나 pCAMBIA2300 M2 HA2 벡터 등을 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 유전자를 보유하는 형질전환 식물 세포를 제공한다. 본 발명의 벡터가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될 수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는, 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체 (protoplast), 잎 절편 (leaf section) 및 캘러스 (callus)를 포함한다. 발현 벡터는 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol) 방법, 전기천공법 (electroporation), 아그로박테리움 (Agrobacterium)에 의해 매개되는 전달 및 입자 충격(particle bombardment) 방법과 같은 공지의 방법에 의하여 식물 세포에 도입될 수 있다.
본 발명은 상기 유전자를 보유하는 형질전환 식물체를 제공한다. 상기 식물체는 그 종류에는 특별한 제한이 없으며, 상기 식물세포를 조직배양 방법으로 재분화시켜 제조되는 병저항성이 유도된 형질전환 식물체일 수 있다. 본 발명의 형질전환 식물을 얻기 위하여 수행하는 조직 배양을 통한 재분화는 일반적인 형질전환 식물체 제조 공정을 통해 수행하는 것이 바람직하다.
상술한 바와 같이, 고추에서 유래한 신규 유전자 CaHSTF1는 TMV-P0, 고온, SA 및 에테폰 (ethephon) 처리에 의해 발현이 유도되고, 식물의 방어 반응에 관련이 있다는 것이 확인됨으로써, 본 발명은 저항성 식물체의 육종을 위한 재료를 제공하여 고온에서 효과적인 저항성을 갖는 식물체 제작 및 식물체의 방어 반응 메커니즘 연구에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 CaHSTF1의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
도 2는 다른 종의 HSTF (heat shock transcription factor)와 본 발명에 의한 CaHSTF1 cDNA로부터 유추된 아미노산 서열을 비교한 도면이다. Capsicum annuum (CaHSTF1), Arabidopsis thaliana (AT-HSFB1, AT-HSFB2A, AT-HSFB2B, AT-HSFB3, HSFB4)의 서열을 나타낸다.
도 3은 아미노산 서열의 유사성에 기초하여 본 발명에 의한 CaHSTF1과 다른 HSTF와의 예측되는 진화적 관계를 나타내는 계통수이다. 수평선의 길이는 연관된 서열 사이의 비유사성을 나타내고, 선 아래의 숫자는 근접한 노드로부터의 상대적 거리를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명에 의한 CaHSTF1 프로모터 부위의 식물 조절 DNA 요소를 나타내는 도면과, 본 발명에 의한 CaHSTF1의 프로모터의 염기서열(서열번호 3)을 나타내는 도면이다.
도 5a 및 5b는 TMV-P0 접종에 따른 CaWRKYd 침묵 식물에서의 본 발명에 의한 CaHSTF1 유전자 발현 양상을 보인 도면이다.
도 6a ~ 6d는 24℃에서 TMV-P0의 접종에 의한 본 발명에 의한 CaHSTF1, CaPR-1 및 CaHSP18의 발현을 RT-PCR 및 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 총 RNA는 접종 후 0, 24, 48, 72 시간에 잎으로부터 추출되었다 (HAI). 대조군으로 이용된 잎은 버퍼와 카보런덤만으로 모조-접종 (mock-inoculation) 되었다. 수치는 CaActin 유전자의 발현으로 표준화된 mRNA 수준을 나타낸다.
도 7a 및 7b는 본 발명에 의한 CaHSTF1 유전자가 칠레 고추 (Capsicum annuum) 식물에서 침묵한 것을 나타낸 사진과 CaHSTF1 유전자가 침묵한 식물에서 HR lesion이 대조군에 비해 감소한 것을 나타낸 그래프이다. 2주 된 칠레 고추 유묘에 아그로인필트레이션 (agroinfiltration)에 의해 pTRV1 및 pTRV2-CaHSTF1 벡터가 접종되었다. 4주 후, 상부 잎들에 TMV-P0가 접종되었고, 사진은 24℃에서 TMV-P0가 접종된 후 3일 후 pTRV2 및 pTRV2-CaHSTF1의 잎을 나타낸다.
도 8a ~ 8f는 24℃에서 TMV-P0 접종에 따른 CaHSTF1 침묵 식물에서의 고추 병 관련 (Capsicum annuum pathogenesis - related, CaPR) 유전자의 발현 양상을 나타낸다. qRT-PCR을 이용하여 pTRV2 및 pTRV2-CaHSTF1 침묵 식물 잎에서의 CaPR 유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸다. 총 RNA는 TMV-P0 접종 후 24, 48, 및 72 시간에 잎으로부터 추출되었다. 수치는 CaActin 유전자의 발현으로 표준화된 mRNA 수준을 나타낸다.
도 9a ~ 도 9g는 고온 처리에 의한 Capsicum annuum CaHSTF1 , 고추 병 관련 (Capsicum annuum pathogenesis - related, CaPR) 유전자 및 고온 관련(Capsicum annuum heat shock protein18 , CaHSP18) 유전자의 발현양상을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다.
도 10a ~ 도 10f는 34℃에서 TMV-P0의 접종에 의한 본 발명에 의한 CaHSTF1 , 고추 병 관련 (Capsicum annuum pathogenesis - related, CaPR) 유전자 및 고온 관련(Capsicum annuum heat shock protein18 , CaHSP18)의 발현 양상을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 총 RNA는 접종 후 0, 24, 48, 72 시간에 잎으로부터 추출되었다 (HAI). 대조군으로 이용된 잎은 버퍼와 카보런덤만으로 모조-접종 (mock-inoculation) 되었다. 수치는 CaActin 유전자의 발현으로 표준화된 mRNA 수준을 나타낸다.
