CN111549164A - 番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物及其应用 - Google Patents

番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111549164A
CN111549164A CN202010363915.4A CN202010363915A CN111549164A CN 111549164 A CN111549164 A CN 111549164A CN 202010363915 A CN202010363915 A CN 202010363915A CN 111549164 A CN111549164 A CN 111549164A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tomato
mir399a
sly
molecular marker
gus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010363915.4A
Other languages
English (en)
Inventor
黄腾波
林佳超
朱小恩
林冬波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Longhua Bio-Industry Innovation Research Institute Of Shenzhen University
Shenzhen University
Original Assignee
Longhua Bio-Industry Innovation Research Institute Of Shenzhen University
Shenzhen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Longhua Bio-Industry Innovation Research Institute Of Shenzhen University, Shenzhen University filed Critical Longhua Bio-Industry Innovation Research Institute Of Shenzhen University
Priority to CN202010363915.4A priority Critical patent/CN111549164A/zh
Publication of CN111549164A publication Critical patent/CN111549164A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明通过应用的番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物Sly‑miR399A，对番茄的环境磷缺乏相关基因进行表达，通过GUS信号强弱来反映Sly‑miR399A在番茄植株响应磷缺乏中的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态。其中，当环境中磷缺乏越严重时，分子标记物Sly‑miR399A的表达量越高。以Sly‑miR399A作为环境磷缺乏的功能性分子标记物，通过检测活体番茄中Sly‑miR399A的表达量，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。

Description

番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物、一种载体、一种引物对、一种试剂盒、一种分子标记物在检测番茄生长过程中环境磷缺乏的应用以及一种采用分子标记物检测番茄生长过程中环境磷缺乏的方法。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum)属于茄科植物，是一种含有丰富的碳水化合物、有机酸、维生素和矿物质等的浆果，也是人类重要的食物和营养来源。番茄是一种喜温性的蔬菜，在正常条件下，同化作用最适温度为20-25℃，根系生长最适土温为20-22℃。
磷是番茄的三大营养物质之一，是番茄发育和维持活力的关键。磷的吸收、储存和代谢对于番茄的生长发育至关重要，磷在番茄体内是细胞原生质的组分，对细胞的生长和增殖起重要作用；还参与番茄生命过程的光合作用，糖和淀粉的利用和能量的传递过程；还能促进番茄苗期根系的生长；在番茄结果时，磷大量转移到籽粒中，使得籽粒饱满。若缺乏磷元素，会导致番茄中蛋白质合成受阻，使细胞分裂迟缓、新细胞难以形成，番茄生长缓慢、植株矮小、分枝少、叶小易脱落。现阶段中，番茄主要依赖于施有磷肥的土壤中吸取磷元素，但是，土壤矿物通常对磷元素具有强烈的固定和吸附作用，使土壤中95％以上的磷成为无效态，导致番茄对磷元素的有效利用率普遍较低。
MicroRNA(miRNA)是一类单链、长度约为20-24nt的内源性非编码的小RNA，能够通过与靶基因的mRNA特异性的碱基配对引起其mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因表达进行转录后调控。miRNA在番茄的生长与发育中发挥着重要的调控作用。其中，某些番茄miRNA是环境磷缺乏的重要指示基因，在调节植物磷稳态中具有重要作用。因此，对环境磷缺乏相关基因功能性分子标记进行研究，有利于直观体现环境(土壤或水培环境)中可利用磷的含量情况，进而有利于对番茄的生长进行调控。
发明内容
本发明的目的在于提供一种番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物、一种载体、一种引物对、一种试剂盒、一种分子标记物在检测番茄生长过程中环境磷缺乏的应用以及一种采用分子标记物检测番茄生长过程中环境磷缺乏的方法，旨在解决现有技术中无法直观检测植物生长环境中可利用磷的含量情况的问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物，所述分子标记物为Sly-miR399A，所述Sly-miR399A的序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面，本申请提供一种载体，所述载体含有所述的番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物。
第三方面，本申请提供一种引物对，所述引物对用于扩增表达番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物的启动子，所述分子标记物为Sly-miR399A，所述分子标记物的启动子为proSlMIR399A，且所述引物对包括与proSlMIR399A结合的上游引物和与所述proSlMIR399A结合的下游引物；其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
第四方面，本申请提供一种试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。
第五方面，本申请提供一种分子标记物在检测番茄生长过程中环境磷缺乏的应用，所述分子标记物为所述的番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物。
第六方面，本申请提供一种采用分子标记物检测番茄生长过程中环境磷缺乏的方法，包括如下步骤：
获取Sly-miR399A启动子序列，与双酶切得到的PLP_GUS载体进行连接反应，构建得到PLP_proSlMIR399A:GUS载体，将所述载体侵染番茄并进行阳性筛选得到阳性proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株；
