CN112409468A - 植物光系统i多克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

植物光系统i多克隆抗体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物光系统I多克隆抗体及其制备方法。本发明设计光系统I相关蛋白的抗原表位以及合成的相应的KLH偶联多肽，以该系列偶联多肽作为免疫原免疫动物获得相应的抗体，用于ELISA法检测植物光系统I相关蛋白的检测试剂，实现了光系统I相关蛋白的全检测和精确定量检测，有利于对光系统I的深入研究。

Description

植物光系统I多克隆抗体及其制备方法
技术领域
本发明属于检测用抗体制备技术领域，具体涉及一种植物光系统I多克隆抗体及其制备方法。
背景技术
光系统是进行光吸收的功能单位，是由叶绿素、类胡萝卜素、脂和蛋白质组成的复合物。包括光系统I（ PSI）和光系统II（PSII），每一个光系统含有两个主要成分：捕光复合物和光反应中心复合物。这两个光系统是以串联的方式协同作用的。PSI的光化学反应是长光波反应，其主要特征是NADP+的还原。PSII的光化学反应是短光波反应，其主要特征是水的光解和放氧，夺取水中的电子供给PSI。
PSI由光能吸收、传递和转化所需的一系列蛋白质和结合在这些蛋白上的色素分子及电子传递链组分组成，涉及的蛋白主要有PsaA蛋白、PsaB蛋白、PsaC蛋白、PsaD蛋白、PsaE蛋白、PsaF蛋白、PsaG蛋白、PsaH蛋白、PsaJ蛋白、PsaK蛋白、PsaL蛋白、PsaN 蛋白、PsaO蛋白、Ptac8/PsaP蛋白，PsaA蛋白和PsaB蛋白结合形成异二聚体的反应中心，PsaC蛋白、PsaD蛋白、PsaE蛋白构成 PSI的外周蛋白，PsaL蛋白、PsaK蛋白、PsaF蛋白、PsaJ蛋白为膜内在蛋白，PsaN 蛋白、PsaO蛋白蛋白的功能目前还未完全研究清楚。在进行光系统I蛋白研究时，常常要需要对提取的光系统蛋白亚基的种类和含量进行测定，传统的测定方法是采用单一蛋白提取并测定的方法，费时费力，且测定结果不准确，采用抗原抗体进行蛋白检测的方法是一种较为精确的方法，但是，需要制备相应的标准抗体，目前，针对光系统I蛋白检测用抗体的报道非常少，常见的为亚基蛋白全蛋白免疫制备的抗体，这些抗体的专一性和灵敏性均不强，交叉反应太多，检测结果不可靠，且目前还未有针对光系统I全部种类蛋白检测的抗体，阻碍了对于光系统I的深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物光系统I多克隆抗体及其制备方法。
一种光系统I抗原表位，所述抗原表位包括来自PsaA蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；来自PsaB蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:2所示；来自PsaC蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；来自PsaD蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；来自PsaE蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；来自PsaF蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；来自PsaG蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示；来自PsaH蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；来自PsaJ蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；来自PsaK蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；来自PsaL蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示；来自PsaN 蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示；来自PsaO蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示。
优选的，在抗原表位氨基酸序列中不含有半胱氨酸的抗原表位末端加半胱氨酸。加入半胱氨酸的目的为增强KLH蛋白与抗原表位多肽的偶联性能，增强免疫原性。
一种光系统I多克隆抗体的制备方法，按照如下步骤进行：
（1）抗原的合成：按照所述光系统I抗原表位的氨基酸序列，人工合成抗原多肽，在不含有半胱氨酸的抗原表位末端加半胱氨酸；
（2）将抗原多肽联到具有强免疫原功能的KLH蛋白上并用PBS稀释后，得到抗原溶液；
（3）动物免疫：将步骤2）制备的抗原溶液对动物进行免疫使其产生多克隆抗体，然后采集动物的多抗血清，分离纯化后，即得多克隆抗体。
步骤（2）PBS稀释至抗原浓度为0.5～5mg/mL。
所述动物为兔、小鼠、大鼠、山羊中的一种。
一种检测植物中光系统I相关蛋白的试剂盒，该试剂盒包含所述的多克隆抗体；所述相关蛋白包括PsaA蛋白、PsaB蛋白、PsaC蛋白、PsaD蛋白、PsaE蛋白、PsaF蛋白、PsaG蛋白、PsaH蛋白、PsaJ蛋白、PsaK蛋白、PsaL蛋白、PsaN 蛋白、PsaO蛋白。
一种所述多克隆抗体在检测植物中光系统I蛋白的应用。
优选的，所述检测植物中光系统I蛋白的方法为ELISA或western blot。