도 11은 본 발명에 의한 CaHSTF1 유전자가 칠레 고추 (Capsicum annuum ) 식물에서 침묵한 것을 나타낸 사진이다. 2주 된 칠레 고추 유묘에 아그로인필트레이션 (agroinfiltration)에 의해 pTRV1 및 pTRV2-CaHSTF1 벡터가 접종되었다. 4주 후, 상부 잎들에 TMV-P0가 접종되었고, 사진은 34℃에서 TMV-P0가 접종된 후 3일 후 pTRV2 및 pTRV2-CaHSTF1의 잎을 나타낸다.
도 12a ~ 도 12d는 34℃에서 TMV-P0 접종에 따른 CaHSTF1 침묵 식물에서의 고추 병 관련 (Capsicum annuum pathogenesis - related, CaPR) 유전자 및 고온 관련(Capsicum annuum heat shock protein18 , CaHSP18)의 발현 양상을 나타낸다. qRT-PCR을 이용하여 pTRV2 및 pTRV2-CaHSTF1 침묵 식물 잎에서의 CaPR 유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸다. 총 RNA는 TMV-P0 접종 후 24, 48, 및 72 시간에 잎으로부터 추출되었다. 수치는 CaActin 유전자의 발현으로 표준화된 mRNA 수준을 나타낸다.
도 13a 및 13b는 방어반응에 관련된 신호전달 분자에 의해 Capsicum annuum CaHSTF1이 유도되어 발현되는 것을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다.
도 13a는 살리실산 (SA)으로 처리된 칠레 고추 식물 (Capsicum annuum cv. Bukang)에서 CaHSTF1의 전사가 확인된 결과를 나타낸다. 고추 잎에 10mM SA가 분무되거나 모조(mock)로 10% 에탄올이 처리되었다.
도 13b는 에테폰 (ethephon)으로 처리된 칠레 고추 식물 (Capsicum annuum cv. Bukang)에서 CaHSTF1의 전사가 확인된 결과를 나타낸다. 고추 잎에 10mM 에테폰이 분무되거나 모조(mock)로 10% 에탄올이 처리되었다.
도 14a 및 14b는 GFP :: CaHSTF1 융합 유전자의 개략적 구조 및 GFP :: CaHSTF1 융합 단백질의 세포 내 위치를 나타낸다.
도 14a는 GFP 대조군의 세포 내 위치를 나타낸다.
도 14b는 GFP::CaHSTF1 융합 단백질의 세포 내 위치를 나타낸다. 상기 GFP::CaHSTF1 융합 구조체는 PEG-매개 형질전환에 의해 고추 원형질체로 도입되었다. 도입된 유전자의 발현은 형광 또는 광학 현미경관찰로 24시간 후에 확인되었다.
도 2는 다른 종의 HSTF (heat shock transcription factor)와 본 발명에 의한 CaHSTF1 cDNA로부터 유추된 아미노산 서열을 비교한 도면이다. Capsicum annuum (CaHSTF1), Arabidopsis thaliana (AT-HSFB1, AT-HSFB2A, AT-HSFB2B, AT-HSFB3, HSFB4)의 서열을 나타낸다.
도 3은 아미노산 서열의 유사성에 기초하여 본 발명에 의한 CaHSTF1과 다른 HSTF와의 예측되는 진화적 관계를 나타내는 계통수이다. 수평선의 길이는 연관된 서열 사이의 비유사성을 나타내고, 선 아래의 숫자는 근접한 노드로부터의 상대적 거리를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명에 의한 CaHSTF1 프로모터 부위의 식물 조절 DNA 요소를 나타내는 도면과, 본 발명에 의한 CaHSTF1의 프로모터의 염기서열(서열번호 3)을 나타내는 도면이다.
도 5a 및 5b는 TMV-P0 접종에 따른 CaWRKYd 침묵 식물에서의 본 발명에 의한 CaHSTF1 유전자 발현 양상을 보인 도면이다.
도 6a ~ 6d는 24℃에서 TMV-P0의 접종에 의한 본 발명에 의한 CaHSTF1, CaPR-1 및 CaHSP18의 발현을 RT-PCR 및 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 총 RNA는 접종 후 0, 24, 48, 72 시간에 잎으로부터 추출되었다 (HAI). 대조군으로 이용된 잎은 버퍼와 카보런덤만으로 모조-접종 (mock-inoculation) 되었다. 수치는 CaActin 유전자의 발현으로 표준화된 mRNA 수준을 나타낸다.
도 7a 및 7b는 본 발명에 의한 CaHSTF1 유전자가 칠레 고추 (Capsicum annuum) 식물에서 침묵한 것을 나타낸 사진과 CaHSTF1 유전자가 침묵한 식물에서 HR lesion이 대조군에 비해 감소한 것을 나타낸 그래프이다. 2주 된 칠레 고추 유묘에 아그로인필트레이션 (agroinfiltration)에 의해 pTRV1 및 pTRV2-CaHSTF1 벡터가 접종되었다. 4주 후, 상부 잎들에 TMV-P0가 접종되었고, 사진은 24℃에서 TMV-P0가 접종된 후 3일 후 pTRV2 및 pTRV2-CaHSTF1의 잎을 나타낸다.