将所述阳性proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株培育得到番茄幼苗，进行GUS染色，收集GUS染色结果，分析Sly-miR399A在番茄响应磷缺乏过程中的表达情况，检测番茄生长过程中环境磷缺乏的状态。
本发明提供一个分子标记物Sly-miR399A，所述分子标记物Sly-miR399A与番茄环境磷缺乏相关基因紧密连锁，能够通过分子标记物Sly-miR399A的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
本发明提供一种载体，所述载体含有所述番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物Sly-miR399A，通过该载体含有的分子标记物Sly-miR399A的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
本发明提供一种引物对，通过应用所述用于扩增表达番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物的引物对，对表达番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物Sly-miR399A的启动子序列进行克隆、表达，并通过GUS信号强弱来反映Sly-miR399A在番茄植株响应磷缺乏中的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括所述用于扩增表达番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物的引物对，对表达番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物Sly-miR399A的启动子序列进行克隆、表达，并通过GUS信号强弱来反映Sly-miR399A在番茄响应磷缺乏中的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
本发明提供一种分子标记物在检测番茄生长过程中环境磷缺乏的应用，其中，所述分子标记物为所述的番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物；通过应用所述的番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物Sly-miR399A，对番茄的环境磷缺乏相关基因进行表达，并通过GUS信号强弱来反映Sly-miR399A在番茄植株响应磷缺乏中的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，其中，当环境中缺乏越严重时，分子标记物Sly-miR399A的表达量越高。以Sly-miR399A作为环境磷缺乏的功能性分子标记物，通过检测活体番茄中Sly-miR399A的表达量，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
本发明提供一种采用分子标记物检测番茄生长过程中环境磷缺乏的方法，通过构建PLP_proSlMIR399A:GUS载体，并将筛选的阳性PLP_proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株进行培育，再将所述阳性proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株培育得到番茄幼苗，进行GUS染色，收集GUS染色结果，分析Sly-miR399A在番茄中的表达情况，检测番茄生长过程中环境磷缺乏的状态；该检测方法简单方便，通过GUS信号强弱来反映Sly-miR399A在番茄植株响应磷缺乏中的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，其中，当环境中缺乏越严重时，分子标记物Sly-miR399A的表达量越高。通过检测活体番茄中Sly-miR399A的表达量，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的试验组和对照组的植物GUS的染色结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明实施例的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明实施例的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
以下提供本申请各种培养基的配方。
LB培养基：培养基成分包括10g/L NaCl、5g/L酵母粉、10g/L蛋白胨和双蒸水，控制最终培养基的pH为7.0。
1/2MS培养基：培养基成分包括2.2g/L MS、3g/L结冷胶、500μL/L维他命(MSV)和双蒸水，控制最终培养基的pH为5.8。
预培养基(固体)：培养基成分包括4.4g/L MS、30g/L蔗糖、3g/L结冷胶、200mg/LKH2PO4、0.2mg/L乙酰丁香酮(AS)、0.9mg/L维生素B1(VB1)、0.2mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0.1mg/L激动素(KT)和双蒸水，控制最终培养基的pH为5.8。
预培养基(液体)：培养基成分包括4.4g/L MS、30g/L蔗糖、200mg/LKH2PO4、0.2mg/L乙酰丁香酮(AS)、0.9mg/L维生素B1(VB1)、0.2mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0.1mg/L激动素(KT)和双蒸水，控制最终培养基的pH为5.8。
初筛培养基：培养基成分包括4.4g/L MS、30g/L蔗糖、3g/L结冷胶、1mL/L维他命(MSV)、20mg/L玉米素核苷(ZR)、400mg/L阿莫西林克拉维酸钾(Aug)、200mg/L特美汀(Tim)、100mg/L卡那霉素(K+)和双蒸水，控制最终培养基的pH为5.8。
生根培养基：培养基成分包括2.2g/L MS、3g/L结冷胶、1mL/L维他命(MSV)、200mg/L阿莫西林克拉维酸钾(Aug)、100mg/L特美汀(Tim)、75mg/L卡那霉素(K+)和双蒸水，控制最终培养基的pH为5.8。
改良霍格兰营养液：包括大量元素溶液(250×)、微量元素溶液(250×)和铁盐溶液(250×)；其中，大量元素溶液包括4mmol/L母液浓度为236.26g/L的四水硝酸钙、5mmol/L母液浓度为126.5g/L的硝酸钾、1mmol/L母液浓度为20g/L的硝酸铵、1mmol/L母液浓度为34g/L的磷酸二氢钾、2mmol/L母液浓度为123.25g/L的七水硫酸镁；微量元素溶液包括5μmol/L母液浓度为236.25g/L的碘化钾、100μmol/L母液浓度为126.5g/L的硼酸、147.6μmol/L母液浓度为20g/L的硫酸锰、53.4μmol/L母液浓度为34g/L的硫酸锌、1μmol/L母液浓度为123.25g/L的钼酸、0.16μmol/L母液浓度为236.25g/L的硫酸铜、0.1μmol/L母液浓度为126.5g/L的氯化钴；铁盐溶液包括20mmol/L母液浓度为5.56g/L的七水硫酸亚铁、20mmol/L母液浓度为7.46g/L的乙二胺四乙酸二。
第一方面，本发明实施例提供一种番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物，分子标记物为Sly-miR399A，Sly-miR399A的序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1如下：
5’-UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUA-3’。