本发明的有益效果：本发明设计光系统I相关蛋白的抗原表位以及合成的相应的KLH偶联多肽，以该系列偶联多肽作为免疫原免疫动物获得相应的抗体，用于ELISA法检测植物光系统I相关蛋白的检测试剂，实现了光系统I相关蛋白的全检测和精确定量检测，有利于对光系统I的深入研究。
附图说明
图1 为PsaA抗体检测图；
图中，1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：2000。
图2 为PsaB抗体检测图；
图中，1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：4000。
图3 为PsaC抗体检测图；
1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：2000。
图4 为PsaD抗体检测图；
1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：2000。
图5 为PsaE抗体检测图；
1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：4000。
图6 为PsaF抗体检测图；
1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：2000。
图7 为PsaG抗体检测图；
1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：4000。
图8 为PsaH抗体检测图；
1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：2000。
图9 为PsaJ抗体检测图；
1-3泳道分别为含0.1ug、0.25ug、0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：2000。
图10 为PsaK抗体检测图；
1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：5000。
图11 为PsaL抗体检测图；
1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：5000。
图12 为PsaN抗体检测图；
1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：2000。
图13 为PsaO抗体检测图；
1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：1000。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。实施例中未注明的具体技术或者条件，均按照本领域内的文献所记载或本领域常规技术手段进行操作。
实施例1：抗原表位设计
采用antheprot软件，根据www.arabidopsis.org公布的拟南芥光系统I蛋白序列（ATCG00350/PsaA、ATCG00340/PsaB、ATCG01060/PsaC、AT1G03130/PsaD、AT4G28750/PsaD、AT1G31330/PsaF、AT1G55670/PsaG、AT3G16140/PsaH、ATCG00630/PsaJ、AT1G30380/PsaK、AT4G12800/PsaL、AT5G64040/PsaN、AT1G08380/PsaO）对光系统I的PsaA蛋白、PsaB蛋白、PsaC蛋白、PsaD蛋白、PsaE蛋白、PsaF蛋白、PsaG蛋白、PsaH蛋白、PsaJ蛋白、PsaK蛋白、PsaL蛋白、PsaN 蛋白、PsaO蛋白进行序列分析，分析内容包括跨膜区分，信号肽分析，修饰位点分析和全序列分析，从中找出可能的抗原表位，并将上述抗原表位中不含有半胱氨酸的序列末端加上半胱氨酸，如PsaA、PsaD、PsaE、PsaG、PsaJ、PsaO。
最终选定如表1所述的抗原表位：
表1
Figure 534298DEST_PATH_IMAGE001
按照常规方法与KLH蛋白偶联，作为免疫用抗原。
实施例2：多克隆抗体制备
免疫动物选择年龄在3个月、体重2.5±0.1kg，健康的雄性新西兰大白兔，以实施例1中制备的抗原，进行动物免疫。
首次免疫前，经耳静脉取血作为阴性对照。将抗原用PBS（137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4）稀释至1mg/mL，分装后储存于-20℃。取500μL的1mg/mL抗原（即0.5mg，加入300μL PBS再次稀释，然后加入等体积的弗氏完全佐剂（首次免疫）或弗氏不完全佐剂（第2次至第4次免疫）。对兔子的四肢、腋下及背部皮下进行多点注射，首次免疫三周后进行第二次免疫，以后每间隔两周加强一次（共进行4次免疫）。第3次免疫7天后，经耳静脉取血测定抗体效价。达到要求者，于第4次免疫11天后颈动脉放血，收集血样。将血样静置于4℃过夜或者37℃温育3h，在4℃条件下，6000rpm离心10min，收集血清，分装后-80℃保存。
硫酸铵沉淀法浓缩蛋白样品：将20mL的血清用TBS缓冲溶液稀释到100mL，然后边搅拌该溶液中边加入饱和硫酸铵溶液，直至硫酸铵溶液浓度达到55%，4℃条件下，使用磁力搅拌器搅拌过夜。第二天将含有大量沉淀的溶液进行离心处理，弃上清，保留沉淀。加入10mL含有叠氮钠的PBS缓冲溶液溶解沉淀，用透析袋进行透析处理，去除硫酸铵。透析后，对透析袋中的溶液进行离心处理，收集上清。