도 8a ~ 8f는 24℃에서 TMV-P0 접종에 따른 CaHSTF1 침묵 식물에서의 고추 병 관련 (Capsicum annuum pathogenesis - related, CaPR) 유전자의 발현 양상을 나타낸다. qRT-PCR을 이용하여 pTRV2 및 pTRV2-CaHSTF1 침묵 식물 잎에서의 CaPR 유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸다. 총 RNA는 TMV-P0 접종 후 24, 48, 및 72 시간에 잎으로부터 추출되었다. 수치는 CaActin 유전자의 발현으로 표준화된 mRNA 수준을 나타낸다.
도 9a ~ 도 9g는 고온 처리에 의한 Capsicum annuum CaHSTF1 , 고추 병 관련 (Capsicum annuum pathogenesis - related, CaPR) 유전자 및 고온 관련(Capsicum annuum heat shock protein18 , CaHSP18) 유전자의 발현양상을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다.
도 10a ~ 도 10f는 34℃에서 TMV-P0의 접종에 의한 본 발명에 의한 CaHSTF1 , 고추 병 관련 (Capsicum annuum pathogenesis - related, CaPR) 유전자 및 고온 관련(Capsicum annuum heat shock protein18 , CaHSP18)의 발현 양상을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 총 RNA는 접종 후 0, 24, 48, 72 시간에 잎으로부터 추출되었다 (HAI). 대조군으로 이용된 잎은 버퍼와 카보런덤만으로 모조-접종 (mock-inoculation) 되었다. 수치는 CaActin 유전자의 발현으로 표준화된 mRNA 수준을 나타낸다.
도 11은 본 발명에 의한 CaHSTF1 유전자가 칠레 고추 (Capsicum annuum ) 식물에서 침묵한 것을 나타낸 사진이다. 2주 된 칠레 고추 유묘에 아그로인필트레이션 (agroinfiltration)에 의해 pTRV1 및 pTRV2-CaHSTF1 벡터가 접종되었다. 4주 후, 상부 잎들에 TMV-P0가 접종되었고, 사진은 34℃에서 TMV-P0가 접종된 후 3일 후 pTRV2 및 pTRV2-CaHSTF1의 잎을 나타낸다.
도 12a ~ 도 12d는 34℃에서 TMV-P0 접종에 따른 CaHSTF1 침묵 식물에서의 고추 병 관련 (Capsicum annuum pathogenesis - related, CaPR) 유전자 및 고온 관련(Capsicum annuum heat shock protein18 , CaHSP18)의 발현 양상을 나타낸다. qRT-PCR을 이용하여 pTRV2 및 pTRV2-CaHSTF1 침묵 식물 잎에서의 CaPR 유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸다. 총 RNA는 TMV-P0 접종 후 24, 48, 및 72 시간에 잎으로부터 추출되었다. 수치는 CaActin 유전자의 발현으로 표준화된 mRNA 수준을 나타낸다.
도 13a 및 13b는 방어반응에 관련된 신호전달 분자에 의해 Capsicum annuum CaHSTF1이 유도되어 발현되는 것을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다.
도 13a는 살리실산 (SA)으로 처리된 칠레 고추 식물 (Capsicum annuum cv. Bukang)에서 CaHSTF1의 전사가 확인된 결과를 나타낸다. 고추 잎에 10mM SA가 분무되거나 모조(mock)로 10% 에탄올이 처리되었다.
도 13b는 에테폰 (ethephon)으로 처리된 칠레 고추 식물 (Capsicum annuum cv. Bukang)에서 CaHSTF1의 전사가 확인된 결과를 나타낸다. 고추 잎에 10mM 에테폰이 분무되거나 모조(mock)로 10% 에탄올이 처리되었다.
도 14a 및 14b는 GFP :: CaHSTF1 융합 유전자의 개략적 구조 및 GFP :: CaHSTF1 융합 단백질의 세포 내 위치를 나타낸다.
도 14a는 GFP 대조군의 세포 내 위치를 나타낸다.
도 14b는 GFP::CaHSTF1 융합 단백질의 세포 내 위치를 나타낸다. 상기 GFP::CaHSTF1 융합 구조체는 PEG-매개 형질전환에 의해 고추 원형질체로 도입되었다. 도입된 유전자의 발현은 형광 또는 광학 현미경관찰로 24시간 후에 확인되었다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1.
DNA
분리, 서열분석 및 프로모터의 분리
담배 모자이크 바이러스-P0(TMV-P0)를 감염시킨 부강 고추에서의 마이크로어레이 결과, 몇몇 전사인자가 저항성 반응 동안 특이적으로 발현이 증가하였는데, 이들 중 TMV-P0에 반응하여 가장 많이 발현이 증가한 열 반응에 관여하는 고추 열충격전사인자 유전자(CaHSTF1)를 추출하였다.
서열결정 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 CaHSTF1은 하나의 HSTF 도메인과 1개의 nuclear localization signal을 가지는 것으로 나타났다. CaHSTF1 cDNA 핵산 서열은 1729bp (서열번호 1)이며, 242 개의 아미노산 (서열번호 2)을 인코딩 (encoding)하는 729개의 뉴클레오타이드 (neucleotide)로 이루어진 하나의 ORF를 가지고 있었다. 상기 아미노산 서열은 애기장애에서 유래한 HSTF와 대비되었는데, 슈도모나스 시링게, 열 및 H202에 반응하는 애기장대 열충격 전사인자, AT-HSFB3와 47%의 서열 상동성을 보였다 (도 2 및 3 참조).