本发明实施例提供一个分子标记物Sly-miR399A，分子标记物Sly-miR399A与番茄环境磷缺乏相关基因紧密连锁，能够通过分子标记物Sly-miR399A的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
优选的，Sly-miR399A基因的启动子序列proSlMIR399A如SEQ ID NO.2所示，SEQID NO.2如下：
CGTACGCCGCCTCTTACGCTGCCACTTACACCCTGTTGCATTGTTTCACTGGAACATGTTGTGTTACCTGTTCAATACTATTTTGCCATTTTCAAAATCTCAAGATTAACAATATAGTTGAAACGGCTTGTCATCTTTACAAGCAAACACAAACTATCCTTGAACATGATCGATGTGATAACATTAAGATTTCAGGAAATACCAATAATGTAAAACCAGAGGGAGCCCATGTGATAGCTAGTTGGCTTGCGCATCAATTCGTGCCAAAATTTTTAGGAGAAATTAAAAAAGAATGTTAGCATTTAATACAAGTGTGCTATAATACCTTCTGCATCGGAGTATTAAGAACGGATCTTTGAGTTATTATATTAAGCAGAGACAGTAGCAGGGCAGCTCTCCTTTGGCGTATCGGTTAAAATATGCGATACAGTGAATTGGAGTCACTGTACATATATTAACGCATGCCAATAGAGAGTAGCCCTATCACTATTTCCCTTATTTTCATTCACCAACGACTTCCTTTCTCATGCTTCCGCTTCATCACAAGAGAGCCCTTCCATGCTTTTATAGAGCATTTGTTCTCAGTTTAAGAGATGGAATAAACCACTCGAGATATGAGATATCCTATGGCTTTTATGCATGATGGGGTTGAAATGAGGGTAACTTTCTTATCTCTTTACAATTCCATTTTGTGAAAGCTCCTTTAAAAAAAAATGTGTTCATCAGATTCCCCAGTTGCCTTCTCCATAAATTTGTAGGTGTAAATGCGGAAACAAAAAAAGTTGTTCAAACCAAGAGATGCTCTATTATTTCACCTTTGAAATTTGTCATTTGACTCAAAAAGTTGTGACTAAGGAGGCAAAGGACCTTAAAACAGCATATCCTCTGCATATTCCTCTCTTCTTTATTTCCATCTGTATTATACTTCTATATATGAATAGGTTTCATTTCTATATAATTTTTAAGATTGCAAAATTTTTAGATGCTAGGTAATCAAGATCACTTAGTTCCTTTTATATATATTATTATCACTCAAGTGTGTTATCATACTTCTGTAATTTGAAATGATTAAGGTTAGTAAAGTGAACTACAACATTATTTCCAGGATATGTTTCGTGTTTTAGCTATTACAGTCCAAATTCTATATTCGCATTAAAGAACGACTAAATATGTCTACTCAACGCATGACCTCCGGAAATTGGAATATTAATTAAAATTTAAAAACATTTGTAAATTGAAAAGTGAAGGTCCTTGACTCGTAAACTTAAGTGTCAAATGGCATACTTGGAACGCATAAAATCGAGAAGCATCTAAAAATTGAATTCATGAACAATGCAAGAGGAAGAATCTGATGAATTTTTATTTTTTTTAAAAGAGCTTTCACCAAATGGAATATGTAAAAGATAAGAAAAGTTACTGTCCCATTTCTGACTTTAGAAAAAGCAACCCTTAATGCAAGAAGATATATATCTACAGGTCACACAGCATAAAAATAAATGATAGGATATGCCGATTCTCTAGGGG。
通过提供Sly-miR399A的启动子基因序列proSlMIR399A，以便于后续采用GUS系统进行PLP_proSlMIR399A:GUS载体的构建，有利于直接通过GUS染色的信号强弱以分析Sly-miR399A在番茄植株中的表达情况，进而对活体番茄的受到缺磷胁迫的状态进行检测。
第二方面，本发明实施例提供一种载体，载体含有的番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物。
优选的，载体还含有PLP-GUS载体，上述载体中包括了GUS基因，GUS基因(β-葡萄糖苷酸酶基因)是植物遗传转化中常用的报告基因，能催化许多β-葡萄糖苷脂类物质的水解。若组织细胞中发生了GUS基因的转化，并表达出Gus蛋白，在适宜的条件下，该酶就可把5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸(X-Gluc)水解生成蓝色产物，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况。
本发明实施例提供的载体含有番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物Sly-miR399A，通过该载体含有的分子标记物Sly-miR399A的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
第三方面，本发明实施例提供一种引物对，引物对用于扩增表达番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物的启动子，分子标记物为Sly-miR399A，分子标记物的启动子为proSlMIR399A，且引物对包括与proSlMIR399A结合的上游引物和与proSlMIR399A结合的下游引物。其中，上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3如下：CCTTGTCTATGTATACGGTTGGC；
下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，如SEQ ID NO.4如下：GTGACTAAGGAGGCAAAGGACC。
本发明实施例提供一种引物对，通过应用用于扩增表达番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物的引物对，对表达番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物Sly-miR399A的启动子序列进行克隆、表达，并通过GUS信号强弱来反映Sly-miR399A在番茄植株响应磷缺乏中的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
第四方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，试剂盒包括的引物对。
优选的，引物对包括与proSlMIR399A结合的上游引物和与proSlMIR399A结合的下游引物。
进一步优选的，上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3如下：CCTTGTCTATGTATACGGTTGGC；
下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，如SEQ ID NO.4如下：GTGACTAAGGAGGCAAAGGACC。
本发明实施例提供一种试剂盒，试剂盒包括用于扩增表达番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物的引物对，对表达番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物Sly-miR399A的启动子序列进行克隆、表达，并通过GUS信号强弱来反映Sly-miR399A在番茄植株响应磷缺乏中的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