亲和层析纯化抗多肽抗体：将上述透析离心后的蛋白溶液以0.5mL/min的速度加入层析柱（protein A FF）内，为保证抗体蛋白与填料的充分结合，需连续上柱两次。用TBS清洗层析柱至洗脱液的A280nm＜0.008后，用洗脱缓冲液（50mM甘氨酸，pH2.7）以相同的速度洗脱，用事先加入中和缓冲液（1M Tris-HCl,pH8.0,1.5M NaCl，1mM EDTA）的离心管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查溶液的pH，如果pH低于7.4，可用中和缓冲液调至约pH7.4，以防止抗体变性，同时检测抗体的浓度，最后加入等体积的甘油，保存在-20℃条件下，即得纯化好的多克隆抗体。
实施例3：ELISA血清效价测定
实验用试剂： 0.01M PBS (pH 7.4）；包被液（0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液， pH9.6），用浓HCl调节PH值；吐温-20；酶标二抗（HRP-GAR IgG）；无水乙醇；0.03%H2O2；2mol/LH2SO4溶液；醋酸缓冲液（pH 5.8-6.0）；抗原（包被多肽）。
操作步骤：
包被抗原: 将抗原用ELISA包被液稀释至5 µg/ml（即1ml ELISA包被液+5ul 1mg/ml的多肽混合均匀），每孔加入100µl ，4℃过夜或37℃温箱孵育2hr；
洗包被液: 在洗板机上用0.01 mol/L PBS-0.05% Tween-20溶液洗孔3次，拍干；
封闭酶标板：每孔加入3% 脱脂奶/0.01M PBS 200µl，37℃封闭1hr；（3%脱脂奶/0.01MPBS：1.5g脱脂奶粉+50ml 0.01M PBS充分溶解-两块板）；
洗封闭液：在洗板机上用0.01 mol/L PBS-0.05% Tween-20洗液洗孔3次，拍干；
加入待测样品：每孔加100µl一抗稀释液，每块板左边一列的第一个孔加阴性对照11µl，每块板的其它列的第一个孔加入待测样品（动物血清）11µl；做倍比稀释，A行混匀后用排枪吸11µl 到B行，其它各行混匀后吸25µl 到对应的下一行，37℃环境孵育1hr（一抗稀释液：0.5g脱脂奶粉+50ml 0.01M PBS+25ul Tween-20-两块板；
洗一抗：在洗板机上用0.01mol/LPBS-0.05%Tween-20溶液洗孔6次，拍干；
加入酶结合物：每孔加入稀释的酶标二抗100µl，37℃环境孵育1hr（酶标二抗：25ml一抗稀释液+5ul羊抗兔HRP（常）——1:5000-两块板）；
洗二抗：在洗板机上用0.01 mol/L PBS-0.05% Tween-20溶液洗孔6次，拍干；
加入底物溶液：每孔加入100µl底物溶液（醋酸缓冲液：TMB溶液：0.03% H2O2体积比为4：1：5），置37℃避光显色15-30min；
终止反应：当阳性对照出现明显颜色变化后而阴性孔没有颜色反应时，每孔加入2mol/L H2SO4溶液50µl终止反应，20min内测定结果；
酶标仪测定结果：读OD450nm；
结果判断：以阴性孔OD值为标准，若样品孔的OD 值与阴性孔相应稀释度OD 值的比值大于2时，且样品孔的OD 值与阴性孔相应稀释度OD 值之差大于0.2，即定为阳性反应。
检测结果见表2：
表2
Figure 139854DEST_PATH_IMAGE002
由表2可以看出，ELISA 血清效价测定全部抗体的滴度均大于1:62500。
实施例4：western blot检测抗体
拟南芥中总蛋白提取方法：
1.取约50mg组织放于离心管中，液氮中冷冻；
2.样品研磨至粉末；
3.加入相当于样品量2倍体积的蛋白提取液（例如：100 μl提取液/50 mg组织），并充分混匀；
4.沸水中变性样品，5 min；
5.最大转速离心10 min，分离上清与沉淀；注意：若蛋白为可溶蛋白或者存在明显的溶解，按1:1的比例添加匀浆液（例如：50 μl 匀浆/50 mg组织），然后4℃最大转速离心10min。
6.以BSA为标准利用Bradford实验估测上清液中的蛋白浓度；注意：Bradford实验不能检测含SDS的蛋白溶液。
7.用SDS胶检测蛋白。
Figure 591695DEST_PATH_IMAGE003
类囊体膜蛋白提取方法：
试剂配置
Medium I 1L
0.33M Sorbitol (M=182.17) 60.12g
30mM Tricine/KOH (0.5M, pH 8.4) 40ml
5 mM EDTA (0.25M, pH 8.35) 20ml
10 mM NaHCO3 (M=84.01) 20ml
Medium II 250ml
0.3M Sorbitol (M=182.17) 13.66g
20mM Hopes/KOH (1M, pH 7.6) 5ml
5 mM EDTA (0.5M, pH 8.0) 1.25ml
5 mM MgCl2 (M=203.3) 0.255g
Medium I+ASA+BSA
1.87M Ascorbate 20ul
10% BSA 200ul
Medium I 20ml
提取步骤：
1.取50ml离心管，加入20mlMedium I+BSA+ASA溶液，置于冰上；
2.取生长3周左右的哥伦比亚型拟南芥叶片1g，加入上述溶液中，用匀浆器打碎；
3.将上述液体用两层的过滤膜过滤，然后4200g, 4度离心5min；
4.弃上清，沉淀用1ml的Medium II悬浮，然后8000g，4度离心2min；
5.弃上清，沉淀用不含山梨醇的Medium II悬浮，8000g，4度离心2min；
6.沉淀用200ul的不含山梨醇的Medium II悬浮即为类囊体膜蛋白；丙酮法定量。
将实施例2制备的抗体（作为一抗）分别稀释为不同的浓度，二抗稀释比例为1：20000。
制备分离胶，配方为：15%分离胶预混液 4.5ml+10%APS 25μl + TEMED2.5μl/块胶，用量为4.5ml /块胶，凝胶时间15min；制备浓缩胶，配方为：4.5%浓缩胶预混液 2ml +10%APS 20μl + TEMED 2μl /块胶，用量为2ml /块胶，凝胶时间20min。