CaHSTF1의 프로모터를 분리하기 위해, 2개의 다른 유전자 특이적 프라이머를 ORF 내에서 고안하였다. 도 1에 나타난 유전자 특이적 프라이머(GSP) 1 및 2를 이용하여, 810 bp의 CaHSTF1의 프로모터(서열번호 3)를 분리하였다. 이때, 프로모터는 제조자의 지시에 따라 Universal Genome WalkerTM Kit (Clontech, USA)를 이용하여 분리하였다. 프로모터 부위를 포함하는 클론은 서열이 결정되었고, web signal scan program: PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)을 이용하여 분석되었다. 그 결과 도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, CaHSTF1의 프로모터는 3개의 TATA box 및 3개의 W-box 그리고 여러 종류의 전사인자(CRT/DRE, MYB:전사조절인자)들이 결합할 수 있는 요소(element)를 가지는 것으로 나타났다.
실시예
2. 식물 재배 및 병원균 접종에 따른
CaHSTF1
발현
TMV의 P0 병원형에는 저항성인 고추 식물체 (Capsicum annuum L. cv. Bugang)를 식물 재료로 이용하였다. 식물체를 6h 광/ 8h 암의 광주기로 23℃의 생장 챔버에서 생장시켰다. 2달 된 식물체로부터 수거된 건강하고 잘 벌어진 잎을 병원균 접종 및 핵산 추출에 이용하였다. CaCl2-함유 페트리 디쉬에 TMV-P0가 감염된 담배(Nicotiana tabacum cv. Samsun) 잎과 함께 두었다. 5mM EDTA을 함유하는 0.25M 포스페이트 버퍼와 함께 감염된 잎을 갈아서 TMV-P0를 함유하는 잎 수액을 준비하였다. 식물에 접종하기 위해, 바이러스를 함유하는 수액을 고추 식물체의 4 또는 5번째의 완전히 벌어진 잎의 표면에 도포하고 카보런덤 (mesh 500)(Hayashi Chemical, Japan)으로 문질렀다. 모조-접종 식물체는 포스페이트 버퍼 및 카보런덤만으로 문질렀다. 시스템적 반응을 확인하기 위해, 2개 아래의 잎을 TMV-P0 수액으로 접종하였고 상부의 접종되지 않은 잎을 접종 후 0, 24, 48, 및 72h 시간에 수거하였다(DAI).
상기와 같은 TMV-P0의 접종에 의한 본 발명에 의한 CaHSTF1 발현 양상을 RT-PCR 및 qRT-PCR로 분석한 결과로 나타내었다(도 6a ~ 6d).
이때, RNA 추출, RT-PCR 및 정량 리얼타임 PCR 분석 (quantitative real-time PCR analysis)은 다음과 같이 하였다. 50mg의 식물 재료를 액체 질소에서 막자사발 및 막자에 의해 갈아 약간 하얀 분말이 되었다. 이 분말을 0.5ml RNA 추출 버퍼 (0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M LiCl, 10 mM EDTA, 및 1 % SDS) 및 물-포화 페놀 (pH 4.5)과 혼합되는 1.5ml e-tube에 옮긴 다음, 강하게 볼텍싱 하였다. 같은 부피의 클로로포름을 상기 튜브에 추가한 다음, 강하게 볼텍싱 하였다. 상기 튜브를 4 ℃에서 10분 동안 13,000 rpm으로 원심분리 하였다. 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 0.5ml 클로로포름을 추가하고 강하게 볼텍싱 하였다. 상기 튜브를 4 ℃에서 10분 동안 13,000 rpm으로 원심분리 하였다. 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 0.5ml의 4M LiCl을 추가하고 부드럽게 뒤집은 다음 80 ℃에서 밤새 배양하였다. 4 ℃에서 30분 동안 13,000 rpm으로 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 펠릿을 70% 에탄올로 세척하였고 DEPC-처리 물에 용해시켰다.
추출된 총 RNA를 RT-PCR 분석을 위해 이용하였다. 5 마이크로그램 RNA 샘플들을 MMLV-역 전사효소 (Promega, USA)를 이용하여 역전사 하였다. 각 첫 번째-가닥 (first-strand) cDNA 산물을 CaHSTF1 3´-UTR, CaHSP18 , CaPR -1, -2, -4, -5, -10, actin , 프라이머들 (표 1)을 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 리얼타임-PCR은 KAPA SYBR FAST qPCR Kit (KAPABIOSYSTEM) 및 유전자-특이 프라이머를 이용하여 LightCycler 480 (Roche, Germany)에서 수행하였다. 특정 mRNA 검출하기 위해 사용된 qRT-PCR 프라이머 조합(Combination of qRT-PCR primer for specific mRNA detection)이 표 1에 나타나 있다.