第五方面，本发明实施例提供一种分子标记物在检测番茄生长过程中环境磷缺乏的应用，分子标记物为的番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物。
优选的，番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物为Sly-miR399A，Sly-miR399A的序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1如下：
5’-UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUA-3’。
本发明实施例提供一种分子标记物在检测番茄生长过程中环境磷缺乏的应用，其中，分子标记物为的番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物；通过应用的番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物Sly-miR399A，对番茄的环境磷缺乏相关基因进行表达，并通过GUS信号强弱来反映Sly-miR399A在番茄植株响应磷缺乏中的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，其中，当环境中缺乏越严重时，分子标记物Sly-miR399A的表达量越高。以Sly-miR399A作为环境磷缺乏的功能性分子标记物，通过检测活体番茄中Sly-miR399A的表达量，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
第六方面，本发明实施例提供一种采用分子标记物检测番茄生长过程中环境磷缺乏的方法，包括如下步骤：
S01.获取miR399A启动子序列，与双酶切得到的PLP_GUS载体进行连接反应，构建得到PLP_proSlMIR399A:GUS载体，将载体侵染番茄并进行阳性筛选得到阳性proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株；
S02.将所述阳性proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株培育得到番茄幼苗，进行GUS染色，收集GUS染色结果，分析Sly-miR399A在番茄中的表达情况，检测番茄生长过程中环境磷缺乏的状态。
本发明实施例提供一种采用分子标记物检测番茄生长过程中环境磷缺乏的方法，通过构建PLP_proSlMIR399A:GUS载体，并将筛选的阳性PLP_proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株进行培育，再对番茄幼苗采用不同时间的缺磷溶液进行处理，并收集相关的GUS染色结果，分析Sly-miR399A在番茄中的表达情况；该检测方法简单方便，通过GUS信号强弱来反映Sly-miR399A在番茄植株响应磷缺乏中的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，其中，当环境中缺乏越严重时，分子标记物Sly-miR399A的表达量越高。通过检测活体番茄中Sly-miR399A的表达量，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
具体的，在上述步骤S01中，获取Sly-miR399A启动子序列，优选的，获取Sly-miR399A启动子序列的方法包括如下步骤：
S011.提取番茄的基因组DNA；
S012.设计与Sly-miR399A启动子序列结合的上游引物和与Sly-miR399A启动子序列结合的下游引物对；
S013.采用上游引物和下游引物基因组DNA进行扩增，得到Sly-miR399A启动子序列。
具体的，在上述步骤S011中，提取番茄的基因组DNA，番茄选自番茄野生型micro-Tom；优选的，提取番茄野生型micro-Tom的基因组DNA。进一步优选的，采用CTAB法提取番茄野生型micro-Tom的基因组DNA。
在本发明优选实施例中，采用CTAB法提取番茄的DNA的方法包括如下步骤：
S0111.在液氮中研磨番茄野生型micro-Tom的幼苗粉末，收集0.1g粉末与300uLCTAB提取液混合，并在65℃保温20分钟得到第一混合液；
S0112.在第一混合液中加入体积比为24:1的氯仿：异戊醇的混合液，室温静置5分钟；在4℃，12000rpm的条件下离心15分钟，收集第一混合上清液；
S0113.在第一混合上清液中加入200uL异丙醇，于-20℃放置30分钟；再在4℃、12000rpm的条件下离心5分钟，收集沉淀；
S0114.在沉淀中加入1000uL的75％乙醇溶液，于4℃、12000rpm的条件下离心5分钟，重复三次收集沉淀；加入30uL TE Buffer，混匀得到番茄野生型micro-Tom的基因组DNA。
具体的，在上述步骤S012中，设计与Sly-miR399A启动子序列结合的上游引物和与Sly-miR399A启动子序列结合的下游引物对；优选的，上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3如下：CCTTGTCTATGTATACGGTTGGC；下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，如SEQID NO.4如下：GTGACTAAGGAGGCAAAGGACC。
具体的，在上述步骤S013中，采用上游引物和下游引物基因组DNA进行扩增，得到Sly-miR399A启动子序列。
优选的，采用DNA聚合酶2×Phanta Max Master Mix，对基因组DNA进行PCR以扩增番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物Sly-miR399A；优选的，PCR反应的体系如下表1：
表1
Figure BDA0002476050940000121
Figure BDA0002476050940000131
PCR扩增反应的程序如下表2：
表2
Figure BDA0002476050940000132
优选的，待反应完毕，取5uL PCR产物和加入对照Marker进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，电泳结束后在凝胶成像系统下进行拍照，将扩增的proSlMIR399A启动子片段进行切胶回收。
采用上述PCR反应的体系和反应程序对基因组DNA进行扩增，获取Sly-miR399A启动子序列。
进一步的，与双酶切得到的PLP_GUS载体进行反应。优选的，PLP-GUS载体中包括了GUS基因，GUS基因(β-葡萄糖苷酸酶基因)是植物遗传转化中常用的报告基因，能催化许多β-葡萄糖苷脂类物质的水解。若组织细胞发生了GUS基因的转化，并表达出Gus蛋白，在适宜的条件下，该酶就可把X-Gluc水解生成蓝色产物，以检测Sly-miR399A在番茄中的表达情况；进而验证Sly-miR399A的表达量与番茄缺磷情况的关联性。
优选的，双酶切得到的PLP_GUS载体中，采用HindIII和EcoRI对PLP_GUS载体进行双酶切。在本发明优选实施例中，双酶切的温度为37℃，双酶切的时间为1h。制备得到的双酶切产物采用试剂盒进行回收处理，备用。
优选的，将Sly-miR399A启动子序列proSlMIR399A片段与双酶切得到的PLP_GUS载体进行连接反应，构建得到PLP_proSlMIR399A:GUS载体。进一步优选的，采用同源重组技术构建PLP_proSlMIR399A:GUS载体。在本发明优选实施例中，PLP_proSlMIR399A:GUS载体属于人工合成的重组载体，使用同源重组酶ExnaseⅡ(Vazyme公司)将双酶切得到的PLP_GUS载体与Sly-miR399A启动子序列proSlMIR399A片段进行同源重组连接得到的。在本发明具体实施例中，将双酶切得到的PLP_GUS载体与扩增的proSlMIR399A片段放置在37℃水浴锅中，反应1.5h，得到PLP_proSlMIR399A:GUS载体。