上样：上样体积为10μl；标准Marker稀释20倍，上样10μl。
电泳：电泳缓冲液500ml /电泳槽，配方：50ml 10×Tris-Gly-SDS 电泳缓冲液 +450ml 超纯水；电泳电流10 mA 恒流，电压300 V，电泳时间3h40min。
转膜：采用NC 膜，膜孔径0.22μm，转膜液用量1.5L /电泳槽，配方：150ml 10×Tris-Gly-SDS 电泳缓冲液+300ml甲醇+1050ml 超纯水，转膜电流180 mA 恒流，转膜电压300 V，转膜时间：1h。
洗膜：洗膜液用量20ml /张膜，配方（每 L）: 100ml 10×TBS+5ml 20%Tween-20+895ml 超纯水；洗膜3次，每次10min，脱色摇床转速60 rpm。
封闭：封闭液为5%脱脂奶粉+20ml 1×TBST，用量为20ml /膜，封闭时间为1h，脱色摇床转速60 rpm。
一抗孵育：一抗稀释液（1×TBST +BD 脱脂奶粉）20ml + 一抗20 ml 0.2g，4℃转移脱色摇床过夜，然后洗膜。
二抗孵育：二抗稀释液（1×TBST +BD 脱脂奶粉）20ml + 二抗20 ml 0.2g，4℃转移脱色摇床2h，然后洗膜。
ECL曝光：ECL→A 液：B液=1:1（Cat No.WBKLS0500 Lot No.1529202），曝光30s。
测试结果如图1-13所示，PsaA、PsaB、PsaC、PsaD、PsaE、PsaF、PsaG、PsaH、PsaJ、PsaK、PsaL、PsaN、PsaO的一抗浓度稀释至1：1000至1：5000均有清晰的检测结果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 北京启维益成科技有限公司
<120> 植物光系统I多克隆抗体及其制备方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Pro Gly His Phe Ser Arg Thr Ile Ala Lys Gly Pro Asp Thr Cys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Asp Tyr Asn Pro Glu Gln Asn Glu Asp Asn Val Leu Ala Arg Cys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Gly Cys Lys Ala Lys Gln Ile Ala Ser Ala Pro Arg Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Ala Glu Lys Thr Glu Ser Ser Ser Ala Ala Pro Ala Val Lys Cys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Asn Ile Ser Thr Asn Asn Tyr Ala Leu Asp Glu Val Glu Glu Cys
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Ser Tyr Leu Ile Ala Ile Ser Gly Glu Lys Lys Pro Ala Cys
1 5 10 15
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Tyr Tyr Ile Leu Ala Thr Ser Ser Asn Gly Tyr Asp Pro Ser Cys
1 5 10 15
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Tyr Gly Ser Asp Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Pro Leu Gln Ser Lys Cys
1 5 10 15
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Leu Leu Ile Glu Ile Asn Arg Leu Phe Pro Asp Ala Leu Thr Phe Cys
1 5 10 15
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Leu Glu Ala Arg Asp Ser Gly Leu Gln Thr Gly Asp Pro Ala Cys
1 5 10 15
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Gln Leu Gln Thr Ala Asp Gly Trp Ala Lys Phe Thr Gly Gly Phe
1 5 10 15
Cys
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Arg Val Val Gly Asp Asp Val Asp Gly Ser Asn Gly Arg Arg Cys
1 5 10 15
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Leu Gly Gly Ser Ser Ile Thr Thr Lys Pro Phe Ser Ser Ser Cys
1 5 10 15

Claims (7)