| Gene |
|
Sequence |
|
CaHSTF1
|
Forward | CCT CAG ATT AAC TGG CAA AG (서열번호 4) |
| Reverse | CAC TAA AAC TTC CGC TAT GG (서열번호 5) | |
|
CaHSP18
|
Forward | ACA AGT CCA TGC AGA TCA ACT (서열번호 6) |
| Reverse | AAT CAA ACT CTC ACA ACA TTT TCT (서열번호 7) | |
|
CaPR
-1
|
Forward | GAG GAC AAC GTC CGT ATG GT (서열번호 8) |
| Reverse | AAC TCC AGT TAC TGC ACC ATT AGA (서열번호 9) | |
|
CaPR
-2
|
Forward | CTA CTT AAG CTT TGC AAG ACA CCA (서열번호 10) |
| Reverse | AGA TCT CTT TCC TCA TCG TCA CTT (서열번호 11) | |
|
CaPR
-4
|
Forward | GAA CAC AAG CAA CGG TGA GA (서열번호 12) |
| Reverse | GGC ACT TGT TTA GGC AGA GC (서열번호 13) | |
|
CaPR
-5
|
Forward | TTG CCA AAG TTG GAC TAC TGA TTA (서열번호 14) |
| Reverse | TCA ACC AAA TTG AAC AAA AAG AGA (서열번호 15) | |
|
CaPR
-10
|
Forward | CTG TCT ATG TTT AAG CCA ATG ACC (서열번호 16) |
| Reverse | AAA GTT CTT TCC ATG ACA ACC AAT (서열번호 17) | |
|
CaActin
|
Forward | GTG CTG AGA GAT TCC GTT GC (서열번호 18) |
| Reverse | ATG GTT GAG CCA CCA CTG AG (서열번호 19) |
CaHSTF1 : 고추에서 CaHSTF1 유전자를 침묵(silencing) 시킨 식물에서 CaHSTF1 유전자가 knock-down 되었는지 확인하는데 사용한 프라이머(primer)
CaPR -1/-2/-4/-5/-10/ CaHSP18은 고추에 존재하는 여러 가지 병 관련 유전자들(pathogen-related genes) 및 고온 관련 유전자의 종류이며 대조군과 CaHSTF1을 침묵(silencing) 시킨 식물에서 여러 가지 PR 유전자들의 발현 양상을 조사하기 위해 사용한 프라이머(primer)
CaActin : 고추에 존재하는 house keeping 유전자로 qRT-PCR 실험시 cDNA양을 보정해 주는데 사용한 프라이머(primer)
도 6a는 CaHSTF1 cDNA 3'-UTR 특이 프라이머로 수행된 RT-PCR 분석 결과를 나타내고 도 6b ~ 6d는 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸다. 상기 도면들에 나타난 바와 같이 본 발명에 의한 CaHSTF1는 다수의 병원균에 의해 고추에서 유도되는 것으로 알려진 CaPR -1 유전자와 동일한 유도패턴 및 HR-특이적 발현 패턴을 보였다.
실시예
3. 바이러스 유도 유전자 침묵 (
virus
-
induced
gene
silencing
, VIGS)을 이용한 정상온도에서의 본 발명에 의한
CaHSTF1
기능 분석
PCR에 의해 증폭된 CaHSTF1의 187-bp 5´UTR 단편을 pTRV2 벡터 (Liu et al., 2002; Chung et al ., 2004)의 EcoRI 사이트에 클론하였다. PCR 프라이머로 5´-CTCCGTGCATAACAACAAC - 3´(서열번호 20) 및 5´- CCACAA GGATGTTACACACA - 3´(서열번호 21)을 이용하였다. pTRV2 및 pTRV2-CaHSTF1로 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens strain GV3101)를 형질전환시켰고, 형질전환된 세포를 50 mg 카나마이신 (kanamycin), 및 100 mg 리팜피신 (rifampicin)을 함유하는 YEP 배지에서 선발하였다. 형질전환체를 28℃에서 생장시키고, 원심분리 후 박테리아는 20 mM 시트르산 (pH 5.2), 2% 수크로오스, 및 200 μM 아세토시링원 (acetosyringone)을 함유하는 버퍼에서 A600 0.3이 될 때까지 재현탁하였고, 2-4 시간 동안 실온에서 세워 두었다. 형질전환체 배양물은 TRV1 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜메파시엔스 (A. tumifaciens)와 1:1 비율로 혼합하였고 (OD600 nm, 0.2), 혼합물을 부광 칠레 고추 식물에 인필트레이션 시켰다. 각 실험을 위해, 50개의 칠레 고추 식물체에 pTRV2 벡터 및 pTRV2- CaHSTF1-5´ UTR 벡터를 각각 접종하였다. 상기 접종 후 1개월 후, CaHSTF1-침묵 식물에 TMV-P0을 접종하였다. 잎은 RNA 추출에 이용되었다.
트리판 블루 염색을 이용하여 방법에 따라 과민성 세포 사멸 (hypersensitive cell death)을 시각화하였다. pTRV2 및 pTRV2- CaHSTF1-5´UTR 침묵 식물체로부터 잘라낸 잎을 트리판 블루 용액 (10 g phenol, 10 ml glycerol, 10 ml lactic acid, 10 ml water and 0.02 g trypan blue)을 함유하는 50ml 팔콘 튜브로 옮겼다. 트리판 블루 용액을 5분 동안 끓였다. 그 다음 5분 동안 진공 상태에 노출시켰다. 하룻밤 동안 암 상태에서 보관 후, chloral hydrate 용액 (2.5g/ml, Fluka, Germany)에 옮겨 하루 동안 탈색시켰다. 과민성 세포 사멸 (hypersensitive cell death)은 점 모양으로 나타난다.