优选的，将构建得到PLP_proSlMIR399A:GUS载体进行转化至大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中。优选的，转化方法包括如下步骤：将10uL PLP_proSlMIR399A:GUS载体加入解冻的大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，冰浴20～30分钟得到感受态混合物；将感受态混合物放置于42℃条件下热激处理30秒，再进行冰浴2分钟；加入500uL LB液体培养基混匀，放置于37℃摇床上50min-60min进行活化。
优选的，将全部转化产物倒于LB(卡那霉素抗性)的固体平板，干燥彻底后倒置于37℃恒温培养箱中培养12-16h。观察平板上长出的菌落克隆，选择特征为圆形边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起和菌落间互相分开的大肠杆菌单克隆进行菌落PCR。进一步优选的，采用proSlMIR399A-GUS-F、proSlMIR399A-GUS-R为引物进行菌落PCR验证，其中，proSlMIR399A-GUS-F的序列如SEQ ID NO.5所示，SEQ ID NO.5如下：CCCTTTCGTCTTCAAGAATTCCCCACTTGGAAGGTCAAACGAG；proSlMIR399A-GUS-R的序列如SEQ ID NO.6所示，SEQ IDNO.6如下：GACCTGCAGGCATGCAAGCTTCCCCTAGAGAATCGGCATATCC；进行菌落PCR的反应体系如下表3：
表3
Figure BDA0002476050940000141
Figure BDA0002476050940000151
菌落PCR的反应程序如下表4：
表4
Figure BDA0002476050940000152
将鉴定得到的阳性菌落送至测序公司测序。从番茄基因组数据库网站下载目的基因的核酸序列，并在muscle alignment网站上将测序结果对照数据库网站上的基因序列信息进行对照分析，直至测序得到的碱基和Tair的基因序列完全匹配则说明载体构建成功。
进一步的，将载体侵染番茄得到proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株，包括如下步骤：
G01.将目的质粒载体(含有PLP_proSlMIR399A:GUS载体)通过农杆菌转化法得到已转化的目的载体(含有PLP_proSlMIR399A:GUS载体)的农杆菌菌液；
G02.提供番茄无菌苗的子叶和上胚轴，将农杆菌菌液进行稀释后滴加于番茄无菌苗的子叶和上胚轴的伤口处，进行侵染并暗培养得到侵染组织；
G03.将侵染组织进行培养得到proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株。
在上述步骤G01.中，将目的载体(含有PLP_proSlMIR399A:GUS载体)转化至农杆菌GV3101中进行培养，得到农杆菌初菌液。优选的，将1mL农杆菌初菌液加入到10mL LB液体培养基中，于28℃、200rpm的条件下黑暗培养直到农杆菌菌液OD600值为0.8～1.0。
在上述步骤G02中，提供番茄无菌苗的子叶和上胚轴，采用如下方法进行制备：挑取饱满的番茄种子，用10％的次氯酸钠溶液消毒15min；用无菌水冲洗3遍，于摇床培养2天至种子萌发，播种到1/2MS培养基上，于28℃光照培养7～8天，得到番茄无菌苗长出两片小真叶之后，切下子叶和上胚轴，置于固体预培养基上(子叶正面朝上)，28℃条件下暗培养1天。优选的，子叶切为0.5cm2的小块，上胚轴切成1cm长度。
进一步，将农杆菌菌液进行稀释后滴加于番茄无菌苗的子叶和上胚轴的伤口处，进行侵染得到侵染组织。优选的，采用液体预培养基将农杆菌菌液稀释10倍后，滴加于番茄无菌苗的子叶和上胚轴的伤口处，侵染15分钟，再于28℃条件下暗培养2天，得到侵染组织。
在上述步骤G03中，将侵染组织进行培养得到proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株。优选的，培养步骤包括先进行继代培养，再进行生根培养。进一步优选的，继代培养包括如下方法：将侵染组织转移至初筛培养基中，于28℃的光照条件下进行培养，诱导愈伤组织和不定芽的生长，其中，每2周换一次初筛培养基。进一步再进行生根培养，将长出分化叶的部分，切去愈伤组织，放置在生根培养基上，2周更换一次培养基，直至分化出根，再移栽到营养土中，得到proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株。
进一步的，将培养得到的proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株进行阳性筛选得到阳性proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株。优选的，将培养得到的proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株进行阳性筛选的方法包括如下步骤：采用CTAB法提取待鉴定的番茄植株的基因组DNA，以Taq-plus PCR Forest Mix(2x)(NOVA公司)作为DNA聚合酶，进行PCR扩增，其中，采用上述表3的PCR反应体系，采用上述表4的PCR反应条件，将PCR产物进行测序，筛选阳性proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株。
具体的，在上述步骤S02中，将阳性proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株培育得到番茄幼苗，优选的，采用无菌法培养番茄幼苗，以利于进行后续试验。
在本发明优选实施例中，将阳性proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株培育得到番茄幼苗包括如下步骤：收取阳性proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株的种子，在超净台中取适量种子于无菌组培瓶内，倒入10％的次氯酸钠溶液浸泡消毒15min，期间不时摇晃以保证种子浸泡均匀，随后用无菌水冲洗3次，洗净后将种子放置摇床摇晃2天至种子发芽；取在托盘内铺上约0.3cm厚的蛭石并用纯水清洗1～2遍，随后倒入1/4浓度的改良霍格兰营养液浇透蛭石至湿润，将已发芽的种子均匀播在蛭石表面并在托盘表面覆盖一层保鲜膜以保持水分，待种子长出子叶后将膜揭开；幼苗于蛭石上长出真叶，此时即可转移至含有1/4浓度的改良霍格兰营养液水培装置中继续培养，得到番茄幼苗。
进一步的，取番茄幼苗进行GUS染色处理，收集GUS染色结果，分析Sly-miR399A在番茄中的表达情况，检测番茄育种生长过程中环境磷缺乏的状态。
优选的，GUS染色处理中，GUS染色包括如下步骤：将样品置于丙酮溶液中于-20℃处理20min，倒掉丙酮；用X-Gluc缓冲液洗涤一次，再浸泡在配置好的X-Gluc染液中，真空抽取30min，并于37℃恒温培养箱中染色过夜，用75％乙醇进行脱色，每2h更换一次75％乙醇，至叶绿素褪去。再用相机进行拍照获取图片。