1.一种光系统I抗原表位，其特征在于，所述抗原表位包括来自PsaA蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；来自PsaB蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；来自PsaC蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；来自PsaD蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；来自PsaE蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；来自PsaF蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；来自PsaG蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示；来自PsaH蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；来自PsaJ蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；来自PsaK蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；来自PsaL蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQID NO:11所示；来自PsaN 蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示；来自PsaO蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示。
2.根据权利要求1所述光系统I抗原表位，其特征在于，在抗原表位氨基酸序列中不含有半胱氨酸的抗原表位末端加半胱氨酸。
3.一种光系统I多克隆抗体的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
（1）抗原的合成：按照权利要求1所述光系统I抗原表位的氨基酸序列，人工合成抗原多肽，在不含有半胱氨酸的抗原表位末端加半胱氨酸；
（2）将抗原多肽联到具有强免疫原功能的KLH蛋白上并用PBS稀释后，得到抗原溶液；
（3）动物免疫：将步骤2）制备的抗原溶液对动物进行免疫使其产生多克隆抗体，然后采集动物的多抗血清，分离纯化后，即得多克隆抗体。
4.根据权利要求3所述光系统I多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤（2）PBS稀释至抗原浓度为0.5～5mg/mL。
5.根据权利要求3所述光系统I多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述动物为兔、小鼠、大鼠、山羊中的一种。
6.一种检测植物中光系统I相关蛋白的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求3所述的多克隆抗体；所述相关蛋白包括PsaA蛋白、PsaB蛋白、PsaC蛋白、PsaD蛋白、PsaE蛋白、PsaF蛋白、PsaG蛋白、PsaH蛋白、PsaJ蛋白、PsaK蛋白、PsaL蛋白、PsaN 蛋白、PsaO蛋白。
7.一种权利要求6所述多克隆抗体在检测植物中光系统I蛋白的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113214372A (zh) * 2021-06-21 2021-08-06 北京启维益成科技有限公司 植物光系统ii多克隆抗体及其制备方法
CN113788885A (zh) * 2021-08-23 2021-12-14 广东省农业科学院蔬菜研究所 黄瓜光合系统I反应中心N亚基蛋白CsPSI-N在抗瓜类疫病中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105294846A (zh) * 2015-11-05 2016-02-03 中国科学院植物研究所 Cic1蛋白在调控植物低温耐性中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105294846A (zh) * 2015-11-05 2016-02-03 中国科学院植物研究所 Cic1蛋白在调控植物低温耐性中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARMBRUST, TS ET AL.: "Structural analysis of photosystem I polypeptides using chemical crosslinking", 《THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL ZOOLOGY》 *
GALINA GULIS ET AL.: "Purification of His 6-tagged Photosystem I from Chlamydomonas reinhardtii", 《PHOTOSYNTH RES》 *
庞玥 等: "蓝藻光合膜蛋白复合体结构与功能研究进展", 《天津农学院学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113214372A (zh) * 2021-06-21 2021-08-06 北京启维益成科技有限公司 植物光系统ii多克隆抗体及其制备方法
CN113788885A (zh) * 2021-08-23 2021-12-14 广东省农业科学院蔬菜研究所 黄瓜光合系统I反应中心N亚基蛋白CsPSI-N在抗瓜类疫病中的应用

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