도 7a는 본 발명에 의한 CaHSTF1 유전자가 칠레 고추 (Capsicum annuum ) 식물에서 침묵한 것을 나타낸 사진이고, 도 7b는 CaHSTF1 유전자가 침묵한 식물에서 HR lesion이 대조군에 비해 감소한 것을 나타낸 그래프이다. 2주 된 칠레 고추 유묘에 아그로인필트레이션 (agroinfiltration)에 의해 pTRV1 및 pTRV2-CaHSTF1 벡터를 접종하였다. 4주 후, 상부 잎들에 TMV-P0를 접종하였고, 사진은 24℃에서 TMV-P0가 접종된 후 3일 후 pTRV2 및 pTRV2-CaHSTF1의 잎을 나타낸다. 상기 도 7b에 나타난 바와 같이, pTRV1 대조군은 약 50 HR lesion을 보이는 반면, CaHSTF1 침묵 잎에서는 약 12 HR lesion으로 80% 감소한 것을 보였다.
도 8a ~ 8f는 TMV-P0 접종에 따른 CaHSTF1 침묵 식물에서의 고추 병 관련 (Capsicum annuum pathogenesis - related, CaPR) 유전자의 발현 양상을 나타낸다. 실시예 2에 제시된 방법에 따라 qRT-PCR을 이용하여 pTRV2 및 pTRV2-CaHSTF1 침묵 식물 잎에서의 CaPR 유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸다. 총 RNA를 TMV-P0 접종 후 24, 48, 72 및 96 시간에 잎으로부터 추출하였다. 수치는 CaActin 유전자의 발현으로 표준화된 mRNA 수준을 나타낸다. 상기 도면들에 나타난 결과들은 CaHSTF1 가 프로그램된 세포죽음 조절을 통한 TMV-P0에 대한 저항성과 관련되어 있다는 것을 나타낸다. 또한, 대부분의 PR 유전자들은 대조군 식물에 비해 CaHSTF1 침묵 식물에서 발현이 감소하였으나, CaWRKYd 발현 수준은 큰 변동이 없었다. 이는 CaHSTF1의 타겟 유전자가 CaPR -1,4,5, 및 10이라는 것을 나타낸다.
실시예
4. 고온 처리에 따른
CaHSTF1
발현
CaHSTF1은 열충격전사인자의 일종이므로, 열에 의해 유도되는지를 확인해 보았다.
도 9a ~ 도 9g는 고온 처리에 의해 Capsicum annuum CaHSTF1이 유도되어 발현되는 것을 CaPR 유전자들 및 CaHSP18 유전자 발현과 함께 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다. 도 10a ~ 도 10f는 34℃에서 TMV-P0의 접종에 의한 본 발명에 의한 CaHSTF1 발현을 CaPR 유전자들 및 CaHSP18 유전자 발현과 함께 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 상기 도면들에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 CaHSTF1은 고온에 의해 그 발현이 증가한다.
실시예
5. 바이러스 유도 유전자 침묵 (
virus
-
induced
gene
silencing
, VIGS)을 이용한 고온에서의 본 발명에 의한
CaHSTF1
기능 분석
온도를 24℃에서 34℃로 변경한 것을 제외하고 실시예 3과 동일한 방법으로 실시하였다.
도 11은 34℃에서 TMV-P0가 접종된 후 3일 후 pTRV2 및 pTRV2-CaHSTF1의 잎을 나타내고, 도 12a ~ 12d는 34℃에서 TMV-P0 접종에 따른 CaHSTF1 침묵 식물에서의 고추 병 관련 (Capsicum annuum pathogenesis - related, CaPR) 유전자 및 고온 관련(Capsicum annuum heat shock protein18 , CaHSP18 ) 의 발현 양상을 나타낸다. qRT-PCR을 이용하여 pTRV2 및 pTRV2-CaHSTF1 침묵 식물 잎에서의 CaPR 유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸다. 총 RNA는 TMV-P0 접종 후 24, 48, 및 72 시간에 잎으로부터 추출되었다. 수치는 CaActin 유전자의 발현으로 표준화된 mRNA 수준을 나타낸다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, CaHSTF1 침묵 식물에서 CaPR-1의 전사수준은 대조군과 동일하고, 열충격 마커유전자 CaHSP18은 현저하게 감소하였다. 34℃에서는 TMV-P0 감염시 세포 사멸(cell death)의 표현형이 24℃에서의 과민성 세포 사멸 (hypersensitive cell death)과 유사하게 나타나는 것을 관찰하였다. CaHSTF1 침묵 식물은 고온 감지능력을 상실하는 것으로 보인다.
실시예
6. 화학물질 처리에 따른
CaHSTF1
발현
2달 된 고추 잎에 10 mM SA 용액, 10 mM 에테폰 (ethephon) 용액을 분무하였다. 가능한 때마다, 다른 대조군 식물 세트에 증류수로 유사하게 처리하였다. 처리 후 제시된 시점에서 잎을 수거하였고, 액체 질소에서 급속 냉동된 후 -80℃에서 보관하였다. 잎은 처리 후 0, 0.5, 1, 2, 6, 12, 24 및 48 h 후 수거하였다.