进一步，收集番茄幼苗的GUS染色结果，通过拍照得到的照片分析GUS信号强弱，分析Sly-miR399A在番茄中的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态。GUS基因是植物遗传转化中常用的报告基因，能催化许多β-葡糖糖苷脂类物质的水解。若组织细胞发生了GUS基因的转化，并表达出Gus蛋白，在适宜的条件下，该酶就可将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸(X-Gluc)水解生成蓝色产物，通过GUS信号强弱来反映Sly-miR399A在番茄植株响应磷缺乏中的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，其中，当环境中缺乏越严重时，分子标记物Sly-miR399A的表达量越高。通过检测活体番茄中Sly-miR399A的表达量，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
进一步以具体实施例的内容进行说明。
实施例1
一种验证番茄环境磷缺乏相关基因的功能性分子标记物Sly-miR399A检测环境缺磷情况的方法
番茄miRNA399A启动子融合GUS基因载体的构建
以番茄野生型micro-Tom的DNA为模板，采用2×Phanta Max Master Mix(Vazyme公司)为DNA聚合酶，以SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3作为上下游引物，进行PCR以扩增proSlMIR399A。反应结束后，取5uL PCR产物和DNA Marker(对照)进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，电泳结束后在凝胶成像系统下进行拍照，将扩增的proSlMIR399A片段切胶回收。
PLP_GUS载体双酶切：将PLP_GUS载体用限制性内切酶HindIII和EcoRI进行双酶切，酶切反应液放置在37℃水浴锅中，反应1h，酶切产物进行直接回收。
PLP_proSlMIR399A:GUS载体构建：采用同源重组技术构建PLP_proSlMIR399A:GUS载体，将双酶切得到的PLP_GUS载体与扩增的proSlMIR399A片段放置在37℃水浴锅中，反应1.5h，得到PLP_proSlMIR399A:GUS载体。
再将构建得到PLP_proSlMIR399A:GUS载体进行转化至大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，进行抗性筛选、阳性验证、测序得到阳性PLP_proSlMIR399A:GUS载体，完成番茄Sly-miR399A启动子融合GUS基因载体的构建。
将阳性PLP_proSlMIR399A:GUS载体侵染番茄得到阳性proSlMIR399A:GUS番茄转 基因植株
将阳性PLP_proSlMIR399A:GUS载体转化至农杆菌GV3101中进行培养得到农杆菌初菌液，将1mL农杆菌初菌液加入到10mL LB液体培养基中，于28℃、200rpm的条件下黑暗培养直到农杆菌菌液OD600值为0.8～1.0；挑取饱满的番茄种子，用10％的次氯酸钠溶液消毒15min；用无菌水冲洗3遍，于摇床培养2天至种子萌发，播种到1/2MS培养基上，于28℃光照培养7～8天，得到番茄无菌苗长出两片小真叶之后，切下子叶和上胚轴；将农杆菌菌液稀释10倍后，滴加于番茄无菌苗的子叶和上胚轴的伤口处，侵染15分钟，于28℃条件下暗培养2天得到侵染组织；将侵染组织进行继代培养、生根培养，得到阳性proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株。
进一步，鉴定转基因番茄植株。采用CTAB法提取番茄植株的DNA，以2×Easy TaqDNA聚合酶作为DNA聚合酶，进行PCR扩增，将PCR产物进行测序，鉴定转基因阳性植株，得到proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株的种子。
进一步，收取proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株的种子，在超净台中取适量种子于无菌组培瓶内，倒入10％的次氯酸钠溶液浸泡消毒15min，期间不时摇晃以保证种子浸泡均匀，随后用无菌水冲洗3次，洗净后将种子放置摇床摇晃2天至种子发芽；取在托盘内铺上约0.3cm厚的蛭石并用纯水清洗1～2遍，随后倒入1/4浓度的改良霍格兰营养液浇透蛭石至湿润，将已发芽的种子均匀播在蛭石表面并在托盘表面覆盖一层保鲜膜以保持水分，待种子长出子叶后将膜揭开；幼苗于蛭石上长出真叶，此时即可转移至含有1/4浓度的改良霍格兰营养液水培装置中继续培养，得到番茄幼苗。
番茄植株的缺磷胁迫处理及GUS染色处理
提供缺磷溶液和全磷溶液，其中，缺磷溶液为以无磷酸二氢钾成分的改良霍格兰营养液，全磷溶液为改良霍格兰营养液。
试验组为以缺磷溶液对番茄幼苗进行处理，处理方式：采用水培方式进行培养，缺磷溶液每三天更换一次，将proSlMIR399A:GUS转基因番茄幼苗分别进行12小时(12h)、3天(3d)、7天(7d)的缺磷处理；对照组为以全磷溶液对番茄幼苗进行处理，处理方式：采用水培方式进行培养，全磷溶液每三天更换一次，将proSlMIR399A:GUS转基因番茄幼苗分别进行12小时(12h)、3天(3d)、7天(7d)的全磷处理；该处理试验一共包括：进行12小时(12h)缺磷处理的试验组1和进行12小时(12h)全磷处理的对照组1；进行3天(3d)缺磷处理的试验组2和进行3天(3d)全磷处理的对照组2；进行7天(7d)缺磷处理的试验组3和进行7天(7d)全磷处理的对照组3。
对处理得到的各试验组和对照组进行GUS染色，其中，GUS染色包括如下步骤：将样品置于丙酮溶液中于-20℃处理20min，倒掉丙酮；用X-Gluc缓冲液洗涤一次，再浸泡在配置好的X-Gluc染液中，真空抽取30min，并于37℃恒温培养箱中染色过夜，用75％乙醇进行脱色，每2h更换一次75％乙醇，至叶绿素褪去。再用相机进行拍照获取图片。
收集采用不同时间的缺磷处理得到的番茄幼苗的GUS染色结果，通过拍照得到的照片分析GUS信号强弱，分析Sly-miR399A在番茄中的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫与Sly-miR399A在番茄中的表达情况有关。
结果分析：
对实施例1中“番茄植株的缺磷胁迫处理”的试验结果进行分析，如附图1所示，进行12小时(12h)全磷处理的对照组1的GUS染色结果如图1A所示，进行全磷处理时，植物的GUS信号很弱；进行12小时(12h)缺磷处理的试验组1的GUS染色结果如图1D所示，进行缺磷处理12小时，植物的GUS信号出现于植物的叶片和茎(地上部分)，表明在缺磷环境下12小时，分子标记物Sly-miR399A已经出现表达，因此植物出现了GUS信号。
进行3天(3d)全磷处理的对照组2的GUS染色结果如图1B所示，进行全磷处理时，植物的叶片、茎、根均没有出现GUS信号；进行3天(3d)缺磷处理的试验组2的GUS染色结果如图1E所示，进行缺磷处理3天时，植物的GUS信号出现于植物的叶片、茎(地上部分)和根(底下部分)，表明在缺磷环境下3天后，分子标记物Sly-miR399A已经出现表达，因此植物出现了GUS信号；进一步与进行12小时(12h)缺磷处理的试验组1进行比较，可以发现随着缺磷处理时间增加，GUS信号强度越强，表明分子标记物Sly-miR399A的表达量随着番茄植株受缺磷胁迫时间的加长也逐渐增加。
进行7天(7d)全磷处理的对照组3的GUS染色结果如图1C所示，进行全磷处理时，植物的叶片、茎、根均没有出现GUS信号；进行7天(7d)缺磷处理的试验组3的GUS染色结果如图1F所示，进行缺磷处理7天时，植物的GUS信号出现于植物的叶片、茎(地上部分)和根(底下部分)，表明在缺磷环境下7天后，分子标记物Sly-miR399A已经出现表达，因此植物出现了GUS信号；进一步与进行3天(3d)缺磷处理的试验组2进行比较，可以发现试验组3的植物根部出现的GUS信号比试验组2根部出现的GUS信号更强，进一步证明，随着缺磷处理时间增加，GUS信号强度越强，表明分子标记物Sly-miR399A的表达量随着番茄植株受缺磷胁迫时间的加长也逐渐增加。
以上结果显示：proSlMIR399A:GUS信号迅速且显著响应缺磷诱导表达，说明可通过GUS信号强弱来反映Sly-miR399A在番茄植株响应磷缺乏中的表达情况，进而快速验证番茄植株受到缺磷胁迫的状态，其中，当环境中磷缺乏越严重时，分子标记物Sly-miR399A的表达量越高。通过检测活体番茄中Sly-miR399A的表达量，能够快速、准确、高效地鉴定反应环境中可利用磷的含量情况，提供了实时监测环境中磷含量的手段，以了解环境中磷缺乏状态，从而在农业生产中及时采取相应策略，应对缺磷胁迫对作物生产的影响提供帮助。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物及其应用
<130> 2020/4/22
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 1
ugccaaagga gaguugcccu a 21
<210> 2
<211> 1524
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cgtacgccgc ctcttacgct gccacttaca ccctgttgca ttgtttcact ggaacatgtt 60
gtgttacctg ttcaatacta ttttgccatt ttcaaaatct caagattaac aatatagttg 120
aaacggcttg tcatctttac aagcaaacac aaactatcct tgaacatgat cgatgtgata 180
acattaagat ttcaggaaat accaataatg taaaaccaga gggagcccat gtgatagcta 240
gttggcttgc gcatcaattc gtgccaaaat ttttaggaga aattaaaaaa gaatgttagc 300
atttaataca agtgtgctat aataccttct gcatcggagt attaagaacg gatctttgag 360
ttattatatt aagcagagac agtagcaggg cagctctcct ttggcgtatc ggttaaaata 420
tgcgatacag tgaattggag tcactgtaca tatattaacg catgccaata gagagtagcc 480
ctatcactat ttcccttatt ttcattcacc aacgacttcc tttctcatgc ttccgcttca 540
tcacaagaga gcccttccat gcttttatag agcatttgtt ctcagtttaa gagatggaat 600
aaaccactcg agatatgaga tatcctatgg cttttatgca tgatggggtt gaaatgaggg 660
taactttctt atctctttac aattccattt tgtgaaagct cctttaaaaa aaaatgtgtt 720
catcagattc cccagttgcc ttctccataa atttgtaggt gtaaatgcgg aaacaaaaaa 780
agttgttcaa accaagagat gctctattat ttcacctttg aaatttgtca tttgactcaa 840
aaagttgtga ctaaggaggc aaaggacctt aaaacagcat atcctctgca tattcctctc 900
ttctttattt ccatctgtat tatacttcta tatatgaata ggtttcattt ctatataatt 960
tttaagattg caaaattttt agatgctagg taatcaagat cacttagttc cttttatata 1020
tattattatc actcaagtgt gttatcatac ttctgtaatt tgaaatgatt aaggttagta 1080
aagtgaacta caacattatt tccaggatat gtttcgtgtt ttagctatta cagtccaaat 1140
tctatattcg cattaaagaa cgactaaata tgtctactca acgcatgacc tccggaaatt 1200
ggaatattaa ttaaaattta aaaacatttg taaattgaaa agtgaaggtc cttgactcgt 1260
aaacttaagt gtcaaatggc atacttggaa cgcataaaat cgagaagcat ctaaaaattg 1320
aattcatgaa caatgcaaga ggaagaatct gatgaatttt tatttttttt aaaagagctt 1380
tcaccaaatg gaatatgtaa aagataagaa aagttactgt cccatttctg actttagaaa 1440
aagcaaccct taatgcaaga agatatatat ctacaggtca cacagcataa aaataaatga 1500
taggatatgc cgattctcta gggg 1524
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ccttgtctat gtatacggtt ggc 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtgactaagg aggcaaagga cc 22
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ccctttcgtc ttcaagaatt ccccacttgg aaggtcaaac gag 43
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gacctgcagg catgcaagct tcccctagag aatcggcata tcc 43

Claims (10)

1.一种番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物，其特征在于，所述分子标记物为Sly-miR399A，所述Sly-miR399A的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物，其特征在于，所述Sly-miR399A的启动子基因序列proSlMIR399A如SEQ ID NO.2所示。
3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1或2所述的番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体还含有PLP_GUS载体。
5.一种引物对，其特征在于，所述引物对用于扩增表达番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物的启动子，所述分子标记物为Sly-miR399A，所述分子标记物的启动子为proSlMIR399A，且所述引物对包括与proSlMIR399A结合的上游引物和与所述proSlMIR399A结合的下游引物；其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5所述的引物对。
7.一种分子标记物在检测番茄生长过程中环境磷缺乏的应用，其特征在于，所述分子标记物为权利要求1或2所述的番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物。
8.一种采用分子标记物检测番茄生长过程中环境磷缺乏的方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取Sly-miR399A启动子序列，与双酶切得到的PLP_GUS载体进行连接反应，构建得到PLP_proSlMIR399A:GUS载体，将所述载体侵染番茄并进行阳性筛选得到阳性proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株；