상기와 같이 방어 신호전달 분자 처리에 의해 Capsicum annuum CaHSTF1이 유도되어 발현되는 것을 실시예 2에 기재된 방법대로 qRT-PCR로 분석한 결과를 도 13a 및 도 13b에 나타냈다. 도 13a는 살리실산 (SA)으로 처리된 칠레 고추 식물 (Capsicum annuum cv. Bukang)에서 CaHSTF1의 전사가 확인된 결과를 나타낸다. 고추 잎에 10 mM SA를 분무하거나 모조(mock)로 10% 에탄올을 처리하였다. 도 13b는 에테폰 (ethephon)으로 처리된 칠레 고추 식물 (Capsicum annuum cv. Bukang)에서 CaHSTF1의 전사가 확인된 결과를 나타낸다. 고추 잎에 10mM 에테폰을 분무하거나 모조(mock)로 10% 에탄올을 처리하였다. 수치는 CaActin 유전자의 발현으로 표준화된 mRNA 수준을 나타낸다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 CaHSTF1은 살리실산 및 에테폰에 의해 유도된다.
실시예
7.
CaHSTF1
세포 내 발현 위치 확인
35S-CaHSTF1 -GFP 융합 단백질을 이용하여 CaHSTF1의 세포 내 위치를 확인하였다. 주형으로 CaHSTF1 cDNA 및 2개의 프라이머 (forward, 5´- GGATCCATGGAGGTATTGGAAGAA - 3´(서열번호 22) 및 reverse, 5´- GGATCCTTTGCATAATTGAGAGATAAAA-3´(서열번호 23))를 이용하여 PCR에 의해 종료 코돈이 없는 전체 길이 (full-length)의 CaHSTF1 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 준비하였다. BamHI 사이트를 포함하는 PCR 산물을 BamHI로 절단하여 GFP 발현 인자에 융합하였다. PCR-증폭된 CaHSTF1 cDNA 단편의 N-터미널 부위를 sGFP 발현 벡터의 N-터미널 부위에 융합하였다. CaHSTF1이 없는 35S-sGFP 벡터를 대조군으로 사용하였다. PEG-형질전환을 이용하여 적절한 융합 구조체 (2~3 μg each of 35S-CaHSTF1 -sGFP or p35S-sGFP)의 플라스미드 DNA를 애기장대 원형질체로 도입하였다. 형광이미지는 fluorescein isothiocyanate filters (an excitation filter of 520 nm and an emission filter of 488)가 장착된 UV light incident fluorescence microscope (Zeiss, Axioskop, Germany)를 이용하여 캡처하였고 그 결과를 도 14a 및 14b에 나타냈다.
도 14a는 GFP 대조군의 세포 내 위치가 나타나 있고, 도 14b에는 GFP::CaHSTF1 융합 유전자의 구조 및 sGFP::CaHSTF1 융합 단백질의 세포 내 위치가 나타나 있다. 도입된 유전자의 발현을 형광 또는 광학 현미경관찰로 24시간 후에 확인하였으며, 그 결과 본 발명에 의한 CaHSTF1은 핵에 위치한 단백질로 확인되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION
<120> A transcription factor gene, CaHSTF1 related to plant defence
response and transgenic plants using the same gene
<130> P11-110617-01-CaHSTF1
<160> 23
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1729
<212> DNA
<213> Capsicum annuum L. cv. Bugang
<400> 1
cacacacaaa aaaaaggttg tgtttgcatt tctcatgaac ttcggagttg tgttaggttt 60
ctattgttgg ggttgggagt tcttaacttc ccttcttctt tactctaccc ctttttctat 120
gtaactaaac aaacaatttt aattattttc tacaaaaaaa aaaaaaaatc tcaaaaaccc 180
aaaaaggggt tgatcatttt gtgtttctct actcatttta cccattttct tgaaaaaaaa 240
aatacaaaaa taagttcatt ttttgtgtat gtttctttct tgttttagca agtttcttgg 300
ttttcaaaaa ctccaacaac aaaggaacaa aaaggggttg attactttgt gtttttctac 360
tcattttacc aattttcttg aaaacaaaaa agtactctca tggtccggtc ctttctgaac 420
tccgtgcata acaacaactt tagtgcatcg tgcatgtgca tgctcttttt gtgtgtgctt 480
ctttcttgtt ttagcaattt tcttggtttt caaaaacccc caacaacaaa aacaacaaca 540
aggggttgat tactttgtgt ttctctactc atttcaccaa ttttcttgtg tgtaacatcc 600
ttgtggccag acccttcctc ggaccccgta tatatacagt gagagcttta gtgcatcgcg 660
ctgcgctttt tgtgtcatgg aggtattgga agaagttcaa atgagtgatc atgacaagag 720
tttgttggac tatgttgtaa tgaggaagtc atcaccatca ccatttctat tgaaaaccta 780
catgttagtt gaaaatccgg cgaccgacga catcgtttct tggaattccg atggatcggc 840
gtttgttgta tggcaaccag cagaatttgc aagagatttg cttccaacac tcttcaaaca 900
tagcaacttt tcaagttttg tcaggcaact taatacttat ggttttcgta aagttacaac 960
gagtcgatgg gagttcagca atgacaagtt caaaaaaggc aaaagggata tattatgtga 1020
tattcataga agaaaagcat ggacaaataa taataataat aataataata acaagaaaga 1080
tttagaagaa gatcaatcat caacttctaa ttcatcatca caatatataa atcttgttga 1140
tgaaaataaa aggttgaaaa tggaaaatgg agttcttaat tctgagcttt cacttatgaa 1200
aaataaatgc aaagaattaa ttgatattgt tagcattttt gctaaaagta attcagaaaa 1260
aaatgaagaa gaaaaaaaga aaaaagatga aaggccaatg ttatttggag taagattgga 1320
agttcaagaa gaaatggaaa gaaaaagaaa aagaattgaa cttaataaaa tagctaatat 1380
ttttatctct caattatgca aataataaag gggagcctca gattaactgg caaagttgct 1440
gctacgggtt cgagcctcga aaacaacgtc cggcagaaac gcaaggtaag gctacttaca 1500
atcgactctt gtaatcgatc catagcggaa gttttagtgc agcggactgt tgttatatgt 1560
aattatatta gtacttattt acatcatttc atgcaaatta gtactagtat taattagcat 1620
gtatacctaa gttgtataaa ttttgcaagt gttatttcat gtgaaatgtt aacatggaat 1680
acaatgtaat aaaacatttt aataaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1729
<210> 2
<211> 242
<212> PRT
<213> Capsicum annuum L. cv. Bugang
<400> 2
Met Glu Val Leu Glu Glu Val Gln Met Ser Asp His Asp Lys Ser Leu
1 5 10 15
Leu Asp Tyr Val Val Met Arg Lys Ser Ser Pro Ser Pro Phe Leu Leu
20 25 30
Lys Thr Tyr Met Leu Val Glu Asn Pro Ala Thr Asp Asp Ile Val Ser
35 40 45
Trp Asn Ser Asp Gly Ser Ala Phe Val Val Trp Gln Pro Ala Glu Phe
50 55 60
Ala Arg Asp Leu Leu Pro Thr Leu Phe Lys His Ser Asn Phe Ser Ser
65 70 75 80
Phe Val Arg Gln Leu Asn Thr Tyr Gly Phe Arg Lys Val Thr Thr Ser
85 90 95
Arg Trp Glu Phe Ser Asn Asp Lys Phe Lys Lys Gly Lys Arg Asp Ile
100 105 110
Leu Cys Asp Ile His Arg Arg Lys Ala Trp Thr Asn Asn Asn Asn Asn
115 120 125
Asn Asn Asn Asn Lys Lys Asp Leu Glu Glu Asp Gln Ser Ser Thr Ser
130 135 140
Asn Ser Ser Ser Gln Tyr Ile Asn Leu Val Asp Glu Asn Lys Arg Leu
145 150 155 160
Lys Met Glu Asn Gly Val Leu Asn Ser Glu Leu Ser Leu Met Lys Asn
165 170 175
Lys Cys Lys Glu Leu Ile Asp Ile Val Ser Ile Phe Ala Lys Ser Asn
180 185 190
Ser Glu Lys Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Lys Asp Glu Arg Pro Met
195 200 205
Leu Phe Gly Val Arg Leu Glu Val Gln Glu Glu Met Glu Arg Lys Arg
210 215 220
Lys Arg Ile Glu Leu Asn Lys Ile Ala Asn Ile Phe Ile Ser Gln Leu
225 230 235 240
Cys Lys
<210> 3
<211> 810
<212> DNA
<213> Capsicum annuum L. cv. Bugang
<400> 3
ctatagggca cgcgtggtcg acggcccggg ctggtaaacg atatacacgt ggatataaac 60
ccttagttct agttaaacaa agagaaacta atctggtcca ctaagcttct gctatacgtt 120
gattttggag aaaggctcga tcataagaat atatggtaca caactttatc ttgcattctt 180
gcaaaaggtt gtttcaatag gtcaaactcg tgatctttac aaccagccaa gactcccttc 240
aaataattaa cttctttaat aatcatttga tataagaaat taactagctc gtttaattcg 300
aattcgcaac gcataaaaca tatccactaa gatgtaaacg ctccctacta agattttctt 360
catttccagg ttcattacta ctaaaaacgt gaaatttcca cgcgtccaaa acattttcat 420
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actacttttt tttttttgtt ttccacccgg tgtccaatac ccacattggg gcttcaacta 600
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atacccaagc tcgaacccga gacctctgat taaaggacgt gtagcagccc caccacggca 720
acacaaccca tatgctggtt tcttcttcta ctgctactat ataagaagaa gtaagcacaa 780
tacaaaactt tcattctttg aaaacaaaaa 810
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> PCR PRIMER
<400> 23
ggatcctttg cataattgag agataaaa 28
Claims (9)
- 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 분리된 유전자(CaHSTF1 ).
- 제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
- 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질.
- 제1항 기재의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제1항 기재의 유전자 또는 제4항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 식물세포.
- 제1항 기재의 유전자 또는 제4항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 식물체.
- 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는, 제1항 기재의 유전자 CaHSTF1의 프로모터.
- 제7항의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
- 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는, 식물의 방어관련 식물특이 전사인자 유전자 CaHSTF1를 TRV 벡터에 재조합하여 구축된 VIGS (virus induced gene silencing)용 벡터 pTRV2-CaHSTF1.
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-
2011
- 2011-08-04 KR KR1020110077866A patent/KR101280107B1/ko not_active IP Right Cessation
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| CN109182345A (zh) * | 2018-08-27 | 2019-01-11 | 河北省农林科学院遗传生理研究所（河北省农林科学院农产品质量安全研究中心） | 小麦HsfA2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法 |
| CN116024256A (zh) * | 2022-10-09 | 2023-04-28 | 南京农业大学 | 一种水稻基因OsHSFA4d的基因工程应用 |
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