将所述阳性proSlMIR399A:GUS番茄转基因植株培育得到番茄幼苗，进行GUS染色，收集GUS染色结果，分析Sly-miR399A在番茄中的表达情况，检测番茄生长过程中环境磷缺乏的状态。
9.根据权利要求8所述的采用分子标记物检测番茄生长过程中环境磷缺乏的方法，其特征在于，获取Sly-miR399A启动子序列的方法包括如下步骤：
提取番茄的基因组DNA；
设计与所述Sly-miR399A启动子序列结合的上游引物和与所述Sly-miR399A启动子序列结合的下游引物对；
采用所述上游引物和所述下游引物所述基因组DNA进行扩增，得到所述Sly-miR399A启动子序列。
10.根据权利要求8或9所述的采用分子标记物检测番茄生长过程中环境磷缺乏的方法，其特征在于，所述双酶切得到的PLP_GUS载体中，采用HindIII和EcoRI对所述PLP_GUS载体进行双酶切。
CN202010363915.4A 2020-04-30 2020-04-30 番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物及其应用 Pending CN111549164A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010363915.4A CN111549164A (zh) 2020-04-30 2020-04-30 番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010363915.4A CN111549164A (zh) 2020-04-30 2020-04-30 番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111549164A true CN111549164A (zh) 2020-08-18

Family

ID=72006270

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010363915.4A Pending CN111549164A (zh) 2020-04-30 2020-04-30 番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111549164A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102206662A (zh) * 2011-04-28 2011-10-05 中国科学院南京土壤研究所 miR399融合基因及其构建方法和在植物育种中的应用
CN104131078A (zh) * 2014-06-30 2014-11-05 江汉大学 利用miRNA399j基因预报水稻白叶枯病的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102206662A (zh) * 2011-04-28 2011-10-05 中国科学院南京土壤研究所 miR399融合基因及其构建方法和在植物育种中的应用
CN104131078A (zh) * 2014-06-30 2014-11-05 江汉大学 利用miRNA399j基因预报水稻白叶枯病的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANGUANG ZHANG, ET AL.: ""Identification of conserved microRNAs and their targets from Solanum lysopersicum Mill"", 《GENE》 *
JIANGUANG ZHANG, ET AL.: ""Solanum lycopersicum microRNA MIR399，NR_108003.1"", 《NCBI GENEBANK》 *
张烨: ""低磷胁迫诱导植物酸性磷酸酶的分子调控机制"", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *
艾佳 等: ""植物逆境microRNA的研究进展"", 《基因组学与应用生物学》 *
赵先炎 等: ""拟南芥AtmiR399f基因在番茄中异位表达对低磷耐性及外观形态的影响"", 《西北农业学报》 *
陶平: ""miR399调控大豆磷平衡及开花的初步研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107435047B (zh) 一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25及其与应用
WO2022135246A1 (zh) 一种控制大豆-根瘤菌匹配性的r基因及其蛋白质和应用
CN104004781A (zh) 一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法
CN109081865B (zh) 毛竹PeVQ28蛋白及其编码基因与应用
CN108624596B (zh) 一种调控豆科根瘤生长的基因GmSPX5及其应用
CN111233988B (zh) 茄子钾离子通道蛋白SmAKT1及其编码基因和应用
CN108997487B (zh) 抗逆相关蛋白z76在调控植物抗逆性中的应用
CN106674337A (zh) 一种植物磷转运蛋白ZmPHT1;7及其编码基因和应用
CN115896128B (zh) 一种烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF6.13、编码基因及其应用
CN110106171B (zh) 长链非编码rna及其在调控植物耐低温中的应用
CN116083445A (zh) 一种CrBZR1基因及其应用
CN107937412A (zh) 一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法
CN111549164A (zh) 番茄环境磷缺乏相关基因的分子标记物及其应用
CN104673803B (zh) 基因甲基化在调控基因表达方面的应用
WO2013010368A1 (zh) 水稻通气组织形成关键基因OsLSD2的应用
CN107164373B (zh) 大豆低温诱导人工合成启动子sp5及应用
CN112442511A (zh) 提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法
CN104988176B (zh) 一种提高杜仲含胶量的方法
KR101677483B1 (ko) 벼 유래의 종자무기성분함량을 증진시키는 OsNAS3 유전자가 과발현된 항생제 마커프리 형질전환 벼
KR101677482B1 (ko) 벼 유래의 고친화성 인산운반체 OsPT4 유전자가 과발현된 항생제 마커프리 형질전환 벼
Jin et al. Techniques for the regeneration and genetic transformation of Arabidopsis pumila: An ephemeral plant suitable for investigating the mechanisms for adaptation to desert environments
CN116445508B (zh) 大豆GmMATE109基因及其应用
CN116004646B (zh) 一种烟草NtSWEET11基因及其应用
CN117187277A (zh) 油茶pap基因在提高植物磷吸收性中的应用
CN117143212A (zh) 一种转录因子AmbHLH148及其在抗旱中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200818